KR20000057258A - 염색체 말단으로 텔로머라제가 접근하는 것을 방지하는 억제제의 확인 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 텔로머라제-관련 단백질뿐만 아니라 텔로머라제-관련 단백질을 암호화하는 유전자를 분리하는 방법을 기술한다. 제시된 신규한 선별법을 사용하여 추가의 텔로머라제-관련 유전자를 분리함으로써 이들의 단백질 생성물을 발현시키고 특징화할 수 있다. 텔로머라제의 생체내 기능에 필요한 단백질-단백질 상호반응의 확인으로 종양치료제에 대한 신규한 선별법의 기반이 제공된다.

Description

염색체 말단으로 텔로머라제가 접근하는 것을 방지하는 억제제의 확인{Identification of inhibitors that prevent access of telomerase to chromosomal terminus}

텔로머(telomere)는 선형 진핵세포 염색체의 말단에 존재하는 특화 서열로, 염색체 말단의 게놈 안정성과 완전 복제에 필요한 것이다(참조: Blackburn and Greider 1995; Zakian 1995, Greider 1996). 텔로머는 짧은 반복 DNA 서열의 탬덤 배열로 특징되며; 사람에 있어서는 텔로머 반복 서열이 d(TTAGGG)_n이다.

지금까지 조사된 모든 진핵세포에서, 드로소필라(Drosophila)와 수종의 다른 쌍시류를 제외하고, 텔로머는 텔로머라제로 명명된 특화된 DNA 폴리머라제에 의해 복제된다(참조: Kipling 1995; Blackburn and Greider 1995; Zakian 1995). 이 효소는 텔로머의 G-풍부 본쇄의 3' 말단상에 텔로머 반복 단위를 부가하는데 관여하며, RNA 아단위중에 존재하는 내부 주형을 사용하여 부가된 텔로머성 DNA의 서열을 명령한다. 텔로머라제의 RNA 성분을 암호화하는 유전자는 에스. 세레비지애(S. cerevisiae)로부터의 TLC1 유전자(Singer and Gottschling 1994)를 포함하여, 수많은 종에서 확인되었다(Greider and Blackburn 1989; Shippen-Lentz and Blackburn 1990; Lingner, et al. 1994; MCEachern and Blackburn 1995; Feng, et al. 1995; Blasco, et al. 1995). 그러나, 대조적으로, 상기 효소의 단백질 성분의 특징화는 뒤쳐져 있다. 또한, 분자 수준에서 텔로머라제 활성이 어떻게 조절되는지에 관해서는 거의 알려져 있지 않다.

텔로머라제 효소 복합체의 추가 성분을 확인하기 위한 몇가지 방법이 있다. 최근, 섬모충 테트라하이메나(Tetrahymena)로부터 텔로머라제를 생화학적으로 정제하여, RNA 성분이외에, 상기 효소의 아단위를 포함하는 2종의 단백질을 확인하였으나(Collins, et al. 1995); 완전하게 서열화된 에스. 세레비지애 게놈을 포함하여 다른 종에서 이들 유전자의 동족체는 아직 확인하지 못하였다. 생화학적 경로의 대안은, 돌연변이시 생체내에서 텔로머라제의 결함에 대해 예측되는 표현형 세트를 갖는 유전자를 확인하는 것이다. 이들 2종의 상이한 프로토콜은 아마도 적어도 일부의 동일한 인자를 확인할 수 있도록 할 것이다. 그러나, 유전적 방법은 생체내에서의 기능에 대해서는 중요할 수 있지만(예를 들어, 포지티브 조절자로서) 효소 활성의 경우 시험관내에서 요구되지 않아 효소와 함께 동시에 정제되지 않을 수 있는 성분을 확인할 가능성이 있다.

결실시, 텔로머라제 활성이 상실됨으로써 예측되는 표현형을 갖는 세포를 생성하는 2개의 유전자가 사카로미세스 세레비지애에서 이미 확인되었다. 이들중 첫번째 것은 EST1 유전자로, 이는 텔로머라제의 아단위일 것으로 가정되는 고도의 염기성 82 kD 단백질을 암호화한다(Lundblad and Szostak 1989; Lundblad and Blackburn 1991). 상기 제안은 대부분 est1 영(null) 돌연변이주가 텔로머라제 결핍에 대해 예측되는 두가지 특징: 염색체 말단으로부터 텔로머 서열 및 노화 표현형의 급진적인 소실(세포 생존성에 있어서 고정적인 감소로서 입증됨)을 나타내는 관찰에 기초한다. 상기와 같은 표현형이 텔로머라제의 결함에 대한 진단 방법일 수 있다는 강력한 지지는 효모 텔로머라제 RNA를 암호화하는 TLC1 유전자가 결실된 효모 균주는 동일한 표현형 세트를 나타낸다는 증거로부터 유래된다(Singer and Gottschling 1994).

Est1p가 촉매적 활성에 있어서 시험관내에서 요구되지 않음을 제시하는(Cohn and Blackburn 1995), 텔로머라제 활성이 est1-△균주로부터 제조된 크로마토그라피 분획물중에 아직 존재하지만, 이는 EST1이 텔로머라제의 비-촉매적 성분일 수 있다는 가능성을 배제시키지는 않는다(Lin and Zakian 1995). Est1 단백질이 일본쇄 효모 텔로머 서열에 결합하기 때문에 Est1은 텔로머 인지에 관여하는 텔로머라제 성분으로서 작용할 수 있다. 이와 일치하여, 이들 실험에 있어서 관련이 정량적인지에 대해서는 결정할 수 없지만, Est1 단백질은 텔로머라제 RNA 및/또는 효소 활성과 관련되어 있다(Lin and Zakian 1995; Steiner, et al. 1996). 텔로머 DNA에 결합하는 Est1의 특성이 또한 염색체 말단상에 텔로머라제를 지시함으로써 텔로머라제 기능의 포지티브 조절자로서 작용하는 텔로머-말단-결합 단백질로서의 역할과 일치한다. 다른 모델로, Est1 기능에 대한 요구가 네이키드(naked) DNA를 텔로머라제 신장에 대한 기질로서 사용하는 시험관내 실험에서 미연에 방지될 수 있다.

포유동물 세포에 있어서, 텔로머라제는 고도로 조절되는데; 이는 생식세포 계열에는 존재하나 대부분의 정상 조직에서는 부재하거나 크게 감소되어 있다. 상기 효소의 부재와 일치하여, 텔로머는 이들 정상 세포중에서 단축된다. 종양 형성 과정중에, 텔로머라제 활성은 정상 세포중에 존재하는 수준과 비교하여, 상향-조절된다. 이런 상향-조절은 텔로머 길이를 유지하고 종양 발달중 증식이 조절되지 않도록 하는데 필수적일 것으로 예측된다.

상기 제안은 상이한 조직에서의 효소 활성 상태의 실질적인 연구에 의해 지지된다: 텔로머라제 활성은 998개의 사람 종양 조직중 851개에서 발현되지만, 생식 세포와 조혈 간세포를 제외한, 대부분의 정상 조직중에는 존재하지 않는다(Shay and Wright 1996, 참고로 언급됨). 일부 종양에서는 텔로머라제가 초기-단계 암과 비교하여 후기-단계 암에서 더 높은 수준으로 발현되지만, 일부 데이타는 환자의 회복 속도가 텔로머라제 활성 수준과 관련됨을 제시한다(Hiyama, et al. 1995a. 1995b).

사람의 유방암의 특정 연구가 또한 대부분의 전이성 유방암에 있어서 속도-제한 단계의 분석에 기초하여 예측되는 바와 같이, 종양 발달과 텔로머라제 활성간의 강력한 상관관계를 증명한다(Shay, et al. 1993). 초기 데이타는 확립된 유방암 세포주에서 텔로머 길이가 변화되고 텔로머관 길이에서의 변화 정도는 유방암의 조직학적 공격성과 관련됨을 증명한다(Rogalla, et al. 1994; Odagiri, et al. 1994). 이후, 텔로머라제 활성의 직접적인 분석으로 효소 활성과 암 진행간의 강력한 관련성이 밝혀졌으며; 활성은 진행된 단계의 유방암의 〉 95%에서 검출되는 반면, 덜 진행된 종양의 68 내지 81%에서 존재하며 낭양변성섬유종 질환에서는 부재한다(Hiyama, et al. 1996).

총괄하여, 상기 데이타는 텔로머라제의 재활성화가 종양 성장을 지연시키는데 있어서 필수적임을 강력하게 주장하는 것이다. 그러므로, 상기 효소를 표적화하는 항암제는 유방암을 포함한 암 치료에 있어서 신규한 방법을 제공할 수 있다(Harley, et al. 1995). 또한, 텔로머라제 발현이 거의 배타적으로 종양 세포에 제한되기 때문에, 이는 텔로머라제 억제가 항암 치료로서 사용될 경우 부작용이 제한될 수 있음을 제시한다. 텔로머라제-플러스이며 따라서 텔로머라제 억제제에 의해 영향을 받는 제한된 간세포 집단은 대부분의 화학치료제의 의도되지 않은 표적인 훨씬 더 광범위한 증식성 정상 조직에 알맞게 비유된다. 따라서, 텔로머라제를 억제하는 것이 잠재적인 항암 치료 표적으로 제안된 바 있으며, 텔로머라제가 정상적인 체세포 성장에는 필요하지 않을 수 있기 때문에 텔로머라제를 억제하는 것은 부작용이 거의 없을 수 있다는 잇점이 추정된다.

현재, 대부분의 노력은 시험관내 폴리머라제 활성으로 정의되는 상기 효소의 촉매적 활성을 억제하는 화합물을 발견하는데 기울여지고 있다. 그러나, 몇몇 관찰들은 기능적 텔로머의 유지로서 정의되는 텔로머라제 활성이 또한 상기 효소의 촉매적 활성외의 수준에서 조절될 수 있음을 제시하고 있다. 텔로머라제 촉매적 활성은 텔로머 단축을 나타냄에도 불구하고(Cooke and Smith 1986; Allshire, et al., 1988; de Lange, et al., 1990) 조혈 세포주와 같은 특정한 사람 세포주에 존재한다(Broccoli, et al., 1995; Counter, et al., 1995). 이는 일정 방법으로 텔로머라제 활성을 조절함으로써 예측할 수 있는, 텔로머 길이 조정을 중재하는데 있어 다른 인자가 관련될 수 있음을 제시한다. 그러나, 포유동물 시스템에 있어서 이들 성분의 확인은 이들의 검출에 대한 검정 시스템의 부재로 인하여 문제가 되고 있다.

발명의 요약

본 발명자들은 효모중에서 상기와 같은 인자에 대해 연구함으로써 텔로머라제 성분을 확인하는 문제에 접근하였다. 상술하면, 본 발명자들은 텔로머라제중 결함(텔로머 단축화 및 노화 표현형)에 대해 예측되는 표현형을 나타내는 효모의 돌연변이체를 찾고자 노력하였다. 이들 특징은 효모 텔로머라제 RNA 유전자, TLC1이 결실된 균주가 또한 이들 동일한 두가지 표현형을 나타낸다는 증거로부터 유래되는 텔로머라제 결함에 대한 진단일 수 있음을 강력하게 지지한다(Singer and Gottschling 1994).

본 발명자들의 선별로 4개의 유전자가 확인되었다: 먼저 확인된 EST1 유전자(Lundblad and Szostak 1989) 및 3개의 신규한 유전자(Lendvay, et al., 1996). 유전자 분석으로 이들 4개의 유전자에서의 돌연변이는 텔로머라제의 성분으로 공지된 TLC1에서의 돌연변이와 동일한 텔로머 복제에 대한 경로를 차단한다는 것이 입증되었다(Lendvay, et al., 1996).

이들 3개의 유전자(EST1, EST2 및 EST3)은 신규한 유전자로 TLC1에 의해 정의된 바와 같이 텔로머 복제에 대해 동일한 경로에서 유일하게 작용한다(참조: Lendvay, et al., 1996). 그러나, 본 발명자들은 네번째 유전자(초기에는 EST4로 명명되었으나 이후 먼저 클로닝된 CDC13 유전자와 동일한 것으로 밝혀짐)가 텔로머 기능에 있어서 이중 기능을 갖고 있음을 밝혀냈다(Nugent, et al., 1995). CDC13 유전자는, CDC13 기능의 부재시 텔로머 본쇄중 하나가 신속하게 소실됨을 나타내는(Garvik, et al., 1995) 리 하트웰(Lee Hartwell) 연구실로부터의 연구에 의해 먼저 제시된 바와 같이, 텔로머 통합을 유지하는데 필요한 필수적인 효모 유전자이다. 본 발명자들의 연구실로부터의 최근 연구는 텔로머 유지에 있어서 Cdc13에 대한 추가적인 역할을 밝혀내지 못하였다. 이는 (방금 논의된 바와 같이, 효소 수준이 상기 균주로부터 제조된 추출물중에서 정상이지만) 텔로머-(-) 균주의 표현형과 실질적으로 동일한 표현형을 나타내는, cdc13-2^est로 명명되는 신규한 돌연변이의 발견으로부터 유래된다. 또한, cdc13-2^est돌연변이와 tlc1-△ 돌연변이간의 상위성 분석으로 cdc13-2^est가 텔로머라제 경로에 필요한 CDC13의 기능을 교란시킨다는 것이 입증되었다.

대조적으로, 선행 분리된 CDC13의 잠정적 치사 대립유전자(cdc13-1^ts)를 유전자 분석함으로써 CDC13이 텔로머라제-기본 경로외에 유지되어야만 하는 별도의 필수적인 기능을 갖고 있는 것으로 밝혀졌다. 본 발명자들은 또한 정제된 CDC13 단백질이 일본쇄 효모 텔로머 기질에 특이적으로 결합함을 밝혀냈다. 이들 데이타를 기본으로 하여, 본 발명자들은 CDC13이 텔로머에서 2가지 별개의 기능을 갖고 있다고 제시하였다(Nugent, et al. 1996). 이들 제안된 역할중 첫번째는 세포 생존성에 필수적인, 염색체의 말단을 보호하는 것이다. 두번째로, 본 발명자들은 Cdc13 단백질이 직접적으로 또는 간접적으로, 상기 효소가 염색체 말단에 접근하는 것을 중재함으로써 텔로머라제를 조절하고, 상기 접근이 이제는 cdc13-2^est돌연변이에 의해 제거된다고 제안하였다.

