KR20000029532A - 합성단백질폴딩촉매작용 - Google Patents

Abstract

진핵 단백질 폴딩 효소 단백질, 이황화물 이성질화효소(PDI)의 단백질 폴딩 특징 분석은 상기 효소의 촉매 활성에 대한 최소한의 충분한 모티브 및 원핵 효소, 티오레독신의 연구를 유도하였다. 이러한 연구를 근거로 하여, 상기 효소 활성을 대신할 수 있는 비단백질 촉매가 무엇인지를 추정하는데 사용된 상기 촉매 활성에대한 모델이 개발되었다. 이러한 분석을 기초로 하여, 약 8.0 미만의 pK_a및 약 -0.25V 보다 높은 E°'을 갖는 작은 분자량의 디티올 분자가 진핵 단백질의 적절한 이황화물 결합의 형성을 촉매할 수 있다는 것을 추정하였다. 그 결과, 전형적인 분자 BMC와 같은 디티올이 생체내 및 시험관내 둘 모두에서 이황화물 결합의 적절한 형성 및 단백질의 적절한 폴딩을 촉매할 수 있다는 것이 입증되었다. 이는 작은 유기 분자가 단백질 합성의 효소 시스템을 대신할 수 있게한다.

Description

합성 단백질 폴딩 촉매 작용{SYNTHETIC PROTEIN FOLDING CATALYSIS}

단백질은 아미노산으로서 공지된 서브유닛 단량체로 구성된 직쇄 중합체이다. 단백질의 화학적 특성은 단백질의 일차 구조로서 나타낸 중합체를 구성하는 아미노산의 순서에 의해 특징지어 진다. 단백질의 기능은 일차 구조 이외에 삼차 구조에도 의존적이다. 삼차 구조는 단백질이 단백질의 숙주 유기체의 세포에서 단백질 발현 메카니즘의 일부로서 삼차원 형태로 구부러지고 고정된 것을 나타낸다. 단백질에 존재하는 임의의 시스테인 잔기 사이의 이황화물 결합의 형성이 단백질의 삼차 구조를 결정하는 중요한 요소이다. 시스테인 잔기 사이의 이황화물 결합은 단백질이 특정한 삼차원 형태 또는 삼차 구조가 되게 한다. 생물학적 활성에 있어서, 적절한 삼차 구조의 형성은 진핵 세포의 소포체에서 수행되는 단백질 발현 및 프로세싱 시스템 동안 자연적으로 진핵 세포에서 수행된다.

이종 숙주 즉, 정상 상태에서는 원하는 단백질을 생산하지 못하는 유기체에서 단백질을 생산하는 것은 현대 생물학의 일반적인 공정이 되어 왔다. 사실, 효능적으로 치료학적 또는 산업적 유용성을 갖는 사람 및 포유 동물 단백질을 생산할 경우, 이러한 단백질을 일반적인 박테리아 대장균과 같은 원핵 유기체에서 생산하는 것이 가장 경제적이고, 가장 바람직하다. 원핵 숙주가 바람직한 주요 이유는 단순히 비용과 관련있으며, 관련된 편의 사항 및 기본적인 실험은 발효, 재배 및 원핵 유기체의 정제의 현대 생물학 산업에 의해 확립되었다.

포유 동물의 단백질 또는 진핵 유기체의 임의의 단백질을 발현시키기 위해 원핵 숙주를 사용하는데 있어서 주요 문제점중 하나는 발현된 단백질의 적절한 삼차 구조의 문제점이다. 단백질 발현 및 어셈블리 과정이 이종 숙주 사이에서 매우 상이하기 때문에, 이러한 원핵 숙주는 단백질 형성의 과정 동안 적당한 이황화물 결합을 형성하지 못한다. 그 결과, 원핵 숙주에서 생성되는 이종 포유 동물의 단백질은 숙주로부터 종종 다양하게 상이한 삼차 구조로 회수되며, 이들중 일부만이 원하는 생물학적 활성을 가진다. 이는 단백질 생산 시스템에서의 비효율성을 초래할 뿐만 아니라, 적절한 삼차 구조 및 생물학적 활성을 갖는 단백질을 종종 부적합하게 폴딩된 단백질로부터 분리해야 하기 때문에, 정제 단계를 추가해야 한다는 문제점을 초래한다.

진핵 세포의 소포체에서 발생하는 진핵 단백질의 폴딩 과정은 단지 부분적으로만 공지되어 있다. 진핵 세포가 단백질 이황화물 이성질화효소(PDI)로 명명된 효소를 갖는다는 것은 공지되어 있다. PDI는 57 킬로달톤의 효소로서, 단백질의 생물학적 활성에 요구되는 이황화물 결합이 정확하게 형성되도록 돕는다. 하나 이상의 PDI 형태가 모든 진핵 유기체의 소포체에서 발견되었다.

