KR20010003154A - 발광 박테리아의 고정화 및 이를 이용한 유해가스의 독성 탐지방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 발광 박테리아를 이용한 유해가스의 독성 탐지방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 미생물 배지를 원심분리시켜 걸러낸 발광 박테리아를 젤(gel) 상태의 영양배지와 혼합한 후 외면에 나사선을 낸 투명 폴리프로필렌 튜브에 부어 상온에서 고형화하여 발광 박테리아를 바이오센서화하고 이것을 유해가스의 독성 탐지에 이용하는 것이다.
본 발명의 유해가스 독성 탐지방법은 발광 박테리아가 고정화된 바이오센서에 광섬유를 연결하고 가스상의 화학물질의 독성에 의해서 변화하는 발광 박테리아의 발광량을 광신호로 루미노미터에 전달함으로써 발광량의 변화에 의하여 독성 여부를 탐지할 수 있다.
본 발명은 발광 박테리아를 영양배지에 고정화한 바이오센서를 쉽게 휴대할 수 있고 가스상의 유해 화학물질의 독성을 직접적으로 신속하게 실시간으로 탐지하여 유해물질을 취급하는 현장의 작업환경을 감시하고 유해가스가 유출시 작업자가 환기 및 대피 등 신속한 안전조치를 취할 수 있게 하는 것을 목적으로 한다.
Description
본 발명은 발광 박테리아를 이용한 유해가스의 독성 탐지방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 미생물 배지를 원심분리시켜 걸러낸 발광 박테리아를 영양배지와 혼합한 후 외면에 나사선을 낸 투명 폴리프로필렌 튜브에 부어 상온에서 고형화하여 발광 박테리아를 바이오센서화하고 이것을 유해가스의 독성 탐지에 이용하는 것이다.
종래의 유해 가스의 독성 탐지방법은 대기시료를 포집하여 가스크로마토그래피를 이용하여 분석하는 방법과 광이온 검출기(Photo ionization detector)를 이용하여 대기중의 농도를 탐지, 분석하는 방법이 있으나 이들은 포집 및 분석하는 과정이 복잡하고 장시간이 소요되어 실시간으로 오염정도를 측정할 수 없고 가격이 비싼 문제점이 있다.
이러한 문제점을 해결하기 위하여 유해가스의 독성에 민감한 반응을 나타내는 미생물을 생물학적 감지기, 즉 바이오센서(Biosensor)화하여 유해가스의 독성 탐지에 이용하고 있는데 유해가스의 독성을 탐지할 수 있는 바이오센서로는 마누스 (Manus J. Dennisson) 등이 발표한 효소의 반응에 의한 전위의 변화를 이용한 바이오센서(Manus J. Dennison, Jennifer M. Hall and Anthony P.F. Turner,1995, Gas-Phase Microbiosensor for Monitoring Phenol Vapor at ppb Levels, Anal. Chem. 67. 3922-3927), 이 정임(Jeong Im Lee) 등이 발표한 세포의 대사작용에 의한 산소 소모량을 이용한 바이오센서(Jeong Im Lee & Isao Karube,1996,Development of a biosensor for gaseous cyanide in solution, Biosensors & Bioelectronics, Vol. 11. No. 11. 1147-1154), 마틴(Martine Naessens) 등이 발표한 녹조류의 광합성 작용을 이용한 바이오센서(Martine Naessens & Canh Tran-Minh, 1998, Whole-cell biosensor for direct determination of solvent vapours, Biosensors & Bioelectronics, Vol. 13. No. 3-4. 341-346) 등이 연구되어 왔지만 아직까지 상용화된 기술은 없다.
본 발명은 발광 박테리아를 영양배지에 고정화한 바이오센서의 크기를 소형화하여 쉽게 휴대할 수 있게 하고 이를 가스 상의 유해 독성 화학물질을 직접적으로 신속하게 실시간으로 탐지하여 유해물질을 취급하는 현장의 작업환경을 감시하고 유해가스가 유출시 작업자가 환기 및 대피 등 신속한 안전조치를 취할 수 있게 하는 것을 목적으로 한다.
