KR20000022141A

KR20000022141A - Gage 종양 거부 항원을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 그종양 거부 항원 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20000022141A
Application number: KR1019980710557A
Authority: KR
Inventors: 올리비어 데박커; 베노이트 반 덴 아인데; 티어리 분-팔로이어
Original assignee: 에드워드 에이. 맥더모 2세, 로이드 제이. 오울드; 루드빅 인스티튜트 포 캔서 리서치
Priority date: 1996-06-24
Filing date: 1997-06-23
Publication date: 2000-04-25
Also published as: US6013481A; CN1221345A; AU722111B2; EP0910396A1; EP0910396A4; JP2002507112A; CA2259124A1; NZ332369A; ZA975588B; AU4325597A; WO1997049417A1

Abstract

본 발명은 새로운 족의 종양 거부 항원 전구체, 및 그것을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 이러한 종양 거부 항원 전구체는 GAGE 종양 거부 항원 전구체로 명명하며, 그것을 코딩하는 핵산 분자는 GAGE 코딩 분자로 명명한다. 코딩 서열 및 종양 거부 항원, 및 그의 전구체 분자의 각종 진단 및 치료 용도가 기재되어 있다. 종양 거부 항원도 또한 기재되어 있다.

Description

ＧＡＧＥ 종양 거부 항원을 코딩하는 단리된 핵산 분자, 그 종양 거부 항원 및 그의 용도

관련 출원

본 출원은 1993년 7월 22일자로 출원된 제08/096,039호의 부분계속출원 (CIP)인 1994년 5월 27일자로 출원된 동시 계류 특허 출원 제08/250,162호의 부분계속출원인, 1995년 1월 10일자로 출원된 동시 계류 출원 제08/370,648호의 부분계속출원인, 1995년 9월 21일자로 출원된 제08/531,662호의 부분계속출원이다. 이 출원들은 모두 참고로 인용되었다.

포유동물 면역계가 외래 또는 이종 물질을 인식하고 그것과 반응하는 프로세스는 복잡하다. 이 면역계의 중요한 일면은 T 임파구 또는 "T 세포" 반응이다. 이 반응에서는 T 세포가 인간 백혈구 항원("HLA") 또는 주요 조직적합성 복합체("MHC")로 불리는 세포 표면 분자와 펩티드의 복합체를 인식하고 그것과 상호작용해야 한다. 이 펩티드는 또한 HLA/MHC 분자를 표면에 드러내는 세포에 의해 프로세싱되는 더 큰 분자로부터 유래된 것이다 (Male et al., Advanced Immunology (J.P. Lipincott Company, 1987), 특히 chapters 6-10 참조). T 세포와 HLA/펩티드 복합체의 상호작용은 제약이 있는데, 즉 HLA 분자 및 펩티드의 특정한 조합에 대해 T 세포가 특이적이어야 한다. 특이적인 T 세포가 존재하지 않는다면, 그의 파트너 복합체가 존재한다 하더라도 T 세포 반응은 일어나지 않는다. 마찬가지로, T 세포가 존재하더라도, 특이적인 복합체가 존재하지 않으면 반응이 일어나지 않는다. 이 메카니즘은 외래 물질에 대한 면역계의 반응, 자기면역 병리상태, 및 세포 이상에 대한 반응에 관련된다. 단백질이 HLA 결합 펩티드로 프로세싱되는 메카니즘에 대해 수많은 연구가 집중되어 왔다 (Barinaga, Science 257: 880 (1992); Fremont et al., Science 257: 919 (1992); Matsumura et al., Science 257: 927 (1992); Latron et al., Science 257: 964 (1992); 및 Engelhard, Ann. Rev. Immunol. 12: 181-207 (1994) 참조).

