KR20000033013A - 헬리코박터 파이로리 감염의 진단방법 및 그를 위한 신속 요소분해효소 반응 키트 - Google Patents

헬리코박터 파이로리 감염의 진단방법 및 그를 위한 신속 요소분해효소 반응 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 사람이나 동물로부터 위장관 조직을 얻고;
(b) 상기 검체를 pH 2.0 내지 5.0의 산성 완충액, 특히, HCl-KCl 완충액 0.1내지 2 ㎖ 및 pH 3.0 내지 5.0에서 색상이 변하는 유효량의 지시약을 포함하는 검사액과 접촉시키며; 또
(c) 상기 검사액의 색상 변화를 측정하는 단계를 포함하고,
검사액의 색상 변화로써 사람이나 동물 위 조직에서 에이치. 파이로리의 존재를 확인하는 검출방법에 관한 것이다. 상기 검사액은 50 내지 500 mg/dL의 요소를 추가로 포함할 수도 있다. 본 발명은 또한 (a) 50 내지 500 mg/dL의 요소, (b) pH 2.0 내지 5.0의 산성 완충액, 특히, HCl-KCl 완충액 0.1 내지 2 ㎖ 및 (c) pH 3.0 내지 5.0에서 색상이 변하는 유효량의 지시약을 포함하는, 지시약에 의한 색상 변화에 의해 검체에 에이치. 파이로리가 존재함을 확인하는, 사람이나 동물의 위장관에 존재하는 에이치. 파이로리를 진단하기 위한 신속 요소분해효소반응 검사 키트에 관한 것이다.

Description

헬리코박터 파이로리 감염의 진단방법 및 그를 위한 신속 요소분해효소 반응 키트
본 발명은 사람이나 동물의 위장관에 존재하는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori: 이하, "에이치. 파이로리"로 칭함) 감염을 진단하기 위한 방법 및 그를 위한 신속 요소분해효소 반응 키트(rapid urease test kit)에 관한 것이다.
에이치. 파이로리는 1983년 마샬(Marshall)과 워렌(Warren)등에 의해서 분리된 이래 위염과 위궤양과 같은 위장관 질환의 원인균으로 알려져 왔으며, 최근에는 위암과도 연관이 있는 것으로 보고되고 있다.
에이치. 파이로리의 감염을 진단하는 방법에는 내시경을 이용하는 침습적 방법과 내시경을 이용하지 않는 비침습적 방법이 있다. 침습적 방법은 내시경을 이용하여 얻은 위 조직 검체를 이용한 배양, 그람(Gram) 염색도말, 조직학적 검사, 신속 요소분해효소반응 검사(rapid urease test) 등이 있고, 비침습적 방법에는 혈청 에이치. 파이로리 항체검사와 같은 혈청학적 검사와 호흡을 이용한 우레아 호흡 검사(urea breath test) 등이 있다.
신속 요소분해효소 반응 검사는 에이치. 파이로리의 강력한 요소분해효소(urease)의 활성도를 이용한 것으로, 마샬(Marshall) 등의 미국특허 제4,748,113호가 가장 널리 알려져 있으며, 이것은 CLOtest(Delta West, Australia)로 상품화되어 시판되고 있다. 이 검사 키트에는 요소가 1 내지 4g/dL 함유되어 있어서, 에이치. 파이로리가 조직에 있으면 에이치. 파이로리의 요소분해효소에 의해 요소가 암모니아와 CO2로 분해되고 이에 따라 겔의 pH가 6.8에서 8 이상으로 상승되면서 지시약에 의해 노랑색에서 빨강색으로 변하는 것에 의해 에이치. 파이로리를 진단하고 있다.
상술한 신속 요소분해효소반응 검사는 방법이 비교적 쉽고, 간단하여 내시경실에서 직접 실시하고 있지만, 민감도와 특이도는 82 내지 95% 정도이다. 따라서, 현재 시판되고 있는 검사 키트로는 100명당 10 내지 20명 정도의 환자는 진단하지 못할 뿐만 아니라 양성 진단에 필요한 시간도 1시간 이상 소요되는 단점이 있다.