도 1은 발광 박테리아를 영양배지에 고정화한 바이오센서의 단면도.
도 2는 발광 박테리아를 고정화한 바이오센서를 이용하여 유해가스의 독성을 탐지하는 시스템 구성도.
도 3은 4℃에서 보관한 바이오센서를 30℃로 유지되는 콘트롤 반응기에 넣었을 때 발광량 변화를 나타낸 그래프.
도 4는 독성물질로 가스상의 벤젠을 테스트 반응기에 유입시켰을 때 독성물질을 유입하지 않은 콘트롤 반응기와 벤젠이 유입된 테스트 반응기의 발광량을 벤젠의 양에 따라 비교한 상대적 발광량을 나타낸 그래프이다.
< 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명 >
1: 발광 박테리아 2: 투명 폴리프로필렌 튜브
3: 고형화된 배지 4: 나사선
5: 원통형 검정 플라스틱 6: 광섬유
7: 바이오센서 8: 검정 플라스틱 캡
9: 이중 항온 자켓 10: 가스 유입구
11: 가스 배출구 12: 항온수 유입구
13: 항온수 배출구 14: 루미노미터
15: 데이터 저장 시스템 16: 콘트롤 반응기
17: 테스트 반응기
본 발명의 발광 박테리아를 이용한 유해가스의 독성물질을 탐지하는 방법에 있어서 먼저 발광 박테리아를 바이오센서화 해야 하는데 다음과 같은 방법에 의해서 발광 박테리아를 바이오센서화 할 수 있다. 먼저 발광 박테리아를 배양시킨 후 원심분리기로 미생물만 걸러낸 후에 37℃∼40℃로 유지되며 1ℓ 증류수당 LB Broth (Difco, USA)와 Micro agar(DUCHEFA, Netherlands)가 5:3의 비로 혼합된 젤(gel) 상태의 영양배지에 발광 박테리아가 균일하게 분포되도록 혼합한 후 광섬유 연결을 위해 외면에 나사선(4)을 낸 투명한 폴리프로필렌(PP) 튜브(2)에 부어서 상온에서 식혀서 고형화시킨다. 이렇게 고정화된 발광 박테리아 바이오센서를 발광 박테리아의 성장을 억제시키고 수분유지, 산소공급 및 장기보관을 위해서 실리콘 튜브에 넣어 밀폐시킨 후 4℃의 온도로 유지되는 냉장고에 보관한다. 한편 발광 박테리아를 투명한 폴리프로필렌 튜브에 고정화시킴으로써 미생물이 내는 빛을 광섬유로 효과적으로 전송시킬 수 있으며, 취급이 간편하도록 크기를 소형화하여 바이오센서를 다량으로 저가에 제작할 수 있으므로 휴대용 바이오센서 장치의 소모부품으로 사용할 수 있다. 도 1은 이러한 발광 박테리아 바이오센서의 단면도를 나타내고 있다.
도 2는 발광 박테리아 바이오센서(7)를 원통형 검정 플라스틱(5)에 결합시키고 이것을 부착한 콘트롤 반응기(16), 테스트 반응기(17)와, 상기 원통형 검정 플라스틱에 결합된 발광 박테리아 바이오센서는 광섬유(6)를 거쳐 루미노미터(14)에 연결된 독성 탐지장치의 개략도이다. 반응기는 발광 박테리아가 생존할 수 있는 적정한 온도를 유지하기 위해서 항온수가 순환되는 유입구(12)와 배출구(13)가 있는 이중 항온 자켓(9), 가스유입구(10) 및 가스배출구(11)로 구성되어 있다. 또한 발광 박테리아의 발광량 손실을 막기 위해 바이오센서를 나사선이 있는 원통형 검정 플라스틱(5)에 결합하고 외부의 빛이 차단되며 가스가 스며들 수 있는 검정 플라스틱 캡(8)을 바이오센서 끝 부분에 결합한다.