단백질의 적절한 폴딩은 상당히 과학적으로 정확하고, 영리적으로 이롭기 때문에, 단백질 폴딩의 연구를 돕기 위한 시스템들이 설계되어 왔다. 한 시스템은 PDI 효소에 대한 핵 유전자가 결핍되어, 단백질의 생물학적 활성에 요구되는 적절한 이황화물 결합의 형성을 촉매할 수 없는 효모 세포를 기본으로 한다. 이러한 효모 세포는 PDI를 생성하는 플라스미드를 잠복시킬 수 있을 정도로 오래 성장할 수 있으나, 플라스미드 PDI가 회수될 경우, 바로 죽는다. 치사로부터 PDI 결핍 효모 배양물을 보호하기 위해 변형되거나 공학적으로 처리된 형태의 PDI를 갖는 돌연변이의 능력은 이렇게 변형된 이소폼이 적합하게 단백질을 폴딩하는지로 시험된다. PDI의 기능 및 선척적이지 않은 이황화물 결합의 형성에 있어서의 PDI의 용도에 대한 조사는 라보이스시어(Laboissiere) 등의 문헌[J. Biol. Chem. 270:47:28006-28009 (1995)]에 기재되어 있다. 이러한 시험 시스템을 기본으로 하여, PDI활성에 대한 모티프가 특정 아미노산 도메인으로 구성된다는 것을 측정하는 것이 가능하다. 이러한 도메인은 분해 박테리아 효소 티오레독신(thioredoxin)과 같이 공유된다. 도메인은 컨센서스 서열 Cys-X-X-Cys 또는 C-X-X-C이며, 여기에서, X는 아미노산이다[참고 문헌: Edman, Nature 317:267-270 (1985)].

개별적으로, 다양한 다른 이유에 따라, 이황화물 결합을 약하게 하여 단백질에서 이황화물 결합을 분해시키는 것이 종종 바람직하다. 따라서, 단백질에서 이황화물 결합의 신속한 환원에 사용될 수 있는 유기 분자에 대한 일부 연구가 수행되어 왔다. 하바드의 화이트사이드스(Whitesides)가 이끄는 연구단은 이황화물 결합을 환원시키는데 사용될 수 있는 다양한 합성 시약에 대한 일련의 보고서를 출판하였다. [참고 문헌: Singh and Whitesides, J. Org, Chem. 56:2332-2337 (1991); Lamoureux and Whitesides, J. Org, Chem. 58:633-641 (1993): and Singh et al., Methods in Enzymology 251:167-173 (1995)]. 화이트사이드스 연구단은 낮은 pK_a값 및 높은 환원전위 값을 갖는 이상적인 유기 분자를 발견하기 위해 노력하였다. 이러한 특징을 이용하여, 화이트사이드스 연구단은 특정 유기 분자, 즉, 미국 특허 제 5,378,813 호에 설명된 바와 같은 이황화물 결합의 환원에 사용하는 이상적인 분자로서 2,5-디머캅토테트라메틸 아디파미드를 발견하였다. 또한, 낮은 pK_a및 높은 환원전위를 갖는 수개의 다른 합성 디티올들이 화이트사이드스 연구단에 의해 설명되었다.

발명의 요약

본 발명을 요약하면, 본 발명은 생체내 또는 시험관내 둘 모두에서 PDI의 완전한 부재하에, pK_a가 약 8.0 미만이고, 표준 환원전위(E°')는 약 -0.25 볼트를 초과하는 유기 디티올 분자가 단백질의 적절한 이황화물 결합의 형성을 촉매할 수 있다는 것이다.

본 발명을 추가로 요약하면, 본 발명은 단백질의 삼차 구조의 적절한 형성을 촉매할 수 있는 디티올 분자를 한정하는 방법을 제한하여, 상기 반응을 촉매할 수 있는 추가적인 분자를 생성하고, 확인할 수 있다는 것이다.

본 발명의 특징은 생체내 및 시험관내 둘 모두에서 디티올 화합물 BMC가 비진핵 시스템에서 생성된 진핵 단백질의 적절한 생물학적 활성 형태의 형성을 촉매할 수 있다는 것이다.

본 발명은 단순한 유기 디티올 분자를 첨가하면, 단백질이 생물학적으로 활성적인 삼차 구조로 발현되는 방식으로 숙주에서 진핵 단백질을 발현시킨다는 이점을 갖는다.

본 발명은 생체내 및 시험관내 둘 모두에서 이용될 수 있어서, 효율적이고 경제적인 방식으로 삼차 구조의 단백질을 생성시키고, 교정시킨다는 이점을 갖는다.

본 발명의 또 다른 목적, 이점 및 특징들은 첨부된 도면과 함께 하기 명세서로부터 명백히 인지할 수 있을 것이다.

도면의 간단한 설명

도 1은 본 발명에 사용된 분자의 특징을 그래픽으로 나타낸 도면이다.

도 2는 BMC 분자, 즉, 본 발명에 유용한 디티올의 구조식이다.

도 3은 단백질의 시스테인 잔기 사이의 이황화물 결합 반응을 촉매할 수 있는 세 전위 상태의 전형적인 디티올 모티프의 개략도이다.

도 4는 하기 실시예에 설명된 바와 같은 BMC의 합성 경로를 나타낸 도면이다.

도 5는 하기 실시예중 하나의 데이타를 그래프로 나타낸 도면이다.

본 발명은 분자 생물학 및 이와 관련된 일반적인 분야에 관한 것이며, 더욱 상세하게는, 유기 분자를 이용하여 선척적인 숙주 이외의 곳에서 생성된 단백질의 적절한 폴딩을 촉매하는 방법에 관한 것이다.

