KR20000060807A - 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치 및 그 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 별도의 시험시스템 및 시료의 처리과정 없이 특정 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 농도를 간편하게 측정하여 동맥경화증세를 조기에 탐지할 수 있도록 하는 단일 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치 및 그 방법에 관한 것으로, 이러한 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치 및 그 방법은 선택된 항원에 대해 특이하게 반응하여 부착하는 항체를 통해 지질단백질을 선택적으로 포획하여 상기 항체와 반응하지 않는 특정 단일 지질단백질을 분리하는 면역분리단계와, 상기 면역분리단계에서 분리된 지질단백질을 파괴하여 방출된 콜레스테롤을 효소반응에 의해 분해하여 상기 콜레스테롤의 농도에 비례한 화합물을 생성하는 효소분해단계와, 상기 효소분해단계에서 생성된 화합물 농도의 비율에 따라 발색신호를 시각적으로 표시하는 신호표시단계로 구성됨으로서 사용이 간편하고 저렴한 비용으로 콜레스테롤의 농도를 측정하여 동맥경화증세를 조기에 판별할 수 있는 효과가 있게 되는 것이다.

Description

혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치 및 그 방법{an apparatus for analyzing cholesterol of plasma lipoprotein and its method}

본 발명은 혈액 내 특정 단일 혈장 지질단백질의 콜레스테롤을 개략적인 농도범위로서 정량할 수 있도록 하는 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치 및 그 방법에 관한 것으로 특히, 별도의 시험시스템 및 시약의 사용없이 간편하게 특정 단일 지질단백질의 콜레스테롤 농도를 측정하여 동맥경화증세를 조기에 탐지할 수 있도록 하는 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치 및 그 방법에 관한 것이다.

일반적으로, 혈장 지질단백질은, 도 1에 도시된 바와 같이, 구형의 입자형태로 존재하며, 그 표면은 인산지방질과 콜레스테롤 그리고 결손지방단백질(apolipoprotein)로 불리우는 막 단백질(membrane protein)로 구성되어 있고, 그 내부는 콜레스테롤에 지방산 한 분자가 결합된 콜레스테릴 에스테르(cholesteryl ester)와 트리아실글리세롤(triglyceride) 분자들로 이루어져 있는 것으로, 이러한 지질단백질에서 수용액에 불용성 성분인 콜레스테롤은 혈장 지질단백질에 의해 조직과 간 사이에 운반되어 그 혈중 농도가 조절된다(참고문헌: M. I. Mackness 등, Lipoprotein Analysis, A Practical Approach, 1992, Page 1-42, IRL Press, Oxford; E. J. Schaefer, Methods for Clinical Laboratory Measurement of Lipid and Lipoprotein Risk Factors, 1991, Page 1-16, AACC Press, Washington DC).

이러한 지질단백질은 그 밀도와 전기영동상에서의 이동성 그리고 지방과 단백질의 상대적인 함량에 따라 크게 초저밀도 지질단백질(VLDL: very low-density lipoproteins), 저밀도 지질단백질(LDL: low-density lipoproteins), 그리고 고밀도 지질단백질(HDL: high-density lipoproteins)의 세 종류로 분류되는 것으로(참고문헌: P. S. Bachorik 등, 1986, Meth. Enzymol. Vol. 129, Page 78-100; M. Nauck 등, 1995, Clin. Chem. Vol. 41, Page 1761-1767), 이를 좀더 구체적으로 설명하면 표 1과 같다.

표 1. 일반적인 사람 지질단백질의 조성과 특성.

지질단백질 분류	밀도(g/mL)	직경(nm)	조성(% 건조 중량)
			단백질	콜레스테롤	인산지방질	트리아실글리세롤
HDL	1.063­1.210	5-15	33	30	29	8
LDL	1.019­1.063	18-28	25	50	21	4
(IDL)	1.006­1.019	25-50	18	29	22	31
VLDL	0.950­1.006	30-80	10	22	18	50

상기 저밀도 지질단백질(LDL)은 세포막의 구성 혹은 스테로이드 호르몬(steroid hormone)의 합성을 위해 콜레스테롤을 조직으로 운반하여 공급하는 것으로, 포화지방산과 콜레스테롤이 높은 식품을 다량 섭취할 경우, 간에서의 저밀도 지질단백질(LDL) 조절기구에 의한 화학대사작용이 감소됨으로서 혈액의 저밀도 지질단백질 콜레스테롤(LDL-C) 농도가 증가된다(참고문헌: E. J. Schaefer, Methods for Clinical Laboratory Measurement of Lipid and Lipoprotein Risk Factors, 1991, Page 1-16, AACC Press, Washington DC). 따라서, 이것은 혈관 벽에 콜레스테롤 분자의 침착을 야기하고, 궁극적으로 심근경색의 원인이 되는 동맥경화(atherosclerosis)를 유발한다(참고문헌: P. S. Bachorik 등, 1995, Clin. Chem. Vol. 41, Page 1414-1420; N. Rifai 등, 1992, Clin. Chem. Vol. 38, Page 150-160).

반면에, 상기 고밀도 지질단백질(HDL)은 조직에 과잉으로 존재하는 과량의 콜레스테롤을 조직에서 간으로 운반하여 제거하는 역수송기작을 담당하기 때문에 동맥경화의 발생확률은 고밀도 지질단백질 콜레스테롤(HDL-C)의 양에 반비례하게 된다(참고문헌: W. J. Johnson 등, 1991, Biochim. Biophy. Acta, Vol. 1085, Page 273-298; A. R. Tall, 1990, J. Clin. Invest., Vol. 86, Page 379-384).

따라서, 심근경색 발병 위험도는 상기 고밀도 지질단백질 콜레스테롤(HDL-C)이 1%씩 증가 할 때마다 2-4% 정도 감소하는 것으로 보고되었다(참고문헌: G. R. Warnick 등, 1995, Clin. Chem., Vol. 41, Page 1427-1433). 또한, 현재까지 연구된 바에 의하면, 저밀도 지질단백질 콜레스테롤(LDL-C)의 증가와 마찬가지로 고밀도 지질단백질 콜레스테롤(HDL-C)의 감소는 심근경색을 일으킬 수 있는 독립적인 요인인 것으로 밝혀져 있다(참고문헌: E. J. Schaefer, Methods for Clinical Laboratory Measurement of Lipid and Lipoprotein Risk Factors, 1991, Page 1-16, AACC Press, Washington DC; Warnick 등, 1995, Clin. Chem., Vol. 41, Page 1427-1433).

이와 같이, 혈액 내 저밀도 지질단백질 콜레스테롤의 증가와 고밀도 지질단백질 콜레스테롤 농도의 감소는 각각 독립적으로 동맥경화증세(심근경색, 뇌졸증 등을 유발)의 발병과 상관관계가 높은 것으로 알려져 있으므로 그 증세를 조기 탐지하여 관리할 수 있도록 콜레스테롤의 농도를 측정하는 시스템의 개발이 요구되고 있는 것으로, 지질단백질 입자의 크기, 표면 전하, 이 두 가지의 특징을 겸한 방법, 밀도, 또는 막 단백질인 결손지방단백질(apolipoprotein)의 구조 등의 차이에 바탕을 두고, 혈액 내 저밀도 지질단백질 콜레스테롤(LDL-C) 또는 고밀도 지질단백질 콜레스테롤(HDL-C)의 농도를 측정하는 여러 방법이 제안되었다(참고문헌: M. I. Mackness 등, Lipoprotein Analysis, A Practical Approach, 1992, Page 1-42, IRL Press, Oxford; P. S. Bachorik 등, 1995, Clin. Chem. Vol. 41, Page 1414-1420; N. Rifai 등, 1992, Clin. Chem. Vol. 38, Page 150-160).