본 발명은 2종의 신규한 텔로머라제-관련 단백질 Est2 및 Est3의 1차 구조를 제공한다.

본 발명의 목적은 Est2 또는 Est3 단백질 또는 이들의 단편을 사용하여 다른 텔로머라제-관련 단백질을 확인하고 분리시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 Est2 또는 Est3 단백질 또는 이들의 단편을 사용하여 다른 텔로머라제-관련 단백질을 확인하고 분리시킴으로써 항체를 생성시키고 상기 생성된 항체를 사용하여 텔로머라제-관련 단백질을 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 표준 생화학 기술을 사용하여 텔로머라제-관련 단백질을 확인하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 EST 유전자를 선별하기 위한 신규 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 선행 기술에 의해 교시되지 않은 메카니즘을 통하여 작용하는 신규한 부류의 텔로머라제 억제제를 확인하기 위한 검정법을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 효모 텔로머라제-관련 단백질중 보존된 모티프를 확인하고 상기와 같은 보존된 모티프에 대한 사람의 단백질 데이타베이스를 조사함으로써 효모 텔로머라제-관련 단백질의 사람 동족체를 발견하는 방법을 제공한다.

본 발명은 세포 및 분자 생물학 분야에 관한 것이다. 상세하게, 본 발명은 텔로머라제 기능 및 조절에 작용하는 단백질을 암호화하는 유전자에 관한 것이다.

도 1은 est 돌연변이를 암호화하는 유전자를 분리하기 위하여 사용되는 실험 프로토콜의 도식적 설명을 나타낸다.

도 2A는 EST 유전자중 돌연변이를 갖는 효모 균주의 텔로머 DNA의 서던 블롯 분석을 나타낸다.

도 2B는 돌연변이 효모 균주의 연속적인 스트릭-아웃(successive streak-outs) 결과를 나타낸다.

도 3A는 EST 유전자중 돌연변이를 갖는 효모 균주의 텔로머 DNA의 서던 블롯 분석을 나타낸다.

도 3B는 여러가지 돌연변이를 갖는 효모 균주의 생존성 검정 결과를 나타낸다.

도 4A는 여러가지 돌연변이를 갖는 효모 균주의 서던 블롯 분석을 나타낸다.

도 4B는 여러가지 돌연변이를 갖는 효모 균주의 서던 블롯 분석을 나타낸다.

도 4C는 여러가지 돌연변이를 갖는 효모 균주의 생존성 검정 결과를 나타낸다.

도 5A는 EST2 개방 판독 프레임을 배치시키기 위해 사용되는 전략의 도식적 설명을 나타낸다.

도 5B는 EST2 유전자 생성물의 1차 구조를 나타낸다.

도 5C는 여러가지 돌연변이를 갖는 효모 균주의 생존성 검정 결과를 나타낸다.

도 6은 EST3 유전자 생성물의 1차 서열을 나타낸다.

도 7은 플랭킹 영역을 포함하는 EST3 유전자의 뉴클레오티드 서열과 +1 리보좀 프레임 이동 위치를 나타낸다.

도 8은 EST3 유전자의 트랜스포손 맵화를 나타낸다.

도 9는 EST3에서 이동하는 리보좀 프레임에 대한 모델을 나타낸다.

도 10A-10H는 여러가지 EST3 작제물을 나타낸다.

도 11은 EST3 유전자의 구조를 나타낸다.

도 12는 EST2 단백질의 융합 작제물의 플라스미드 맵을 나타낸다.

도 13은 EST2 단백질의 융합 작제물의 플라스미드 맵을 나타낸다.

도 14는 cdc13-1^ts과 tlc1△을 함유하는 돌연변이주의 생존성에 대한 효과를 나타낸다.

도 15A는 제조된 Est3-융합 단백질 작제물 구조의 도식적 설명을 나타내고 도 15B는 상기 단백질 작제물의 발현의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.

재료 및 방법

효모 균주 및 배지: 본 연구에서 사용되는 에스. 세레비지애(S. cerevisiae) 균주는 표 1에 나타내며; YPH275는 이들 연구에서 사용되는 모든 균주의 2배체 모체이다. 돌연변이 유도체 MVL1 내지 MVL26은 하기 설명되는 바와 같이, YPH275를 플라스미드 PVL106(Lundblad and Szostak 1989)으로 형질전환시키고 이어서 포자형성시키고 절단하여 수득한, 반수체 균주 TVL227-1A로부터 분리되었다. TLV120과 TLV140은 이미 기재하였으며(Lundblad and Szostak 1989; Lundblad and Blackburn 1993); DLV131은 192와 909 사이에 서열의 PCR-매개된 결실(Baudin, et al. 1993)에 의해 작제된 tlc1-△LEU2 붕괴물을 도입시킴으로써 YPH275로부터 작제된다. 균주를 30℃에 표준 배지(Guthrie and Fink 1991)에서 성장시키는데, 염색체 소실 검정은 아데닌을 포함하지 않는(6㎍/㎖) 배지상에서 수행하여 콜로니중 적색 Ade^-섹터의 검출을 향상시키는 것이 상이하다. 카나바닌 플레이트와 5-FOA SC-LEU 플레이트를 문헌[참조: Ausubel, et al., 1987]에 기재된 바와 같이 제조한다. 효모 형질전환은 리튬 아세테이트 방법(Schiestl and Gietz 1989)을 사용하여 수행하고; 포자형성 및 4분 해체는 표준 기술(Guthrie and Fink 1991)을 사용하여 수행한다.

EMS 돌연변이: TVL227-1A를 밤새 성장시켜 SC-LEU-TRP중에 포화시키고, YEPD 배지중으로 10배 희석시켜 O.D. 0.8 내지 1.0으로 성장시킨다. 세포 40㎖를 멸균 dH₂O중에서 2회 세척하고 0.1M 인산나트륨, pH 7.0 12㎖에 재-현탁시키며; 1.7㎖ 분획을 EMS(에틸메탄 술포네이트) 45㎕와 1시간 동안 30℃에서 천천히 통기시키면서 배양시킨다. 세포를 멸균 5% 나트륨 티오술페이트에 10배 희석시키고, 5% 나트륨 티오술페이트중에서 2회 및 멸균 dH₂O중에서 2회 세척하여 dH₂O 2.0㎖중에 재현탁시킨다. 분취량을 카나바닌 플레이트상에 플레이팅시켜 카나바닌 내성의 빈도 증가를 모니터하고 YEPD 플레이트상에 희석물을 플레이팅시켜 돌연변이 과정에서 생존한 세포의 퍼센트를 측정하는데; 두 수치를 동일하게 조작되지만 EMS를 가하지 않은 세포의 샘플에 대해 측정한다. 선별되는 콜로니의 개체수가 많기 때문에, 전체적인 선별을 3단계로 유발하는데, 각 단계는 80,000 내지 150,000개의 콜로니 사이에서 조작한다. 총 12회의 독립적인 돌연변이를 수행하는데; 평균 생존률 범위는 30 내지 60%이고 카나바닌 내성의 증가는 50 내지 150배이다. 모든 선별 단계를 30℃에서 수행하기 때문에, 상기 돌연변이체 선별은 조건부 치사 돌연변이를 회복시키기 위하여 특별하게 고안되지는 않는다는 점에 주목하여야 한다.

돌연변이체 선별: 콜로니 영역 선별: 염색체 소실에 있어서 표현형으로 지연됨을 나타내는 돌연변이체를 검출하기 위하여, 돌연변이시킨 세포를 단일 콜로니로서 2회전 성장을 통하여 프로세싱한다. 돌연변이후, 배양물을 SC-LEU-TRP 플레이트상에 500 내지 1000/플레이트의 밀도로 플레이팅시키고 콜로니를 30℃에서 완전 크기로 대략 3 내지 4일간 성장시킨다. SC-LEU-TRP 플레이트로부터의 콜로니를 멸균 dH₂O중에 재현탁시키고, 아데닌을 포함하지 않는 SC-LEU 플레이트상에 약 350/플레이트의 밀로도 재-플레이팅시켜 대략 7500개의 콜로니 푸울을 생성시킨다. 각각의 푸울로부터 재-플레이팅시킨 콜로니의 총수는 원래 푸울중 각 콜로니가 나타내는 차이를 증가시키기 위해서 대략 푸울의 4배 크기이다. 플레이트를 7일간 30℃에서 배양시켜 적색 Ade^-영역이 완전히 발달하도록 하고; 또한, 염색체 소실에 대해 점수를 매기기 전에 4℃에서 밤새 배양시키는 것이 적색 영역의 검출을 향상시키는데 있어서 도움이 된다(F. Spencer, 개인적 대화내용). 2개의 돌연변이체가 단일 푸울로부터 분리되어 이후 동일한 상보성 그룹에 대해 맵화되는 것으로 밝혀질 경우, 이들은 서로 자매세포인 것으로 간주되며 이후 1개만 분석한다.

플라스미드 선형화 검정법: Ade^-영역의 수가 증가된 콜로니를 SC-LEU 배지 0.2㎖를 함유하는 미세역가 접시 웰에 집어넣고 pVL106의 보유에 대해 선별한다(Lundblad and Szostak 1989). 30℃에서 2일간 성장시킨 후, 다중-채널 피펫을 사용하여 각 웰로부터 5㎕ 분취량을 SC-LEU-5-FOA 플레이트로 옮기고 플레이트를 30℃에서 3일 이상 동안 배양시켜 5-FOA 내성 미세-콜로니를 성장시킨다. 야생형 비-돌연변이 균주를 상기 검정법으로 5-FOA 플레이트상에서 대략 10 내지 15개의 미세-콜로니로 성장시키고; 3배 이상 감소된 것으로 나타난 모든 돌연변이체를 추가 분석용으로 회수한다. 각 후보를 상기 미세역가 접시 웰로부터 회수하여 SC-LEU 플레이트상의 단일 콜로니에 대해 스트리킹시켜, 각각에 대해 3개의 단일 콜로니를 플라스미드 선형화 검정법으로 다시 시험한다. 상기 재-시험을 통과하는 후보는 서던 분석법으로 텔로머 길이의 변형에 대해 검정한다. 또한, 상기 단계에 도달한 후보를 15% 글리세롤로 옮겨 70℃에서 보관함으로써 신속하게 노화되는 균주의 소실을 방지한다.

텔로머 길이 분석: 플라스미드 선형화 검정을 통과한 각 후보에 대해 SC-LEU 스트릭-아웃물로부터의 단일 콜로니 1 내지 2개를 8㎖ YEPD중에 포화 상태로 성장시키고 상기한 바와 같이(Guthrie and Fink 1991) 게놈성 DNA를 제조한다. XhoI 효소(New England Biolabs)로 분해시킨 DNA 대략 1㎍의 샘플을 20㎝ 0.7% 아가로스 겔상에서 분리시켜, 나일론막으로 옮기고 폴리 d(GT/CA)로 상기한 바와 같이(Lundblad and Szostak 1989) 프로빙한다. 텔로머 길이를 성장 세대수를 증가시키면서 검정할 경우(도 2 내지 4), 배양물을 YEPD중에 포화 상태로 성장시키고 이어서 10^-4배수로 희석시켜 포화 상태로 재-성장시키는데; 상기 공정을 3 내지 4회 반복한다.

세포 노화 검정법: 텔로머 길이가 〉250 bp로 감소된 모든 돌연변이체를 이들이 각 돌연변이체를 YPH275의 야생형 반수체 유도체와 역-교잡시켜 포자형성시키고 이후 2배체 균주로 분해시킴으로써 관련된 노화 표현형을 나타내는지에 대해 시험한다. 각 돌연변이체에 대해, 4 내지 6개의 4분체로부터의 반수체 포자 생성물을 YEPD상에 단일 콜로니에 대해 스트리킹시켜, 30℃에서 48시간 동안 배양시키고 TVL120의 분해로부터 발생된 est1-△1::HIS3 반수체 포자 생성물과 동시에 성장 특징에 대해 평가한다. 이들 "1X" 스트릭-아웃물로부터의 단일 콜로니를 이후 재-스트리킹시키고 유사하게 분석하는데; 본 공정은 4회 이하로 반복한다. 도 2, 3 및 4에 제시된 데이타의 경우, 이들 연속적인 YEPD 스트릭-아웃물 각각은 23℃에서 보관하여 단일 플레이트상에서의 시간 과정의 재-조합에 사용한다.

유전자 조작: 상보성 분석: 2배체를 비-선택 교배물로부터 분리시켜, 노화 표현형의 복귀 또는 억제에 대한 선별을 방지한다. 반대 교배 타입의 반수체 균주를 YEPD 플레이트상에 함께 패칭시켜 4 내지 6시간 동안 교배시킨다. 자이스 분해 현미경으로 미세조작하여 각 교잡에 대해 4개의 접합체를 채취하여 30℃에서 2일간 성장시킨다. 생성된 균주를 단일 콜로니 분리를 통하여 일단 정제하여 교배 타입 및 2개의 반수체 부모형간의 구별이 되는 영양적 마커에 대해 시험한다. 텔로머 길이의 상보성을 검정하기 위하여, 2 내지 3개의 2배체로부터의 단일 콜로니 1개를 성장시켜 2종의 반수체 부모형 각각과 함께 서던 분석법으로 검정한다. 제시된 교잡에 대해 다수의 2배체의 성장 특징 및 염색체 안정성을 반수체 부모형과 동시에 유사하게 분석한다.