또한, 최근에는 에이치. 파이로리가 메트로니다졸(metronidazole)에 대해 약제 내성을 갖고 있는 것으로 밝혀짐에 따라, 이 세균에 의해 유발된 질환의 치료 실패 및 재발 등이 보고되고 있어서, 배양과 항균제 감수성 검사가 함께 의뢰되고 있는 바, 이 검사를 위해서는 별도의 조직을 채취해야 하므로 환자에게 부담을 줄 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 사람이나 동물의 위 조직에 있는 에이치.파이로리의 요소분해효소를 검출하는 방법 및 민감도와 특이도가 높은 신속 요소분해효소 반응 검사(rapid urease test)를 할 수 있고 동시에 수송 배지 역할을 할 수 있는 에이치. 파이로리의 진단 키트를 개발하는 것이다.
본 발명자는 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 연구 결과, 에이치. 파이로리의 요소분해효소(urease)는 요소를 분해하여 암모니아를 생성하므로써 pH를 상승시키는 활동을 한다는 사실과 낮은 pH에서 다른 오염세균이 억제된다는 사실에 착안하여, 위조직 검체에 산성 완충액을 가하여 주변을 산성 조건으로 만들므로써, 검체에 에이치.파이로리가 존재할 경우에는 그것의 요소분해효소가 암모니아를 생성하여 pH를 향상시킴을 관찰하여 에이치. 파이로리의 존재를 확인할 수 있다는 사실을 발견하였다.
일반적으로, 사람의 혈중에는 암모니아가 존재하는 데, 위 관련 질병이 없는 정상인의 경우 흡연자는 80 ㎍/dL의 암모니아 양을 나타내는 반면, 비흡연 정상인은 10 ㎍/dL의 암모니아 양을 나타낸다.
본 발명자는 요소를 첨가하지 않은 산성 완충액, 특히, HCl-KCl 완충액에 위조직을 단순히 방치한 뒤 암모니아 양을 측정하더라도 위 관련 질병에 걸린 환자와 정상인을 구별 할 수 있을 만큼의 암모니아가 생성됨을 발견하였다. 또한, HCl-KCl 완충액에 소량의 요소를 첨가할 때는 에이치. 파이로리에 감염된 양성 환자에서 암모니아 반응성을 더 높일 수 있어서 양성 판정에 필요한 시간을 훨씬 단축할 수 있다는 사실을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 (a) pH 2.0 내지 5.0의 산성 완충액 0.1 내지 2 ㎖ 및 (b) pH 3.0 내지 5.0에서 색상이 변하는 유효량의 지시약을 포함하며, 지시약에 의한 색상 변화에 의해 검체에서 에이치. 파이로리의 존재를 확인하는, 사람이나 동물의 위장관에 존재하는 에이치. 파이로리를 진단하기 위한 신속 요소분해효소반응 검사 키트를 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 50 내지 500 mg/dL의 요소, (b) pH 2.0 내지 5.0의 산성 완충액 0.1 내지 2 ㎖ 및 (c) pH 3.0 내지 5.0에서 색상이 변하는 유효량의 지시약을 포함하며, 지시약에 의한 색상 변화에 의해 검체에서 에이치. 파이로리의 존재를 확인하는, 사람이나 동물의 위장관에 존재하는 에이치. 파이로리를 진단하기 위한 신속 요소분해효소반응 검사 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 키트는 pH 2 내지 5의 산성 완충액을 사용하고 있기 때문에 종래 기술에 비하여 pH가 2 내지 3 정도 낮아지게 되므로, 이러한 낮은 pH에서는 에이치. 파이로리 이외의 다른 균이 생존하지 못하게 되어 오염 문제가 해결된다. 따라서 에이치. 파이로리 균이 존재하는 것으로 밝혀진 검체가 든 키트를 그대로 임상 검사실로 보내어 균을 배양할 수 있게 되므로써, 이러한 키트는 수송 배지 역할도 또한 담당한다.