T 세포가 세포 이상을 인식하는 메카니즘은 또한 암에 관련된다. 예를 들면, 참고로 인용된 PCT 출원 제PCT/US92/04354호(1992년 5월 22일에 출원되고, 1992년 11월 26일에 공개됨)에는 한 유전자족이 개시되어 있는데, 이는 펩티드로 프로세싱된 후 이 펩티드는 다시 세포 표면 상에 발현되어, 특이적 세포용해 T 임파구 (또는 이하에서는 "CTL")를 통해 종양 세포의 용해를 유도할 수 있다. 이 유전자는 "종양 거부 항원 전구체" (또는 "TRAP" 분자)를 코딩하는 것으로 알려졌으며, 이로부터 유도된 펩티드는 "종양 거부 항원" 또는 "TRA"로서 불린다. 이러한 족의 유전자에 대한 추가의 정보는 문헌(Traversari et al., Immunogenetics 35: 145 (1992); van der Bruggen et al., Science 254: 1643 (1991))을 참조하면 된다. 또한, 1991년 12월 12일에 출원하여 현재는 미국 특허 제5,342,774호로 허여된 미국 특허 출원 제807,043호를 참조하면 된다.

본 명세서에 참고로 인용된, 현재는 미국 특허 제5,405,940호로 허여된 미국 특허 출원 제938,334호에는 MAGE-1 유전자가 HLA-A1 분자에 의해 제공되는 노나펩티드로 프로세싱되는 종양 거부 항원 전구체를 코딩한다고 설명되어 있다. 이 참고 문헌에 따르면, 특정한 HLA 분자에 대한 그 특이성이 알려진 특정 펩티드가 있다면, 이 특정 펩티드는 하나의 HLA 분자에는 결합하지만 다른 것에는 결합하지 않을 것이다. 이것은 중요한데, 그 이유는 상이한 개체마다 HLA 표현형이 다르기 때문이다. 결과적으로, 특정 펩티드가 특이적 HLA 분자에 대한 파트너인지를 확인하는 것은 진단 및 치료상의 분기점이 되지만, 이것은 그 특정 HLA 표현형을 갖는 개체에 대해서 관련이 있을 뿐이다. 세포 이상은 하나의 특별한 HLA 표현형에 제한되지 않으며, 표적화된 요법은 문제의 이상 세포 표현형에 관한 다소간의 지식을 필요로 하기 때문에, 이 분야에서 추가의 연구가 필요하다.

본 명세서에 참고로 인용된, 1993년 1월 22일자로 출원된 미국 특허 출원 제008,446호에는 MAGE-1 발현 생성물이 제2 TRA로 프로세싱된다는 사실이 기재되어 있다. 이 제2 TRA는 HLA-C 클론 10 분자에 의해 세포 표면에 드러난다. 이 문헌은 드러난 TRAP가 복수의 TRA를 생산할 수 있다고 지시한다.

본 명세서에 참고로 인용된, 1992년 12월 22일자로 출원된 미국 특허 출원 제994,928호에는 일부 정상 세포(예를 들면, 흑혈구)가 생산하는 분자인 티로시나아제가 종양 세포에서 프로세싱되어 HLA-A2 분자에 의해 세포 표면에 드러난 펩티드를 생산한다고 기재되어 있다.

본 명세서에 전체적으로 참고로 인용된, 1993년 3월 18일자로 출원된 미국 특허 출원 제08/032,978호에는 티로시나아제로부터 유도되지 않은 제2 TRA가 HLA-A2 분자에 의해 제공되는 것으로 교시되어 있다. 이 TRA는 TRAP로부터 유래하지만 비-MAGE 유전자에 의해 코딩된다. 이 문헌은 특별한 HLA 분자가 다른 공급원으로부터 유래된 TRA를 제공할 수 있다고 밝히고 있다.

본 명세서에 참고로 인용된, 1993년 6월 17일자로 출원된 미국 특허 출원 제08/079,110호에는 관련이 없는 종양 거부 항원 전구체, 소위 "BAGE" 전구체가 개시되어 있다. BAGE 전구체는 MAGE 족과 관련이 없다.