결합 분석 및 이중 돌연변이체 반수체 균주의 작제: 반대 교배형의 반수체 est 포자를 사용하여 2개의 상이한 EST 유전자에 대해 이형접합성인 2배체를 생성시킨다(또한 비-선택된 교배에 의해). 2배체를 포자형성시키고 분해시켜 세포 노화 및 텔로머 길이에 대해 포자를 분석한다. 초기에, 4개의 생존성 포자가 있는 4분체뿐만 아니라 4개 미만의 생존성 포자를 갖는 4분체를 분석하는데; 합성 치사율에 대한 증거가 수득되지 않는 경우(도 4 참조), 이후의 분석은 4개의 생존성 포자를 갖는 4분체에 대해서 집중으로 수행한다. 다음 교잡을 수행하여 새로운 상보성 그룹(EST2, EST3 및 EST4)가 서로 및 EST1 및 TLC1과 구별됨을 입증한다: (i) est2-1 x est1-△::HIS3; (ii) est2-1 x tlc1-△::LEU2; (iii) est2-1 x est3-1; (iv) est3-1 x est1-△::HIS3; (v) est3-1 x tlc1-△::LEU2; (vi) est4-1 x est1-△::HIS3; (vii) est4-1 x tlc1-△::LEU2. 각각의 교잡의 경우, ≥8 4분체를 텔로머 길이 및 노화에 대해 분석하는데, 적어도 4개의 테트라타입과 비-부모계 디타입(ditype) 4분체를 회수하여 각각에 대해 분석한다. 생성된 2배체 균주를 또한 사용하여 도 4에서 분석되는 이중 및 단일 돌연변이 반수체 균주를 작제한다. 이들 2배체를 발생시키기 위하여 사용되는 est2-1, est3-1 및 est4-1 반수체는 야생형에 3회 이상 역교잡시킨 결과이며, est1-△::HIS3 및 tlc1-△::LEU2 반수체는 각각 TLV120 및 DVL131로부터 분리된다.

est 생존 균주의 확인: 새롭게 발생시킨 est 반수체 균주 각각을 액체 YEPD 배지중에서 성장시켜, 120 내지 150 세대 동안 연속적으로 희석시키고 이어서 YEPD 플레이트상에 단일 콜로니에 대해 플레이팅시킨다. 30℃에서 2일간 성장시킨 후, 거대한 콜로니를 상기한 바와 같이 성장 표현형 및 텔로머 구조 둘다에 대해 서던 블롯상에서 조사한다.

EST2 유전자의 클로닝: 새롭게 분해시킨 est2-1 돌연변이 균주를 다음 2가지 방법을 사용하여, 게놈성 라이브러리로 형질전환시키고 노화 표현형의 상보성에 대해 선별한다:

(1) est2-1 rad52::LEU2 균주를 3종의 상이한 URA3 CEN 게놈성 라이브러리(Rose, et al. 1987)로 형질전환시키는데, 각 형질전환에 대해 대략 2000개의 형질전환체를 회수한다(est2-1 rad52::LEU2 균주의 심각한 성장 결함으로 인하여, 이는 아마도 실질적인 평가-이하의 형질전환 효율이다). 이들 1차 형질전환체중에서 상보성 클론이 명백하지 않지만; 스크래핑하여 재-플레이팅시에는 3개의 라이브러리 형질전환중 2개로부터 건강한 클론이 확인된다. 각 라이브러리 푸울로부터 1개의 단일 콜로니를 이후의 분석용으로 회수하는데; 둘다 서던 블롯상에서 검정된 바와 같이 야생형 텔로머를 갖는 것으로 밝혀졌다.

(2) 노화 진행중 중간 단계의 est2-1 균주를 2μ LEU2 라이브러리(Engebrecht, et al. 1990)로 형질전환시키고 약간의 성장 잇점을 갖는 형질전환체의 경우 40 내지 45시간후 대략 30,000개의 형질전환체를 조심스럽게 선별한다. 57개의 후보를 선택하여 단일 콜로니에 대해 연속해서 2회 스트리킹하여 노화 표현형의 상보성에 대해 시험한다. 57개의 후보중 10개가 상기 시험에 의해 건강한 성장 표현형인 것으로 밝혀졌는데; 4개는 또한 야생형 텔로머 길이를 가지며 이후 분석용으로 회수된다(나머지는 est1 돌연변이체에 대해 이미 관찰된 재조합-의존성 텔로머 우회 경로인 것으로 입증되었음; Lundblad and Blackburn 1993).

상기 3종의 라이브러리 형질전환으로부터 회수된 6개의 형질전환체의 경우, 건강한 성장 표현형과 야생형 텔로머 길이가 각 경우 플라스미드-의존성인 것으로 밝혀졌다. 이후 각 효모 균주로부터 이. 콜리(E. coli)를 통한 구조에 의해 플라스미드를 회수한다. 게놈 삽입물의 제한 맵화 및 서던 분석을 조합함으로써 2μ LEU2 라이브러리로부터 회수된 4개의 플라스미드가 서로 동일하며, URA3 CEN 게놈성 라이브러리로부터 회수된 2개의 플라스미드중에 존재하는 삽입물과 중첩되는 게놈성 삽입물을 갖는다는 것이 증명되었다. est2-1을 상보성화할 수 있는 이들 3개의 독특한 플라스미드에 공통되는 4.4 kb 서브-클론 단편을 세균성 트랜스포손 8.7 δ(Strathmann et al., 1991)을 사용하여 삽입 돌연변이시킨다. 트랜스포손에 대한 프라이머와 클론된 삽입물에 결합된 폴리링커 서열을 사용하여, PCR에 의해 삽입 돌연변이를 맵화한다. 이어서, γδ 삽입은 8.7 alt 235 트랜스포손의 우측 및 좌측 말단에 대해 독특한 프라이머를 사용하는 서열 분석용 기초를 제공하는데; 서열은 효모 게놈 서열화 프로젝트에 의해 생성된 것과 비교하여 확인한다. 내부 2.2 kb HindIII 단편을 결실시키고, EST2 ORF의 aa13 내지 aa686을 제거한 후, 1.17 kb URA3 HindIII 단편을 삽입하여 est2-△1::URA3 분쇄 돌연변이를 작제한다. 상기 분쇄물을 TVL140중에 도입시켜 EST2/est2-△1::URA3 이형접합성 2배체(균주 TVL228)를 생성시키는데, 이는 서던 분석으로 확인한다. 상기한 바와 같이 서열 및 텔로머 표현형에 대해 12개의 4분체를 상세하게 분석한다.

실시예 1

텔로머 복제 결함과 노화 표현형을 갖는 확대 수집된 에스. 세레비지애 돌연변이체의 확인

est1-1 돌연변이체의 원래의 확인은 효모 URA3 유전자를 포함하는 섬모충 텔로머 서열의 역위 반복 단위를 함유하는 환상 플라스미드의 행태를 검정하는 선별법을 이용한다(Lundblad and Szostak 1989). 야생형 세포중에서 낮은 빈도로, 상기 환상 플라스미드는 안정한 선형 형태로 전환될 수 있다. 상기 전환에는 작용성 텔로머를 형성시키기 위하여 섬모충 말단상에 효모 텔로머 서열을 부가하는 것이 필요하다. 선형으로 전환되면 URA3 유전자가 소실되기 때문에, 선형화 공정에서 결함성인 돌연변이체는 약물 5-FOA에 대한 내성 빈도가 감소되는 것으로 나타난 콜로니에 대해 선별함으로써 확인할 수 있다(Ura⁺세포는 5-FOA를 독성 중간체로 전환시키는 반면, URA3를 소실하면 이것이 방지된다; Boeke, et al. 1984). 잠재적으로, 상기 검정법에 의해 확인될 수 있는 돌연변이체의 서브세트중 하나는 또한, 일단 플라스미드가 선형화되면, 작용성 텔로머를 형성할 수 있는 능력이 결핍될 수 있는데; 상기와 같은 돌연변이체는 또한 짧은 염색체 텔로머를 나타낸다. 상기 원래의 선별로부터, est1-1 돌연변이체는 배양물의 성장이 증가됨에 따라 텔로머 길이가 급진적으로 감소되는, 상기 부류에 속하는 후보중 하나인 것으로 밝혀졌다(Lundblad and Szostak 1989). 그러나, 플라스미드 선형화 검정법의 단점중 하나는 5-FOA 내성 빈도에 대한 각 콜로니의 시험 공정이 노동-집약적이어서, 원래 선별이 단지 약 7000개의 돌연변이 콜로니로 제한된다는 것이다.

일단 확인한 후, est1-1 돌연변이체와 이후 작제된 est1-△ 균주는 둘다 추가의 관련 표현형을 2개 갖는 것으로 밝혀졌다: 세포 생존성의 점진적인 감소, 및 염색체 소실 빈도에서의 부수적인 급진적 증가로 자명해지는 노화 표현형(Lundblad and Szostak 1989). 효모로부터 추가의 est-유사 돌연변이체를 분리시키기 위하여, est1 돌연변이체에 의해 표시되는 4개의 표현형을 모두 도 1에 제시된 확대된 선별 프로토콜에 포함시킨다. 플라스미드 선형화 검정에 있어서 다수의 콜로니를 선별하는 난점으로 인하여, 상기 단계에 앞서 염색체 소실 빈도가 증가된 콜로니에 대한 강화 단계를 수행한다. 이후, 염색체 소실의 증가와 플라스미드 선형화 검정의 결함을 둘다 나타내는 후보를 서던 블롯 분석법으로 텔로머 길이의 변화에 대해 선별한다. 최종적으로, 텔로머가 짧은 분리물은 est1 및 tlc1 돌연변이체에서 이미 관측된 시간 경과에 따른 생존성에서의 특징적인 감소를 나타내는지에 대해 새롭게 생성된 반수체 돌연변이체를 조사하여, 관련된 노화 표현형에 대해 시험한다.

염색체 불안정성에 대한 est1 돌연변이 효과의 독특한 양태중 하나로 인하여, 다른 것에 사용된 표준 염색체 소실 검정법은 개량을 필요로 한다. 염색체 안정성에서의 변형 검출은 비-필수 150 kb 인공 시험 염색체(Spencer, et al. 1990)의 존재/부재를 모니터하는, 미리 전개시킨 색상-기본 가시적 검정법에 따른다. 상기 검정법, 또는 유사한 변형법을 사용하는 선별을 수회 수행하여 염색체 적합도에 영향을 주는 돌연변이체를 검출한다(Meeks-Wagner, et al. 1986; Spencer, et al. 1990; Kouprina, et al. 1988; Runge and Zakian 1993). 염색체 유지에 관련된 수많은 유전자가 집합적으로 확인되는 선행 선별법중에서 EST1 또는 본 과제에서 확인된 신규한 EST 유전자에서의 돌연변이를 검출한 것은 하나도 없었다. 이는 아마도 염색체 소실에 대한 est1 돌연변이의 효과가 표현형 lag를 나타낸다는 사실; 즉 est1 돌연변이주에서 염색체 불안정성의 어떠한 실질적 증가도 대략 40 내지 60 세대의 성장까지 관찰되지 않는다는 사실에 기인하는것 같다(Lundblad and Szostak 1989). 그러므로, 염색체 안정성에 대해 유사한 지연된 효과를 나타내는 돌연변이체를 선별하기 위해서는 돌연변이후의 과성장을 필요로 한다. 목적하는 부류의 돌연변이체가 또한 노화 표현형을 가질 것으로 생각되기 때문에, 액체중에서의 성장은 상기와 같은 돌연변이체에 대해 실질적인 선택적 불이익을 줄 것이다. 이를 방지하기 위하여, 돌연변이시킨 배양물을 염색체 불안정성에 대해 선별전에 단일 콜로니로서 2회전 성장시킨다(더욱 상세한 사항은 Materials and Methods 참조).

12개의 독립적으로 돌연변이시킨 효모 배양물로부터 총 350,000개의 단일 콜로니를 도 1에 나타낸 4개-계단식 시스템으로 선별한다. EMS를 사용하여 평균 생존률 약 50%로 돌연변이킨 배양물로부터 각각의 콜로니를 80,000 내지 150,000개의 콜로니 배치로 가공한다. 처음 2개 단계(염색체 소실 및 플라스미드 선형화 검정)로 각각 대략 20배 및 50배의 강화 단계로 된다. 이들 2가지 시험을 통과한 375개 후보의 텔로머 길이를 서던 블롯 분석하면 텔로머 길이가 감소(대략 50 bp 내지 〉300 bp 범위)되거나 증가(150 bp 내지 〉2 kb)된 49개의 돌연변이체가 확인된다. 텔로머 길이가 짧은 36개의 돌연변이체중에서, 19개는 또한 관련된 노화 표현형을 갖는다. 이들 19개의 est 돌연변이체와, 검출가능한 노화 표현형을 갖지는 않지만 이후 EST 유전자에 대해 맵화되는 것으로 밝혀진 추가의 3개의 짧은 텔로머 돌연변이체가 본 보고서의 주제이다.

4개의 유전자에 대한 신규한 est^-돌연변이체 맵: 야생형과 교잡하는 경우, est 돌연변이체는 각각 텔로머 길이, 염색체 소실 및 노화(데이타는 제시하지 않음)에 대해 열성이다. 19개의 돌연변이체는 또한 각각의 돌연변이체를 est1-△ 균주 및 tlc1-△ 균주에 교잡시킴으로써 이들이 EST1 또는 TLC1에서 돌연변이를 갖는지에 대해 시험하고; 생성된 2배체는 텔로머 길이 및 생존성 둘다에 대해 조사한다. 19개의 돌연변이주가 모두 완전히 tlc1-△ 돌연변이의 표현형을 상보성화시키는데, 이는 TLC1의 신규한 대립유전자가 확인되었음을 나타내는 것이다(데이타는 제시하지 않음). 그러나, 11개의 돌연변이체는 est1-△ 균주의 노화 및 짧은 텔로머 표현형을 둘다 상보성화시키는데 실패했다. 텔로머가 짧지만 명백한 노화 표현형은 없는 2개의 추가 돌연변이체가 또한 이후의 상보성화 분석에 의해 약한 est1 돌연변이를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 상기 상보성 데이타는 돌연변이가 야생형 EST1 유전자를 포함하는 gap를 갖는 EST1-함유 플라스미드상으로 gap-수복될 수 있음을 증명함으로써 이들 신규한 est1 대립유전자중 5개에 대해 확인되었다(C. Nugent and V. L., 미공개 데이타). 13개의 est1 대립유전자의 확인은 상기 확대된 선별로 est 돌연변이주를 검출할 수 있음을 증명하는 것이다.

나머지 8개의 est 균주를 서로에 대해 쌍-조합식으로 교잡시켜 생성된 2배체를 텔로머 길이, 염색체 소실 및 노화에 대해 분석한다. 상기 분석은 이들 8개의 돌연변이체가 3개의 신규한 상보성 그룹: EST2, EST3 및 EST4를 정의함을 나타낸다. EST2에 대해 4개, EST3에 대해 3개 및 EST4에 대해 1개의 맵화된 돌연변이가 분리된다. 텔로머가 짧지만 명백하게 야생형 성장 표현형을 갖는 1개의 추가 돌연변이체가 이후 EST3의 비-노화성 대립유전자를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 상보성 분석을 확인하기 위하여, 각각의 신규한 상보성 그룹으로부터의 1 내지 2개의 분리물에 대해 결합 분석을 수행하여 EST2, EST3 및 EST4가 각각으로부터 및 TLC1 및 EST1과 구별되는 3개의 유전자를 정의한다는 것을 확립시킨다(데이타는 제시하지 않음; 더욱 상세한 내용은 상기 재료와 방법 참조). 또한, 교잡물의 생존성 포자 4개를 갖는 4분체 6 내지 8개의 생성물을 분석한다. 모든 경우에 있어서, 감소된 텔로머 길이 및 노화는 2:2 분리를 나타내는데, 이들 2개의 표현형은 100% 동시-분리를 나타내며, 이는 단일 열성 핵 돌연변이가 가변적임을 증명하는 것이다(데이타는 제시하지 않음).

