KR20010002858A

KR20010002858A - 간흡충 유래의 시스틴 단백분해효소를 코딩하는 유전자

Info

Publication number: KR20010002858A
Application number: KR1019990022883A
Authority: KR
Inventors: 박현
Original assignee: 고석수; 주식회사 휴먼바이오
Priority date: 1999-06-18
Filing date: 1999-06-18
Publication date: 2001-01-15

Abstract

본 발명은 서열 1로 표시되고, 간흡충 유래의 시스틴 단백분해효소를 코딩하는 유전자에 관한 것으로, 이를 이용하여 간흡충증 환자의 혈청과 반응하는 재조합 단백질을 제조하여 간흡충증의 진단에 이용할 수 있다. 또한, 단백질 수준에서 정제한 시스틴 단백분해효소가 다른 기생충과의 교차반응을 감소시키고, 또한 민감도를 높일 수 있으므로 폐흡충의 진단에 유용하게 이용되었으나, 본 발명에 의해 간흡충 유래의 시스틴 단백분해효소의 유전자 서열이 밝혀짐에 따라, 폐흡충의 진단에 있어서도 이를 이용하여 제조한 재조합 단백질을 이용할 수 있다.

Description

간흡충 유래의 시스틴 단백분해효소를 코딩하는 유전자{The gene for coding a cysteine proteinase isolated from Clonorchis sinensis}

본 발명은 간흡충 유래의 시스틴 단백분해효소를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

간흡충증은 간흡충(肝吸蟲, Clonorchis sinensis Looss)이라는 기생흡충을 함유하고 있는 잉어과 담수어 등을 날로 또는 덜 익힌 것으로 섭취할 때 감염되어 일어나는 질병으로, 우리나라를 비롯한, 중국, 일본, 러시아의 극동지역을 비롯하여 대만, 인도차이나, 필리핀 등에서 많이 발생하고 있지만, 회충, 십이지장충, 편충 등의 토양 매개성 기생충과는 달리 많은 노력에도 불구하고 감소현상이 둔한 기생흡충이다.

간흡충의 감염은 간담도 내의 충체에 의해 산란된 충란이 물속으로 흘러 들어가 제 1중간 숙주인 쇠우렁 또는 몇 가지 담수산 패류에 먹히며, 패류 체내에서 스포로시스트, 레디아를 거쳐 유미 유충으로 발육하고, 2차 숙주인 잉어과 담수어의 근육내로 침범하여 피낭유충으로(metacercaria)으로 전환되는데, 사람이나 동물은 이러한 감염된 담수어를 날로 먹는 것에 의해 간흡충이 십이지장에서 탈낭하고, 곧바로 총수담관을 경유하여 간내 담도로 침입함에 의한 것이다. 이렇게 감염된 간흡충은 간이나 간밖의 담간, 그리고 쓸개 속에 살기 때문에 담관이나 쓸개(담낭)를 자극해서 담관염, 담낭염 등의 심한 염증을 일으키고 그 합병증으로 담석을 만들기도 한다. 대채로 간흡충의 성충이나 알이 담석의 기초가 되며, 오랫동안 심한 염증이 계속되면, 나중에 담관암이 발생하기도 한다.

간흡층증의 증상은 배가 더부룩하고, 황달이 오며, 입맛이 없어지고, 빈혈, 야맹증, 소화불량, 설사 등의 현상이 나타난다. 또한, 간비종대의 소견이 보이며, 담관염으로 인한 문맥압의 상승으로 복수가 차는 현상이 나타난다(인체기생충학 소진탁 著, 임상기생충학개요 이순형등 著).

따라서, 상기한 증상이 발생하면 이를 치료하기 위해서 간흡충의 치료약으로 알려진 염산에메틴(상품명; 프라지칸텔(Prazaquantel))을 투여하고 있으나, 이는 질병 원인을 확인하지 않고 선택한 치료법으로서 다른 원인에 의한 간질환 및 치료 유무에 대한 판단이 안될 위험이 발생할 수 있다. 그러므로, 치료에 앞서 간흡충에 의한 감염을 먼저 진단하는 것이 필요하다.