상기 인용된 논문, 특허 및 특허 출원에 언급된 연구는 대부분 MAGE 유전자족 및 MAGE와 관련이 없는 BAGE 유전자를 다루고 있다. 그러나, 현재 또다른 종양 거부 항원 전구체는 세포에 의해 발현되는 것으로 밝혀졌다. 이러한 종양 거부 항원 전구체는 "GAGE" 종양 거부 항원 전구체로 부른다. 그것은 MAGE 유전자족 또는 BAGE 유전자 중 어느 것과도 상동성을 나타내지 않는다. 따라서, 본 발명은 그러한 TRAP를 코딩하는 유전자와 종양 거부 항원 전구체 자체 뿐만 아니라 이 둘 모두의 용도에 관한 것이다.

따라서, 본 발명의 다른 특징은 9 내지 16 아미노산 길이의, 다음 서열을 포함하는 펩티드이다.

<서열 23>

Xaa_(1,2)Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr

여기서, Xaa는 임의의 아미노산이며, Xaa_(1,2)는 1 또는 2개의 아미노산이 Trp 잔기에 대한 N-말단에 있을 수 있다는 것을 의미한다. 이들 펩티드는 HLA-A29 분자에 결합하는 펩티드에 결합하고(거나) 그것으로 프로세싱된다.

본 발명은 다음 명세서에 더욱 상세히 설명된다.

본 발명은 종양 거부 항원 전구체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 종양 거부 항원 전구체가 특히 HLA-Cw6 분자에 의해 제공되는 하나 이상의 종양 거부 항원으로 프로세싱되는 유전자에 관한 것이다. 당해 유전자는 다른 공지된 종양 거부 항원 전구체 코딩 서열과 관련이 없는 것으로 보인다. 본 발명은 또한 HLA-Cw6 분자에 의해 제공되는 펩티드, 및 그의 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명의 일부는 HLA-A29 분자에 의해 제공되는 펩티드, 및 그의 용도에 관한 것이다.

도 1은 CTL 클론 76/6을 이용한 용해 (lysis) 연구를 나타낸다.

도 2는 각종 형질감염체 및 대조군으로 얻어진 종양 괴사 인자("TNF") 분비량 분석을 나타낸다.

도 3은 클론 CTL 76/6의 세포용해 T 임파구에 의해 유도되는 용해율을 비교한다. 서열 4를 포함한, 다양한 길이의 펩티드를 시험하였다.

도 4는 본 명세서에 논의된 6개의 GAGE 유전자의 cDNA의 배열을 나타낸다. 이 도면에서, 동일한 영역은 박스로 둘러싸여 있다. 번역 개시 부위 및 정지 코돈도 또한 표시되어 있다. 실시예에 기재된 바와 같은 중합효소 연쇄 반응에 이용된 프라이머는 화살표로 표시했다.

도 5는 GAGE 족에 속하는 것의 아미노산 서열을 추정하여 배열한 것이다. 동일한 영역은 박스로 표시했으며, 서열 4의 항원성 펩티드가 표시되어 있다.

도 6은 GAGE cDNA 각각이 HLA-Cw6 cDNA와 함께 COS 세포를 형질감염시켰을 때 얻어진 결과를 나타낸다. 24시간 후에, CTL 76/6의 샘플이 추가되고 TNF 분비량을 24시간 후에 측정했다.

도 7은 나타낸 바와 같이 HLA-A29 cDNA, MAGE, BAGE 또는 GAGE 서열로 형질감염된 COS-7 세포에 의한 CTL 22/23의 자극을 비교한다. 대조군 값은 자극물로서 MZ2-MEL.43 및 COS 세포에 의해 제공된다.

도 8은 서열 22를 포함한 각종 펩티드 및 그로부터 유래된 각종 펩티드를 이용한⁵¹Cr 방출 연구 결과를 나타낸다.

