KR20000061133A

KR20000061133A - 아스퍼질러스 니가에서 분리한 새로운 항진균성 단백질

Info

Publication number: KR20000061133A
Application number: KR1019990009957A
Authority: KR
Inventors: 이동건; 함경수; 김길룡; 맹철영; 신송엽; 서무열
Original assignee: 박호군; 한국과학기술연구원
Priority date: 1999-03-24
Filing date: 1999-03-24
Publication date: 2000-10-16
Also published as: KR100289231B1

Abstract

본 발명은 아스퍼질러스 니가 (Aspergillus niger)의 배양액으로부터 최초로 분리된 항진균성 단백질에 관한 것으로, 인체에 무해하고 대량 배양이 가능한 아스퍼질러스 니가로부터 분리되어 서열 1의 아미노산 서열을 가지는 본 발명의 항진균성 단백질은 다양한 병원성 진균에 대하여 항진균 활성을 나타냄으로써 진균성 질환의 예방 및 치료제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

아스퍼질러스 니가에서 분리한 새로운 항진균성 단백질{A novel antifungal protein isolated from Aspergillus niger}

본 발명은 새로운 항진균성 단백질에 관한 것으로, 구체적으로 아스퍼질러스 니가로부터 분리되고 서열 1의 아미노산 서열을 가지며 다양한 병원성 진균에 대하여 항진균활성을 가지는 단백질에 관한 것이다.

본 발명은 병원성 진균으로 알려진 아스퍼질러스 퓨미가트스 (Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 플라버스 (Aspergillus flavus), 캔디다 알비칸스 (Candida albicans), 트리코스포론 베이젤리 (Trichosporon beigelii) 및 사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae), 식물 병원성 진균으로 알려진 푸사리움 옥시스포름 (Fusarium oxysporum) 및 푸사리움 솔라니 (Fusarium solani), 그리고 숙주진균인 아스퍼질러스 니가 (Aspergillus niger)에 대해 항진균 활성을 나타내는 새로운 단백질에 관한 것이다.

또한 본 발명은 병원성 진균인 아스퍼질러스 퓨미가트스 및 아스퍼질러스 플라버스에 의해 유발되는 아스퍼질로시스증 (Aspergillosis), 캔디다 알비칸스에 의해 유발되는 캔디다증, 트리코스포론 베이젤리에 의해 유발되는 사모증의 예방과 치료에 사용할 수 있고 상기 단백질을 유효성분으로 하는 항진균성 약학적 조성물에 관한 것이다.

진균류는 인체와 농작물을 감염시켜 여러 가지 질병을 일으키는데, 예를 들어 병원성 진균인 아스퍼질러스 퓨미가트스, 아스퍼질러스 플라버스 등은 아스퍼질로시스증 (Aspergillosis)를 유발하고, 캔디다 알비칸스는 캔디다증을, 트리코스포론 베이젤리는 사모증을, 푸사리움 옥시스포름 및 푸사리움 솔라니는 농산물의 오염 등을 유발하는 것으로 알려져 있다.

지금까지 항진균제로는 화학성 물질이 사용되어져 왔으며, 병원성 진균에 대해서도 화학적인 항진균제를 개발하여 사용하고 있는 실정이다. 그러나 이러한 화학적 물질들은 환경파괴 물질로써 사회적 문제를 일으키고 있으며 또한 그 부작용으로 인해 인체에 해로운 효과를 나타내는 경우도 있다. 그래서 천연물로부터 항진균 효과가 탁월한 물질을 분리하기 위해 많은 노력을 기울여 왔으며, 최근에 유전공학적인 기법의 발달과 함께 새롭게 발견된 몇몇 천연물성 항진균 물질을 대량 생산하는데 많은 연구상의 진척이 있었다. 또한 천연물성 항진균물질의 정제특성과 항진균 활성에 대해서도 연구가 되어 이를 이용한 항생제 또는 천연물성 농약의 개발이 시도되고 있으나, 이들 항진균물질의 응용적인 면에서는 그 연구가 아직까지 미비한 실정이다.