그러나, 상기와 같이 콜레스테롤을 측정하는 방법들은 특정 지질단백질의 콜레스테롤 농도를 측정하기 앞서 측정의 신뢰성을 높이기 위해 상기 지질단백질의 분리가 별도의 공정에 의해 미리 선행되어야만 함으로서 측정작업이 번거롭게 될 뿐만 아니라 그에 따라 작업공정이 늘어나게 되는 문제점이 있었다.

따라서, 상기와 같은 문제점을 해결할 수 있도록 고밀도 지질단백질 콜레스테롤(HDL-C)인 경우 별도의 분리공정 없이 액상에 존재하는 각 지질단백질의 특성차이를 이용하여 콜레스테롤 분해효소가 고밀도 지질단백질(HDL)과 선택적으로 반응하도록 조건을 설정함으로써 그 입자 내에 포함된 콜레스테롤 농도를 정량할 수 있게 되었다(참고문헌: H. Sugiuchi 등, 1995, Clin. Chem., Vol. 41, Page 717-723; M. Nauck 등, 1996, Clin. Chem., Vol. 42, Page 424-429).

그러나, 이와 같은 콜레스테롤 측정방법은 혈구의 분리 등 시료의 전처리가 필요할 뿐만 아니라 효소반응의 결과인 액체상의 색 변화를 측정하기 위해 스펙트로포토미터를 사용해야 하는 숙련된 기술을 필요로 함으로서 가정에서나 또는 의사진료실에서 간편하게 실시할 수 없게 되는 문제점이 있었다.

본 발명의 목적은 상기와 같은 종래의 문제점을 해소하기 위한 것으로, 특히, 별도의 시험시스템 및 시료의 처리과정 없이 특정 단일 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 농도를 일련되게 측정하여 동맥경화증세를 조기에 간편하게 탐지할 수 있도록 하는 단일 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치 및 그 방법을 제공함에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치 및 그 방법은 선택된 항원에 대해 특이하게 부착하여 반응하는 항체를 통해 특정 지질단백질들을 선택적으로 포획하여 상호 분리한 후, 포획되지 않고 분리된 특정 단일 지질단백질의 콜레스테롤 농도에 비례하는 발색신호를 효소학적으로 발생시켜 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 농도를 개략적으로 정량할 수 있도록 하는 것을 특징으로 하는 것이다.

또한, 본 발명은 면역분리를 위해, 저밀도 지질단백질(LDL)과 초저밀도 지질단백질(VLDL)의 표면에 존재하는 결손지방단백질(apolipoprotein 혹은 줄여서 apo) B100에 특이하게 반응하는 단일클론 항체(부착상수 = 5x10¹⁰L/mol)와 streptavidin과 화학중합시킨 중합체를 지질단백질 입자와 반응시킴으로서 SA-biotin 반응에 의해 혈장 지질단백질을 선택적으로 포획하여 포획되지 않은 특정 혈장 지질단백질 입자내의 콜레스테롤(HDL-C) 농도에 비례한 발색신호가 연속적으로 발생될 수 있도록 하는 것을 특징으로 하는 것이다.

도 1은일반적인 지질단백질의 구성을 보인 일부 절개사시도.

도 2는본 발명의 콜레스테롤 측정장치의 구성을 개략적으로 보인 것으로,

도 2a는 사시도이고,

도 2b는 측면예시도이다.

도 3은 본 발명 콜레스테롤 측정장치의 일련된 정량과정을 보인 것으로,

도 3a는 혈장 지질단백질이 포함된 시료를 흡수하는 과정을 보인 것이고,

도 3b는 흡수된 지질단백질에서 HDL을 선택적으로 투과시켜 분리하는 과정을 보인 것이고,

도 3c는 분리된 HDL을 분해하여 콜레스테롤을 발생시키는 과정을 보인 것이고,

도 3d는 발생된 콜레스테롤을 효소분해하여 과산화수소를 생성하는 과정을 보인 것이고,

도 3e는 생산된 과산화수소와 결합하여 콜레스테롤의 농도에 비례한 신호를 발생하는 과정을 보인 것이다.

도 4는 도 3b의 분리과정의 또 다른 실시예를 보인 예시도.

도 5는 본 발명의 측정방법을 보인 블록도.

도 6은 본 발명의 혈장 지질단백질 콜레스테롤에 대한 농도응답.

도 7은 본 발명 시료첨가방식의 차이에 따른 응답을 비교한 예시도.

도 8은 본 발명 분리과정의 면역분리방법을 비교한 예시도.

도 9는 본 발명 streptavidin-biotin 면역분리방법에서 항체의 존재유무에 따른 포획능력을 보인 예시도. 항체가 존재할 때의 포획효율은 항체가 없을 때의 경우와 비교하여 감소된 신호 백분율로써 예측된다.

도 10은 본 발명의 HDL 콜레스테롤에 대한 면역 크로마토그래피 분석의 선택성을 보인 예시도. 혈장 지질단백질의 분리는 항체가 없는 경우와 존재하는 경우 각 측정시스템에 지질단백질 혼합물을 가하여 측정한다. HDL 콜레스테롤 측정 선택성은 항체가 존재하는 경우와 단지 HDL 만이 포함된 시료에 대한 농도응답들을 비교하여 결정한다.

＜도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명＞

100:항체패드부재 200:효소분해패드부재

300:신호발생패드부재 400:흡수패드부재

이하, 상기와 같이 구성된 본 발명에 대해 단일 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치 및 그 방법의 기술적 사상에 따른 실시예를 들어 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 선택된 항원에 대해 특이하게 부착하여 반응하는 항체를 통해 특정 혈장 지질단백질들을 선택적으로 포획하여 상호 분리한 후, 포획되지 않고 분리된 특정 단일 지질단백질의 콜레스테롤 농도에 비례하는 발색신호를 효소학적으로 발생시켜 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 농도를 개략적으로 정량할 수 있도록 하는 측정수단(1)이 구비된 것으로, 이를 좀더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

`

표 2. 지질단백질의 결손단백질

결손단백질	분자량	혈장농도 (mg/100mL)	분포
A-Ⅰ	28,300	90-120	HDL
A-Ⅱ	8,700	30-50	HDL
B-100	500,000	80-100	LDL, VLDL
C-Ⅰ	7,000	4-7	VLDL, HDL
C-Ⅱ	8,800	3-8	VLDL, HDL
C-Ⅲ	8,800	8-15	VLDL, HDL
D	32,500	8-10	HDL
E	34,100	3-6	VLDL, HDL

상기 효소분해단계(ST20)는 다음과 같은 과정을 수행한다.

CE

Cholesteryl ester + H₂O -------＞ Cholesterol + Fatty acid(a)

CO

Cholesterol + O₂-------＞ Cholesten-4-one + H₂O₂(b)

또한, 상기 신호표시단계(ST30)는 생성된 과산화수소가 신호발생패드부재(300)로 운반되어져 발색기질(chromogen)의 존재 하에서 다음과 같이 효소 HRP와 반응한다.

HRP

H₂O₂+ Chromogen (무색) ------＞ Oxidized chromogen (발색) + 2 H₂O(c)

이러한 반응의 결과로써, 무색의 발색기질은 산화되어 발색을 띄게되며 이 변색은 신호발생패드부재의 멤브레인 표면에 신호로써 나타나게 되는 것으로(도 3 참조), 이와 같이 형성된 발색의 세기는 분석물질인 고밀도 지질단백질 콜레스테롤(HDL-C) 농도에 비례하므로 표준발색대조표와 비교하여 콜레스테롤의 농도를 반정량하거나 또는 광학센서(예: reflective photometry)를 이용하여 발색정도를 광학밀도(optical density)로 측정하여 정량할 수 있게 된다.