실시예 1

흑색종 세포주 MZ2-MEL은 표준 방법을 이용하여 환자 MZ2로부터 취한 흑색종 세포로부터 형성되었다. 이 세포주는 예를 들면 본 명세서에 전체적으로 참고로 인용된, 1992년 5월 22일자로 출원되고 1992년 11월 26일에 공개된 PCT 출원 제PCT/US92/04354호에 기재되어 있다. 세포주가 일단 형성되면, 그의 샘플을 조사(照射)하여 그것을 비증식성으로 만든다. 그후에, 이러한 조사된 세포를 이용하여 그것에 특이적인 세포용해 T 세포 클론("CTL")을 분리한다.

말초 혈액 단핵 세포("PBMC")의 샘플을 환자 MZ2로부터 취하고 조사된 흑색종 세포에 접촉시켰다. 이 혼합물을 흑색종 세포의 용해에 대해 관찰하였으며, 이는 흑색종 세포 표면에 드러난 펩티드와 HLA 분자의 복합체에 특이적인 CTL가 이 샘플에 존재함을 나타낸다.

이용된 용해 분석은 본 명세서에 참고로 인용된 문헌(Herin et al., Int. J. Cancer 39: 390-396 (1987))에 기재된 크롬 방출 분석이었다. 그러나 이 분석은 본 명세서에 설명된다. 표적 흑색종 세포를 시험관내에서 증식시키고, 그후에 10 mM HEPES 및 30% FCS가 보충된 DMEM에 10⁷세포/㎖로 재현탁시키고, Na(⁵¹Cr)O₄200 μCi/㎖와 함께 37 ℃에서 45분 동안 인큐베이션시켰다. 표지된 세포를 10 mM Hepes가 보충된 DMEM으로 3회 세척하였다. 이것을 10 mM Hepes 및 10% FCS가 보충된 DMEM에 재현탁시키고 그후에 10³세포를 함유한 100 ㎕ 분액을 96 웰 미세 평판에 나누어 담았다. PBL의 샘플을 동일한 배지 100 ㎕에 추가하고, 분석을 중복 실시하였다. 평판을 100 g에서 4분 동안 원심분리하고, 8% CO₂대기 중에서 37 ℃에서 4시간 동안 인큐베이션시켰다.

평판을 다시 원심분리시키고, 상층물 100 ㎕ 분액을 모으고 계수하였다.⁵¹Cr 방출율을 다음과 같이 계산하였다:

상기 식에서, ER은 관찰된 실험⁵¹Cr 방출량이고, SR은 배지 200 ㎕ 중에 표지된 10³세포를 인큐베이션시킴으로써 측정된 자발적 방출량이고, MR은 표적 세포에 0.3% 트리톤 X-100 100 ㎕를 첨가함으로써 얻어진 최대 방출량이다.

높은 CTL 활성을 나타낸 단핵 혈액 샘플을 팽창시키고 제한적인 희석을 통해 클로닝하고 동일한 방법을 이용하여 다시 스크리닝하였다. CTL 클론 MZ2-CTL 76/6을 단리했다. 이 클론은 이후에 "76/6"으로 명명한다.

동일한 방법을 이용하여 표적 K562 세포 및 흑색종 세포주를 시험하였다. 도 1은 이러한 CTL 클론이 흑색종 세포주, 즉 MZ2-MEL을 인식하고 용해하지만, K562는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 그후에, 이 클론을 상기한 바와 동일한 방법으로 다른 흑색종 세포주 및 자기유래 (autologous) EBV-형질전환된 B 세포에 대해 시험하였다. 도 1은 엡스타인 바르 바이러스("EBV")에 의해 형질전환된 자기유래 B 세포가 용해되지 않았으며, MZ2-MEL 3.0이 CTL 클론 76/6에 의해 용해되는 반면, 항원 F를 발현하지 않는 변이체인 세포주 MZ2-MEL.4F^-는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 그러므로, 클론은 이 항원에 대해 특이적인 것으로 보인다.