지금까지 아스퍼질러스 지잔트스 (Aspergillus giganteus), 아스퍼질러스 퓨미가트스, 아스퍼질러스 오리제 (Aspergillus orizae) 등의 아스퍼질러스속, 그리고 페니실리움속 등으로 부터 몇몇 종류의 단백질성 항진균성 물질이 분리된 바 있다(Meyrath, J., et al., Experimentia, 29: 1168, 1973; Lacadena, J., et al., Arch. Biochem. Biophy., 324: 273, 1995; Florentine, M., et al., Gene, 167: 167, 1995). 이러한 항진균 물질의 작용기작이라든지 산업적 이용 가능성에 대한 연구는 미흡한 실정이며, 좀 더 강력하면서도 새로운 항진균 물질을 찾으려는 노력이 계속 시도되고 있다.

진균으로부터 분리된 항진균성 물질으로서 지금까지 보고된 사례로는 대표적으로 두가지가 있는데, 아스퍼질러스 지잔트스에서 발견된 51개의 아미노산으로 구성된 항진균 폴리펩타이드(서열 2)와 페니실리움 크리소제넘 (Penicillium chrysogenum) 으로부터 분리된 55개의 아미노산으로 구성된 항진균성 폴리펩타이드(서열 3)가 그것이다. 이러한 저분자성 항진균 단백질들에 대해 지금까지 많은 연구가 이루어져 왔는데 그 단백질의 구조라든지 항진균에 대한 적용범위 등이 알려져 있으며, 그 유전자의 발현도 시도되었지만, 그 응용 면에서는 아직 연구가 미흡한 실정이다.

천연물성 항진균물질의 안전성을 고려할 때 병원성 진균으로부터 항진균물질을 분리하는 것은 위험성을 내포하므로, 비병원성이거나 안전성이 확보된 생물체에서 항진균물질을 분리하는 것이 바람직하다. 아스퍼질러스 니가는 오랜 옛날 부터 우리들의 식생활 특히 간장, 된장, 양조 등에 날리 사용되어져 왔으며, 요즈음은 효소, 의약품의 생산에 산업적으로 유용하게 사용되는 진균이다 (Avram, A., et al., Ann. Dermatol. Venereol., 114: 819, 1987; Kreger-van Rij, N. J. W., Amsterdam, Elsevier Science Publishers., 933-962, 1984). 따라서 아스퍼질러스 니가로부터 항진균성 단백질을 분리한 후 이를 직접 항진균제로 사용하거나 항진균성 단백질의 유전자를 분리하여 유전공학 기술로 대량제조하면, 산업적 유용성과 안전성을 동시에 확보할 수 있다.

이에 본 발명자들은 아스퍼질러스 니가로 부터 새로운 항진균 단백질을 분리 정제하고 전체 아미노산서열을 밝히는 한편, 상기 단백질이 다양한 병원성진균에 대하여 항진균활성을 나타냄을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항진균 활성을 갖는 새로운 단백질을 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명의 항진균성 단백질을 CM-세파로즈 컬럼 (CM-sepharose column)으로 분리정제한 결과를 나타내는 그래프이고,

● : 280nm에서의 흡광도

도 2는 CM-세파로즈 컬럼의 분획 (fraction) 중 항진균 활성을 나타내는 분획을 역상 (reverse-phase) 고성능액체크로마토그래피 (high-performance liquid chromatography : 이하 "HPLC"로 약칭함)로 분리한 결과를 보여주는 그래프이고,

도 3은 단백질 젤 전기영동 사진으로 왼쪽 줄 (lane)은 분자량을 보여주는 사이즈마커 (size marker)를 나타내고 오른쪽 줄의 화살표는 도 1과 도 2의 과정을 거쳐 분리정제된 본 발명의 항진균 단백질의 위치를 나타내며,

도 4는 분리정제된 항진균 단백질의 분자량을 결정하기 위하여 질량분석 (mass spectrometry)을 실행한 결과이고,

도 5는 분리한 항진균 단백질의 직접 서열분석법 (direct sequencing)과 트립신 (trypsin) 및 엔도펩티다제 Glu-C (endopeptidase Glu-C)로 처리한 후 각각의 단편들의 아미노산 서열을 토대로 하여 밝혀진 항진균 단백질의 전체 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

direct sequencing : 직접 서열분석법에 의해 밝혀진 서열 부분 ;