상기 선별로부터 tlc1 돌연변이체의 회수율 결여는 놀랍게도 TLC1에서의 결함이 est 돌연변이주에서 관찰되는 바와 동일한 표현형 세트를 발생시킨다는 사실을 제공하는 것이다(Singer and Gottschling 1994; 도 2, 3). 가능한 설명중 하나는 생성물이 RNA인 유전자중 수많은 EMS-유발 돌연변이가 표현형적으로 침묵성일 것으로 예측된다는 것이다. 그러나, est4 분리물 1개만이 회수된다는 사실과 함께, 본 발명자들의 수집물로부터의 tlc1 돌연변이의 부재는 아직도 추가의 EST 유전자가 확인될 수 있음을 제시하는 것이다.

est2, est3 및 est4 돌연변이체는 est1 및 tlc1 균주와 표현형적으로 구별될 수 있다: 신규한 3개의 EST 유전자가 텔로머 복제에 있어서 EST1 및 TLC1과 유사한 역할을 하는 경우, 이들 3개의 유전자에서의 돌연변이는 est1-△ 및 tlc1-△ 균주에 의해 나타나는 것과 유사한 표현형을 나타내야 한다. 이를 시험하기 위하여, 각각의 신규한 상보성 그룹으로부터 수개의 돌연변이체를 야생형과 역교잡시켜 포자형성시킨다. 새롭게 생성된 포자 생성물을 새롭게 생성된 est1-△ 반수체 균주와 함께 시간에 따라 이들의 성장 표현형과 텔로머 길이에 대해 조사한다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 새로운 est 돌연변이체 분리물은 est1-△ 및 tlc1-△ 균주와 동일한 표현형을 나타낸다. 패널 A에서, 배양물에서 연속적으로 성장시킨 게놈성 효모 DNA의 서던 블롯을 텔로머-특이적 프로브(폴리 d[GT])로 프로빙한다. 레인 1, 2, 24 및 25 EST1⁺TLC1⁺; 레인 3-6, tlc1-△::LEU2; 레인 7-10, est1-△3::HIS3; 레인 11-14, est2-1; 레인 15-18, est3-1; 레인 19-23, est4-1. tlc1, est1, est2 및 est3 균주의 경우, 총 대략 65 내지 70 세대의 성장을 나타내는 4개의 연속적인 계대-배양이 나타나는데; est4-1의 표현형이 약간 더 약하기 때문에, 5번째 계대-배양(대략 13 내지 15 세대의 추가 성장에 상응)을 포함시킨다. 레인 1 및 2와 레인 24 및 25는 각각, 동시에 조작된 2개의 EST1⁺TLC1⁺균주의 첫번째 및 4번째 계대-배양을 나타낸다. 괄호는 상기 균주(Y⁺-함유하는 것)중 텔로머의 대략 2/3를 나타내는 텔로머 밴드를 표시하며; 화살표는 각각의 비-Y⁺-함유 텔로머에 상응하는 제한 단편을 표시한다.

패널 B는 YEPD 플레이트상에서 3개의 연속적인 스트릭-아웃으로 나타낸 est1-△3::HIS3, tlc1-△::LEU2, est2-1, est3-1 및 est4-1의 생존성을 나타내는데, 약 25세대의 성장으로 서로 구별되며; est4-1의 경우, 1개의 추가적인 연속 스트릭-아웃을 나타낸다.

도 2A는 est1-△ 및 tlc1-△ 균주에 의해 나타나는 것과 비교하여, 시간에 따라 신규한 상보성 그룹 각각으로부터 대표적인 돌연변이체가 나타내는 텔로머 길이 감소를 나타낸다. 균주를 대략 80 세대 성장시키는데, 매회 대략 15 세대마다 서던 분석용 DNA를 준비한다. 각 돌연변이체중에서의 텔로머 길이는 시간에 따라 감소하며, est1-△ 및 tlc1-△ 균주에서 관찰된 바와 동일한 정도로 발생한다.

텔로머 길이 분석과 함께, 본 발명자들은 또한 이들 신규한 돌연변이체에서 시간 경과에 따른 성장 및 염색체 안정성을 분석하였다. 새롭게 분해된 돌연변이체 반수체 균주를 새롭게 생성된 est1-△ 및 tlc1-△ 반수체 균주와 함께, YEPD 플레이트상에 스트릭킹하여 3회 연속적으로 단일 콜로니를 수득한다. 신규한 est 돌연변이체는 각각 이들의 과성장에 있어서 후기에 생존성이 급격하게 감소되었다. 신규한 est2 및 est3 대립유전자 각각에 대한 성장 표현형은 EST1 및 TLC1에서의 영 돌연변이(null mutations)에 의해 나타나는 것과 정성적으로 구별될 수 있다(도 2B 및 데이타는 제시하지 않음). est4-1 돌연변이체는 또한 명확한 노화 표현형을 나타내지만, 이 경우 노화는 다른 est 돌연변이체와 비교하여 지연되는데, 이는 단일 est4 대립유전자가 약간 누설되기 쉽기 때문일 것이다. 노화 표현형과 함께, 각각의 신규한 est 돌연변이체는 또한 염색체 소실 빈도에 있어서 급격한 증가를 나타내며(데이타는 제시하지 않음); 상기 증가된 염색체 불안정성의 출현은, est1-△ 균주에 의해 이미 나타난 지연과 유사하게, 지연된다(Lundblad and Szostak 1989).

새로운 est 돌연변이체는 텔로머 유지를 위하여 est1-△ 또는 tlc1-△ 균주와 동일한 별개의 경로를 이용한다: 선행 분석은 est1 돌연변이체 배양물의 과성장 후기에, 소규모 집단의 세포가 EST1 기능의 부재 결과인 치사를 피할 수 있다고 밝힌바 있다. 이들 est1-△ 생존균주는 후기 est1 배양물에서 활성화된 텔로머 유지를 위한 우회 경로의 결과로서 발생한다(Lundblad and Blackburn 1993). 상기 별도의 경로의 활성화는 전체적인 증폭과 텔로머 G-풍부 반복단위 및 서브-텔로머 영역 모두의 재배열 결과로서 발생한다. 상기 증폭은 매우 실질적일 수 있는데; 일부 생존균주에서, 텔로머성 d(G_1-3T) 반복단위의 양은 게놈중 4%가 텔로머성 DNA로 구성되도록, 최대 40배까지 증가된다(V.L., 미공개 데이타). 상기 게놈성 재기관화의 결과로서, 텔로머 기능이 회복되고 생존균주들은 정상적인 또는 거의 정상적인 성장 표현형을 다시 획득하게 된다. 상기 경로는 RAD52 유전자를 필요로하는데, 이 유전자는 효모에서 동족체 재조합중 대다수를 중재한다; RAD52 유전자 기능의 부재시에는, est1 rad52 균주가 후기-배양 생존균주를 생성시킬 수 없으며 대신에 대략 40 내지 대략 60 세대후 완전히 사멸된다(Lundblad and Blackburn 1993). EST1과 TLC1 사이의 다른 유사성과 일치하여, tlc1-△ 균주가 또한 텔로머성 및 서브-텔로머성 DNA의 변형을 나타내는데(Singer and Gottschling 1994), 이는 RAD52-의존적이다(도 3). 상기 별도의 경로가 에스. 세레비지애의 다른 비-노화성 텔로머 복제 결함 균주에서 발생하는지에 대해서는 증명되지 않았다.

est2, est3 및 est4 균주가 또한 상기 공정에 참여할 수 있는지 시험하기 위하여, 각 돌연변이체에 대해 2 내지 3개의 분리물을 배양물중에서 120 내지 150 세대 동안 성장시키고 단일 콜로니에 대해 플레이팅한다. 각 배양물로부터 수개의 단일 콜로니를 성장 특징 및 텔로머 구조에 대해 분석한다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 새로운 est 돌연변이체는 텔로머 유지를 위하여 RAD52-의존성인 별개의 경로를 나타낸다. 패널 A는 게놈성 효모 DNA의 서던 블롯을 나타낸다. 레인 1 및 11, 상기 프로브에 의해 검출되는 λHindIII 및 단일 d(G_1-3T)-함유 4.0 kb 단편의 혼합물; 레인 2 및 10, EST1⁺TLC1⁺; 레인 3 및 9, 초기 tlc1-△::LEU2; 레인 4 내지 8, 각각 tlc1-△::LEU2, est1-△3::HIS3, est2-1, est3-1 및 est4-1로부터 분리된 생존 균주. 생존 균주(Lundblad and Blackburn 1993)에서 발생하는 Y⁺-함유 서브-텔로머성 밴드(괄호로 표시)의 증폭 정도를 입증하기 위하여, 괄호안에 표시된 더 짧은 노출 영역을 하기에 나타낸다. 프로브가 효모 d(G_1-3T) 텔로머성 반복단위를 검출하는데, 이는 Y⁺및 d(G_1-3T) 서열이 둘다 생존균주에서 고도로 증폭됨을 나타낸다.

패널 B는 2개의 연속적인 스트릭-아웃으로 나타낸, EST1⁺rad52::LEU2; tlc1-△::LEU2 rad52::LEU2; est1-△3::HIS3 rad52::LEU2; est2-1 rad52::LEU2; est3-1 rad52::LEU2; 및 est4-1 rad52::LEU2의 생존율을 나타낸다. 도 3A는 폴리 d(GT)로 프로빙한 5개의 tlc1 또는 est 균주 각각으로부터 상기와 같은 생존균주중 하나의 서던 블롯을 나타내며; 모두 d(G_1-3T) 텔로머성 DNA와 Y⁺서브-텔로머성 반복단위의 집중적인 증폭에 의해 특징되는, est1 돌연변이체에서 원래 관찰되는 것과 동일한 타입의 텔로머 재배열을 나타낸다(Lundblad and Blackburn 1993). 또한, 이들 est2, est3 및 est4 생존균주 각각은 이제 est1 생존균주에 대해 이미 관찰된 것과 유사한 야생형의 것과 매우 가까운 성장 표현형을 획득하게 된다(데이타는 제시하지 않음). 생존균주의 출현은 도 3에서 사용되는 특정 est 대립유전자에 대해 특이적이지 않으며, 노화 표현형을 나타내는 상기 돌연변이 선별에서 분리된 19개의 est 돌연변이체 모두가 생존균주를 생성시킨다(데이타는 제시되지 않음).

est2, est3 및 est4 돌연변이체로부터 생존균주를 생성시키는 과정이 또한 RAD52-의존성인지에 대해 시험하기 위하여, 각 돌연변이체를 rad52::LEU2 균주에 교잡시킨다. 생성된 2배체를 포자형성시키고 분해시켜, est 및 est rad52 반수체 균주를 동시에 분석한다. 도 3B는 rad52 돌연변이의 존재가 대략 40 내지 50 세대후 각 균주를 치사시키는 것으로 나타낸다. 또한, rad52 돌연변이의 존재시 노화 표현형의 향상 정도는 est1, est2, est3 및 tlc1 돌연변이체에서와 동일한데, 이는 이들 상이한 유전자에서의 돌연변이간의 유사성의 또다른 점을 제공한다. RAD52⁺균주에서의 est4-1 돌연변이체에 의해 나타난 약간 지연된 노화 표현형과 일치하여(도 2B), est4-1 rad52::LEU2 균주에서의 치사의 출현이 다른 est rad52 및 tlc1 rad52 돌연변이 균주에 비하여 약간 지연된다(도 3B).

텔로머 복제에 대한 단일 경로에 있어서 TLC1 및 4개의 EST 유전자 기능: 상기 비교로 EST2, EST3 및 EST4 유전자에서의 돌연변이를 포함하는 균주는 est1 및 tlc1 균주와 표현형적으로 유사하다는 것이 입증되었다; 사실, 수많은 신규한 est 분리물은 est1-△ 및 tlc1-△ 균주와 구별할 수 있는데, 이는 이들 대립유전자가 또한 영 돌연변이일 수 있음을 제시하는 것이다. 표현형에 있어서 상기와 같은 유사성은 EST1에 의해 원래 정의된 바와 같은 텔로머 복제에 대한 동일한 유전적 경로에 있어서 신규한 EST 유전자가 작용함을 주장하는 것이다. 별도의 가능성은 이들 5개의 유전자가 작용성 텔로머를 형성하기 위해서 각각 필요로 하는 경로 1개 이상에서 작동한다는 것이다. 이들 두가지 가능성은 다중 돌연변이체 조합물을 갖는 균주의 행태를 조사함으로써 구별할 수 있다. 5개의 유전자가 모두 텔로머를 복제하는데 필수적인 단일 경로에서 작용할 경우, 다중 돌연변이 균주는 표현형의 향상을 나타내지 않아야 하는 것으로 예측된다. 이는 이미 EST1 및 TLC1에 대해 증명된 바 있는데(Virta-Pearlman, et al., 제출됨), EST1이 텔로머라제의 공지된 성분에 의해 정의된 바와 동일한 생체내 경로에서 작용함을 나타낸다. 그러나, 1개 이상의 유전자가 텔로머 복제에 필요한 추가의 별도 경로에서 작용할 경우, 특정한 다중 돌연변이체 조합물이 더욱 강한 표현형을 나타낼 것으로 예측될 수 있다. 상기 논의된 텔로머 유지를 위한 백-업 우회 경로를 제거하는, rad52 돌연변이의 존재시(도 3B)에 발생하는 est 돌연변이 균주의 표현형의 실질적인 향상은 후자의 가능성의 일례이다.