상기와 같이 구성되어 콜레스테롤을 측정하는 본 발명은 연속적인 생물학적 반응에 의한 총 분석시간은 약 10분 이내이고 발색된 결과는 장기간 보존할 수 있다. 이와 같은 면역 크로마토그래피 분석법은 항체패드부재(100) 상에 적절한 특이성을 지닌 항체를 고정화시켜 사용함으로써 고밀도 지질단백질 콜레스테롤(HDL-C) 뿐만 아니라 저밀도 지질단백질 콜레스테롤(LDL-C)과 같은 어떠한 단일 혈장 지질단백질 콜레스테롤의 측정에 적용될 수 있는 일반성을 지닌다.

상기와 같이 구성된 측정방법은, 도 3에 도시된 바와 같이, 멤브레인 세공을 통한 수용액의 모세관현상에 의해 유발되는 물질전달현상에 의해 제각기 다른 기능을 갖는 패드부재들 상에서 각 반응공정이 시약의 가감없이 순차적으로 진행된다.

다음은 상기와 같이 구성된 본 발명에 대해 실시예를 통해 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.

실시예 1: 면역분리

면역분리단계에서 특정 혈장 지질단백질의 분리는, 도 2에 도시된 바와 같이, 제거할 지질단백질에 특이한 항체를 고체상에 고정화시켜 항원-항체 반응에 의해 다른 지질단백질들을 포획함으로써 성취될 수 있는 것으로, 항원과 항체가 부착하여 결합하는 면역반응에 의한 포획율은 주로 항체의 부착상수와 면역글로불린(immunoglobulin)상의 항원부착자리에 대한 항원분자의 접근성에 의존된다(참고문헌: W. Schramm과 S.-H. Paek, 1992, Anal. Biochem., Vol. 205, Page 47-56). 이와 같은 면역분리를 위해 선택되는 항체(단일클론 혹은 복합클론)는 일반적으로 높은 부착상수를 갖도록 선별되어 사용되므로 항체의 부착상수는 변수로부터 제외될 수 있다. 따라서 항체에 대한 특정 항원분자의 접근성이 높도록 분석시스템의 설계 그리고 반응물질의 배열 시 신중히 고려되어야 한다. 반응물질들 간의 결합정도를 조절하는 접근성은 항원의 크기와 항체의 고정화방법에 의해 크게 영향을 받는다(참고문헌: R. S. Matson과 M. C. Little, 1988, J. Chromatogr., Vol. 458, Page 67-77; W. Schramm과 S.-H. Paek, 1992, Anal. Biochem., Vol. 205, Page 47-56). 특히 혈장 지질단백질 중 저밀도 지질단백질(LDL)과 초저밀도 지질단백질(VLDL) 입자의 크기는 직경이 주로 19-45 nm 범위인데 이것은 다른 일반 단백질과 비교했을 때 10배 더 크며 부피로 따지면 1000배가 더 크다. 이렇게 크기가 거대한 항원은 고정화된 면역글로불린(immunoglobulin)의 파라토프(paratope; 항원부착자리)에 접근하기가 용이하지 않게 되므로 아래와 같은 다양한 고정화 방법들을 연구하였다.

실시예 2: 항체고정화 방법

멤브레인 표면상에 항체의 고정화방법은 일반적으로 물리적 방법과 화학적 방법으로 나눌 수 있다. 물리적 방법은 멤브레인 표면과 단백질분자 간의 소수성 상호작용(hydrophobic interaction)을 이용한 물리흡착에 의해 항체를 고정화시키는 방법으로, 이러한 방법은 수행과정이 비교적 간단한 장점이 있는 반면에 고정화된 항체분자가 수용액에 포함된 성분들(예를 들어, 계면활성제, 흡착력이 강한 단백질 등)에 의해 탈착될 수 있는 잠재성을 내포한다. 반면, 화학적 방법은 멤브레인 표면에 기능성그룹을 도입시키고 이 그룹을 단백질의 기능성그룹(주로, amino 그룹, carboxyl 그룹, 혹은 sulfhydryl 그룹)과 화학반응 시키는 방법으로써 과정은 비교적 복잡하지만 매우 안정된 항체고정화를 성취할 수 있다(참고문헌: S. S. Wong, 1991, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press, London).

상기에서와 같은 항체 고정화방법은 모체인 멤브레인의 성질 그리고 항원의 분자크기 및 궁극적으로 항체와의 반응특성을 고려하여 수행되어야 한다. 강한 소수성 성질을 지닌 멤브레인(니트로셀루로우즈와 PVDF 재질)의 경우 물리흡착에 의한 단백질 고정화는 별도의 처리없이 간단히 수행될 수 있지만, 화학적 방법은 기능성그룹을 지닌 화학성분의 전처리가 요구되거나, 또는, 고체표면에 이미 반응될 수 있는 잔기를 제공하는 멤브레인(nylon 혹은 활성화된 재질)을 선택하여 단백질을 화학반응 시킬 수 있다. 그러나 항체분자를 직접 고체표면에 고정화시킬 경우 그 분자상의 항원부착자리는 단지 몇 개의 아미노산으로 구성된 매우 작은 부위로써 쉽게 가려지거나(steric hindrance; 위치적 장애), 구조적 변화(conformational change)에 의해 항원-항체 반응성이 손상될 수 있다. 이와 같은 항체분자의 반응성을 최대로 유지시키기 위해 스페이서(spacer; polyamino acid 등)를 매개로 고정화시키는 방법의 개발이 요구될 수 있다. 또한, 고정화된 항체와 항원간의 반응특성은 사용된 반응성분에 따라 매우 독특하여, 고정화방법은 그 성분들의 특정반응/비특정반응 비(signal-to-noise ratio)가 최대가 되도록 선택되어야 한다. 참고로, 이와 같은 면역반응특성은 멤브레인의 잔여표면처리와 시료운반에 사용되는 완충용액의 화학적조성에 의해 변화될 수 있다(참고문헌: 백세환 등, 1996, 한국생물공학회지, 제11권, 420-430쪽).

실시예 3: Streptavidin-biotin 포획시스템

고체상에 고정화된 항체와 지질단백질 입자간의 면역반응에 의한 결합은, 상술한 바와 같이, 제한적일 수 있기 때문에 효율적인 면역결합체 형성을 위해 액체상에서의 반응이 고려될 수 있도록 항체패드부재(100) 상의 항체분자 대신에 멤브레인 표면에 고정화되는(도 2 참조) 우혈청 알브민(BSA: bovine serum albumin)과 화학결합된 비오틴 중합체(BSA-biotin)와, 제거될 지질단백질 입자에 특이한 항체(antibody)와 streptavidin 간의 공유결합된 중합체(Ab-SA)의 두 구성성분이 추가될 수 있다. 특정 지질단백질의 면역분리를 위해(도 4 참조) 먼저 시료와 Ab-SA 중합체를 혼합하여 일정시간 액체상에서 항원-항체 반응시킨 후, BSA-biotin이 고정화된 패드 내로 흡수시킨다. 상기 패드를 통과하는 동안 알려진 생물학적 반응 중 가장 높은 부착상수(10¹⁵L/mol)를 갖는 streptavidin-biotin 반응이 패드 고체표면에서 일어나게 됨으로서 효과적인 지질단백질의 제거가 수행될 수 있다. 이때, 상기 비오틴(biotin)은 분자량 244 Da 정도인 vitamin의 한 종류(vitamin B12)로써 단백질인 avidin(달걀 흰자위 내 존재, 분자량 67,000 Da) 혹은 그와 생물학적 특성은 유사하지만 미생물로부터 생산되는 streptavidin과 특이하게 반응하며, 두 단백질 중 streptavidin이 다루기 쉬운 생화학적 특성 때문에 비오틴(biotin)의 반응물질로써 좀 더 널리 선택된다. 비오틴(biotin)과 streptavidin간 반응 친화력은 현존하는 생물학적 반응 중 가장 높은 것으로 알려져 있고, 따라서 이 반응은 항체와 효소 등을 고체표면에 안정적으로 고정화하거나 액상에 존재하는 특정성분을 포획하기 위해 이용된다.