T1~T9 : 트립신에 의해 절단된 펩타이드 단편 부분 ;

G1~G4 : 엔도펩티다제 Glu-C에 의해 절단된 펩타이드 단편 부분

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는, 비병원성 진균인 아스퍼질러스 니가로부터 항진균성 활성을 갖는 새로운 단백질을 효과적으로 분리하고 분리된 단백질의 분자량 및 서열 정보를 밝히는 한편, 이들의 항진균 활성을 측정함으로써 항진균성 단백질을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 우선 아스퍼질러스 니가에서 분리한 항진균성 단백질을 제공한다.

본 발명에서는 아스퍼질러스 니가로부터 새로운 항진균성 단백질을 분리하기 위해, 우선 아스퍼질러스 니가의 포자를 YPD배지에 접종한 후 20~40℃에서 3~5일간 진탕배양을 한다. 상기 배양된 배양액을 나일롱 울로 여과하여 균체를 제거한 후, 배양상등액을 초미세여과 (Amicon Ultrafiltration)하고 트리스염으로 pH 7.0으로 보정한다. 이때, 초미세여과장치는 분자량 30kDa이하를 분리하도록 하는 것이 바람직하다.

상기 분리한 배양액을 이온교환 수지를 이용하여 분리한다. 이때, 배양액은 0.1M의 트리스 (Tris-HCl, pH 7.0) 완충용액으로 평형화시킨 CM-세파로즈 이온교환 칼럼 (CM-sepharose ion exchange column)에 부가하는 것이 바람직하며, 부가된 컬럼을 0.1M의 트리스 완충용액으로 충분히 세척한 뒤 상기 컬럼에 500㎖의 0~1M 염화나트륨 용액의 선형 구배(linear gradient)로 추출하여 수지에 결합된 단백질을 분리하는 것이 바람직하다(도 1 참조).

상기 분획 중 항진균 활성을 가지는 것만을 모아 초미세여과하되 분자량 3kDa 이상을 분리하는 것이 바람직하다(Amicon Ultrafiltration, MW 3,000). 이와 동시에 분리용액 속의 염을 제거한 후, 농축된 분리단백질 용액은 역상 HPLC를 이용하여 단일단백질로 순수 분리정제하고(도 2 참조), 상기 분리된 단백질을 동결건조 시킨 후, 트리스-글리신 젤 (Tris-glycine gel) 전기영동을 이용하여 단백질이 순수 분리된 것을 확인한다(도 3 참조).

또한 MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization ; 이하 "MALDI"로 칭한다)를 이용한 질량 분석법(Hill, et al., Rapid Commin. Mass Spectrometry, 5: 395,1991)으로 상기 단백질의 분자량을 확인한다(도 4 참조).

상기 단백질의 전체 아미노산 서열의 결정은, 단백질에 포함된 시스테인 잔기의 설프히드릴기를 카르복실아미도메틸화 (carboxyamidomethylation)시킨 후 에드만 분해 (Edman degradation)를 이용한 직접 서열분석법 (direct sequencing)으로 확인하는 동시에(표 1 참조), 트립신 및 엔도프로테나제 Glu-C (endoproteinase Glu-C) 처리로 절단된 펩타이드 단편들의 아미노산 서열을 각각 확인하여 본 발명의 단백질이 서열 1에 나타난 바와 같이 총 58개의 아미노산으로 구성된 단백질임을 확인한다(도 5 참조).

또한 본 발명의 단백질의 항진균 활성 조사 방법은, 병원성 진균 등 균체가 자라지 못하는 최소 펩타이드 농도 즉 최소 생육 저해농도를 MTT법으로 측정함으로써 단백질의 항진균 활성을 측정하는데, 본 발명의 단백질은 병원성 진균으로 알려진 아스퍼질러스 퓨미가트스, 아스퍼질러스 플라버스, 캔디다 알비칸스, 트리코스포론 베이젤리 및 사카로마이세스 세레비시아, 그리고 식물 병원성 진균으로 알려진 푸사리움 옥시스포름 및 푸사리움 솔라니에 대해 항진균 활성을 나타냄을 확인한다(표 2 참조).