본 발명을 요약하면, 본 발명은 시험관내 및 생체내 둘 모두에서 한정된 종류의 작은 유기 디티올 분자가 진핵 단백질의 이황화물 결합의 적절한 형성을 촉매하여, 적절한 삼차 구조 및 적절한 생물학적 활성이 달성되는 것을 확실하게 한다는 것이다. 즉, 한 종류의 단순하고 작은 유기 분자가 이전에 불충분하게 인지되었던 진핵 세포의 진핵 시스템을 대신하여, 복합 단백질의 삼차 구조의 적절한 형성을 확실하게 한다는 것을 발견하였다. 이러한 비단백질 분자는 합성 단백질 폴딩 촉매로서 작용한다. 상기 발견은 원핵 시스템 및 세포와 무관하게 시험관내 시스템에서 생물학적으로 활성적인 진핵 단백질의 생산 문제를 아주 용이하게 하였다.

본 발명에 이르게 한 조사는 PDI 단백질의 기능성 도메인의 연구로 시작되었다. 연구는 PDI 분자의 촉매 모티프를 조장하고, 더 잘 파악하기 위해 발명자의 실험실에서 수행되었다. 연구는 돌연변이 PDI 결핍 효모를 이용하여 수행되었다. 다양한 형태의 돌연변이 PDI를 효모가 배양된 배지에 첨가하여, 어떤 PDI 효소적 모티프에 따른 변형물이 효모를 보호할 수 있음을 발견하였으며, 이는 어떤 모티프에 따른 변형물이 효모 시스템에서 적절한 단백질 폴딩을 촉매할 수 있는지를 나타낸다. PDI의 효소적 모티프는 4개의 아미노산 도메인 Cys-Gly-His-Cys이다. 활성 부위의 첫번째 시스테인 잔기는 PDI 활성에 절대적으로 중요하다는 것이 발견되었다. PDI 분자에서 이렇게 특정한 시스테인은 낮은 pK_a(6.7)를 갖는다. pK_a는 분자의 산 해리 상수의 마이너스 로그값이다. pK_a가 낮다는 것은 분자가 더욱 쉽게 이온화된다는 것을 의미한다. pK_a가 6.7이라는 것은 생리학적 시스템의 pH에서 시스템에 존재하는 PDI 분자의 시스테인 잔기중 50%를 넘는 시스테인 잔기가 이온화된다는 것을 의미한다. 이온화된 티올레이트는 우수한 친핵성을 띠며, 이는 이황화물 결합의 형성에서 초기 단계와 밀접한 관계를 갖는다.

다른 효소가 이황화물 결합의 적절한 형성을 유사하게 촉매할 수 있다는 이론하에, 본 발명자는 대장균으로부터 추출한 효소 티오레독신을 가지고 유사한 작업을 수행하였다. 티오레독신은 원핵생물에서 기능적인 PDI의 상동물이며, PDI에 존재하는 4개의 도메인중 두개의 유사한 도메인을 가지고 있다. 티오레독신은 12 킬로달톤의 매우 작은 단백질이며, 대장균의 세포질에서 발견되며, 지금까지 단백질의 재폴딩에 관계하는 것으로 인식되지 않았다. 티오레독신으로 PDI 결핍 효모를 보완하려는 시도는 실패하였다.

티오레독신과 PDI의 차이점을 연구하기 위해, 티오레독신 활성 부위(Cys-Gly-Pro-Cys)의 일련의 돌연변이를 조작하여, 이러한 돌연변이가 PDI 결핍 효모를 보호할 수 있는 지의 여부를 조사하였다. 몇개의 돌연변이는 성공적으로 보완되었으며, PDI 결핍 효모 배양물을 살아남게 하였다. 어떤 돌연변이가 효모를 보호하는지의 여부에 대한 정보를 이용하여, 성공적인 돌연변이의 입체 및 에너지 속박을 분석하여, PDI 결핍 효모를 성공적으로 보호할 수 있는 촉매에 중요한 변수가 무엇인지를 측정할 수 있게 되었다. 이러한 분석은 키버스(Chivers) 등의 문헌[EMBO J., 15:2659-2667 (1996)]에 보고되어 있다.

이러한 연구는 PDI를 대신할 수 있는 최적의 촉매가 무엇을 갖쳐야 하는지를 나타낸다. 촉매는 두개의 티올 그룹, 비교적 높은 표준 환원전위 E°' 및 비교적 높은 산 해리 상수 또는 낮은 pK_a를 가져야 한다. 이는 도 3을 참조로 하여 더 잘 이해될 수 있을 것이다.

도 3의 분자 (1)에 있어서, 단백질 모티프가 일반적인 구조식 C-X-X-C로 도시되어 있다. 분자 (1)은 시스테인 잔기의 황사이에 이황화물 결합을 갖는 산화된 형태이다. 생리학적 조건의 수용액에서, 분자 (1)은 분자 (2)와 균형을 이루면서 존재하며, 상기 분자 (2)는 분자 (1)의 모티프에서 이황화물 결합이 환원된 것이다. 생리학적 조건에서 분자 (1) 및 분자 (2)의 상대적인 존재 비율은 분자의 표준 환원전위, E°'에 의해 측정된다. 그 후, 분자 (2)는 분자 (3)과 균형을 이루며, 상기 분자 (3)은 분자 (2)가 용액에 양성자 하나를 제공한 분자이다. 분자 (2)와 분자 (3)의 상대적인 존재 비율은 분자의 산 해리 상수에 의해 측정된다. 약 8.0 미만의 pK_a를 갖는 분자는 생리학적 조건하에서 상대적으로 풍부한 분자 (3)의 형태로 존재할 것이다. 본 발명에 사용하기 위한 바람직한 티올레이트 분자는 생리학적인 조건에서 상당한 비율의 분자 (3)의 형태로 존재해야 한다.