상기 결과로는 HLA 분자가 TRA를 제공하는 것으로 결론짓기 어렵다. 용해된 세포주, 즉 MZ2-MEL은 HLA-A1, HLA-A29, HLA-B37, HLA-B44, HLA-Cw6 및 HLA-C 클론 10을 발현하는 것으로 알려져 있다. 여기에 보고되지는 않았지만 이 실시예의 프로토콜에 따르는 실험에서, MZ2-MEL 세포주의 서브라인을 시험한 결과, HLA 분자 A29, B44 및 C 클론 10의 발현 능력이 없었다. 서브라인은 용해되었으며, 따라서 이는 제공 분자가 A1, B37 또는 Cw6 중의 하나이어야 한다는 것을 의미한다.

실시예 2

76/6이 표적 세포와 접촉하면 종양 괴사 인자("TNF")를 생산하는지를 확인하기 위해 또다른 연구를 실시하였다. 이용된 방법은 참고로 인용된 문헌(Traversari et al., Immunogenetics 35: 145-152 (1992))에 기재되어 있다. 간단하게는, CTL 세포주의 샘플을 배지내의 당해 표적 세포의 샘플과 배합하였다. 24시간 후에, 배양액의 상층물을 제거한 후에 TNF-민감성 WEHI 세포에 대해 시험하였다. 위에서와 인용된 문헌에 논의된 MZ2-MEL 세포주의 서브클론인 MZ2-MEL.43 세포주는 아주 강한 반응을 나타냈으며, 그것을 다음 실험에 이용하였다.

실시예 3

실시예 2의 결과는 MZ2-MEL.43이 당해 표적 항원을 제공하였음을 나타내었다. 그것을 그 자체만으로 총 mRNA의 공급원으로서 사용하여 cDNA 라이브러리를 제조하였다.

세포주로부터 전체 RNA를 분리하였다. 올리고-dT 결합 키트를 이용한 후 잘 알려진 기술을 이용하여 mRNA를 단리하였다. 일단 mRNA를 고정하고, 그것을 NotI 부위를 포함하는 올리고 dT 프라이머를 이용하여 cDNA로 역전사시킨 후, 제2 가닥을 합성했다. 그후에, cDNA를 BstXI 어댑터에 연결하고, NotI로 분해하고, 세파크릴 S-500 HR 칼럼으로 크기 분별화한 후, pcDNA-I-Amp의 BstXI 및 Not I 부위에 방향성 없이 클로닝시켰다. 그 다음 재조합 플라스미드를 DH5α 대장균내로 일렉트로포레이팅시켰다. 100 재조합 박테리아의 총 1500개의 군을 마이크로웰에 접종했다. 각각은 약 100 개의 cDNA를 함유하였는데, 그 이유는 거의 모든 박테리아가 하나의 삽입체를 함유하였기 때문이다.

각각의 군을 포화 상태로 증폭시키고, 플라스미드 DNA를 페놀 추출 없이 알칼리 용해 및 아세트산칼륨 침전에 의해 추출하였다.

실시예 4

실시예 3에 기재된 라이브러리의 제조법에 따라서, cDNA로 진핵 세포를 형질감염시켰다. 본 명세서에 기재된 형질감염을 중복 실시하였다. COS-7 세포의 샘플을, 10% 태송아지 혈청이 보충된 둘베코 변형 이글스 배지("DMEM")가 담긴 바닥이 평평한 조직 배양 미세웰로 1 웰당 세포 15,000 개씩을 접종하였다. 세포를 37 ℃에서 밤새 인큐베이션시키고, 배지를 제거한 후 10 % Nu 혈청, 400 ㎍/㎖ DEAE-덱스트란 및 100 μM 클로로퀸이 함유된 DMEM 배지 50 ㎕/웰 + 플라스미드 100 ng으로 대체하였다. 상기한 바와 같이, 용해 연구 결과는 HLA 분자가 항원을 제공하였음을 나타내지 않았다. 결과적으로, 항원 (A1, B37, Cw6)을 제공할 수 있는 HLA 분자 각각에 대한 cDNA를 개별적으로 이용하여 세포를 동시형질감염시켰다. 상세하게는, 라이브러리에 의한 형질감염에 사용한 것과 동일한 프로토콜을 이용하여, HLA-A1을 코딩하는 유전자 28 ng을 사용하여 pCD-SRα내로 클로닝하고, HLA-B37에 대한 cDNA 50 ng를 사용하여 pcDNA-I-Amp 내로 클로닝하거나 또는 HLA-Cw6에 대한 cDNA 75 ng를 사용하여 pcDNAI/Amp 내로 클로닝했다.