이들 2가지 공식적인 가능성을 구분하기 위하여, 각각의 신규한 est 돌연변이체를 est1-△, tlc1-△ 또는 다른 est 돌연변이 균주에 대해 교잡시켜 수개의 EST/TLC1좌에서 이형접합성인 2배체를 생성시킨다. 이후 2배체를 포장형성시키고 분해시켜 야생형, 단일 돌연변이 및 이중 돌연변이 포자 생성물을 생성시킨다. 각각의 이중 돌연변이 포자를 텔로머 길이, 노화 및 염색체 소실에 대해(도 4 및 데이타는 나타나있지 않음), 단일 돌연변이체 및 야생형과 함께 분석한다. 매 경우마다, 이중 돌연변이 조합물의 경우 표현형의 향상은 관찰되지 않는다.

도 4. tlc1 및 est 돌연변이체의 상위성 분석.

A. 게놈성 효모 DNA의 서던 블롯. 레인 1, 2, 15, 16 EST1⁺TLC1⁺(도 2A에서와 같이 조작된 4개의 연속적인 계대-배양을 나타냄); 레인 2 내지 14, est1-△3::HIS3의 3개의 레인 각각(3개의 연속적인 계대-배양); est1-△3::HIS3 est2-1; est1-△3::HIS3 est3-1; 및 est1-△3::HIS3 est4-1.

B. 게놈성 효모 DNA의 서던 블롯. 레인 1, 2, 21, 22, EST1⁺TLC1⁺; 레인 3-20, tlc1-△::LEU2의 3개의 레인 각각(3개의 연속적인 계대-배양); tlc1-△::LEU2 est2-1; tlc1-△::LEU2 est3-1; tlc1-△::LEU2 est4-1; est3-1; est2-1; est3-1.

C. 2개의 연속적인 스트릭-아웃으로 나타낸 이중 돌연변이체의 생존성. 상부:(상부 좌측으로부터 시계반대방향) 야생형; est1-△3::HIS3; est1-△3::HIS3 est2-1; est1-△3::HIS3 est3-1; est1-△3::HIS3 est4-1; est2-1 est3-1; 하부: 야생형; tlc1-△::LEU2; tlc1-△::LEU2 est1-△3::HIS3; tlc1-△::LEU2 est2-1; tlc1-△::LEU2 est3-1; tlc1-△::LEU2 est4-1.

도 4A 및 4B는 적절한 단일 돌연변이 균주와 비교한 이중 돌연변이 균주의 대표적인 세트에 대한 텔로머 길이를 나타내는데; 각 균주에서 텔로머 길이는 시간이 경과됨에 따라 동일한 정도로 감소한다. 유사하게, 도 4C에 나타낸 바와 같이, 단일 돌연변이체에 비하여 이중 돌연변이 균주중 어느것에서나 노화 표현형에 있어서 어떠한 변형도 없었다. 이는 rad52 돌연변이를 est 돌연변이 균주중으로 도입시킨 결과 발생되는 노화의 강한 향상과는 대조적으로 두드러진다(도 3B 및 3C). 이런 페어방식 조합물은 신규한 EST 유전자가 각각 EST1 및 TLC1에 의해 정의된 바와 같은 텔로머 복제에 대한 동일한 경로에서 작용함을 제시하는 것이다.

여러가지 이중 돌연변이 조합물 및 이들의 반수체 카운터파트를 분석함으로써 예상하지 못했던 관찰이 밝혀졌는데, 이는 단일 돌연변이 균주의 노화 및 텔로머 단축 표현형은 이들 반수체가 EST/TLC1 경로에서의 유전자에 대해 다중 이형접합성인 2배체 부모형으로부터 유래되는 경우 약간 향상되었다. 예를들어, tlc1-△ 돌연변이만을 포함하는 반수체 균주의 노화 표현형의 시간경과는 DVL131(TLC1⁺/tlc1-△ EST1⁺/EST1⁺)로부터 유래된 동일한 동질유전성 반수체 tlc1-△ 균주와 비교하여, tlc1-△ 균주가 DVL132(TLC1⁺/tlc1-△ EST1^-/est1-△)으로부터 유래되는 경우 상승된다;(도 2B 및 4C에서 tlc1-△ 균주를 비교). 상기 추가적인 하플로-불충분성은 EST1/TLC1 조합에 대해 특이적이지 않으며, 상기 경로에 있어서 5개의 유전자의 모든 가능한 조합에 대해 관찰된다. 이들 2배체로부터의 반수체에서 관측된 상승된 표현형과 일치하여, 텔로머 길이는 단일 이형접합체와 비교하여 다중 이형접합성 2배체에서 약간 더 짧다(D.K.M., 미공개 데이타). 상이한 돌연변이의 추가적인 조합은 표현형의 향상을 나타내지 않는, 도 4에 제시된 데이타로부터 유도된 결론은 동일한 2배체 부모형으로부터 유래된 이중 및 단일 돌연변이 균주의 세트간의 비교로부터 도출된다; 도 2에서 단일 돌연변이체 반수체와의 비교는 확실하지 않다. 본 발명자들이 상기 현상에 대한 분자적 기초를 이해한 것은 아니나, 이는 유전자 투여에 있어서의 변화가 복합체 또는 상호반응하는 복합체 세트를 파괴할 수 있음을 제시한다.

EST2 유전자는 신규한 고도 염기성 단백질을 암호화한다: 높은 카피 및 낮은 카피 게놈성 라이브러리 둘다로부터, est2-1의 노화 표현형의 상보성에 의해 야생형 EST2 유전자를 클로닝시킨다(더욱 상세한 내용은 Materials and Methods를 참조). 중첩되는 삽입물을 갖는 3개의 독립적인 게놈성 클론이 확인되는데, 이들은 est2-1 돌연변이의 성장 및 텔로머 길이 표현형 둘다를 보충시킨 것이다; 고도의 카피 억제제는 확인되지 않는다. 서브-클로닝하여 est2-1을 보충할 수 있는 3개의 삽입물 모두에 공통되는 4.4 kb 게놈성 절편이 확인된다. 상기 단편을 서열화하고 또한 운반성 요소 γδ(Strathmann, et al., 1991)으로 돌연변이시켜 EST2 유전자의 유전자 경계를 확인한다.

도 5. EST2 유전자의 클로닝

A. EST2 개방 판독 프레임의 위치가 지시된, 4.4 kb 게놈성 클론의 삽입 돌연변이. 13 γδ 삽입물 각각을 텔로머 단축화 및 est2-1 돌연변이 균주의 노화 표현형의 상보성에 대해 검정한다; Est^-표현형과 완전히 상보성인 삽입물은 DNA를 나타내는 직사각형 박스위의 개방된 삼각형으로 표시되며, 상보성이 아닌 삽입물은 DNA 표시 아래에 진한 삼각형으로 표시된다. 삽입물중 하나인, 개시 AUG의 74 bp 상부-스트림은 중간 표현형을 나타내는데, 여기서 노화 표현형이 상보성이지만 텔로머 단축 표현형이 관찰된다(데이타는 제시하지 않음). EST2의 프로모터 영역중 5개의 작은 ORFs 및 폴리-A 구역의 위치가 또한 표시되어 있다.

B. 884개 아미노산 EST2 개방 판독 프레임의 서열.

C. 2개의 연속적인 스트릭-아웃으로 나타낸, est1-△, est2-△ 및 est1-△ est2-△ 균주(RAD2 및 rad52 변형 둘다)의 생존성 비교.

총 13개의 삽입 돌연변이를 분리하여, PCR 및 서열 분석으로 맵화하고, 이들의 est2-1 상보 능력에 대해 검정한다(도 5A). 4.4 kb 단편의 서열과 함께, 이들 데이타는 상보 활성이 884개 아미노산 ORF로 인한 것임을 증명하며(도 5B); 65개 아미노산보다 더 큰 추가의 ORFs는 상기 서열화된 삽입물내에서 발견되지 않았다.

EST2 유전자의 프로모터 영역은 EST1의 것에서 공통되게 발견되는 수개의 인지가능한 양태를 나타낸다. 첫째로, 두 유전자는 수많은 효모 유전자의 개시 AUG 주변에서 발견되는 공통 서열로부터 확실하게 분기한다(Hinnebusch and Liebman 1991; Galibert, et al. 1996). 또한, EST1 및 EST2의 경우, AUG 개시 코돈의 바로 상부의 영역이 다중 소형 ORFs를 암호화할 수 있는 잠재성을 가지며, 이는 효모 유전자의 프로모터 영역중에서 통상적으로 관찰되지 않는 특징이다(Cigan and Donahue 1987). 상기와 같은 상부 ORFs가 분석된 몇몇 유전자중에서, 이들은 유전자 발현의 해독 조절에 관여하는 것으로 밝혀졌다(Hinnebusch 1992). EST1 단백질 암호화 서열의 개시부의 140 bp내에는 3 내지 39 코돈 크기 범위의 5개의 중첩 ORFs가 있다(Lundblad and Szostak 1989). 유사하게, EST2 유전자의 프로모터 영역의 제1 170 bp내에는 코돈 길이가 4 내지 11인 5개의 작은 ORFs가 있다(도 5A). 이들 작은 상부 ORFs가 유전자중에서 기능적으로 상세하게 밝혀져 있지 않지만, 3개의 상부 ORFs의 클러스터중에 삽입된 γδ 분쇄물은 EST2 활성에 대해 부분적으로 결손되어 있는데(도 5A 및 데이타는 제시하지 않음), 이는 상기 영역이 EST2의 발현에 있어서 중요한 역할을 할 수 있음을 제시하는 것이다. EST1에서 발견되지 않는 EST2 프로모터의 특징중 하나는 EST2 암호화 영역의 개시부의 바로 상부의 32 bp 길이의 폴리(dA) 구역이다. 폴리(dA-dT) 구역은 이미 전사 활성화에 연루되어 있으며(Struhl 1986; Lue and Kornberg 1987); EST2 폴리(dA) 구역은, 또한 특별히 해독 개시부에 가깝지만, 프로모터 요소일 수 있다.

영 표현형을 측정하고 EST2 유전자가 클로닝되었는지 확인하기 위하여, 상기 ORF내에서 내부 결실을 제거하여 URA3 유전자로 대체시킨다. 상기 작제물을 1단계 유전자 치환에 의해 2배체 균주내로 도입시키고, 생성된 이형접합성 균주를 포자형성시키면; 4분체중 〉80%가 각각 4개의 생존성 포자를 갖는데, 이는 상기 유전자가 즉시 생존성에 있어서 필수적인 것이 아님을 나타내는 것이다. 12개의 4분체로부터 반수체 균주를 노화 및 텔로머 길이에 대해 추가로 분석하면; 12개의 4분체 모두의 경우, est 돌연변이 표현형이 URA3 마커와 동시에 100% 함께 분리된다. est2-△1의 노화 표현형은 RAD52 유전자 기능의 존재 또는 부재하에 둘다 est1-△ 균주에 의해 나타나는 것과 동일하며(도 5C); 또한, est2-1 점 돌연변이로 상기 수행된 이중 돌연변이체 분석과 일치하여, 두 유전자가 결실된 균주는 노화(도 5C) 또는 텔로머 길이(데이타는 제시되지 않음)에 대해 표현형 향상을 나타내지 않는다. 또한, est2-△1 균주는 est1-△ 및 tlc1-△ 균주에서 관찰되는 것에 필적할만한 빈도로 RAD52-의존성 생존균주를 발생시킬 수 있다.

est2-△1 돌연변이는 텔로머 길이 및 노화 둘다에 대해 est2-1 돌연변이를 상보시키지 못하며, est2-1 점 돌연변이는 플라스미드 gap-수복에 의해 EST2 암호화 영역내에서 맵화시키는 것으로 밝혀졌는데(데이타는 제시하지 않음); 이는 정확한 유전자가 클로닝되었음을 나타내는 것이다.

EST2 유전자는 데이타베이스에 있어서 다른 서열과의 유사성이 없는 신규한 103 kD 단백질을 암호화하며, 이의 기능에 대한 단서를 제공하는 어떠한 모티프도 갖지 않는다. 특히, Est2p와 섬모충 텔로머라제 효소의 2개의 단백질 아단위중 어느 하나 사이에는 어떠한 서열 유사성도 없다(Collins, et al. 1995). Est1과 유사하게, Est2는 통상적이지 않은 염기성 단백질이며: 두 단백질은 10의 pIs로 예측되었다. TLC1 및 4개의 EST 유전자는 텔로머 복제를 위해 단일 경로에서 작용한다: 상기 비교로 EST2, EST3 및 EST4 유전자중에 돌연변이를 포함하는 균주는 est1 및 tlc1 균주와 표현형적으로 유사하며; 사실, 수많은 신규한 est 분리물은 est1-△ 및 tlc1-△ 균주와 구별할 수 없는데, 이는 이들 대립유전자가 영 돌연변이일 수 있음을 제시하는 것이다. 상기 표현형의 유사성은 신규한 EST 유전자가 TLC1 유전자에 의해 원래 정의된 바와 동일한 텔로머 복제를 위한 유전자 경로에서 작용함을 주장하는 것이다.

실시예 2

야생형 EST3의 클로닝 및 서열화

야생형 EST3 유전자를 클로닝하고 서열화함으로써 EST3 유전자 생성물의 특정에 대해서와 같은 중간체 단서를 제공하지 않는 DNA 서열을 갖는 통상의 유전자 구조가 밝혀졌다. 상기 유전자의 유전자 경계내에 함유된 2개의 ORFs만이 각각 100 aa 미만이었다(도 7 및 8). 이는 (i) ORFs중 하나 또는 둘다가 유전자 기능에 필요하거나; (ii) EST3 유전자 생성물이 텔로머 복제에 필요한 ORF-약한 RNA임을 제시한다. 이들 두가지 가능성을 구별하기 위해서, 2개의 ORFs중 하나에서 작제된 일련의 비감작 돌연변이는 기능을 제거하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이들 비감작 돌연변이중 수개가 오크-억제 tRNA를 함유하는 균주 배경하에서 억제되는 것으로 밝혀졌다. 이들 데이타는 유전자 기능을 위해서는 ORFs가 둘다 해독되는 것이 필요하다는 것을 명확하게 밝히고 있다. 그러나, 별개의 프로모터로부터 해독시 상기 2개의 ORFs의 변위 발현(ectopic expression)은 유전자 기능을 회복시키지 않는다. 또한, 본 발명자들의 선별로부터 회수된 EMS 돌연변이중 하나는 2개의 ORFs 간의 영역에 대해 맵화시켰는데, 이는 상기 영역중의 유전 정보가 기능에 있어서 중요함을 나타내는 것이다. EST3 서열의 상기 영역에 대해 더욱 주의하여 재조사한 결과, 본 발명자들은 효모 레트로트랜스포손 요소인 Ty1, Ty2 및 Ty4에서 발견되는 +1 프레임-이동 부위와 공통되는 4개의 뉴클레오티드 서열(CTTA)을 확인하였는데, 이는 Est3 단백질을 생성시키기 위한 유사한 메카니즘을 제시하는 것이다.