상기에서와 같이, 액체상에서 반응된 항체와 지질단백질 입자간의 결합체를 고체상에 포획함으로써 성취된 특정 지질단백질 입자의 효과적인 제거는 streptavidin-biotin 반응의 높은 부착상수 외에 제시된 포획시스템이 갖는 몇 가지 긍정적인 특징에 기인한다. 우선, 항원-항체 반응이 액체상에서 수행되어지기 때문에 항체에 대한 특정 지질단백질 입자의 접근성이 현저히 향상될 수 있을 것으로 예측된다. 둘째로, 면역글로불린(immunoglobulin)에 중합된 streptavidin의 비오틴(biotin) 부착자리 수는 일반적으로 한 개 이상이 반응에 참여할 수 있고 따라서 streptavidin-biotin 반응확률은 단일 상호작용의 경우와 비교하여 매우 증가된다. 이 조건은 특히 비평형상태 하에서 운영되는 면역 크로마토그래피 환경에서 면역결합체의 포획을 위해 요구되어질 것으로 예측된다. 마지막으로, 포획능력은 BSA-biotin 중합체 내 두 분자들 사이의 길고 유연한 화학 연결구조에 의해 향상된 것으로 판단된다.

본 발명의 유용성에 대한 예를 실시하기 위해 구입된 주요 재료들은 다음과 같다. 사람 체내의 VLDL(200 mg/dL 콜레스테롤 포함), LDL(470 mg/dL 콜레스테롤 포함), HDL(280 mg/dL 콜레스테롤 포함), apo B100(＞ 95% purity), CE(미생물로부터 생산, 160 units/mg; EC 3.1.1.13), CO(Nocardia 종으로부터, 16.6 units/mg; EC 1.1.3.6.), HRP(265 units/mg; EC 1.11.1.7.), 그리고 streptavidin(15.2 units/mg)이 Calbiochem 사(미국)로부터 구입되었다. 3,3'-Diaminobenzidine(DAB), poly-L-lysine hydrobromide(MW 53,700; PLL), bovine serum albumin(heat shocked, fraction V powder, minimum 98% purity; BSA), ethylenediamineteraacetic acid(EDTA), Sephadex G-15, 그리고 Sephadex G-100 젤이 Sigma 사(미국)로부터 구입되었다. Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido) hexanoate(NHS-LC-biotin), sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl]cyclohexane-1-caboxylate(SMCC), dithiothreitol(DTT), 그리고 N-succinimidyl-3-[2-pyridyldithil] propionate(SPDP)가 Pierce 사로부터 공급되어졌다. 니트로셀루로우즈 멤브레인(5μm와 20μm 세공크기)과 셀루로우즈 멤브레인(Qualitative #1과 3MM 크로마토그래피 급)이 Millopore 사와 Whatman 사(미국)로부터 각각 공급되었다. 그 외 다른 모든 시약들은 분석용급으로 사용되었다.

실시예 4: 단일클론 항체의 생산

Apo B100 50 μg을 생후 6주된 BALB/c 생쥐의 복강에 2주 간격으로 4번(총 6주) 나누어서 주사하였다. 처음 주사할 항원은 complete Freund's adjuvant에 그리고 두 번째와 세 번째에 주사할 항원은 incomplete Freund's adjuvant에 용해시켰고, 마지막 항원은 140 mM NaCl이 포함된 10 mM 인산완충식염수(PBS: phosphate buffered saline, pH 7.4)에 녹여 주사하였다. 생쥐의 체내에 항체가 생산되어진 후에, 면역화된 생쥐의 비장에서 림프구를 얻었고 이것을 polyethylene glycol 존재 하에서 SP2/0 골수종(myeloma)세포와 융합하였다. 항체를 생산하는 세포주의 선별은 Koler 방법을 따라 수행하였다(참고문헌: G. Koler와 C. Milstein, 1975, Nature, Vol. 256, Page 495-497). 선별과정을 간략히 소개하면 다음과 같다. 첫째로, microwell 내부에 1 μg/mL 혈장 지질단백질(VLDL, LDL, 또는 HDL) 100 μL을 가하여 그 표면에 고정화하였다. 둘째로, 0.5% (w/v) casein이 포함된 인산완충식염수(PBS: phosphate buffered saline) 200 μL을 첨가하여 잔여표면 처리를 수행하였다. 셋째로, 세포배양액 100 μL을 가하여 지질단백질과 항체간 반응을 유도한 후 여기에 0.5% (w/v) casein과 0.1% (v/v) tween-20이 포함된 인산완충식염수(PBS)로 희석된 HRP-항 생쥐 염소항체 중합체를 가하여 반응시켰다. 마지막으로, 발색물질 3,3',5,5'-tetramethyl benzidine이 포함된 HRP 기질용액을 가하여 발색신호를 발생시켰다. 처음 3단계는 37℃에서 1시간 동안 수행하였고 남아있는 과량의 반응물질은 탈이온수로 닦아내었다. 저밀도 지질단백질(LDL) 및 초저밀도 지질단백질(VLDL)에 특이적이고 부착상수(약 5x10¹⁰L/mol)가 높은 항체를 발현하는 세포클론을 선택하였고 쥐의 복강 내 세포배양에 의해 단일클론 항체를 생산하였다. 마지막 과정으로, 생산된 항체는 Protein G 칼럼으로 정제되었다(참고문헌: G. T. Hermanson, 1992, Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, New York).

실시예 5: 분석시스템의 제조 및 발색신호 발생

시료 내 총 콜레스테롤 양에 비례하는 신호를 발생시키기 위해 분석시스템은 다음과 같은 네 쪽의 멤브레인 스트립 패드로 구성되었다(도 2 참조).

시료첨가패드부재(항체패드 대용). 니트로셀루로우즈 멤브레인(5 μm 세공크기, 5x15 mm)의 전처리를 위해 10% 메탄올에 15분 동안 담근 후 탈이온수로 3번 닦아내었다. 이 멤브레인 표면을 2% BSA가 포함된 인산완충식염수(PBS)에 1시간 담그어 처리한 후 세척한 다음 상온에서 건조하였다.

효소분해패드부재. 반응물들을 첨가하기 전에 셀루로우즈 멤브레인(Qualitative #1, 5x10 mm)을 앞서 언급한 것과 같이 메탄올에 담그어 전처리 하였다. 30분 건조 후 이 멤브레인에 염소산나트륨(sodium cholate)용액을 첨가하였고 다시 건조하였다. 인산완충식염수(PBS)를 이용하여 제조된 CE와 CO의 혼합액을 처리된 멤브레인 상에 가하여 축적하였고 100% 습도가 유지되는 상자 내에서 30분 동안 배양하였다. DAB 용액과 발색 강화제로써 선택된 NiCl₂와 CoCl₂의 혼합용액을 패드의 상부에 각각 첨가하였고, 마지막으로 상온에서 30분 동안 건조시킴으로써 효소분해패드부재를 제조하였다. 분석시스템으로부터 발생된 신호세기에 대해 최적화된 시약들의 농도는 표 3에 정리된 바와 같다.

표 3. 효소분해패드 제조를 위해 실험적으로 결정한 각 구성성분의 최적조건.