본 발명에서는 상기 단백질을 유효성분으로 함유하는 항진균제용 약학적 조성물을 제공하는데, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 단백질이 항진균 활성을 나타내는 병원성 진균들로부터 유발되는 질병, 예를 들어 아스퍼질러스 퓨미가트스 및 아스퍼질러스 플라버스에 의해 유발되는 아스퍼질로시스증, 캔디다 알비칸스에 의해 유발되는 캔디다증, 트리코스포론 베이젤리에 의해 유발되는 사모증을 예방하고 치료하는데 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 약학적 조성물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 단백질에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

상기 단백질의 유효용량은 0.5∼2 mg/kg 이고, 바람직하기로는 0.5∼1 mg/kg 이며, 하루 1회 투여될 수 있다.

이하 본 발명의 내용을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 한다. 단, 본 발명의 권리범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 아스퍼질러스 니가의 배양 및 배양액 제조

본 배양에 사용된 아스퍼질러스 니가는 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에서 분양받았다(수탁번호 KCTC 2025). 포자현탁액의 제조는 0.01% 트윈 20 (Tween 20)으로 분리후, YPD배지(덱스트로즈 2%, 펩톤 1%, 효모추출물 0.5%, pH 5.5)에 희석하여 4℃에 보관하였다. 균체배양을 위해 위에서 준비한 포자현탁액을 YPD액체배지 2ℓ에 접종하고 30℃에서 4일간 진탕배양을 하였다. 이 배양액의 상등액만을 취하여 1M 트리스용액을 써서 pH 7.0으로 보정하고, Amicon YM-30막으로 분자량 30kDa 이하의 용액을 취하여 본 단백질의 분리 정제에 사용하였다.

실시예 2. 아스퍼질러스 니가 배양액으로부터의 항진균 단백질 분리 및 정제

새로운 항진균 단백질을 분리, 정제하기 위하여 CM-세파로즈컬럼(2.3×20㎝)을 0.1M 트리스 완충용액(pH 7.0)으로 평형화시켜 준비하였다. 상기 컬럼에 상기 아스퍼질러스 니가의 배양액 (분자량 30kDa 이하)을 부가한 후, 0.1M 트리스 완충용액(pH 7.0)으로 충분히 씻어 주었다. 그 후 0~1.0M 염화나트륨 구배용액이 포함된 0.1M 트리스 완충용액(pH 7.0) 500㎖로 CM-세파로즈 수지에 결합된 단백질을 분리하였다 (도 1 참조). 이렇게 분리한 단백질들 중 항진균활성을 가지는 분획만 모아서 Amicon YM-3막을 사용하여 분자량 3kDa으로 농축함과 동시에 염화나트륨염을 제거하였다. 이렇게 농축된 용액을 역상 HPLC(C₁₈RP-HPLC : 4.6×250mm)로 분리하여 단일 물질을 확인한 후(도 2 참조), 트리스-글리신 젤 전기영동으로 단일 밴드를 확인하였다(도 3 참조). 상기 정제된 단백질은 동결건조하여 아미노산 서열 분석과 항진균활성 측정에 사용하였다.

실시예 3. 아스퍼질러스 니가의 배양액에서 분리한 항진균 단백질의 분자량 측정 및 아미노산 서열 분석

상기 실시예 2.에서 분리정제한 단백질의 분자량은 MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization) 질량 분석법(Hill, et al., Rapid Commun. Mass Spectrometry, 5: 395, 1991)으로 측정하였다(도 4 참조) : 분리, 정제한 항진균 단백질의 분자량을 측정하기 위하여, 0.1%의 트리플루오로아세트산 (trifluoroacetic acid)에 6.5㎎의 단백질을 녹이고 여기에 2㎕의 70 ㎎/㎖ 시나핀산 (sinapinic acid)을 첨가하여 평면 비활성 금속 탐침 (flat inert metal probe)에 넣고 뜨거운 바람으로 유기용매를 제거시켰다. 이렇게 준비된 시료를 진공 챔버에 옮겨 MALDI-질량분석기 (MALDI-mass spectrometer)로 분자량을 측정하였으며(도 4 참조), 그 결과 분자량이 6582.63으로 확인되었다.