종래 사용되어 오던 검사법으로는 환자의 대변에서 간흡충의 난자를 찾는 방법이 있다. 또한, 1950년대에 개발된 후 현재까지 널리 이용되고 있는 피내 검사가 있다. 그러나, 대변검사는 간흡충 성충 안마리의 난자 배출수가 대략 100개 정도이므로, 민감도에 있어서 떨어지며, 피내검사는 과거에 감염된 사람에 있어서도 양성반응을 나타내고(Chung et al., 1995; Sandun et al., 1959; Walton과 주, 1959; 김동찬 외, 1969; 정호연 외,1989), 폐흡충 감염환자에서도 양성으로 나타난다는 사실이 훈터(Hunter) 등(1958)에 의해 44.7%나 되는 것으로 보고 되었으므로, 이 방법 또는 민감도와 특이성이 좋지 않은 문제점이 있다.

따라서, 정제한 간흡충 항원을 사용하여 피내반응검사의 민감도와 특이도를 높이려는 연구가 시도된 바 있으며(최동익, 1959; Sawada et al, 1964; 안염겸 외, 1975), 현재로서는 간흡충 감염에 대한 특이 면역글로블린을 검출하는 ELISA법을 이용하여 혈청학적 진단을 하는 방법이 시도되고 있지만 대변검사 만큼 특이성이 있지는 못하다(이중근외 1981; 양정성 외, 1983).

그러므로, 간흡충증을 진단하기 위해서 피내반응검사, ELISA검사 및 대변검사를 복합적으로 실시하는 일이 증가되고 있는 실정이다.

따라서, 간흡충증에 있어서 현증감염자와 과거감염자, 요꼬가와흡충, 기타 흡충류감염자와 감별할 수 있을 정도의 향상된 특이도와 민감도를 갖으며, 신속하게 간흡충증을 진단할 수 있는 혈청학적 진단법의 개발이 요구되고 있는 상황이다.

이에, 본 발명자들은 간흡충증을 진단할 수 있는 방법에 대하여 연구하던 중, 시스틴 단백분해효소(cysteine proteinase)가 기생흡충에 의해 발병되는 질환의 진단에 활용되고 있으며(Mckerrow, Exp. Parasitol., 68, 111, 1989; Cynthial et al., Am. J. Tropical Med. Hyg., 42, 3435, 1990; Alderete et al., Genitourin. Med., 67, 331, 1991), 부분정제된 간흡충의 시스틴 단백분해효소가 항원성이 있다(Song(1991))는 사실로부터 간흡충의 시스틴 단백분해효소를 간흡층의 진단에 이용하고자 하였으며, 이를 위하여 간흡충으로부터 시스틴 단백분해효소를 코딩하는 유전자를 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열 1로 표시되고, 간흡충 유래의 시스틴 단백분해효소(cysteine proteinase)를 코딩하는 유전자를 제공하는 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

일반적으로, 간흡충에는 24 KDa의 시스틴 단백분해효소, 18.5 KDa의 산성 티올 단백분해효소(acidic thiol protease), 32 KDa의 시스틴 단백분해효소 등의 3가지 정도의 단백분해효소가 있으며, 이중 24 KDa의 시스틴 단백분해효소는 간흡충 감염의 병원성에 깊이 관여한다고 보고되어 있다(Park et al., Korean J. Parasitol. 33, 211, 1995; Song et al., Comp Biochem Physiol., 99, 137, 1991). 또한, 간흡충 성충에서부터 분리 정제된 시스틴 단백분해효소가 면역블롯팅(immunoblotting)상에서 면역원성이 있음이 보고되어 있다.

상기한 사실들로부터, 본 발명자들은 시스틴 단백분해효소 재조합 단백질 중에서 간흡충증 환자의 혈청과 반응하는 재조합 단백질을 찾게 되면, 간흡충의 진단에 이용할 수 있다는 것을 착안하게 되었고, 따라서 본 발명자들은 간흡충으로부터 시스틴 단백분해효소를 코딩하는 유전자를 클로닝한 것이다.