도면부호 15는 루미너미터에서 기록된 발광량을 저장 및 보관하는 데이터 저장시스템이다.
가스유입구를 통해 테스트 반응기에 유입된 유해가스는 검정 플라스틱 캡을 통해 바이오센서의 발광 박테리아와 반응하게 되며 발광 박테리아는 유해가스의 독성에 의해서 발광량이 점차 감소하고 이러한 발광량의 감소는 광섬유를 통해서 루미너미터에서 측정됨과 동시에 데이터 저장시스템에 저장된다. 유해가스가 도입되지 않는 콘트롤 반응기의 발광 박테리아 발광량과 유해가스가 도입된 테스트 반응기의 발광 박테리아의 발광량을 서로 비교함으로써 가스의 독성 정도를 알 수 있다.
한편 본 발명에 사용된 발광 박테리아는 생명공학연구소(KRIBB)에서 연구목적으로 1999년 4월 6일 분양 받은 Photobacterium Phosphoreum(균주번호: KCTC 2852)으로 평시에는 다량의 빛을 내다가 독성 물질과 반응하면 발광량이 감소하는 성질을 가지고 있다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 설명하고자 한다. 그러나 이들이 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것은 아니다.
< 실시예 1 > 바이오센서의 발광량 비교
발광 박테리아를 배양시킨 후 원심분리기로 미생물만 걸러낸 후에 38℃∼39℃로 유지되며 1ℓ 증류수당 25g의 LB Broth(Difco, USA)와 15g의 Micro agar (DUCHEFA, Netherlands)가 혼합된 젤(gel) 상태의 영양배지에 발광 박테리아가 균일하게 분포되도록 혼합한 후 광섬유 연결을 위해 외면에 나사선을 낸 투명한 폴리프로필렌(PP) 튜브에 부어서 상온에서 식혀서 고형화시킨다. 이렇게 고정화된 발광 박테리아 바이오센서 3개를 30℃로 유지된 각각의 콘트롤 반응기에 넣은 후 발광 박테리아의 발광량의 변화량을 측정하였다. 발광량 측정 시작 후 50분 이내에 일정한 발광량을 유지하는 정상상태에 도달하였고 이러한 정상상태는 도 3에 나타낸 것처럼 100분을 전후하여 지속되었다.
< 실시예 2 > 독성 유해 가스의 농도에 따른 발광량의 변화
상기 실시예 1에서 독성물질과 접촉하지 않은 각각의 바이오센서 발광량과 독성물질을 접촉한 바이오센서의 발광량을 측정하고 이들을 서로 비교하여 상대적 발광량을 구하여 독성물질의 농도에 따른 반응 정도를 알아보고자 하였다.
가스상의 독성물질을 주입하지 않은 콘트롤 반응기와 독성물질을 주입한 테스트 반응기의 발광량을 비교하여 상대적 발광량(Relative Bioluminescence, RBL)을 아래의 식(1)을 이용하여 구하였고 이를 이용하여 독성물질의 농도에 따른 반응정도를 알 수 있었다. 독성물질 주입전 RBL은 1을 유지하다가 독성물질과 반응하면 RBL<1이 되며 특히 독성물질의 농도가 높을수록 RBL의 수치가 작아진다.
......(1)
도 4(a)∼4(c)는 독성 가스물질로 벤젠을 발광 박테리아에 무해하고 벤젠을 잘 녹이는 올레익산(Oleic acid)과 혼합하여 액상으로 테스트 반응기에 주입하고 테스트 반응기내에서 벤젠가스를 형성시킴으로써 테스트 반응기의 발광량 감소를 기록한 그래프이다. 액상의 벤젠 농도를 각각 0.1, 1, 10%로 조절하여 주입하였을 때 벤젠의 농도가 높을수록 발광 박테리아의 발광량이 보다 급격하게 감소하는 것을 알 수 있었다.