효소분해패드 구성성분	최적조건	각 성분의 기능
패드 소재	셀루로우즈 멤브레인, 5x10 mm (Whatman Qualitative #1)	고정화 모체
콜레스테롤 분해효소 (CE와 CO)	5 mg/mL 총 효소 6 μL (CE:CO의 무게비로 1:2 혹은 unit 비율로 1:5)	콜레스테롤과 그 에스테르 유도체의 효소 분해
계면활성제(염소산나트륨)	5% (무게/부피) sodium cholate 6 μL	지질단백질 입자 파괴
발색물질 (DAB)	25 mg/mL DAB 1 μL	효소 HRP의 발색기질
발색 보조물질(Metals,Co와 Ni)	2% 금속물질 (Co와 Ni)2.5 μL (동일 무게비)	산화된 DAB의 발화제

효소분해패드부재(200)의 최종 목적은 지질단백질 콜레스테롤을 효소반응에 의해 과산화수소로 변환시키고 또한 신호발생에 필요한 발색물질을 제공해 주는 것이다. 이를 위해, 상기 효소분해패드부재(200) 내에 지질단백질 입자를 파괴시키는 계면활성제, 콜레스테롤을 분해시키기 위한 CE와 CO 두 개의 효소, 그리고 신호발생패드부재에 위치한 HRP의 발색기질이 포함되었다. 계면활성제로써 염소산나트륨(sodium cholate)이 선택되어졌는데 이는 기존에 사용되어져 왔던 Triton X-100 보다 신호수율이 더 좋은 것으로 나타났다. HRP의 효소반응을 위한 발색물질로써, 멤브레인 세공을 통한 이동성과 발생된 신호세기를 평가한 후에 DAB를 선택하였다. DAB에 의해 발생된 색의 세기는 두개의 metal, 즉 코발트와 니켈의 존재 하에서 더욱 강화되어졌다(참고문헌: S.-M. Hsu와 E. Soban, 1982, J. Histochem. Cytochem., Vol. 30, Page 1079-1082).

신호발생을 위한 다른 접근방법으로써, 본 발명자들은 멤브레인 표면에 CE와 CO를 고정화하여 고체상에서 효소반응이 수행되도록 시스템을 고안하였다. 이는 구성물질의 재사용율을 높일 목적으로 시도하였고 특히 값이 비싼 두 효소에 대해 경제적일 것으로 추정되었다. 그러나 이 방법에 있어서 반응에 참여하는 효소의 총량은 멤브레인의 표면적에 의해 제한되었고 따라서 분석민감도(측정 하한 농도로써 정의)는 위에서 설명된 효소분해패드부재를 이용하는 시스템과 비교하여 저하되었다.

신호발생패드부재(300): 메탄올로 전처리된 니트로셀루로우즈 멤브레인(20 μm 세공크기, 5x20 mm)을 인산완충식염수(PBS)로 3번 세척하였다. 1시간 동안 상온에서 건조한 후 멤브레인 스트립 하단으로부터 8 mm 되는 부위에 인산완충식염수(PBS)를 이용하여 제조된 275 units/mL HRP 용액을 1.5 μL 흡수시켰고 공기 중에서 건조하였다.

흡수패드부재(400): 모세관현상에 의해 유발되는 용액의 흐름을 계속 유지시키기 위해 시스템의 최상단에 흡수대로써 셀루로우즈 멤브레인(3MM 크로마토그래피 급, 5x30 mm)이 사용되어졌다.

시스템 구성 및 농도응답. 위에서 제조된 패드부재들을 얇은 플라스틱 필름 상에 서로 다른 멤브레인 패드들의 상단과 하단을 부분적으로 포갠 후 양면 테이프를 이용하여 부착하였다(도 2 참조). 이와 같이 제조된 스트립 시스템 하단을 표준농도로 제조된 소 혈장 지질단백질 10 μL가 포함된 microwell 내에 담가 세워 놓았다. 시료가 시스템 내로 완전히 흡수된 후, 50 mM acetate 완충용액(pH 5.1) 40 μL를 첨가하여 시료가 스트립을 따라 계속 이동되도록 하였고 총 분석 시간은 약 10분 정도로 조절하였다. 발색신호가 발생된 멤브레인의 이미지를 스캐너(Epson, Model GT-5000)와 컴퓨터에 내장된 프로그램을 이용하여 포착하였다. 포착된 이미지 상의 발색신호는 컴퓨터 프로그램(2D Archives Programs, Advanced American Biotechnology, Fullerton, CA)을 이용하여 흡광도로 전환되었다.

최적 조건하에서 제조된 스트립 시스템은 지질단백질 콜레스테롤의 표준농도에 대한 신호응답을 얻음으로써 평가되었다 (도 6). 콜레스테롤 20-200 mg/dL 농도 범위에서의 발색신호는 콜레스테롤 농도에 비례하였고 더욱이 각 농도에서의 신호세기 차이는 육안으로 식별이 가능하였다. 20 mg/dL 콜레스테롤에서의 신호는 콜레스테롤 부재 하에서의 신호(잡음신호)보다 현저히 높았고 따라서 제조된 시스템의 측정하한 농도는 20 mg/dL 보다 더 낮은 것으로 나타났다. 혈장 지질단백질 콜레스테롤 양은 일반적으로 고밀도 지질단백질 콜레스테롤(HDL-C)의 경우 20-70 mg/dL이며 저밀도 지질단백질 콜레스테롤(LDL-C)의 경우 100-200 mg/dL 사이에 분포한다. 그러므로, 고안된 분석시스템은 동맥경화의 발생확률을 수치적으로 측정하는데 이용되어질 수 있을 것으로 판단된다.

실시예 6: 신호발생에 대한 시료운반 효과

고안된 분석시스템은 시료 내 콜레스테롤과 두 분해효소(CE와 CO) 사이의 화학적 평형에 따라 신호를 발생시키므로 분석물질의 초기농도가 다를 경우 첨가된 총 양은 일정하더라도 발생된 신호세기는 변화될 것으로 예측되었다. 따라서, 시스템에 시료와 운반용액을 순차적으로 첨가하는 방법과 두 종류의 용액을 혼합하여 첨가하는 방법을 비교하였다(도 7). 시료를 시스템에 완전히 흡수시킨 후 운반용액을 순차적으로 첨가한 경우, 시험된 콜레스테롤 농도범위에서 직선형태의 농도응답곡선이 얻어졌다. 반면에, 혼합용액을 첨가한 경우 그 곡선은 오른쪽으로 이동되었으므로 순차적 첨가방법과 비교하여 민감도가 감소된 것으로 나타났다.

실시예 7: 항체패드부재의 제조

항체패드부재(100)를 제조하기 위해 저밀도 지질단백질(LDL)과 초저밀도 지질단백질(VLDL) 입자표면에 존재하는 단백질인 apo B100에 특이적인 단일클론 항체를 물리흡착이나 화학적 방법을 이용하여 니트로셀루로우즈 멤브레인(5 μm pore size, 5x15 mm) 표면에 고정화하였다. 물리흡착의 경우, 앞서 수행한 것처럼 멤브레인을 메탄올로 전처리 하였고 1 mg/mL 항체를 스트립 당 4 μL 씩 첨가한 후 100% 습도가 유지되는 상자에 넣어 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 멤브레인의 잔여표면은 2% (w/v) BSA가 함유된 인산완충식염수(PBS) 내에서 1시간 동안 처리되었다. 이 멤브레인은 탈이온수로 3번 세척되었고 상온에서 건조되었다. 화학적 고정화의 경우, 우선 멤브레인을 0.5% (v/v) glutaraldehyde 용액에 1시간 동안 담가 처리한 후 인산완충식염수(PBS)로 세척하였다. 공기건조 후, 1 mg/mL PLL을 한 스트립 당 5 μL 씩 첨가 한 후 상온에서 1시간 배양하였다. 미반응된 잔여 PLL을 제거하기 위해 다시 인산완충식염수(PBS)로 세척 한 후 건조하였다. 항체분자 상에 반응기를 생성시키기 위해 NaIO₄(최종 농도 30 mmol/L)를 이용하여 30분 동안 반응시켰고, 이렇게 하여 산화된 항체 5 μL를 미리 건조시킨 PLL이 함유된 스트립에 흡수시킨 후 100% 습도가 유지되는 상자 내에서 1시간 동안 반응을 수행하였다. 이 멤브레인을 2% (w/v) BSA와 NaCNBH₃(최종 농도 5 mmol/L)가 포함된 인산완충식염수(PBS)에 담가 반응시킨 후 0.1% tween-20이 포함된 Tris 완충용액(pH 7.6)으로 씻어 내었고 마지막으로 공기 중에서 건조시켰다.