이제 단백질 폴딩 효소의 기본이 되는 티올레이트 그룹으로서 작용하는데 필요하고 충분한 조건이 무엇인지를 알 수 있을 것이며, 단백질보다 다소 단순한 유기 분자가 PDI 및 이것의 효소적 기능을 대신할 수 있다는 것을 추정하는 것이 가능하다. 화이트사이드스 등은 이황화물 결합에 대한 효능적인 환원제로서의 다양한 디티올 분자를 연구하였다. 그러나, 단지 환원되는 이황화물 결합에 관심이 있었던 화이트사이드스 연구단은 높은 환원전위를 갖는 분자에 대해서는 관심이 없었는데, 그 이유는, 이들이 그들의 연구 목적에 상반되기 때문이다. 화이트사이드스 연구단에 의한 화학 문헌을 근거로 하여, 유기의 비단백질 티올레이트 후보 분자를 선택하였다. BMC로서 언급된 이러한 분자, N,N'-비스(2-머캅토아세틸)-1,2-디아미노시클로헥산은 도 2에 도시된 화학 구조식을 갖는다. 이 화합물은 카시나(Kasina) 등의 문헌[J. Med. Chem. 29:1933-1940 (1986)]에 따라 처음으로 합성되었다. 이러한 분자의 화학적 합성은 또한 라모녹스(Lamoureux) 및 화이트사이드스 등의 문헌[J. Org. Chem. 58:633-641 (1993)]에 의해 설명된 방법에 따라 수행될 수 있다. BMC 분자가 PDI 결핍 돌연변이 효모 배양물을 보호할 수 있으며, 이것 자체로도 이를 수행하는데 완전히 충분하다는 것을 발견하였다. 즉, 이러한 단일하고 작은 유기 분자가 생체내에서 충분한 기능을 수행하여, 자연적으로 발생하는 효소, 즉, PDI를 대신할 수 있다. 이는 BMC와 같은 작은 유기 디티올 분자를 설계하는 것이 가능하다는 것을 입증하며, 이러한 분자는 진핵 세포이외의 곳에서 생성시킨 단백질의 적절한 이황화물 형성 및 적절한 삼차 구조를 촉매할 수 있으며, 이를 수행하는데 이들 자신만으로도 충분하다.

특히, 진핵 단백질의 적절한 이황화물 결합 및 적절한 삼차 구조를 형성하는데 충분한 디티올 촉매가 있다는 것이 추정된다. 이황화물 결합의 이성질화를 효과적으로 촉매하기 위해, 디티올 분자는 두 가지 특성을 가져야 한다. 첫 째, 이들의 티올 그룹중 하나 또는 둘 모두는 생리학적 조건하에서 용이하게 이온화되어야 한다. 이를 달성하기 위해, 분자는 약 8.0 미만의 pK_a를 가져야 하며, 바람직하게는, 7.0에 가깝거나 이보다 낮아야 한다. 이러한 요건에 대한 이유는 이온화된 티올 그룹 또는 티올레이트가 수용액에서 친핵성을 띠기 때문이다. 촉매 반응은 촉매가 이황화물 결합에 친핵성 공격을 수행하는 것을 필요로 하기 때문에, 단지 낮은 pK_a를 갖는 디티올만이 촉매로서 작용할 수 있다.

둘 째, 디티올은 분자간 이황화물 결합을 형성할 수 있어야 하며, 이러한 결합은 너무 용이하게 형성되서는 안된다. 만약 분자간 이황화물 결합이 생리학적 조건하에서 너무 용이하게 형성된다면, 이는 -0.18 볼트보다 아주 낮은 E°'를 가지며, 어쨋튼 필요한 친핵성 티올은 존재하지 않을 것이다. 그러나, 너무 안정적이어서 추가로 반응할 수 없는 분자간의 이황화물 결합으로부터의 촉매를 탈환시키는데는 이황화물 결합의 형성이 중요하다. 일반적으로, 디티올은 약 -0.25V보다 높은 E°'를 가져야 한다.

따라서, 본 발명에 따른 합성 단백질 촉매는 약 8.0 미만의 pK_a를 가지며, 약 -0.25V 보다 높은 E°'를 갖는 유기 디티올로 간단하게 한정될 수 있다. 이러한 간단한 이해를 근거로 하여, 본 발명자는 디티올 분자, 즉, BMC를 선택하였으며, 하기 데이타로부터 입증된 바와 같이 상기 분자가 단독으로 진핵 단백질에서 적절한 이황화물 결합의 형성을 촉매하는데 충분하다는 것을 나타내었다.

상기에 설명된 바와 같이, 비록 pK_a및 E°'의 간단한 평가를 근거로 하는 디티올 단백질 폴딩 촉매의 선택에 대한 간단한 기준으로도 충분하지만, 이러한 변수 사이의 실질적인 관계는 다소 더 복잡하다. 사실상, 티오레독신 촉매 모티프의 연구를 근거로 하여, 일반화된 화학식을 유도하여, 어떤 디티올이 이러한 기능을 하는지를 측정하였다.

디티올 촉매를 설명하기 위해 유도된 방정식은 하기와 같다:

상기 식에서, n = 2, F = 96,487 C/mol, R = 8.314 J/(K·mol) 및 T ~ 310K이다. pK_a1및 pK_a2값은 첫 번째 및 두 번째 티올 그룹의 pK_a를 의미한다.