EST3 유전자가 단백질 생성물을 생성시키는데 있어서 리보좀 프레임이동(이후 RF로 약칭)을 유사하게 이용하는지를 측정하기 위하여, EST3의 돌연변이 분석을 수행하여 Ty RF에 필요한 수개의 성분이 또한 EST3 RF에 필수적인 것임을 증명한다. Ty1 리보좀 프레임이동을 요약하기 위해서는, 상기 공정이 통상적이지 않은 류신 동수용체(isoacceptor)인 tRNALEU(UAG)에 따르는데, 이는 6개의 류신 코돈을 모두 인지할 수 있다(Belcourt and Farabaugh 1990). 다음 코돈을 탈암호화시키는 tRNA의 낮은 생존성으로 인한 해독 중단 결과로서 상기 tRNA는 CTT로부터 TTA로 슬립될 수 있다(이에 의해 +1 판독 프레임으로 슬립된다). EST3은 DNA 서열 CTT AGT TGA를 함유하는데, 여기서 AGT는 세린에 대해 희귀하게 사용되는 코돈이다(TGA는 비감작 코돈이다). 그러므로, Ty와 유사하게, 본 발명자들의 가설은 CTT 코돈에서 정지시키면, 가끔 사용되는 후속 코돈으로 인해 코돈 TTA를 판독하는 것이 누락되어 +1로 판독 프레임이 변화된다.

이를 시험하기 위하여, 3회 실험을 관찰하였다(도 11B에 나타냄):

i. CTT 코돈을 다른 류신-암호화 코돈으로 변화시켜 EST3 기능을 없앤다.

ii. 낮은(AGT)로부터 높은(TCT) 사용 세린 코돈으로 변화되어 기능을 없앤다.

iii. 서열 CTTA중 뉴클레오티드 하나를 결실시켜(리보좀 프레임이동에 대한 필요성을 없애기 위하여) 기능성 EST3 유전자를 발생시킨다.

이들 유전자 결과는 전장 Est3 181 아미노산 단백질 생산물 뿐만 아니라 프레임이동을 수행하지 않은 절단된 93 aa 생성물 둘다가 생산됨을 입증하는 웨스턴 분석으로 확인한다(도 11C).

도 11A는 EST3 유전자의 구조를 나타내며, 11B는 프레임이동 부위의 돌연변이 분석을 나타내고, 11C는 Gal4 활성화 도메인(레인 1) 및 Gal4 활성화 도메인에 융합된 Est3 단백질(레인 2)의 웨스턴 블롯 결과를 나타내는데, 이는 전장 융합 단백질 및 1차적인 ORF후 종결되는 절단된 형태를 나타낸다.

실시예 3

단백질 구조

Est2 및 Est3 단백질의 1차 구조가 결정되면 전체 단백질 및 상기 단백질의 단편을 사용하여 다른 텔로머라제-관련 단백질을 분리시킨다. 텔로머라제-관련 단백질은 텔로머라제의 정상적인 생체내 작용에 필요한 단백질로 정의된다. 이들 단백질은 텔로머라제의 촉매적 활성과 관련될 수 있거나, 한편으로, 이들 단백질은 텔로머라제 복합체의 텔로머로의 접근 능력과 관련될 수 있다.

상기 단백질의 단편은 도 5, 6 및 10에 나타낸 서열중 하나의 6개의 연속하는 아미노산과 동일한 6개 이상의 연속하는 아미노산을 함유하는 펩타이드를 포함하는 것으로 밝혀졌다. 단편은 항체를 발생시키는데 사용될 수 있다. 특히 유용한 단편은 Est2 또는 Est3 단백질의 도메인을 형성하는 것들이다. 도메인은 별개의 3차 구조를 갖는 단백질의 부분으로 나머지 단백질의 부재시 유지되는 것으로 정의된다. 상기와 같은 구조는 당해 분야의 숙련가에게 숙지된 기술에 의해 발견될 수 있다. 상기 단백질은 서브틸리신, 트립신, 키모트립신 등과 같은 프로테아제로 부분적으로 분해시킨 다음 폴리아크릴아미드 겔 전기영동시켜 단백질 단편을 분리시킨다. 이어서, 상기 단편을 PVDF 막으로 옮겨 미세 서열화시켜 상기 단편의 N-말단 아미노산 서열을 결정한다.

실시예 4

텔로머라제-관련 단백질의 발현

EST2 및 EST3 유전자의 1차 구조를 알면 통상적인 발현 시스템으로 상기 유전자를 과발현시킬 수 있다. 통상의 발현 시스템은 비제한적으로 바쿨로바이러스(baculovirus), 이. 콜리, 백시니아 바이러스(vaccinia virus) 또는 다른 등가의 발현 시스템이 포함되는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 목적을 위하여 등가의 발현 시스템은 기능적으로 활성이거나 천연 단백질과 항원적으로 유사한 단백질을 생성시킨다.

본 발명의 유전자는 천연 프로모터로부터 발현될 수 있거나 이종성 프로모터로부터 발현될 수 있다. 프로모터는 조절 요소를 함유하도록 변형시킬 수 있다.

재조합적으로 발현된 단백질의 정제가 용이하도록 하기 위하여, 이종성 단백질 서열을 함유하는 융합 단백질의 형태로 상기단백질을 발현시킬 수 있다. 예를들어, EST2 또는 EST3 또는 이들의 단편의 암호화 서열을 글루타티온-S-트랜스퍼라제(GST)에 융합시킬 수 있다. EST2 또는 EST3 유전자 또는 이들의 단편을 융합 단백질의 정제를 용이하게 하거나 확인되도록 하는데 유용한 다른 공지된 단백질 또는 펩타이드에 융합시킬 수 있다. 상기와 같은 단백질 및 펩타이드의 예로는 비제한적으로, 말토오즈 결합 단백질, 6개의 히스티딘 펩타이드, 헤마글루티닌으로부터의 에피토프, c-myc로부터의 에피토프 및 이들 목적으로 당해 분야에 공지된 다른 단백질 또는 펩타이드가 포함된다. 도 12 및 13은 N-말단 뿐만 아니라 내부 제한 부위에서 c-myc tag가 포함됨을 설명하는 특정 작제물의 플라스미드 맵을 나타낸다. 상기 동일한 작제물은 1개 이상의 이종성 단백질 서열을 함유할 수 있다. 1개 이상의 이종성 서열이 작제물중에 포함되는 경우, 이종성 서열은 동일하거나 상이할 수 있으며, 병치될 수 있거나 텔로머라제-관련 단백질로부터 유래된 서열에 의해 분리될 수 있다.

Est2 또는 Est3 단백질 또는 이의 단편은 N-말단 또는 C-말단에서 이종성 단백질에 융합시킬 수 있다. 작은 펩타이드를 융합시킬 경우, 펩타이드는 N-말단 또는 C-말단에서 융합될 수 있거나 펩타이드는 Est2 또는 Est3 단백질 또는 이들 단편의 내부에 융합될 수 있다. 바람직한 양태로 이종성 펩타이드는 헤마글루티닌 에피토프 또는 c-myc 에피토프이며, 에피토프는 N-말단, C-말단, 및 Est2 또는 Est3 단백질 또는 이의 단편에 대해 내부 위치에서 융합된다. 에피토프가 Est2 또는 Est3 단백질 또는 이의 단편에 대해 내부 위치에서 융합되는 경우, 에피토프의 위치는 단백질 또는 이의 단편의 정상적인 기능에 방해되지 않도록 선택한다.

융합 단백질은 이종성 부분이 단백분해 효소의 작용에 의해 융합 단백질로부터 분리될 수 있도록 제조할 수 있다. 즉, 단백분해 효소에 대한 인식 부위를 융합 단백질의 이종성 부분과 Est2 또는 Est3 단백질 또는 이의 단편으로부터 유래되는 부분 사이에 도입시킬 수 있다. 융합 단백질의 정제후, 융합 단백질을 단백분해시켜 융합 단백질의 이종성 부분을 제거할 수 있다.

융합 단백질의 제조, 이들의 발현, 및 생성된 융합 단백질의 정제는 당해 분야의 숙련가에게 숙지된 기술로 수행할 수 있다. 상기와 같은 기술의 예는 다음 문헌에서 발견할 수 있다[참조: Sambrook, et al., Molecular Cloning, 2nd edition and Ausubel, et al., current protocols in Molecular Biology]. 이들 공지문헌 각각의 기재 내용은 본 명세서에서 참고로 특별하게 인용된다.

도 10A 내지 10F에 나타낸 단백질 서열에 상응하는 DNA 작제물을 제조한다. 야생형 Est3 단백질에 상응하는 DNA 서열을 HA 에피토프에 대한 암호화 서열에 프레임내에서 융합된 Gal4 활성화 도메인 암호화 서열을 함유하는 플라스미드중에 삽입한다. 발현은 ADH 프로모터에 의해 추진된다. 플라스미드를 효모 균주 AVL78중으로 형질감염시키고 1.5㎖ 배양물을 중간-로그상으로 성장시킨다. 세포를 펠릿화하여 30㎕ SDS 겔 부하 완충액(125 mM Tris pH 6.8, 4% SDS, 20% 글리세롤, 2% 2-머캅토에탄올, 0.001% 브로모페놀 블루)에 재현탁시키고, 95℃에서 10분간 배양시킨다. 미세원심분리기에서 10,000rpm으로 원심분리시켜 샘플을 청정화하고 1 내지 10㎕ 샘플을 12% 아크릴아미드 겔상에서 SDS-PAGE로 분리한다. 샘플의 크기를 작제물의 발현 수준의 변화에 따라 조정한다. 단백질을 니트로셀룰로오스로 옮겨 항-HA 항체로 프로빙한다. 서양 고추냉이 퍼옥시다제 접합된 염소 항-마우스 항체 및 향상된 화학발광제(Enhanced ChemiLuminescence; Amersham)를 사용하여 단백질을 가시화한다. 도 15B의 레인 1은 HA 에피토프에 융합된 Gal4-활성화 도메인을 발현시키는 배경 플라스미드를 나타낸다. 레인 2 및 7은 도 10A에 나타낸 서열의 발현을 나타내는데, 여기서 야생형 EST3 유전자는 Gal4 활성화 도메인-HA 작제물에 프레임내에서 융합되어 있다. 93개 아미노산의 비-프레임이동 생성물(하부 밴드) 및 181개 아미노산의 전장 프레임이동 생성물(상부 밴드)에 상응하는 2개의 단백질이 발현된다. 레인 3은 도 10C에 나타낸 서열을 갖는 결실 작제물의 발현을 나타내는데, 여기서 야생형 전장 단백질의 아미노산 34-164는 결실되어 있다. 레인 4는 도 10E에 나타낸 서열을 갖는 절단 작제물의 발현을 나타내는데, 여기서 티로신 35는 정지 코돈에 돌연변이되어 있다. 레인 5는 페닐알라닌 103이 정지 코돈에 돌연변이되어 있는 절단 작제물의 발현을 나타낸다. 레인 6은 전장 181개 아미노산 Est3 단백질만을 발현시킬 수 있는 프레임 이동된 작제물의 발현을 나타낸다.

실시예 5

추가의 텔로머라제-관련 단백질을 확인하기 위한 효모의 신규한 선별법

본 실시예는 효모중 텔로머 기능에 필요한 추가의 유전자를 회수하기 위한 신규한 방법을 제안한다. 본 발명자들은 텔로머라제 기능의 부재에 감작화되는 균주 배경에 따르는 새로운 돌연변이 선별법을 기술한다. 여기에 기술되는 방법은 EST 유전자에 대한 선행 선별법보다 기술적으로 훨씬 덜 복잡하고 est-유사 결손에 대해 최대 10⁶개의 콜로니가 선별되도록 한다. 본 방법은 cdc13-1^tstlc1-△ 균주가 2개의 합성 표현형을 갖는다는 관찰에 따른다: 도 14에 나타낸 바와 같이 노화 표현형의 최대 허용 온도. 상기 관찰은 cdc13-1^ts-tlc1-△ 균주에 대해 독특한 것은 아닌데, 본 발명자들의 미공개 데이타는 EST1, EST2 또는 EST3중 하나가 결실된 cdc13-1^ts균주가 또한 이런 행태를 나타냄을 밝히고 있다. 이는 이런 것이 cdc13-1^ts배경하에 EST/TLC1 경로가 소실된 일반적인 결과임을 나타낸다. 그러므로, cdc13-1^ts돌연변이의 존재시 동일한 표현형을 제공하는 추가의 돌연변이에 대한 선별용 기본으로서 향상된 온도 감응성을 사용할 수 있다.

상기 공정은 pCDC13-URA3 플라스미드로 형질감염시킨 cdc13-1^ts균주로 개시하는 플리스미드-셔플(plasmid-shuffle) 방식을 이용한다. CDC13 유전자의 야생형 대립유전자를 함유하는 플라스미드의 존재가 상기 유전자의 염색체 카피중에서의 온도 감응성 돌연변이를 보충한다.

돌연변이후, 단일 콜로니를 CM-Ura(우라실이 제외된 완전 배지) 플레이트상에 플레이팅하여 23℃에서 배양시킨다. 이는 상기 플라스미드를 보유하는 콜로니에 대해 선택한다. 완전히 성장시킨후, 콜로니를 5-FOA 플레이트에 복제-플레이팅시켜 26℃에서 배양시킨다. 5-FOA의 존재는 상기 플라스미드의 부재에 대해 선택한다. 상기 부재의 결과로서, 존재하는 cdc13의 대립유전자만이 돌연변이 카피가 된다. 도 14에 이미 나타낸 바와 같이, cdc13의 온도 감응성 대립유전자가 EST/TLC1 경로중 돌연변이된 유전자의 존재와 배합될 경우, 온도 감응성 표현형을 악화시킨다. cdc13의 온도 감응성 대립유전자만을 포함하는 균주를 26℃에서 성장시키는 반면, 온도 감응성 cdc13 대립유전자와 EST/TLC1 경로 유전자중 제2의 돌연변이를 둘다 포함하는 균주는 26℃에서 생존할 수 없다. 5-FOA 플레이트상에 26℃에서 성장에 실패한 분리물을 CM-Ura 플레이트로부터 회수한다.