한편 분리, 정제한 항진균 단백질의 아미노산 서열을 결정하기 위하여, 상기 분리된 단백질 20㎍을 50㎕의 4M 구아니딘-염산염 (guanidine hydrochloride)이 함유된 0.2M 중탄산암모늄 (ammonium bicarbonate), pH 8.0 완충용액에 녹인 후, 여기에 45mM 디티오트레이톨 (dithiothreitol) 용액 5㎕를 첨가하여 액체질소를 처리하고 50℃에서 30분간 처리하였다. 단백질에 100mM 요드아세트아미드 (iodoacetamide)를 5㎕ 첨가하고 37℃에서 12시간 처리하였다. 이렇게 하여 생성된 카르복실아미도메틸화단백질을 에드만 분해 (Edman degradition)의 직접 서열분석법 (direct sequencing)에 의하여 아미노 말단으로 부터 46개의 아미노산 서열을 밝혔다 (표 1 참조). 단백질에 60㎕의 물을 첨가한 후, 트립신 (trypsin)과 엔도프로테나제 Glu-C (endoproteinase Glu-C)로 37℃에서 24시간 처리한 후, 효소 반응을 드라이아이스로 중지시켰다. 이렇게 효소 처리된 단백질 단편을 HPLC(Microbe HPLC system ABI172)로 분리 정제한 후, 상기 분리된 펩타이드 단편의 아미노산 서열을 서열분석기(Applied Biosystems 476A protein sequencer)로 밝혔으며 (도 5 참조), 그 결과 아스퍼질러스 니가에서 새로 분리된 항진균 단백질은 시스테인이 6개 포함되어 있고 총 58개의 아미노산으로 구성되어 있는 단백질임을 알 수 있었다(서열 1 참조).

사이클 수	아미노산	수율(pmol)	사이클 수	아미노산	수율(pmol)
1	Leu	281.4	24	His	62.8
2	Ser	15.1	25	Val	69.2
3	Lys	277.4	26	Val	104.0
4	Tyr	188.7	27	Ser	6.6
5	Gly	304.2	28	Cam-Cys^a)	ND^b)
6	Gly	301.4	29	Pro	41.6
7	Glu	214.3	30	Ser	5.3
8	Cam-Cys^a)	ND^b)	31	Ala	31.7
9	Ser	27.8	32	Ala	49.7
10	Leu	3.8	33	Asn	35.3
11	Glu	156.9	34	Leu	26.0
12	His	109.0	35	Arg	43.8
13	Asn	134.2	36	Cam-Cys^a)	ND^b)
14	Thr	32.0	37	Lys	55.0
15	Cam-Cys^a)	ND^b)	38	Thr	23.0
16	Thr	29.0	39	Asp	23.5
17	Tyr	96.5	40	Arg	25.5
18	Arg	109.2	41	His	25.2
19	Lys	235.7	42	His	23.0
20	Asp	79.5	43	Cam-Cys^a)	ND^b)
21	Gly	72.2	44	Glu	7.6
22	Lys	259.8	45	Tyr	70.8
23	Asn	75.2	46	Asp	20.7
^a)Cam-Cys : 카르복실아미도메틸 시스테인^b)ND : 결정되지 않음

실시예 4. 아스퍼질러스 니가의 배양액에서 분리한 항진균 단백질의 항진균 활성측정

본 발명의 항진균 단백질의 항진균 활성을 조사하기 위하여, 균체가 분열되지 않는 최소 펩타이드 농도인 최소 생육 저해농도를 측정하였다.