상기 방정식(1)에 있어서, 방정식의 오른쪽은 두개의 항을 포함한다. 첫 번째 항은 네를스트 방정식으로부터 유도됐으며, 이는 E°' = ~-0.18 볼트인 환경에서 환원된 형태로 존재하는 디티올 촉매의 분율을 나타낸 것이다. 이러한 조건은 진핵 세포에서 이황화물 결합이 형성되는 소포체를 나타낸 것이다. 두 번째 항은 헨더슨-하슬바치 방정식(Henderson-Hasslebach equation)으로부터 유도됐으며, 이는 소포체에 존재하는 바와 같이 pH가 약 7.0인 환경에서 이온화된 하나 이상의 티올 그룹을 갖는 환원된 티올 형태의 분율을 나타낸다. 이러한 방정식에 의해 한정된 표면은 도 1에 도시되어 있다.

디티올 촉매의 선택에 방정식 (1)을 이용하기 위해, 디티올 촉매가 E°' = -0.18 볼트, pK_a1= 7.0 및 pK_a2= 9.0이라고 하자. 소포체에서, 이러한 가상적인 촉매는 이들의 E°'가 환경의 값과 동일하기 때문에 반은 환원되고 반은 산화될 것이다. 따라서, 방정식 (1)의 첫 번째 항은 2분의 1일 될 것이다. 이렇게 환원된 형태는 단지 네가지 상태로 존재할 수 있는데, 한 상태에서는 어떤 티올 그룹도 이온화되지 않은 것이며, 또 한 상태는 티올 그룹 모두가 이온화된 것이며, 두가지의 또 다른 상태는 한 티올 그룹이 이온화되고, 다른 티올 그룹은 이온화되지 않은 것이다. 티올레이트, 즉, 이온화된 티올 그룹을 함유하는 환원된 분자의 분율은 모두 양성자화된 분율으로부터 가장 용이하게 계산될 것이다. 티올 그룹 (1)의 pK_a가 소포체의 pH와 동일하기 때문에, 그룹 (1)의 티올은 환원된 분자의 반이 양성자화될 것이다. 첫 번째 티올 그룹과는 달리 두 번째 티올 그룹은 소포체의 pH보다 두 단위 더 높은 pK_a를 갖는다. 따라서, 두 번째 티올 그룹은 분자중 약 99%가 양성자화될 것이다. 따라서, 둘 모두의 티올 그룹은 환원된 분자의 약 반이 양성자화될 것이며, 분자의 약 반은 티올레이트 형태의 하나 또는 둘 모두의 티올을 갖는다. 따라서, 두 번째 항은 약 2분의 1(사실상, 101분의 51)이며, 따라서, 이러한 가상 촉매의 티올레이트 분율은 약 4분의 1이 될 것이다.

상기에 설명된 돌연변이 대장균 티오레독신은 진핵 세포에서 이황화물 결합 이성질화의 촉매 반응을 발생시킬 수 있는 E°' 및 pK_a의 조합을 측정하는데 사용되었다. 이러한 데이타는 수개의 E°' 및 pK_a의 조합이 실제로 기능적인 단백질 촉매를 제공한다는 것을 나타낸다. 또한, 상기 방정식 (1)에 의해 계산된 바와 같은 티올레이트 분율이 디티올 촉매에 함유된 세포의 생존력과 관계있음을 발견하였다. 이러한 결과는 성공적인 촉매를 설명하기 위해 변수로서의 "티올레이트 분율"의 중요성을 강조한다. 동일한 변수가 단백질 및 비단백질 촉매 둘 모두에 적용가능하다. PDI 돌연변이 효모의 건강하게 생존가능한 개체군을 증가시키는 가장 낮은 분율의 티올레이트는 효소적 그룹 CGHC를 갖는 티오레독신의 돌연변이에서와 동일한 0.011 분율의 티올레이트이다. 이러한 요건은 최소한의 것으로 여겨진다. 즉, 성공적인 이황화물 촉매를 위해서, 티올레이트 분율은 하기 방정식에서 정의된 바와 같이 0.01보다 높아야 한다:

세가지의 변수, 즉, 티올레이트 분율, E°' 및 pK_a를 관련시키는 또 다른 방식은 삼차원 좌표이다. 이러한 좌표는 도 1에 도시되어 있다. 와일드형 PDI 및 와일드형 티오레독신(Trx)에 대한 티올레이트 분율의 값을 도 1의 좌표에 나타내었다. 이 좌표에서, PDI 및 티오레독신 둘 모두에 대해서와 같이, pK_a2는 7.0보다 훨씬 높다. 두 번째 티올 그룹에 대한 pK_a가 첫 번째 티올 그룹의 pK_a보다 훨씬 높은 조건 또는 최소한의 이런 조건은 또한, 바람직한 합성 디티올에 해당하는데, 그 이유는, 하나의 티올 그룹의 탈이온화상에 형성된 음전하가 두번째 티올 그룹의 탈이온화를 더욱 어렵게 하기 때문이다. 도 1의 삼차원 그래프에서 회색 및 백색 표면사이의 경계선은 0.01과 동일한 티올레이트 분율에 대한 선을 나타낸다. 백색 표면상의 디티올 촉매는 상기 방정식 (2)을 따른다. 이러한 백색 표면상의 합성 디티올은 유기 단백질 폴딩 촉매를 충분히 입증할 것으로 여겨진다.