본 발명은 또한 (a) 사람이나 동물로부터 위장관 조직을 얻고; (b) 상기 검체를 pH 2.0 내지 5.0의 산성 완충액 0.1 내지 2 ㎖ 및 pH 3.0 내지 5.0에서 색상이 변하는 유효량의 지시약을 포함하는 검사액과 접촉시키며; 또 (c) 상기 검사액의 색상 변화를 측정하는 것을 포함하며, 상기 지시약의 검사액의 색상 변화가 위 조직에 에이치. 파이로리가 존재하는 것을 나타내는 사람이나 동물 검체에서 에이치. 파이로리의 검출방법을 제공한다.
본 발명은 또한 (a) 사람이나 동물로부터 위장관 조직을 얻고; (b) 상기 검체를 50 내지 500 mg/dL의 요소, pH 2.0 내지 5.0의 산성 완충액 0.1 내지 2 ㎖ 및 pH 3.0 내지 5.0에서 색상이 변하는 유효량의 지시약을 포함하는 검사액과 접촉시키며; 또 (c) 상기 검사액의 색상 변화를 측정하는 것을 포함하며, 검사액의 색상 변화가 위 조직에 에이치. 파이로리가 존재하는 것을 나타내는 사람이나 동물 검체에서 에이치. 파이로리의 검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 키트와 방법에서 사용되는 산성 완충액으로는 HCl-KCl 완충액이 특히 바람직하며, 이는 0.001N 내지 0.00001N의 HCl과 0.001N 내지 10.0N의 KCl을 1:5 내지 1:12 비율로 섞어 제조하며, 그것의 pH는 2.2인 것이 특히 바람직하다.
지시약으로서는 pH 3.0 내지 5 범위의 것을 사용하며, "The Merck Index"에 제시된 상기 pH 범위의 것을 사용할 수 있다. 그 중 콩고 레드가 특히 바람직하다. 콩고 레드를 지시약으로 사용하는 경우 색이 짙은 파랑색에서 빨강색으로 변하면 검사를 양성으로 판정한다. 지시약의 농도는 색상의 변화를 확인할 수 있는 량이면 유용하며, 바람직하게는 50 mg/dL에서 2 g/dL이다.
검체와 검사액의 접촉은 튜브를 단순히 방치하거나 흔들어 줌으로써 유효하게 일어날 수 있지만, 유연성 있는 튜브에 상기 검체와 검사액을 담고 이를 문질러 주므로써. 접촉 반응을 촉진하여 반응의 활성을 높힐 수도 있다.
이하, 실시예에서 본 발명의 내용을 더욱 자세히 설명하지만, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되게 해석되는 것은 아니다.
실시예 1
요소 첨가 없이 암모니아 생성
11명의 사람으로부터 얻은 위조직을 pH 2.2 의 HCl-KCl 완충액 0.5㎖에 넣고 30분 동안 항온시킨 뒤 암모니아 양을 측정하였다. 그 결과는 다음과 같았다.
피검체 에이치.파이로리 검사* NH3(㎍/dL)
1 양성 256
2 양성 229
3 음성 17
4 양성 182
5 음성 32
6 양성 703
7 양성 137
8 양성 104
9 양성 735
10 음성 17
11 양성 134
(주) *는 델타 웨스트사의 CLOtest, 배양, 조직검사, 그람염색 검사를 나타낸다.
정상인의 혈중 암모니아 농도가 10 내지 80 ㎍/dL임을 고려할 때, 상기 생성된 암모니아의 양이 정상인의 혈중 암모니아 농도 범위의 상한을 벗어나는 경우는 에이치. 파이로리에 감염된 양성으로 판정하였다. 상기 표 1로부터, HCl-KCl 완충액에 요소를 첨가하지 않아도 에이치.파이로리에 감염된 환자와 정상인을 구별할 수 있을 만큼의 암모니아가 생성됨을 알 수 있었다.
실시예 2
에이치. 파이로리의 분리에 있어서 HCl-KCl 완충액의 유용성
32명의 소화기내과 환자에게서 각기 2개의 위점막 검체를 분리하여, 한 개는 혈액 한천 배지에 접종하고 다른 한개는 HCl-KCl 완충액(0.001N HCl; 0.13N KCl, 1:10, pH 2.2)로 전처리하여 혈액 한천 배지(blood agar)에 접종하였다. 에이치. 파이로리의 증식은 3일 및 5일 후에 관찰하였으며, 그람 음성 간균이 관찰되고 옥시다제, 카탈라제 및 요소분해효소에 양성이면 에이치. 파이로리로 동정하였다.