간흡충으로부터 시스틴 단백분해효소를 코딩하는 유전자를 클로닝하는 과정은 먼저, 시스틴 단백분해효소에 관련된 유전자를 분리하기 위하여 β-시아노에틸포스포미디트(cyanoethyl phosphormidite)방법으로 프라이머를 설계하는 것이다. 일반적으로 시스틴 단백분해효소에는 시스틴과 아스파라진의 활성부위가 상당히 보존되고 있으므로, 시스틴 활성부위와 제한효소 EcoRⅠ으로 절단되는 특이성이 부여된 프라이머 1(5'-ACA GAA TTC CAR GGI CAR TGY GGI TCI TGY TGG-3')과 아스파라진 활성부위와 제한효소 Hind Ⅲ로 절단되는 특이성이 부여된 프라이머 2(5'-TTA AAG CTT CCA IGA RTT YTT IAC RAT CCA RTA-3')를 설계한다. 상기 프라이머의 서열에서 I는 이노신(inosine)이고, R은 A 또는 C이며, Y는 T 또는 C이다.

두 번째 과정은, 간흡충으로부터 추출한 mRNA유래의 cDNA라이브러리와 상기 프라이머를 반응시켜 시스틴 단백분해효소에 관련된 DNA 조각을 분리하는 것이다.

세 번째 과정은, DNA 염기서열을 결정하는 것이다.

이하 실시예를 들어 본 발명의 시스틴 단백분해효소 유전자의 염기서열의 결정과정을 보다 상세하게 설명한다.

[실시예 1]

경상북도의 청도에서 참붕어(Pseudorasbora parva)를 구하여 참붕어에서 피낭유충을 추출해 200개씩 5마리의 토끼에 감염시켜 3개월 후에 토끼를 도살한 후 간흡충을 회수하였다. 회수된 간흡충의 충체로부터 염화세슘(CsCl) 원심분리 방법을 이용하여 전체 RNA를 분리하였다. 즉, 황시안산구아니딘(guanidium thiocyanate)으로 동질화한 후, 토끼로부터 회수된 신선한 간흡충 추출액에 5.7M (pH 7.5)의 CsCl이나 CsTFA 큐션을 깔고, SW28 스윙 버켓 로터(swing bucket rotor; Beckman. CA. USA)를 이용하여 25,000×g에서 24시간 동안 원심분리하였다. 그 다음, 아세트산나트륨(0.3M, pH 5.2)과 에탄올 침전법으로 RNA를 분리한 후, 올리고(dT) 친화 컬럼을 이용하여 poly(A)⁺-mRNA를 순수분리하였다(Sambrook J et al., 1989).

[실시예 2]

ZAP-cDNA 합성 킷트(Lot No. UC118, Stratagene, La zolla, CA)를 이용하여(Stratagene Co, 1992) 실시예 1에서 준비한 poly(A)⁺-mRNA와 poly dT sequence를 지닌 프라이머를 뮤린 마이어블래스틱 류케미아 바이러스(murine myeloblastic leukemia virus)역전사 효소로 처리하여 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하였다. 두 번째 가닥 cDNA는 DNA 폴리머라제 I을 이용하여 합성 중합하였다. 다시 T4 DNA 폴리머라제, T4 폴리뉴클레오타이드 키나아제 및 Xho I 제한효소로 처리하여 양끝에 EcoRⅠ과 XhoⅠ 평활말단을 지닌 cDNA를 합성하였다. 그 후, 세파크릴 S-400 스펀 컬럼(Sephacryl S-400 spun column)을 이용하여 0.5 kb이상의 크기를 지닌 cDNA 분획을 회수하고, Uni-ZAP XR 벡터(Lot No. UC118, Stratagene, La zolla, CA)에 접합시키고, Gigapack II Gold packaging extract를 재조합된 빈도(recombination frequency)를 점검할 수 있는 SURE 세포(Lot No. UC118, Stratagene, La zolla, CA)에 끼워 넣었다. 형질전환된 SURE세포를 NZY plate(효모 추출액과 카제인 가수분해물이 들어있는 NZY Broth에 한천을 첨가하여 만든 것임)에서 배양하여 Uni-ZAP XR 라이브러리를 얻었으며, 이를 "cDNA 라이브러리"라 명하였다.