비진핵 시스템에서의 진핵 단백질의 생성 이외에, 진핵 단백질의 폴딩을 교정하는 작용을 하는 작은 유기 분자를 지정할 수 있는 능력은 이러한 분자에 대한 다른 가능한 유용성을 나타낸다. 몇가지의 중요한 질병, 특히, 유전적 질환은 단백질 폴딩의 결함에 의해 발생하는 질환과 관계되어 왔다. 이러한 질환은 낭포성섬유증, 가족성 콜레스테롤과잉혈증(familial hyperchlosterolemia), 알파 1-안티트립신 결핍증, 마르팡 증후군, 근위축성측삭경화증, 불완전골형성증 및 암의 특정한 형태를 포함한다. 단백질 폴딩 촉매로서 제공된 본원에 설명된 합성 촉매는 이러한 질환 및 다른 단백질 폴딩과 관련된 질환을 치료하는데 기초를 두고 있다. 특히, 합성 폴딩 촉매제의 투여가 세가지의 가능한 메카니즘중 하나에 의해 환자에게 이로울 수 있다는 것이 고려되었다. 첫 번째는 합성 단백질 폴딩 촉매가 질환의 원인이 되는 이상한 단백질의 적절한 폴딩을 촉매함으로써 직접적으로 작용할 수 있다는 것이다. 두 번째 메카니즘은 합성 폴딩 촉매가 전반적으로 더욱 효과적으로 병에 걸린 세포의 단백질 폴딩 공작을 유도하여 선척적인 메카니즘이 높은 퍼센테이지의 부적합하게 폴딩된 단백질을 더욱 우수하게 폴딩시킴으로써 간접적으로 작용할 수 있다는 것이다. 세 번째는, 질환에 의해 차례로 영향을 받는 단백질의 폴딩을 촉매함으로써 합성 폴딩 촉매가 질환이 원래 유발하는 것보다 다소 질환의 증상을 개선시킬 수 있다는 것이다.

낭포성섬유증을 예로 들어 보자. 이 질환은 낭포성섬유 전도 조절체(CFTR) 단백질을 코드화하는 유전자의 돌연변이에 의해 발생하는 치명적인 유전 질환이다. 낭포성섬유증의 약 70%가 CFTR 단백질 서열의 아미노산 508인 페닐알라닌 잔기의 손실에 의해 초래된다. 페닐알라닌 잔기의 삭제는 △F508 CFTR의 부적절한 프로세싱을 초래한다. 적합하게 프로세싱된 △F508 CFTR은 기능적이며, 따라서, 돌연변이만이 최종 단백질로의 단백질 폴딩에 영향을 끼친다. 본원에 설명된 바와 같은 합성 단백질 폴딩 촉매의 투여는 낭포성섬유증을 앓고 있는 환자에게 잠재적으로 이로울 수 있는 것으로 추정된다. 상기 투여는 합성 단백질 폴딩 촉매의 에어로졸 침전의 흡입에 의해 수행될 수 있다. 합성 단백질 폴딩 촉매는 간접적으로 또는 직접적으로 △F508 CFTR의 폴딩을 돕는 작용을 한다. 대안적으로, 합성 단백질 폴딩 촉매는 호흡 곤란 및 진행성 폐 질환을 포함한 질환의 증상을 개선시킬 수 있다. 환자는 본원에 설명된 형태의 합성 단백질 폴딩 촉매에 대해 우수한 내성을 갖는데, 그 이유는, 합성 단백질 폴딩 효소의 E°'가 예를 들어, DTT와 달리 진핵 세포의 E°'와 유사하기 때문이다.

실시예 1

BMC의 합성

BMC를 카시나의 문헌[J. Med. Chem. 29:1933-1940 (1986)] 및 라모녹스 등의 문헌[J. Org. Chem. 58:633-641 (1993)]에 의해 보고된 경로와 유사한 도 4의 경로로 합성하였다.

1,2-디아미노시클로헥산을 트랜스 이성질체와 시스 이성질체의 혼합물로서 알드리취(Aldrich)(밀워키에 소재)로부터 구입하였으며, 추가적 정제 없이 사용하였다. 용매 및 다른 시약을 통상적인 공급원으로부터 구입하였으며, 추가적 정제 없이 사용하였다. 1,2-디아미노시클로헥산(1.1g, 10mmol)과 K₂CO₃(2.8g, 20mmol)을 50ml의 얼음같이 찬 증류수에 용해시켰다. 클로로아세틸 클로라이드(1.7ml, 21mmol)을 한 방울씩 첨가하고, 이 용액을 교반시켰다. 생성된 불투명한 백색 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반시켰다. 흡인 깔때기로 여과시켜 한랭 혼합물로부터 침전물을 모았다. 침전물을 차가운 증류수로 세척하고, 감압하에 건조시켰다. 비스(클로로아세틸) 생성물(0.68g, 25%)을 백색 분말로서 수득하였으며, 이는 NMR 분광분석 결과, 순수한 것으로 판명되었다.