돌연변이된 배양물의 상기 1차 세트를 pCDC13-URA3 플라스미드의 존재하에서 CM-Ura 플레이트상 26℃에서의 성장에 대해 시험하고(제2 돌연변이가 일반적인 온도 감응성 표현형을 부여하는 가능성을 배제시키기 위하여), 26℃ 대 23℃에서의 5-FOA 표현형에 대해 더욱 주의하여 재-시험한다(일정 온도에서 플라스미드의 소실 불능 또는 5-FOA상에서의 성장 실패로 인한 것이 아님을 확인하기 위하여). 23℃에서 플라스미드를 소실할 수 있는 후보는 CDC13 플라스미드의 부재하에서 잠재적인 노화 표현형을 시험하는데; 도 14B에 나타낸 바와 같이, 상기 노화 표현형은 1회만의 스트릭-아웃후 자명해야 한다. 최종적으로, 이들 단계를 통과하는 후보를 텔로머 길이의 변화에 대해 조사한다(CDC13 플라스미드의 존재하에서, 서던 블롯에 충분할 정도로 성장시킴). 상기 공정은 단일 콜로니에 대한 플레이팅 및 복제-플레이팅만을 포함하기 때문에, 본 발명자들의 선행 선별법에 비해 크게 단순화된다.

실시예 6

2개-하이브리드 시스템

추가의 텔로머라제-관련 단백질을 확인하기 위하여 EST2 또는 EST3 유전자 또는 이의 단편을 사용하는 방법중 하나는 2개-하이브리드 시스템을 사용하는 것이다. 2개-하이브리드 시스템은 2개의 단백질간의 상호반응을 표시하기 위하여 전사 활성화 회복을 사용한다. 이 시스템에서는, 진핵세포 전사 활성화제, 일반적으로 효모 GAL4 전사 인자를 2개의 도메인, 즉 전사 활성화 도메인과 DNA-결합 도메인으로 나눈다. 정상 환경하에서 상기 2개의 도메인은 동일한 단백질의 일부이다. 그러나, 상기 2개의 도메인을 밀착시킬 수 있는 한, 작용성 전사 활성화제를 조립할 수 있다.

사용시, EST2 또는 EST3 유전자 또는 이의 단편을 DNA-결합 도메인에 대한 암호화 서열을 함유하는 플라스미드 벡터중으로 클로닝시킬 수 있다. 상기 유전자 또는 단편을 DNA-결합 도메인과의 프레임내 융합 단백질을 발생케하는 방식으로 벡터중에 삽입할 수 있다. DNA 라이브러리는 활성화 도메인을 함유하는 플라스미드중에서 작제한다. 상기 라이브러리는 결합 도메인 암호화 서열에 인접한 플라스미드중에 삽입하여 라이브러리에 표시된 결합 단백질과 유전자 사이에 융합 단백질을 생성시킨다. 상기 라이브러리는 랜덤 DNA 단편으로부터 작제할 수 있거나 cDNA 단편으로부터 작제할 수 있다.

2개의 플라스미드를 적절한 효모 균주중으로 동시에 형질전환시키고 동시형질전환체를 작용성 GAL4 전사 활성화제의 발현에 대해 선별한다. 상기 선별은 리포터 유전자, 예를들면 β-갈락토시다제를, GAL4 반응성 요소를 함유하는 프로모터의 조정하에 배치시켜 수행할 수 있다. 상기 라이브러리중 EST2 또는 EST3 단백질 또는 이의 단편 및 단백질간에 상호반응이 일어나는 경우, 2개의 GLA4-작용성 도메인은 최대로 밀착하게 된다. 이로써 작용성 전사 활성화제가 회복되고 리포터 유전자가 발현된다. 리포터 유전자의 발현에 대해 콜로니를 선별하고 리포터 유전자를 발현시키는 콜로니를 분리한다. 활성화 도메인 라이브러리 융합 단백질을 함유하는 플라스미드를 회수하여 상기 라이브러리 단백질의 서열을 결정한다.

상기 2개-하이브리드 선별 시스템을 수행하는데 필수적인 물질은 예를들어 Clontech로부터 상업적으로 입수가능하다.

도 10은 EST3 유전자로 제조된 수많은 GAL4 활성화 도메인 융합체의 1차 구조를 나타낸다. 도 10A는 제1 개방 판독 프레임과 전체 프레임 이동된 유전자 생성물을 둘다 발현시키는 GAL4 활성화 도메인·HA 융합체를 나타낸다. 도 10B는 프레임 이동 보정된 EST3과의 GAL4-HA 융합을 나타낸다. 도 10C는 제1 개방 판독 프레임의 처음 50개 아미노산후 절단된 결실 유도체를 나타낸다. 도 10D는 페닐알라닌 103이 정지 코돈으로 전환된 절단 돌연변이체를 나타낸다. 도 10E는 티로신 35가 정지 돌연변이로 전환된 GAL4-HA 융합 단백질을 나타낸다. 도 10F는 대략 70개 아미노산인 내부 단백질 분해 단편을 나타낸다. 도 10G는 3개의 HA 에피토프를 갖는 C-말단에서 태깅된 EST3 유전자를 나타낸다. 도 10H는 Est3 단백질이 6개의 히스티딘 아미노산과 함께 C-말단상에서 태깅된 바쿨로바이러스 발현용으로 제조된 작제물을 나타낸다.

제조된 다른 융합 단백질로는 GST-Est2 융합 단백질이 있다.

실시예 7

항체의 생산

Est2 및 Est3 단백질 또는 이들의 단편을 발현시켜 정제시킨후 상기 단백질 또는 단편을 사용하여 상기 단백질 또는 이들의 단편에 특이적인 항체를 생성시킨다. 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날일 수 있다. 항체의 생산은 당해 분야의 숙련가에게 숙지된 통상의 기술을 사용하여 수행한다. 사용되는 기술은 예를들어 다음 문헌에서 알 수 있으며, 이는 본 명세서에서 참고로 인용된다[참조: Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual].

간략하면, 단백질 또는 이의 단편을 천연 공급원으로부터 정제할 수 있거나, 별법으로, 발현 숙주상에서 이종성으로부터 정제할 수 있다. 단편을 사용할 경우, 프로테아제 효소로 처리하여 정제된 단백질로부터 단편을 제조할 수 있거나, 별법으로, 당해 분야의 숙련가에게 숙지된 고체상 합성 기술을 이용하여 합성적으로 단편을 제조할 수 있다. 정제된 단백질 또는 단편을 당해 분야의 숙련가에게 공지된 보조제, 예를들면, 프로인트 완전 보조제 또는 프로인트 불완전 보조제와 혼합할 수 있다. 보조제/단백질 혼합물을 실험실 동물중에 주사하여 면역 반응을 일으킨다. 보조제의 존재 또는 부재하에 추가의 단백질 물질을 주사하여 면역 반응을 자극시킬 수 있다. 주사 스케쥴과 양생법은 당해 분야의 숙련가에게 숙지되어 있다. 펩타이드에 특이적인 항체가 제조된 경우, 상기 펩타이트를 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH)와 같은 담체 분자, 또는 당해 분야에 공지된 다른 담체 단백질에 접합시킬 수 있다.

실시예 8

텔로머라제 기능을 억제하는 펩타이드 또는 소형 분자의 확인

항-텔로머라제 약물의 개발에 있어서 현재의 방법은 수많은 학술 및 상업적 연구실에서 추구하는, 효소 활성을 억제하는 화합물을 찾아내는 것이다. 그러나, 상기 예는 효소 자체를 억제하는 것이 아니라 효소가 텔로머에 접근하는 것을 방지함으로써, 별개의 혁식적인 텔로머라제 억제 방법에 중점적으로 연구하고 있다. 이는 본 발명자들이 염색체 말단에 텔로머라제가 접근하는데 필요한 텔로머 결합 단백질을 확인하여 특징화한 최근의 연구를 기본으로 하여, 텔로머라제 억제에 대한 신규한 개념이다. 효소 활성 및 효소 접근 둘다의 억제제를 동시에 개발함으로써 HIV 감염 치료에 있어서 프로테아제와 역전사효소 억제제를 혼합 사용하는 증가된 효과의 예를 기본으로 하여, 더욱 강력한 혼합된 항-텔로머라제 암 요법에 대한 기회를 제공할 수 있다.

효모 CDC13 유전자(본 발명자들의 est 돌연변이체 선별에서 확인)의 특징화는 텔로머 기능에 이중 역할을 가짐을 나타낸다. CDC13 유전자는 CDC13 기능 부재시 텔로머 본쇄중 하나가 신속하게 소실됨을 밝히는 리 하트웰(Lee Hartwell)의 연구실로부터의 연구에 의해 처음 제시된 바와 같이, 텔로머 통합성을 유지하는데 필요한 필수적인 효모 유전자이다. 본 발명자들의 연구실로부터의 최근 연구로 텔로머 유지에 있어서 CDC13에 대한 추가적인 역할을 밝혀내었다. 이는 텔로머라제-(-) 균주의 것과 실질적으로 동일한 표현형을 나타내는, cdc13-2eSt로 명명된 신규한 돌연변이의 발견으로부터 유래된 것이다. 또한, cdc13-2eSt 돌연변이와 tlc1-A 간의 상위성 분석으로 cdc13-2eSt가 텔로머라제 경로에 필요한 CDC13의 기능을 교란시킨다는 것이 증명되었다. 대조적으로, 이미 분리된 CDC13의 조건적 치사 대립유전자(cdc13-lts)의 유전자 분석으로 CDC13이 텔로머라제-기본 경로외에 유지되어야 하는 별개의 필수적인 기능을 갖고 있음이 밝혀졌다. 본 발명자들은 또한 정제된 Cdc13 단백질이 일본쇄 효모 텔로머성 기질에 특이적으로 결합함을 밝혀내었다. 이들 데이타를 기본으로 하여, 본 발명자들은 Cdc13이 텔로머에서 2가지 명확한 기능을 갖는다고 제안하였다. 이들 역할중 첫째는 세포 생존성에 있어서 필수적인, 염색체 말단을 보호하는 것이다. 둘째로, Cdc13 단백질은 상기 효소가 염색체 말단에 접근하는 것을 직접적으로 또는 간접적으로 매개하여 텔로머라제를 조절하고, 상기 접근은 이제 cdc13-2eSt 돌연변이에 의해 제거된다. 상기 두번째 역할은 cdc13-2eSt 돌연변이에 의해 정의된 부위에서, 돌연변이에 의해 또는 Cdc13p에 소형 분자 또는 펩타이드 억제제가 결합하는 것을 통하여 잠재적으로 염색체 말단에 효소 텔로머라제가 접근하는 것을 차단시키기 위한 기반을 제공한다. 이후 이는 텔로머에 효소가 접근하는 것을 차단하는 억제제의 확인을 통하여, 텔로머라제 활성을 억제하는 또다른 수단을 제공한다. 본 발명자들은 사람의 Cdc13 단백질을 확인하고, CDC13의 텔로머라제-관련 기능에 길항적 영향을 주는 펩타이드를 확인하기 위하여 파아지-표시된 랜덤 펩타이드 라이브러리를 사용하여, 상기 제안된 텔로머라제 부하 부위에 결합하는 펩타이드를 확인하는 수단으로서 사용할 것을 제안하였다.

랜덤 펩타이드와 소형 분자 라이브러리는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 여러가지 방법으로 선별할 수 있다. 바람직한 양태중 하나는 파아지 표시 라이브러리를 선별하는 것이다. 상기 기술은 섬유상 파아지의 파아지 피복물을 구성하는 2종의 단백질중 하나에 랜덤 펩타이드 서열을 융합시키는 방법을 사용한다. 선별 단백질에 단단하게 결합하는 파아지의 수회전 풍부화는 친화성 크로마토그라피 또는 패닝을 통하여 달성된다.

랜덤 펩타이드 라이브러리와 소형 분자 라이브러리를 둘다 선별하기 위한 별개의 방법은 시험관내 텔로머라제 검정법을 사용하여 텔로머라제의 효소 활성의 억제를 시험하는 것이다. 이런 타입의 검정법은 로보트 장비를 이용하여 용이하게 자동화시킴으로써 다량의 샘플을 신속하게 검정할 수 있다. 적합한 효소 검정법을 확립시킬 수 있는 능력 및 억제 데이타의 분석은 당해 분야의 숙련가의 기술 범위내에서 용이하다.

고도로 복잡한 라이브러리를 사용한다. 상기 라이브러리는 더 높은 친화성 리간드가 선별되도록 하는 1가 디스플레이; 구조적으로 강제된 라이브러리; 및 D-펩타이드 리간드를 나타내는 라이브러리와 같은 수많은 최근의 개량을 포함할 수 있다. 또한, 1개 이상의 라이브러리를 선별하여 회수율의 차를 증가시키고 회수된 펩타이드의 범위를 확대시킨다.

Cdc13 단백질을 사용하여 선별할 경우, 별도의 선별과 항-선별을 사용한다. 먼저 야생형 Cdc13 단백질을 사용하는 단계를 수행한다. 이는 야생형 Cdc13 단백질에 결합할 수 있는 펩타이드 및/또는 소형 분자를 선택한다. 이 단계에 이어서, 텔로머라제 복합체에 결합하는 것을 제거하는 돌연변이를 함유하는, Cdc13^est단백질을 사용한 항-선택 단계로 Cdc13 단백질상의 랜덤 부위에 결합하는 펩타이드 및 소형 분자가 제거된다. 따라서, 항-선택 단계에서는 Cdc13^est단백질에 결합하지 않는 소형 분자, 펩타이드 및 파아지가 회수된다. 각각의 라이브러리는 2회 내지 4회 선별하여 완전히 밝혀내도록 한다.

Cdc13 단백질에 결합하는 것으로 확인된 펩타이드 및 소형 분자는 텔로머라제 활성을 억제하는 능력에 대해 선별하고, 그러한 펩타이드와 소형 분자를 텔로머라제 기능을 생체내에서 방지하는데 이용하여 비제한된 복제 가능성을 방지한다. 선택 단백질이 사람의 텔로머라제 복합체로부터 유래되는 경우, 확인된 펩타이드는 종양 세포의 비제한된 복제를 억제시키기 위한 종양 치료제로서 사용된다. 선택 단백질이 병원성 유기체로부터 유래되는 경우, 상기 선별에 의해 확인된 펩타이드는 병원성 유기체의 성장을 억제하는데 사용할 수 있다.