실시예 8: 항체패드부재(100)를 이용한 혈장 지질단백질의 면역분리

항체 고정화방법 간의 효율성을 평가하기 위해서, 도 2에 도시된 바와 같이, 항체패드부재(100)를 이용하여 제조된 분석시스템에 단지 저밀도 지질단백질(LDL) 만이 포함된 시료를 첨가하였고, 상기 항체패드부재(100) 내에서의 부착반응 정도는 항체가 없는 경우에 얻어지는 대조부(control; 항체 부재, 도 8)와 비교하여 신호의 감소량을 측정함으로써 결정되었다. 항체패드부재로 구성되어진 면역 스트립을 여러 콜레스테롤 농도로 희석된 저밀도 지질단백질(LDL) 5 μL가 있는 microwell 내에 세워 위치시켰다. 시료가 완전하게 흡수되어진 후, acetate 완충용액(초기 pH 5.1)에 100 mM Na₂HPO₄용액을 가하여 pH 6.0으로 적정한 운반용액 40 μL를 지질단백질이 스트립을 따라 위로 이동되어 질 수 있도록 각 well에 넣어주었다. 스트립 상의 신호발생패드부재(300)에 나타난 발색은, 상술한 바와 같이, 광학 밀도(optical density)로 수치화되었다.

실험결과로부터, 항체가 물리흡착에 의해서 패드 상에 고정화되었을 경우 신호감소의 정도는 현저히 감지되지 않았다(물리흡착, 도 8). 고정화된 항체분자의 유연성을 향상시키기 위해서 고정화 매개물질로 폴리 L-라이신(PLL: poly L-lysine)을 선택하였고 그 고분자 섬유체(polymer strand)상에 항체를 화학적으로 결합시켰다(화학적 고정화, 도 8). 이 방법에서 지질단백질 입자가 소량(40 mg/dL 이하)인 경우 부착반응이 탐지되었지만 그 보다 증가된 농도범위의 지질단백질(100 mg/dL 이상)에 대해서는 수용능력이 충분하지 못한 것으로 나타났다.

본 발명자들은 또한 용액 내 첨가될 항체농도를 변화시키거나 혹은 라텍스(Latex) 입자를 이용한 고정화 방법을 도입함으로써 그 표면밀도를 증가시켰다. 그러나 이러한 노력에도 불구하고 포획율의 뚜렷한 향상은 나타나지 않았다. 항원과 항체간 부착 결합체의 양은 일반적으로 항체의 표면밀도에 비례하여 증가하지만 곧 항원크기에 따라 결정되는 상한선에 도달하게 된다. 혈장 지질단백질 입자처럼 크기가 매우 클 경우, 도달될 수 있는 부착 결합체의 상한농도는 비교적 낮고 따라서 그 농도에 있어서의 작은 변이는 인지되지 않을 수 있다. 따라서, 결합체 농도를 증가시키기 위한 또 다른 접근으로써 상기 패드를 세공크기가 더 작은 멤브레인으로 대치시키거나 패드길이를 늘리는 방법이 시도되었지만 이러한 방법들은 이동하는 입자와 멤브레인 표면 사이에 저항을 증가시키므로 분석시간의 연장이 초래되었다. 지금까지의 결과를 종합하면, 패드 상에 고정화된 항체를 이용할 경우 임상농도 범위(200 mg/dL까지) 내에 존재하는 저밀도 지질단백질(LDL)의 효율적인 제거는 매우 어려운 것으로 나타났다.

실시예 9: 비오틴(biotin) 패드부재 제조

BSA와 40배 과잉 몰농도의 NHS-LC-biotin을 인산완충식염수(PBS)에서 반응시켰고, 여기서 얻어진 중합체(BSA-biotin)는 Sephadex G-15 젤 칼럼으로 정제하였다. 화학적 부동화방법을 이용한 항체패드부재의 제조 시와 동일하게, 니트로셀루로우즈 멤브레인을 glutaraldehyde로 처리한 후 1 mg/mL 농도의 BSA-biotin 5 μL를 흡수시켜 100% 습도가 유지되는 상자 내에서 1시간 배양한 후 BSA로 표면처리를 수행하였다.

실시예 10: 항체-streptavidin 중합체 제조

Apo B100에 특이적인 항체(실시예 4 참조)를 100 mM NaCl이 포함된 100 mM 인산완충식염수(PBS: phosphate buffered saline, pH 7.0; 중합용액)로 투석하였다. 항체는 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 용해되어 있는 SMCC(20배 몰농도 과잉)와 4℃에서 4시간 반응시킴으로써 활성을 띠게 하였다. 과량의 SMCC는 Sephadex G-15 칼럼을 이용하여 제거되었다. Streptavidin은 5 mM EDTA가 함유된 중합용액에 용해시켰고 DMSO에 용해된 몰 농도가 2배 더 높은 SPDP와 상온에서 1시간 반응시켰다. 활성을 위해서 DTT(최종 100 mM)를 반응 혼합액에 첨가하여 37℃에서 2시간 반응시켰다. 과량의 시약들은 Sephadex G-15 칼럼을 이용하여 제거되었다. 두 종류의 활성화된 반응물질 즉, 항체와 streptavidin을 그 몰비가 1:3이 되도록 혼합한 후 4℃에서 밤새 반응시켰다. 항체-streptavidin 중합체(Ab-SA)는 diaminobiotin-agarose와 Sephadex G-100의 이중층으로 된 크로마토그라피 칼럼을 이용하여 정제되었다(참고문헌: J. D. Olson 등, 1990, J. Immunol. Meth., Vol. 134, Page 71-79).

실시예 11: 비오틴(biotin) 패드부재를 이용한 혈장 지질단백질의 면역분리

지질단백질 입자를 포획하기 위하여 비오틴 패드부재(100')로 구성된 면역 스트립 시스템은, 도 4에서 도시된 바와 같이, 항체패드부재(100) 대신에 비오틴 패드부재(100')로 대치하여 면역 스트립을 구성하였고, 분리를 위해 우선 다른 농도의 저밀도 지질단백질(LDL) 5 μL를 1.7 mg/mL Ab-SA 2.5 μL와 혼합시켜 30분(최저 5분) 동안 반응시킨 후 이 반응 혼합물을 microwell에 넣고 스트립의 하단으로부터 흡수시켰다. 그 외 실험과정 및 조건은 항체패드부재(100)를 이용한 면역분리 (실시예 8)에서와 같다. 면역분리의 선택성을 입증하기 위해 동일한 실험과정이 초저밀도 지질단백질(VLDL)과 고밀도 지질단백질(HDL)에 대해 반복되었다.

알려진 생물학적 반응 중 가장 높은 부착상수(10¹⁵L/mol 범위)를 갖는 것으로 알려진 SA-biotin 반응은, 도 8에 도시된 바와 같이, 상기 비오틴 패드부재 상에서 일어나도록 고안되어 실제로 지질단백질을 효과적으로 제거하는 것으로 나타났다. 이와 같은 면역분리 시스템을 평가하기 위해, 혈장 지질단백질의 농도에 따른 포획율과 다른 종류의 혈장 지질단백질에 대한 선택성을 시험하였다. 도 9에 도시된 바와 같이, 입자 표면에 apo B100을 포함하고 있는 저밀도 지질단백질(LDL) 및 초저밀도 지질단백질(VLDL)의 경우에 항체를 사용한 면역분리 시 항체가 없을 때와 비교하여 현저한 신호감소가 측정되었다. 이것은 지질단백질이 항원-항체 면역결합체를 형성하고 이 결합체는 비오틴 패드부재(100') 상에 SA-biotin 반응에 의해 포획되는 것을 나타낸다. 반면에, 고밀도 지질단백질(HDL)은 항체와 반응하지 않기 때문에 항체의 존재유무와 상관없이 거의 일정한 신호를 나타내었다. 따라서, 이러한 결과는 apo B100 특정 항체를 사용한 면역반응은 저밀도 지질단백질(LDL) 혹은 초저밀도 지질단백질(VLDL)과 특이하게 반응함을 나타낸다. 면역분리에 의한 신호의 감소를 지질단백질의 포획 백분율로 표현하였고(도 9의 수치참조), 상기 수치는 지질단백질 농도가 증가함에 따라 감소하였다. 혈액시료 내 예상되는 LDL-C(100-200 mg/dL)와 VLDL-C(20-40 mg/dL)의 농도범위에서 포획율은 88% 이상인 것으로 나타났다. 상기에서와 같이 적용된 면역 크로마토그래피 방법을 이용한 분리는 기존의 방법보다 비교적 간단하고 빠르기 때문에 실제로 의사진료실 등 현장시험용 장치를 구성하는데 사용되어질 수 있다.