실험 결과, 25명에서 에이치. 파이로리가 분리되었는데, HCl-KCl 완충액으로 처리되지 않은 배지에서는 23 검체에서 분리되는 반면, HCl-KCl 완충액으로 처리한 경우에는 25 검체에서 에이치. 파이로리가 분리되었다. 또한, HCl-KCl 완충액으로 처리되지 않은 배지에서는 다른 세균의 집락 숫자가 평균 76.8개인 반면에, HCl-KCl 완충액으로 처리한 배지에서는 다른 세균의 집락 숫자가 평균 9.1개이었다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
(산성 완충액으로 처리한 검체와 미처리한 검체에서 에이치. 파이로리가 분리된 검체의 수와 다른 세균의 집락 숫자)
HCl-KCl 완충액으로 미처리 HCl-KCl 완충액으로 처리
검체의 수 32 32
에이치. 파이로리가 분리된 검체의 수 23 25
오염도(CFU) 0 2 12
1 내지 10 5 11
10 내지 100 12 9
＞ 100 13 0
평균 76.8 9.1
(주) CFU: 다른 세균의 집락 숫자(Colony Forming Unit)
상기 결과로 부터, HCl-KCl 완충액으로 위내시경 검체를 처리하여 접종한 경우도 세균 오염을 현저히 감소시키고 또 에이치. 파이로리의 분리율이 증가되어 HCl-KCl 완충액의 전처리가 에이치. 파이로리 배양에 유용하다는 것을 알 수 있었다.
실시예 3
반응성을 높이기 위하여 소량의 요소 첨가
양성 환자에서의 암모니아 반응을 더욱 높이기 위하여 pH 2.2의 HCl-KCl 완충액 0.5㎖에 요소를 소량(완충액 기준 400㎎/dL) 첨가하고, 여기에 다른 에이치. 파이로리 검사법으로 양성, 음성이 판단된 13명의 피검체로부터 얻은 위조직을 각기 넣어 30분간 항온시킨 후 암모니아 양을 측정하였다. 그 결과는 다음과 같았다.
피검체 에이치.파이로리 검사* NH3(㎍/dL)
12 양성 558
13 양성 727
14 음성 17
15 음성 17
16 양성 1675
17 양성 138
18 음성 17
19 양성 851
20 양성 855
21 양성 359
22 음성 17
23 음성 17
24 음성 20
(주) *는 CLOtest, 배양, 조직검사, 그람염색 검사를 나타낸다.
표 3로부터, 소량(400㎎/dL)의 요소를 HCl-KCl 완충액에 첨가하면, 양성으로 판정된 암모니아 값이 표 1에 비하여 훨씬 증가함을 알 수 있다.
또한, 16명의 사람에 대하여, 에이치. 파이로리의 감염 여부에 대한 확인을 종래의 CLOtest(델타 웨스트사)와 본 발명의 키트에서 행한 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 실험에 사용된 HCl-KCl 완충액과 첨가한 요소의 량은 상기 조건과 동일하고 지시약으로 콩고레드를 사용하였다.
피검체 CLOtest HCl-KCl 완충액+요소+지시약
25 양성 양성
26 양성 양성
27 음성 음성
28 음성 음성
29 양성 양성
30 음성 음성
31 양성 양성
32 양성 양성
33 음성 음성
34 음성 음성
35 양성 양성
36 양성 양성
37 음성 음성
38 양성 양성
39 양성 양성
40 양성 양성
상기 표 4에서 보는 바와 같이, 에이치. 파이로리 감염 확인은 CLOtest와 본 발명의 키트에서 100% 일치하였다. 본 발명에서 감염을 확인하는데 소요되는 시간 또한 대부분 15분 이내에 결과를 판독할 수 있었다. 이것은 종래의 CLOtest가 대부분의 반응(70%)이 1시간 정도 걸리고, 95% 확인하는데 2시간, 100% 확인하는 데 24시간 정도 걸리는 것과 비교하면, 본 발명의 것이 아주 효과적인 것임을 알 수 있다.