[실시예 3]

상기 실시예 2에서 얻은 cDNA라이브러리 10 ㎕와 프라이머 1과 2 각각 10㎕를 GeneAmp PCR reagent Kit with AmpliTaq DNA Polymerase(Perkin-Elmer Cetus사 )시스템에 첨가하여 얻은 PCR 반응액 99.5㎕를 DNA Thermal Cycler(Perkin-Elmer Cetus사, model=9600)에 첨가하여 PCR 증폭을 실시하였다. PCR 증폭은 94℃에서 1.5분간 DNA를 변성시키는 단계; 25℃에서 1.5분간 어닐링 시키는 단계; 72℃에서 3분간 DNA를 합성하는 단계를 총 45회 반복하여 실시하였다. 증폭된 DNA 단편들을 확인하기 위하여 PCR 증폭을 실시한 반응액 10㎕에 시료 완충용액(6X, 0.25% 브로모페놀블루, 0.25% 자일렌 시아노 FF, 40% 슈크로스) 2㎕를 혼합하여 1% 아가로스젤로 전기영동하는데, 이때 트리스-초산/에틸렌디아민테트라아세트산(TAE) 전기영동 완충액으로 100 V에서 30분 동안 전기영동하여, 654bp 정도의 DNA분획을 분리하였다.

[실시예 4]

상기 실시예 3에서 전기영동하여 얻은 증폭된 DNA 분획을 1% 아가로스 젤에서 전기영동하고 난 후, 잘라내어 Geneclean II kit (Bio 101 Inc.)를 사용하여 증폭된 DNA 단편을 정제하였고( Wilson VG et al., 1988 ), 정제한 DNA를 pT7Blue T-벡터 (Novagen)에 클로닝하였다. 클로닝된 플라스미드 DNA를 알칼리시스 방법으로(Birnboim HC et al., 1979; Ish-Horowicz O and Barke JF, 1981) 정제한 후 다시 Geneclean II kit를 이용하여 정제하였다.

[실시예 5]

상기 실시예 4에서 정제한 DNA를 T7 프로모터 프라이머(promotor primer)와 T3 리버스(reverse) 프라이머(ABI cloning system)를 첨가하여 PCR 반응을 한 뒤, 8M의 우레아가 함유된 4.75% 폴리아크릴아마이드 겔을 사용하여 2,500V, 30mA로 12시간 전기영동하였다. 전기영동 결과는 Microgene software program (ABI사 제품)을 이용하여 분석하였다. 그 결과는 서열 1과 같다.

서열 1은 GenBank에 U85984로 97년 1월 17일 기탁된 간흡충 시스틴 단백분해효소의 부분 염기서열을 1998년 12월 23일자로 Update한 전체 염기서열로서, 종래 공지된 여러 단백분해효소들과의 아미노산 서열에 있어서, 폐디스토마(Paragonimus westermani)의 시스틴 단백분해효소와는 57%, 폐디스토마 피낭유충의 시스틴 단백분해효소와는 51%, 만손주혈흡충(Schistosoma mansoni)의 시스틴 단백분해효소와는 53%, 인간 케텝신(human cathepsin L)의 시스틴 단백분해효소와는 35%, 간흡충(Fasciola hepatica)의 시스틴 단백분해효소와는 38%의 유사성을 보이며, 또한, 아스파라진, 시스틴 및 히스티딘 보존부위가 아미노산 서열내에 존재함을 알 수 있다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 간흡충 유래의 시스틴 단백분해효소를 코딩하는 유전자에 관한 것으로, 이를 이용하여 간흡충증 환자의 혈청과 반응하는 재조합 단백질을 제조하여 간흡충증의 진단에 이용할 수 있다. 또한, 단백질 수준에서 정제한 시스틴 단백분해효소가 다른 기생충과의 교차반응을 감소시키고, 또한 민감도를 높일 수 있으므로 폐흡충의 진단에 유용하게 이용되었으나, 본 발명에 의해 간흡충의 시스틴 단백분해효소의 유전자 서열이 밝혀짐에 따라 폐흡충의 진단에 있어서도 이를 이용하여 제조한 재조합 단백질을 이용할 수 있다.

Claims

서열 1로 표시되고, 간흡충(肝吸蟲, Clonorchis sinensis Looss) 유래의 시스틴 단백분해효소(cystein proteinase)를 코딩하는 유전자.