실시예 12: 멤브레인 스트립을 이용한 HDL-C 분석

멤브레인 면역 크로마토그래피 방법을 이용한 특정 단일 지질단백질 콜레스테롤의 측정 가능성을 증명하기 위해, 비오틴 패드부재(100')로 구성된 멤브레인 스트립 시스템을 지질단백질 혼합용액에 존재하는 고밀도 지질단백질 콜레스테롤(HDL-C)의 선택적 측정에 이용하였다. 고밀도 지질단백질(HDL)을 희석하여 여러 다른 콜레스테롤 농도를 나타내는 용액(20-100 mg/dL)을 제조하였고 이것을 일정 농도의 LDL(150 mg/dL 콜레스테롤) 그리고 HDL(20 mg/dL 콜레스테롤)과 혼합하여 표준시료를 준비하였다. 각 표준용액(5 μL)을 1.7 mg/mL Ab-SA(2.5 μL)을 포함하거나 혹은 그 중합체를 포함하지 않은 microwell 내에 첨가하였고, 멤브레인 스트립을 이용한 분석은 지질단백질의 면역분리 실험에서와 동일하게 수행하였다. Ab-SA가 존재하는 경우 단지 고밀도 지질단백질(HDL) 만 포함되어 있는 시료에 대해 같은 실험과정을 반복하였고, 고밀도 지질단백질 콜레스테롤(HDL-C) 변화에 대한 농도응답 결과들을 상호 비교하였다.

농도응답 결과를 보면(도 10 참조), apo B100에 특이성을 갖는 항체가 포함되지 않은 경우 총 콜레스테롤 농도 190-270 mg/dL 범위에 해당하는 높은 신호가 발생되었다(왼쪽 패널). 반면에, 항체가 존재하는 조건하에서 신호는 현저하게 줄어들었고 발생된 신호는 고밀도 지질단백질 콜레스테롤(HDL-C)의 양에 직접적으로 관련이 있는 것으로 보여졌다(중간 패널). 이와 같은 농도응답 패턴은 고밀도 지질단백질(HDL) 만이 존재하는 시료에서 얻어진 것과 매우 유사하였다(오른쪽 패널). 그러므로 멤브레인 스트립 시스템은 시료에 포함된 저밀도 지질단백질(LDL) 및 초저밀도 지질단백질(VLDL)을 선택적으로 제거하였고 결과적으로 고밀도 지질단백질 콜레스테롤(HDL-C)의 농도에 비례하는 신호만을 선택적으로 발생시키는 것으로 확인되었다.

도 10에서 보여지는 신호세기는 도 6에서 나타난 동일한 농도의 지질단백질 콜레스테롤로부터 발생된 신호보다 더 약한 것으로 보여지는데, 이것은 시료부피가 50% 감소되었기 때문이다. 부가하여, 각 경우에 사용된 운반용액들의 pH 차이가 또한 신호발생에 영향을 주는 것으로 나타났다. 실험초기에 신호발생 시스템의 운영 시 신호세기에 대한 최적조건인 산성 운반용액(pH 5.1)을 이용하였다. 그러나 산성 운반용액은 지질단백질의 면역분리 효율을 감소시킬 수 있기 때문에 Na₂HPO₄용액을 첨가하여 pH 값을 6.0으로 증가시켜 반응을 수행하였다.

한편, 저밀도 지질단백질 콜레스테롤(LDL-C) 분석시스템을 예를 들면, 저밀도 지질단백질(LDL)에는 존재하지 않지만 다른 두 지질단백질 입자 상에 존재하는 단백질인 apo C 혹은 apo E(표 2 참조, 참고문헌: A. M. Gotto 등, 1986, Meth. Enzymol., Vol. 128, Page 3-41)를 특이하게 인지하는 항체를 대체하여 사용하고(두 항체를 동시에 사용할 수도 있음), 다른 모든 과정은 위에서 언급된 조건과 동일하다. 이 경우 고밀도 지질단백질(HDL)과 초저밀도 지질단백질(VLDL)은 면역반응에 의해 항체패드부재 내에 포획되고 저밀도 지질단백질(LDL)은 상단에 위치한 효소분해패드부재 내로 운반되므로 상기한 바와 같이 일련의 효소분해반응에 의해 그 입자에 포함된 콜레스테롤 농도에 비례한 신호를 궁극적으로 발생시킬 수 있다. 따라서 단지 특정 단일 지질단백질에 함유된 콜레스테롤 측정만을 위해 고안된 방법 예를 들어, 고밀도 지질단백질 콜레스테롤(HDL-C) 만을 정량하기 위해 사용될 수 있는 침전법(참고문헌: V. Y. S. Liu 등, 1993, Clin. Chem., Vol. 39, Page 1948-1952)과는 근본적으로 다르다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명 단일 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치 및 그 방법은 별도의 시험시스템 및 시료의 처리과정 없이 특정 단일 지질단백질의 콜레스테롤 농도를 개략적으로 정량할 수 있도록 함으로서 사용이 간편하고 저렴한 비용으로 콜레스테롤의 농도를 측정하여 동맥경화증세를 조기에 판별할 수 있는 효과가 있게 되는 것이다.

Claims (17)

1. 콜레스테롤 측정장치에 있어서,

   선택된 항원에 대해 특이하게 부착하여 반응하는 항체를 통해 특정 혈장 지질단백질들을 선택적으로 포획하여 상호 분리한 후, 포획되지 않고 분리된 특정 단일 지질단백질의 콜레스테롤 농도에 비례하는 발색신호를 효소학적으로 발생시켜 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 농도를 개략적으로 정량할 수 있도록 하는 측정수단(1)이 구비된 것을 특징으로 하는 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치.
2. 제1항에 있어서 측정수단(1)은,

   특정 단일 지질단백질을 선택적으로 투과시켜 분리하도록, 포획될 지질단백질 입자상의 결손단백질에 특이한 항체가 도포되는 항체패드부재(100)와;

   상기 항체패드부재(100)에서 포획되지 않고 투과하여 분리된 특정 단일 지질단백질을 파괴하여 방출된 콜레스테롤을 분해함과 아울러 신호발생에 필요한 발색물질을 제공하는 효소분해패드부재(200)와;

   상기 효소분해패드부재(200)에서 제공된 분해 생성물 그리고 발색물질과 반응하여 콜레스테롤 농도에 비례하여 발색의 세기를 표시하는 신호발생패드부재(300)와;

   도하는 흡수패드부재(400)로 구성된 것을 특징으로 하는 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치.
3. 제1항에 있어서 측정수단(1)은,

   항체-streptavidin 중합체와 반응하여 흡수된 시료에서 특정 지질단백질을 면역포획하는 비오틴 패드부재(100')와;

   상기 비오틴 패드부재(100')에서 포획되지 않고 투과하여 분리된 특정 단일 지질단백질을 파괴하여 방출된 콜레스테롤을 분해함과 아울러 신호발생에 필요한 발색물질을 제공하는 효소분해패드부재(200)와;