본 발명에 따르면, 에이치. 파이로리를 HCl-KCl 완충액으로 배양함으로써 종래에는 다른 세균의 오염이 심해서 미호기성 배양을 해도 분리할 수 없었던 적이 많았으나, 산성 용액으로 처리함으로써 에이치. 파이로리의 배양시 오염율이 낮아져서 쉽게 분리할 수 있는 이점도 있다.
또한 본 발명에 따른 방법에 의하여 에이치. 파이로리를 갖는 것으로 확인된 검체는 임상병리 검사실로 보내어져서 배양될 수 있기 때문에 별도로 위조직을 채취할 필요가 없기 때문에 환자의 부담을 덜 수 있는 이점도 있다.
본 발명에 따른 에이치. 파이로리 진단방법과 그를 위한 키트는 pH가 낮은 산성 완충액, 특히, HCl-KCl 완충액과 소량의 요소만으로도 위조직이 에이치. 파이로리에 감염되었는지 여부를 간단하고 신속하게 확인할 수 있고 또한 항균제의 첨가없이 다른 세균의 오염을 방지할 수 있어 상기 세균을 배양 및 분리할 수 있다.

Claims (11)

  1. (a) 사람이나 동물로부터 위장관 조직을 얻고;
    (b) 상기 위조직을 pH 2.0 내지 5.0의 산성 완충액 0.1 내지 2 ㎖ 및 pH 3.0 내지 5.0에서 색상이 변하는 유효량의 지시약을 포함하는 검사액을 포함하는 튜브에 넣어 상호 접촉시키며; 또
    (c) 상기 검사액의 색상 변화를 측정하는 것을 포함하는,
    검사액의 색상 변화가 위 조직에 에이치. 파이로리가 존재하는 것을 나타내는 사람이나 동물 검체에서 에이치. 파이로리의 검출방법.
  2. 제 1항에 있어서, (b) 단계의 검사액에 50 내지 500 mg/dL의 요소를 더 포함하는 에이치. 파이로리의 검출방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 산성 완충액이 HCl-KCl 완충액이며, 0.001N 내지 0.00001N의 HCl과 0.001N 내지 10.0N의 KCl을 1:5 내지 1:12 비율로 섞어 제조한 완충액인 에이치. 파이로리의 검출방법.
  4. 제 1항에 있어서, 지시약의 농도가 5 mg/dL 내지 200 mg/dL인 에이치. 파이로리의 검출방법.
  5. 제 1항에 있어서, (b) 단계시 반응을 촉진시키기 위하여 검사 튜브를 문질러주는 것을 특징으로 하는 에이치. 파이로리의 검출방법.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 지시약이 콩고 레드인 에이치.파이로리의 검출방법.
  7. (a) pH 2.0 내지 5.0의 산성 완충액 0.1 내지 2 ㎖ 및 (b) pH 3.0 내지 5.0에서 색상이 변하는 유효량의 지시약을 포함하는, 지시약에 의한 색상 변화에 의해 검체에 에이치. 파이로리가 존재함을 확인하는, 사람이나 동물의 위장관에 존재하는 에이치. 파이로리를 진단하기 위한 요소분해효소반응 검사 키트.
  8. 제7항에 있어서, 50 mg/dL 내지 500 mg/dL의 요소를 더 포함하는 에이치. 파이로리를 진단하기 위한 요소분해효소반응 검사 키트.
  9. 제 7항에 있어서, 상기 산성 완충액이 HCl-KCl 완충액이며, 0.001N 내지 0.00001N의 HCl과 0.001N 내지 10.0N의 KCl을 1:5 내지 1:12 비율로 섞어 제조한 완충액인 에이치. 파이로리를 진단하기 위한 요소분해효소반응 검사 키트.
  10. 제 7항에 있어서, 상기 지시약이 콩고 레드이며, 지시약의 농도가 5 내지 200 mg/dL인 에이치. 파이로리를 진단하기 위한 요소분해효소반응 검사 키트.
  11. 제 7항 내지 제 10항 중 어느 하나의 요소분해효소반응 검사키트를 수송배지로 사용하는 방법.
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