한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행 (KCTC)에서 분양받은 아스퍼질러스 플라버스 (수탁번호 KCTC 1375), 아스퍼질러스 퓨미가트스 (수탁번호 KCTC 6145), 프사리움 옥시스포럼 (수탁번호 KCTC 6076), 프사리움 솔라니 (수탁번호 KCTC 6326), 사카로마이세스 세레비시아 (수탁번호 KCTC 2805), 캔디다 알비칸스 (수탁번호 KCTC 1940), 트리코스포론 베이젤리 (수탁번호 KCTC 7251) 균주를 YPD (0.5% 효모 추출액, 1% 펩톤, 2% 덱스트로즈)배지에서 세포수를 측정한 후 1×10²의 균체를 100 ㎕ 부피로 YPD배지를 이용하여 희석한 후, 마이크로 타이트레이트 플레이트에 접종한 후 펩타이드를 각각 30, 15, 8, 4, 2 및 1μM씩 첨가하여 28℃에서 30시간 배양한 후 5㎎/㎖ MTT (3-[4,5-Dimethyl thiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide)를 10㎕ 씩, 그리고 10×인산-염화나트륨 완충용액 (PBS ; Phosphate-Buffered Saline, pH 7.0)을 10㎕씩 첨가하여 37 ℃에서 4시간 반응시키고, 30㎕의 SDS 용액(20% SDS, 0.1N HCl)을 첨가한 후 37 ℃에서 12시간 정도 발색시켜 발색정도를 마이크로 플레이트 리드 흡광도 570nm에서 흡광도를 측정하여 최소 생육 저해농도 (MIC)를 측정하였다. 측정 결과를 표 2에 나타내었다.

곰팡이 종류	최소 생육 저해농도 (μM)
아스퍼질러스 플라버스 (Aspergillus flavus)	8
아스퍼질러스퓨미가트스 (Aspergillus fumigatus)	4~8
프사리움 옥시스포럼 (Fusarium oxysporum)	8~15
프사리움 솔라니 (Fusarium solani)	8
사카로마이세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae)	8
캔디다 알비칸스 (Candida albicans)	8~15
트리코스포론 베이젤리 (Trichosporon beigelii)	8~15

상기 측정 결과에 따르면, 본 발명의 항진균 단백질은 사상균 뿐만 아니라 효모에서도 강한 항진균 활성을 나타내었다.

실시예 5. 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

본 발명에서 분리한 단백질의 급성 독성을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명에서 분리한 단백질을 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1g/kg/15ml의 용량으로 단회 경구투여하였다. 시험물질 투여후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 화합물은 모두 랫트에서 1 g/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량 (LD₅₀)은 1 g/kg이상인 안전한 물질로 판단되었다.

따라서, 본 발명에서 분리한 단백질은 항진균성 약학적 조성물의 유효성분으로 사용할 수 있다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 항진균성 단백질은 인체에 무해하다고 알려진 아스퍼질러스 니가가 생산하는 새로운 단백질로서, 서열 1의 아미노산 서열을 가지는 본 발명의 항진균성 단백질은 아스퍼질러스 플라버스, 아스퍼질러스 퓨미가트스, 프사리움 옥시스포럼, 프사리움 솔라니, 사카로마이세스 세레비시아, 캔디다 알비칸스 및 트리코스포론 베이젤리에 대해 항진균 활성을 나타냄으로써, 아스퍼질러스 퓨미가트스 및 아스퍼질러스 플라버스에 의해 유발되는 아스퍼질로시스증, 캔디다 알비칸스에 의해 유발되는 캔디다증, 트리코스포론 베이젤리에 의해 유발되는 사모증에 대한 예방 및 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

아스퍼질러스 니가(Aspergillus niger)에서 분리한 서열 1의 아미노산 서열을 갖는 항진균성 단백질.
제 1항에 있어서, 상기 단백질은 분자량이 6.2~7.0 kDa인 것을 특징으로 하는 항진균성 단백질
제 1항에 있어서, 상기 단백질은 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus), 아스퍼질러스 퓨미가트스(Aspergillus fumigatus), 프사리움 옥시스포럼(Fusarium oxysporum), 프사리움 솔라니(Fusarium solani), 사카로마이세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae), 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 및 트리코스포론 베이젤리 (Trichosporon beigelii)에 대해 항진균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 항진균성 단백질
제 1항의 단백질을 유효성분으로 함유하는 항진균제용 약학적 조성물
제 4항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 아스퍼질러스 퓨미가트스 및 아스퍼질러스 플라버스에 의해 유발되는 아스퍼질로시스증(Aspergillosis), 캔디다 알비칸스에 의해 유발되는 캔디다증, 트리코스포론 베이젤리에 의해 유발되는 사모증을 예방하고 치료하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 항진균제용 약학적 조성물