   상기 효소분해패드부재(200)에서 제공된 분해 생성물과 발색물질에 반응하여 콜레스테롤 농도에 비례하여 발색의 세기를 표시하는 신호발생패드부재(300)와;

   상기 패드부재(100',200,300)에 일련된 시료운반을 위해 용액의 지속적인 흐름을 유도하는 흡수패드부재(400)로 구성된 것을 특징으로 하는 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치.
4. 제2항에 있어서 항체패드부재(100)는,

   저밀도 지질단백질(LDL) 및 초저밀도 지질단백질(VLDL) 입자 표면에 존재하는 결손단백질 B100에 특이한 항체가 니트로셀루로우즈 멤브레인 표면에 고르게 도포되어 고정화되는 것을 특징으로 하는 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치.
5. 제2항에 있어서 항체패드부재(100)는,

   고밀도 지질단백질(HDL) 및 초저밀도 지질단백질(VLDL) 입자 표면에 존재하는 결손단백질 C 또는 E에 특이한 항체가 니트로셀루로우즈 멤브레인 표면에 고르게 도포되어 고정화되는 것을 특징으로 하는 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치.
6. 제2항 또는 제3항에 있어서 효소분해패드부재(200)는,

   분리된 지질단백질 입자를 파괴하여 콜레스테롤 및 그 에스테르 유도체를 방출하는 계면활성제와, 상기 계면활성제에 의해 방출된 콜레스테롤 에스테르 유도체(cholesteryl ester)를 효소분해하여 콜레스테롤을 생성시키는 cholesterol esterase(CE)와, 상기 cholesterol esterase(CE)에 의해 분해된 콜레스테롤을 효소분해하여 과산화수소를 발생시키는 cholesterol oxidase(CO)와, 상기 cholesterol oxidase(CO)에 의해 발생된 과산화수소와 결합하여 발색의 세기를 표시하는 발색기질이 셀루로우즈 멤브레인 상에 건조상태로 일련되게 도포되는 것을 특징으로 하는 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치.
7. 제2항 또는 제3항에 있어서 신호발생패드부재(300)는,

   상기 효소분해패드부재(200)에서 발생된 과산화수소 및 발색기질과 반응하여 발색신호를 형성하는 HRP가 니트로셀루로우즈 멤브레인의 일정 위치에 도포되어 고정화되는 것을 특징으로 하는 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치.
8. 제2항 또는 제3항에 있어서 각 패드부재(100', 100, 200, 300, 400)는,

   세공크기가 0.1-20 μm에서 셀루로우즈, 니트로셀루로우즈, 나일론, 유리섬유 또는 PVDF로 형성된 것을 특징으로 하는 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치.
9. 제2항 또는 제4항 또는 제5항에 있어서 항체패드부재(100)는,

   멤브레인을 메탄올로 전처리하고 0.1-10 mg/mL 항체를 첨가하여 물리흡착시킨 후 잔여표면은 BSA와 같은 비반응성 단백질로 처리하거나, 혹은 멤브레인을 0.1-1% glutaraldehyde 용액에 1시간 동안 담가 처리하여 세척하고 공기건조시킨 후 0.1-10 mg/mL poly-lysine을 고정화하고, NaIO₄(최종 농도 10-100 mmol/L)로 활성화된 항체분자를 가하여 반응시킨 후 상기 멤브레인을 2% (w/v) BSA와 NaCNBH₃(최종 농도 1-10 mmol/L)가 포함된 용액에 담가 반응시키고, 0.05-0.5% tween-20이 포함된 tris 완충용액 (pH 7.6)으로 씻어 낸 후 건조되어 제조되는 것을 특징으로 하는 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치.
10. 제2항 또는 제3항 또는 제6항에 있어서 효소분해패드부재(200)는,

    메탄올에 전처리된 셀루로우즈 멤브레인에 1-10% sodium cholate 용액을 첨가하여 건조시키고 총 1-25 mg/mL CE와 CO의 혼합액을 가하여 축적하고 5-50 mg/mL DAB 용액과 발색 강화제로 선택된 0.5-5% NiCl₂와 CoCl₂의 혼합용액을 패드의 상부에 각각 첨가하여 제조되는 것을 특징으로 하는 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치.
11. 제2항 또는제3항 또는 제7항에 있어서 신호발생패드부재(300)는,

    메탄올에 전처리된 니트로셀루로우즈 멤브레인(20 μm 세공크기, 5x20 mm)을 인산완충식염수(PBS)로 3번 세척한 후 1시간 동안 상온에서 건조하고, 멤브레인 스트립 하단으로부터 5-15 mm 되는 부위에 인산완충식염수(PBS)를 이용하여 제조된 100-1000 units/mL HRP 용액을 1.5 μL 흡수시킨 후 공기 중에서 건조하여 제조되는 것을 특징으로 하는 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치.
12. 제2항 또는 제3항에 있어서 흡수패드부재(400)는,

    모세관현상에 의해 유발되는 용액의 흐름을 계속 유지시키기 위해 셀루로우즈 멤브레인(3MM 등 크로마토그라피 급, 5x30 mm)이 사용되는 것을 특징으로 하는 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치.
13. 제3항에 있어서 항체-streptavidin 중합체는,

    SMCC와 같은 maleimide 유도물질을 이용하여 활성화된 항체와 SPDP 등 sulfhydryl 유도물질에 의해 활성화된 streptavidin을 그 몰비가 1:1-1:10 이 되도록 반응시켜 제조되는 것을 특징으로 하는 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치.
14. 제3항에 있어서 비오틴 패드부재(100')는;

    BSA와 10-100배 과잉 몰농도의 NHS-LC-biotin을 반응시키고 정제된 중합체를 0.1-1% glutaraldehyde로 처리된 니트로셀루로우즈 멤브레인 상에 가하여 제조되는 것을 특징으로 하는 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치.
15. 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정방법에 있어서,

    선택된 항원에 대해 특이하게 부착하여 반응하는 항체를 통해 특정 혈장 지질단백질들을 선택적으로 포획하여 상호 분리한 후, 포획되지 않고 분리된 특정 단일 지질단백질의 콜레스테롤 농도에 비례하는 발색신호를 효소학적으로 발생시켜 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 농도를 개략적으로 정량할 수 있도록 하는 것을 특징으로 하는 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정장치.
16. 제15항에 있어서,

    선택된 항원에 대해 특이하게 반응하여 부착하는 항체를 통해 지질단백질을 선택적으로 포획하여 상기 항체에 반응하지 않는 특정 단일 지질단백질을 분리하는 면역분리단계(ST10)와;

    상기 면역분리단계(ST10)에서 분리된 지질단백질을 파괴하여 방출된 콜레스테롤을 효소분해하여 상기 콜레스테롤의 농도에 비례한 화합물을 생성하는 효소분해단계(ST20)와;

    상기 효소분해단계(ST20)에서 생성된 화합물에 반응하여 콜레스테롤 농도 비율에 따라 발색신호를 시각적으로 표시하는 신호표시단계(ST30)로 구성된 것을 특징으로 하는 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정방법.
17. 제15항에 있어서,

    혈장 지질단백질 혼합시료와 항체-streptavidin 중합체를 5-30분 반응시킨 후 비오틴 패드부재에 흡수시켜 특정단백질을 선택적으로 포획함으로서 포획되지 않은 특정 단일 지질단백질을 분리하는 면역분리단계(ST10)와;

    상기 면역분리단계(ST10)에서 분리된 지질단백질을 파괴하여 방출된 콜레스테롤을 효소분해하여 상기 콜레스테롤의 농도에 비례한 화합물을 생성하는 효소분해단계(ST20)와;

    상기 효소분해단계(ST20)에서 생성된 화합물에 반응하여 콜레스테롤 농도 비율에 따라 발색신호를 시각적으로 표시하는 신호표시단계(ST30)로 구성된 것을 특징으로 하는 혈장 지질단백질의 콜레스테롤 측정방법.