실시예 9

4개의 EST 유전자의 포유동물 동족체의 확인

본 실시예에서는, 클로닝된 효모 EST 유전자 뿐만 아니라 est-돌연변이 균주를 등가의 사람 유전자를 수득하기 위한 시약으로서 사용하기 위한 수개의 분자 및/또는 유전자 방식을 이용하는 방법을 기재한다. 방법중 하나는 기능적 상보성이다. 효모 발현 벡터중 2개의 사람 cDNA 라이브러리의 예는 유발성 효모 GAL 프로모터로서, 이는 높은 카피 효모 셔틀 벡터(Ninomiya-Tsuji, et al., 1991)상에 존재하여 조절된 전사를 제공하며; 두번째 라이브러리는 구조적 효모 ADH1 프로모터를 사용하여 작제하고 또한 높은 카피 효모 벡터(Becker, et al., 1991)상에 존재한다. 또한, pYES2 벡터(Pearlman, Becherer and Lundblad, 미공개)중의 에스. 세레비지애 ADH 프로모터뒤의 24K 격자로부터의 2개의 상이한 cDNA 라이브러리(핵 편재화 시그날을 갖거나 갖지 않음)를 더욱 밀접하게 관련된 종으로부터 동족체를 확인하는데 사용하기 위하여 작제하였다.

새롭게 분해된 반수체 est2^:rad52^:및 est3^:rad52^:균주를 이들 라이브러리중 하나로 형질전환시키고 건강하게 성장하는 형질전환체를 확인하는데; rad52 돌연변이의 존재는 건강하게 성장하는 유도체를 발생시키는 우회 경로의 출연을 방지하는데 있어서 필수적이다(Lundblad and Blackburn, 1993). EST4/CDC13 유전자의 경우, 상기 라이브러리를 (i) est4 rad52의 노화 표현형, (ii) cdc13-ts 돌연변이의 표현형 및 (iii) est4/cdc13-의 치사율(본 실험은 전략적인 플라스미드 셔플 타입을 사용하여 수행함)의 상보성에 대해 선별하며; 이들 3가지 상이한 타입의 돌연변이 상보성은 상보성 클론을 회수하는 능력에 도움을 줄 수 있다. 동족체를 분리시키는 두번째 방법은 교잡-하이브리드화와 변성 PCR에 의한 것이다. 본 발명자들이 EST1으로 수득한 결과 뿐만 아니라 EST2, EST3 및 EST4 프로브를 사용하여 관계가 먼 종의 쥬 블롯(zoo blot)을 선별한 결과를 기본으로 하여, 본 발명자들은 약간 관계있는 종으로부터 각각의 EST 유전자에 대한 3 내지 4개의 동족체 세트를 수집하고 서열화할 필요가 있는것 같다. 상기 정보는 Est3 단백질에 대한 기호인 아미노산 서열 패턴을 찾는데 사용된다. 이들 아미노산 기호 서열은 이들 모티프를 함유하는 단백질에 대한 패턴 인식 연구 프로그램(Smith and Smith, 1990)을 사용하는 단백질 서열 데이타 베이스를 찾는데 사용된다. 상기 방법으로 확인된 단백질 서열은 본 발명자들이 Est3 후보를 확인하였음을 제시하는 추가의 서열 특징이 있는지에 대해 분석된다. 전망있는 후보는 이후 기술되는 바와 같이 더욱 상세하게 분석된다.

이들 아미노산 기호 서열을 또한 사용하여 실질적인 교잡종 점프에 사용될 고도로 보존된 영역에 대한 변성 PCR 프라이머를 고안할 수 있다. 제시된 EST 유전자중에서 고도로 보존된 영역이 2개 이상 확인될 경우, 내재된 변성 PCR 반응이 수행된다. PCR 생성물을 크기-선별하고, 클로닝하여 서열화하고, 서열 정보를 평가하여 본 발명자들이 EST 동족체를 확인하였는지에 대해 결정한다. 전망있는 PCR 클론을 사용하여 적절한 라이브러리로부터 전장 cDNAs를 확인하고 서열화한다.

사용되는 cDNA 라이브러리의 공급원은 상기한 2개의 HeLa cDNA 라이브러리이다. 둘다 효모중에서 클로닝된 사람의 유전자를 발현시키는 벡터중에 존재하기 때문에, 이는 후보 유전자가 이후 논의되는 바와 같이 효모중에서 표현형을 제공하는지에 대해 신속하게 선별할 수 있다는 잇점을 갖는다.

수가지 타입의 실험을 사용하여 정확한 유전자가 분리되었는지를 증명한다. 동족체 데이타베이스로부터 유전자가 PCR 점프에 의해 확인되면 서열 비교를 사용한다. 둘째로, 각각의 후보 cDNA를 효모중에서 유전자 표현형을 나타내는지에 대해 시험한다. 각각의 cDNA를 est3 돌연변이의 상보성에 대해 체크한다. 상보성에 대한 증거가 없는 경우, 각각의 cDNA를 야생형 효모에서 텔로머 복제에 대해 우세한 효과를 부여할 수 있는지에 대해 시험하는데; 다시 말해서, 상기와 같은 cDNA의 과-발현은 필수적인 효모 복합체(텔로머라제와 같은)의 형성을 방해함으로써 효모 텔로머 복제를 억제할 수 있다.

〈인용 문헌〉

효모 균주

균주	유전형a	공급원
YPH275	MATa/MATa CF-SUP11-TRP1	P. Hieter
TVL120	MATa/MATa EST1/est1-Δ3::HIS3 CF-SUP11-TRP1	본연구
TVL140	MATa/MATa EST1/est1-Δ3::HIS3 RAD52/rad52::LEU2 CF-SUP11-TRP1	본연구
TVL228	MATa/MATa EST1/est1-Δ3::HIS3 RAD52/rad52::LEU2 EST2/est2-Δ1::URA3 CF-SUP11-TRP1	본연구
DVL131	MATa/MATa TLC1/tlc1-Δ::LEU2 EST1/est1-Δ3::HIS3 CF-SUP11-TRP1	본연구
DVL132	MATa/MATa TLC1/tlc1-Δ::LEU2 CF-SUP11-TRP1	본연구
TVL227-1A	MATa CF-SUP11-TRP1/pVL106b	본연구
MVL6c MATa	est1-19	본연구
MVL9 MATa	est1-20	본연구
MVL11 MATa	est1-21	본연구
MVL12 MATa	est1-22	본연구
MVL16 MATa	est1-23	본연구
MVL17 MATa	est1-24	본연구
MVL18 MATa	est1-25	본연구
MVL19 MATa	est1-26	본연구
MVL20 MATa	est1-27	본연구
MVL21 MATa	est1-28	본연구
MVL22 MATa	est1-29	본연구
MVL23 MATa	est1-30	본연구
MVL24 MATa	est1-31	본연구
MVL7 MATa	est2-1	본연구
MVL8 MATa	est2-2	본연구
MVL13 MATa	est2-3	본연구
MVL14 MATa	est2-4	본연구
MVL10 MATa	est3-1	본연구
MVL15 MATa	est3-2	본연구
MVL25 MATa	est3-3	본연구
MVL1 MATa	est3-4	본연구
MVL26 MATa	est4-1	본연구

^a모든 균주는 YPH275의 동질유전자 유도체이며; 2배체는 또한 ura3-52/ura3-52 lys2-801/lys2-801 ade2-101/ade2-101 trp1-△1/trp1-△1 his3-△200/his3-△200 leu2-△1/leu2-△1을 포함하며 반수체는 ura3-52 lys2-801 ade2-101 trp1-△1 his3-△200 leu2-△1을 포함한다.

^bpVL106은 플라스미드 선형화 검정에 사용되는 ARS1 LEU2 CEN3 플라스미드이며; 상세한 것은 문헌[참조: Lundblad and Szostak 1989]를 참조하라.

^cMVL1-MVL26이 TVL227-1A로부터 유도되지만, 선별 과정중에, 수많은 돌연변이체 분리물이 CF 또는 pVL106(또는 둘다)을 소실하며; 따라서, 이들 2개의 요소는 MVL1-MVL26의 유전자형으로 표시되지 않는다.

Claims (45)

1. 적어도 도 5에 나타낸 서열을 갖는 분리된 단백질.
2. 도 5의 단백질 서열중 6개의 연속하는 아미노산과 동일한 6개 이상의 연속하는 아미노산을 갖는 펩타이드.
3. 제2항에 있어서, GAL4 DNA 결합 도메인을 추가로 포함하는 펩타이드.
4. 제2항에 있어서, GAL4 활성화 도메인을 추가로 포함하는 펩타이드.
5. 제2항에 있어서, 펩타이드 에피토프를 추가로 포함하는 펩타이드.
6. 제5항에 있어서, 상기 에피토프가 헤마글루티닌 에피토프인 펩타이드.
7. 제5항에 있어서, 상기 펩타이드 에피토프가 c-myc 에피토프인 펩타이드.
8. 제5항에 있어서, 상기 에피토프가 펩타이드의 N-말단에 융합되어 있는 펩타이드.
9. 제5항에 있어서, 상기 에피토프가 펩타이드의 C-말단에 융합되어 있는 펩타이드.
10. 제5항에 있어서, 상기 에피토프가 펩타이드의 내부에 융합되어 있는 펩타이드.
11. 도 5의 단백질 서열를 암호화하는 DNA 분자.
12. 도 5의 단백질 서열중 6개의 연속하는 아미노산과 동일한 6개 이상의 연속하는 아미노산을 갖는 펩타이드를 암호화하는 DNA 분자.
13. 적어도 도 6에 나타낸 서열을 갖는 분리된 단백질.
14. 도 6의 단백질 서열중 6개의 연속하는 아미노산과 동일한 6개 이상의 연속하는 아미노산을 갖는 펩타이드.
15. 제14항에 있어서, GAL4 DNA 결합 도메인을 추가로 포함하는 펩타이드.
16. 제14항에 있어서, GAL4 활성화 도메인을 추가로 포함하는 펩타이드.
17. 제14항에 있어서, 펩타이드 에피토프를 추가로 포함하는 펩타이드.
18. 제17항에 있어서, 상기 에피토프가 헤마글루티닌 에피토프인 펩타이드.
19. 제17항에 있어서, 상기 펩타이드 에피토프가 c-myc 에피토프인 펩타이드.
20. 제17항에 있어서, 상기 에피토프가 펩타이드의 N-말단에 융합되어 있는 펩타이드.
21. 제17항에 있어서, 상기 에피토프가 펩타이드의 C-말단에 융합되어 있는 펩타이드.
22. 제17항에 있어서, 상기 에피토프가 펩타이드의 내부에 융합되어 있는 펩타이드.
23. 도 6의 단백질 서열을 암호화하는 DNA 분자.
24. 도 6의 단백질 서열중 6개의 연속하는 아미노산과 동일한 6개 이상의 연속하는 아미노산을 갖는 펩타이드를 암호화하는 DNA 분자.
25. 제1 텔로머라제-관련 유전자에서 온도 감응성인 유기체를 제1 텔로머라제-관련 유전자의 야생형 대립유전자를 암호화하는 플라스미드로 형질감염시키는 단계(여기서, 유기체는 온도 감응성이고, 플라스미드는 선별 유전자를 암호화한다);

    유기체를 돌연변이원과 접촉시키는 단계;

    돌연변이된 유기체를 플라스미드의 존재에 대해 선별하는 물질을 함유하는 배지상에서 허용되는 온도에서 성장시키는 단계;

    유기체를 플라스미드의 존재에 대해 선별하는 물질을 함유하는 배지상에서 허용되는 온도보다 높은 온도에서 성장시키는 단계;

    허용되는 온도보다 더 높은 온도에서 성장하지 못하는 유기체를 확인하는 단계; 및

    허용되는 온도보다 더 높은 온도에서 성장하지 못하는 유기체중에서 제1 텔로머라제-관련 유전자를 제외한, 텔로머라제-관련 유전자인 돌연변이된 유전자를 확인하는 단계를 포함하는, 텔로머라제-관련 단백질을 암호화하는 유전자의 확인 방법.
26. 제25항에 있어서, 상기 유기체가 효모이고 온도 감응성인 효모의 유전자가 CDC13인 방법.
27. 제1항의 단백질과 결합하는 항체.
28. 제27항에 있어서, 상기 항체가 폴리클로날 항체인 항체.
29. 제27항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인 항체.
30. 제13항의 단백질과 결합할 수 있는 항체.
31. 제30항에 있어서, 상기 항체가 폴리클로날 항체인 항체.
32. 제30항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인 항체.
33. 제2항의 펩타이드와 결합하는 항체.
34. 제33항에 있어서, 상기 항체가 폴리클로날 항체인 항체.
35. 제33항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인 항체.
36. 제14항의 펩타이드와 결합하는 항체.
37. 제36항에 있어서, 상기 항체가 폴리클로날 항체인 항체.
38. 제35항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인 항체.
39. 화합물의 라이브러리를 텔로머라제-관련 단백질인 선별 단백질과 접촉시키는 단계; 및

    선별 단백질에 결합하는 화합물을 분리시키는 단계를 포함하는, 텔로머라제-억제 화합물의 분리 방법.
40. 제39항에 있어서, 상기 선별 단백질이 EST1 유전자에 의해 암호화되는 방법.
41. 제39항에 있어서, 상기 단백질이 EST2 유전자에 의해 암호화되는 방법.
42. 제39항에 있어서, 상기 선별 단백질이 EST3 유전자에 의해 암호화되는 방법.
43. 제39항에 있어서, 상기 선별 단백질이 CDC13 유전자에 의해 암호화되는 방법.
44. 제39항에 있어서, 상기 화합물이 펩타이드 및 소형 분자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
45. 2종 이상의 유기체중에서 텔로머라제-관련 단백질을 확인하는 단계;

    모든 유기체중에서 보존되는 1개 이상의 모티프를 확인하는 단계; 및

    보존된 모티프를 갖는 단백질이 텔로머라제-관련 단백질인, 보존된 모티프를 함유하는 단백질에 대한 데이타베이스를 조사하는 단계를 포함하는, 텔로머라제-관련 단백질에 대한 동족체의 확인 방법.