본 발명에 의한 독성 가스 탐지용 바이오센서는 기존의 장비에 비해 간편하고 쉽게 제작이 가능할 뿐만 아니라 현장에서 신속하고 민감하게 독성을 탐지할 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명의 독성 탐지방법을 이용하여 휘발성 유기화합물등 유독가스가 고농도로 유출되는 작업장의 대기환경을 감시하여 작업자의 불안감을 해소하고 작업자의 안전과 생산성을 높일 수 있게 해주며 유독가스의 유출시 경보를 발생시켜 작업자가 환기, 대피 등 안전조치를 취할 수 있다.
Claims (4)
- 발광 박테리아(Photobacterium Phosphoreum, 균주번호: KCTC 2852)를 배양시킨 후 젤(gel) 상태의 영양배지에 혼합한 발광 박테리아 바이오센서를 가스상태의 독성물질과 반응시켜 발광 박테리아의 발광량 감소를 측정하여 독성물질을 탐지하는 것을 특징으로 하는 발광 박테리아의 고정화 및 이를 이용한 유해가스의 독성 탐지방법.
- 제 1항에 있어서, 젤(gel) 상태의 영양배지는 1ℓ중류수당 LB Broth와 Micro agar가 5:3의 비로 혼합됨을 특징으로 하는 발광 박테리아의 고정화 및 이를 이용한 유해가스의 독성 탐지방법.
- 제 1항에 있어서, 발광량 감소는 가스상태의 독성물질을 투입한 테스트 반응기의 발광량을 독성물질을 투입하지 않은 콘트롤 반응기의 발광량으로 나눈 상대적 발광량(Relative Bioluminescence, RBL)에 의해 측정하는 것을 특징으로 하는 발광 박테리아의 고정화 및 이를 이용한 유해가스의 독성 탐지방법.
- 제 1항에 있어서, 발광 박테리아 바이오센서는 광섬유와 연결시키고 발광 박테리아의 발광량 손실을 막기 위해서 나사선이 있는 원통형 검정 플라스틱에 결합함을 특징으로 하는 발광 박테리아의 고정화 및 이를 이용한 유해가스의 독성 탐지방법.
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| KR1019990023325A KR100329121B1 (ko) | 1999-06-21 | 1999-06-21 | 고정된 발광 박테리아를 이용한 유해가스의 독성 탐지방법 |
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| KR1019990023325A KR100329121B1 (ko) | 1999-06-21 | 1999-06-21 | 고정된 발광 박테리아를 이용한 유해가스의 독성 탐지방법 |
Publications (2)
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| KR1019990023325A KR100329121B1 (ko) | 1999-06-21 | 1999-06-21 | 고정된 발광 박테리아를 이용한 유해가스의 독성 탐지방법 |
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|---|---|
| KR (1) | KR100329121B1 (ko) |
Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| KR20140059609A (ko) * | 2012-11-08 | 2014-05-16 | 고려대학교 산학협력단 | 자기확인 기능성 마이크로비드를 이용한 독성 탐지용 딥스틱 바이오센서 |
| KR20180110963A (ko) * | 2017-03-30 | 2018-10-11 | 주식회사 네오엔비즈 | 유기 오염물 및 휘발성 독성물질의 수질 독성 원인 물질 규명장치 |
-
1999
- 1999-06-21 KR KR1019990023325A patent/KR100329121B1/ko not_active IP Right Cessation
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| KR20140059609A (ko) * | 2012-11-08 | 2014-05-16 | 고려대학교 산학협력단 | 자기확인 기능성 마이크로비드를 이용한 독성 탐지용 딥스틱 바이오센서 |
| KR20180110963A (ko) * | 2017-03-30 | 2018-10-11 | 주식회사 네오엔비즈 | 유기 오염물 및 휘발성 독성물질의 수질 독성 원인 물질 규명장치 |
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