비스(클로로아세틸) 생성물(0.67g, 2.5mmol)을 120ml의 메틸렌 클로라이드에 용해시키고, 이 용액을 0℃로 냉각시켰다. 냉각 용액을 교반시키면서, 티올아세트산(0.42ml, 5.8mmol)을 한 방울씩 첨가하였다. 그 후, 트리에틸아민(0.80ml, 5.8mmol)을 교반시키면서 첨가하였다. 생성된 용액을 실온으로 천천히 가온시키고, 20 시간 동안 질소 가스하에 교반시켰다. pH 4의 아세트산 완충액을 첨가함으로써, 반응을 중지시켰다. 분별 깔때기에서 층을 분리시킨 후, 유기 층을 건조시키고, 여과시키고, 농축시켜, 백색 분말을 수득하였다. 이 분말을 에틸 아세테이트로부터 재결정함으로써 정제하였다. 비스(티올아세테이트) 생성물(0.25g, 30%)을 백색 분말로서 수득하였으며, 이는 NMR 분광분석 결과, 순수한 것으로 판명되었다.

비스(티올아세테이트)(0.24g, 0.7mmol)를 메탄올중의 1.2M HCl 15mL에 용해시켰다. 생성된 투명한 용액을 실온에서 20시간 동안 인큐베이션하였다. 용매를 감압하에 제거하여, 황색 오일을 수득하였다. 오일을 최소량의 메탄올에 용해시키고, 생성 용액을 건식 아이스/아세톤 중탕기에서 냉각시켰다. 상청액을 따르고, 백색 침전물을 감압하에 건조시켜, 백색 고형물로서의 BMC(102mg, 56%)를 수득하였으며, 이는 NMR 분광분석 결과, 순수한 것으로 판명되었다. NMR 스펙트럼 피크의 통합에 의해 BMC가 6.5:1의 트랜스 이성질체와 시스 이성질체의 혼합물인 것으로 판명되었다.

실시예 2

PDI 결핍 효모의 보호

생체내에서 단백질 폴딩을 촉매하는 합성 디올 단백질 촉매의 능력을 진핵 세포에서 PDI의 기능을 대체할 수 있는지의 여부로 시험하였다. 이러한 절차에 사용된 세포는 pdi1Δ 맥주 효모균(Saccharomyces cerevisiae)이며, 이는 발현된 효소의 역기능을 나타내게 하는 PDI1 유전자가 결실된 것이다. PDI1 유전자는 맥주 효모균의 생존에 중요한 유전자이다. 이러한 세포를 살리기 위해서, 세포는 맥주 효모균 PDI의 발현을 유도하는 플라스미드를 함유한다. 상기 플라스미드는 또한, URA3 유전자 생성물의 발현을 유도한다. 이러한 세포를 맥주 효모균에 유독한 URA3 유전자 생성물을 생성시키는 5-플루오로오로트산(5-FOA)을 함유하는 최소 배지의 플레이트에 스트리킹(streak)하였다. 따라서, 이는 플라스미드가 존재하지 않는 것을 선택하며, 살아남은 세포는 플라미스드 및 PDI를 갖지 않을 것이다.

이러한 실험을 또한, 0 또는 10mM BMC를 함유하며, 5-FOA를 함유하는 플레이트에서 수행하였다. 살아남은 콜로니는 5일째에 10mM BMC 플레이트상에서 나타났다. BMC가 없는 플레이트에는 살아남은 콜로니가 없었다.

그 후, BMC로 보호된 콜로니로부터 추출된 세포를 BMC가 없는 리치 배지(rich medium)에 플레이트시켰다. 보호된 세포는 모든 효모 영양분이 존재함에도 불구하고 이 배지에서 살아남지 못했다.

이것과 동일한 공정을 이황화물 결합 환원제 디티올트리에톨(DTT)로 반복하였다. DTT는 BMC보다 높은 Pk_a및 낮은 E°'를 갖는 저분자량의 디티올이다. DTT를 사용할 경우, 5-FOA를 첨가한 후, PDI 결핍 계통으로부터 살아남은 효모 콜로니가 존재하지 않았다.

이는 BMC가 생체내의 진핵 세포에서 PDI를 대신하여, 비선천적인 이황화물 결합을 형성시킬 수 있다는 것을 입증한다. 따라서, BMC는 생체내에서 PDI의 활성을 대신할 수 있는 돌연변이 티오레드독신과 같이 기능적으로 작용할 수 있다.

실시예 3

시험관내에서 생성된 단백질의 프로세싱

BMC 활성의 시험관내 분석

이황화물 결합은 산화 환경에서 용이하게 형성된다. 그러나, 이러한 이황화물 결합은 단백질의 활성 형태로 선천적으로 존재할 수 있는 것은 아니다. 합성 단백질 폴드아제에서 바람직한 특성은 비선천적인 이황황물 결합의 형성을 촉매할 수 있는 능력이다. 시험관내에서 비선천적인 이황화물 결합의 형성을 촉매하는 BMC의 능력을 이전에 보고된 방법과 유사한 방법으로 분석하였다. [참고 문헌: Laboissiere et al., Protein Express. Purif., 6:700-706 (1995)].

이러한 분석은 우수한 특성을 나타내는 효소인 리보누클레아제 A에서의 이황화물 결합을 기초로 한다. 선척적인 이들 효소에서, 효소적으로 활성적인 형태의 리보누클레아제 A는 4개의 특이적 이황화물 결합에 관여하는 8개의 시스테인 잔기를 갖는다. 이러한 분석을 위한 기재는 "분해된" 리보누클레아제 A이며, 이는 비선천적인 이황화물 결합을 갖는 리모누클레아제 A 분자의 혼합물이다. (8개의 시스테인 잔기로부터 4개의 이황화물 결합을 형성하는 방식으로 105가지가 있다.) 선천적인 이황화물 결합이 높은 효소적 활성에 요구되기 때문에, 분해된 리보누클레아제는 선천적인 리보누클레아제 A보다 매우 낮은 효소적 활성을 갖는다. 분해된 리보누클레아제 A는 시그마 케미칼(Sigma Chemical)(미주리, 세인트 루이스에 소재)에서 구입하였다.

분석에 있어서, 분해된 리보누클레아제 A에서 효소적 활성의 회복을 촉매하는 BMC의 능력에 대해 시험하였다. 활성의 이러한 회복은 단지 비선천적인 이황화물 결합의 이성질화(또는 결합)에 의해 발생할 수 있다. 100mM의 수성 아세트산중에 0.50mg/mL의 분해된 리보누클레아제 A가 용해된 용액 1.0μL를 BMC(0, 20 또는 200μM), 환원된 글루타티온(1mM) 및 산화된 글루타티온(0.2mM)를 함유하는 pH가 7.6인 25mM의 트리스-HCl 완충제 99μL에 첨가함으로써 반응을 시작하였다. 반응 혼합물중의 글루타티온은 환원전위 상수를 유지시키고, 이황화물 결합이 형성되는 값을 유지시키는 완충제를 제공한다. 이러한 조건은 진핵 세포의 소포체의 조건을 흉내낸 것이다. 반응 혼합물을 30℃에서 인큐베이션시켰다. 공지된 시간(전형적으로, 30분) 후, 10μL 분취량을 취하여, 리보누클레아제 분해 활성이 회복됐는지를 시험하였다. 이 실험에서, 상기 10μL 분취량을 100mM NaCl 및 리보누클레아제 A의 기질이 되는 10mM의 폴리(C) RNA를 함유하는 500μL의 100mM MES-HCl 완충액(pH 6.0)에 첨가하였다. 효소적으로 활성적인 리보누클레아제 A에 의해 폴리(C)의 절단이 수행되는 리보누클레아제 분해 활성을 238nm에서 흡광도를 변화시킴으로써 모니터링하였다.

이러한 분석으로부터의 데이타는 도 5에 좌표로서 기록되어 있다. 이러한 데이타로부터 두가지가 명백해진다. 첫 째, BMC는 분해된 이황화물 결합을 갖는 단백질의 생물학적 활성의 회복에서 현저한 촉매작용을 나타내었다. 둘 째, 활성 단백질의 총 수율은 BMC가 없을 때보다 존재할 경우 현저하게 높았다. 이러한 특성은 BMC를 유용한 합성 단백질 촉매로 만든다.

Claims (10)

1. 더욱 바람직한 이황화물 결합을 갖도록 단백질을 재폴딩하는 방법으로서,

   (a) 단백질을 디티올 단백질 폴딩 촉매에 노출시키는 단계를 포함하며, 단백질 폴딩 촉매는 약 8.0 미만의 pK_a및 약 -0.25V보다 높은 E°'를 갖는 비단백질 디티올 분자인 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 단계 (a)가 시험관내에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
3. 제 1 항에 있어서, 단계 (a)가 생체내에서 수행됨을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 단백질이 이종 숙주에서 발현되며, 단계 (a)가 숙주가 배양된 배지에 디티올 단백질 촉매를 첨가함으로써 수행됨을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 디티올 단백질 폴딩 촉매가 BMC임을 특징으로 하는 방법.
6. 이종 숙주에서 발현된 단백질의 적절한 발현을 촉매하는 방법으로서,

   (a) 숙주에서의 단백질 발현에 유익한 조건하에 숙주를 배양하는 단계; 및

   (b) 배양 단계동안, 단백질을 유효량의 디티올 합성 단백질 폴딩 촉매에 노출시켜, 단백질 폴딩 촉매가 첨가되지 않았을 때보다 더 많은 양의 단백질이 원하는 이황화물 결합을 형성하도록 단백질을 유도하는 단계를 포함하며,

   단백질 폴딩 촉매가 약 8.0 미만의 pK_a및 약 0.25V보다 높은 E°'를 갖는 비단백질 디티올 분자인 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 디티올 단백질 폴딩 촉매가 BMC임을 특징으로 하는 방법.
8. 이종 숙주에서 발현된 단백질의 적절한 발현을 촉매하는 방법으로서,

   (a) 숙주에서의 단백질 발현에 유익한 조건하에 숙주를 배양하는 단계; 및

   (b) 배양 후에, 단백질을 유효량의 디티올 합성 단백질 폴딩 촉매에 노출시켜, 단백질 폴딩 촉매가 첨가되지 않았을 때보다 더 많은 양의 단백질이 원하는 이황화물 결합을 형성하도록 유도하는 단계를 포함하며,

   단백질 폴딩 촉매가 약 8.0 미만의 pK_a및 약 0.25V보다 높은 E°'를 갖는 비단백질 디티올 분자인 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 디티올 단백질 폴딩 촉매가 BMC임을 특징으로 하는 방법.
10. 적절한 단백질 폴딩을 촉매하는 효율을 측정하기 위해 자체가 단백질은 아닌 잠재적 단백질 폴딩 촉매를 시험하는 방법으로서,

    PDI 결핍 효모를 PDI의 부재하에 다량의 잠재적인 단백질 폴딩 촉매에 노출시키는 단계; 및

    잠재적인 촉매에 의해 보호된 효모 세포의 존재 여부를 시험하는 단계를 포함하는 방법.