형질감염을 이중 웰에서 실시하였지만, HLA-Cw6 형질감염체 500 개의 군만은 단일 웰에서 시험할 수 있었다. 37 ℃에서 4시간 동안 인큐베이션시킨 후에, 배지를 제거하고, 10% DMSO를 함유하는 PBS 50 ㎕로 대체하였다. 이 배지를 2분 후에 제거하고 10% FCS로 보충된 DMEM 200 ㎕로 대체하였다.

배지에서의 이러한 변화에 이어서, COS 세포를 37 ℃에서 24 내지 48 시간 동안 인큐베이션시켰다. 배지를 폐기하고, 20-30 U/㎖의 IL-2로 보충된 10% 인간 혈청 풀 (pool)을 함유하는 이스코브(Iscove) 배지 100 ㎕ 중에 CTL 클론 76/6 1000-3000 세포를 첨가하였다. 24시간 후에 상층물을 제거하고, 참고로 인용한 문헌(Traversari et al., Immunogenetics 35: 145-152 (1992))에 기재된 바와 같은, WEHI 세포에 대한 분석법으로 TNF 함량을 측정하였다.

HLA-A1로 형질감염된 1500 풀 및 HLA-B37로 형질감염된 1500 풀은 TNF 분비를 각각 15-20 pg/㎖ 또는 2-6 pg/㎖의 농도로 촉진하였다. HLA-Cw6 형질감염체 대부분은 60 pg/㎖를 초과하도록 형성하는 하나의 풀을 제외하고는 3-20 pg/㎖를 형성하였다. 이 풀은 또다른 연구를 위해 선택되었다.

실시예 5

선택된 박테리아 풀을 클로닝한 후, 600 클론을 시험하였다. 플라스미드 DNA를 그로부터 추출하여, 상기한 바와 동일한 방법으로 COS 세포의 새로운 샘플을 형질감염시키고, 그 세포를 CTL 클론 76/6의 자극에 대해 다시 시험하였다. 94개의 양성 클론을 발견하였다. cDNA 클론 2D6으로 명명되는 이들 중 하나를 더 시험하였다. 비교 시험에서, COS 세포를 cDNA 클론 2D6 및 HLA-Cw6 cDNA, HLA-Cw6 cDNA 단독 또는 cDNA 2D6 단독으로 형질감염시켰다. 대조 세포주 MZ2-MEL F^-및 MZ2-MEL F⁺도 또한 이용하였다. 상기한 바와 같이 WEHI 세포에 대해 시험하여 CTL 상층물 내의 TNF 분비량을 측정하였다. MTT와 함께 세포를 인큐베이션시킨 후에 흡광도를 통해 생존 WEHI 세포의 수를 측정하였다. 도 2는 HLA-Cw6 및 cDNA-2D6으로 형질감염된 COS 세포 및 세포주 MZ2-MEL F⁺가 CTL 클론 76/6으로부터의 TNF 분비를 자극하였음을 나타내며, 이것은 HLA-Cw6이 대상 TRA에 존재하였음을 의미하는 것이다.

실시예 6

cDNA 2D6은 당업계에 공지된 기술에 따라 서열 분석했다. 서열 연구 결과는 플라스미드 삽입체가 공지된 유전자 또는 단백질과 상동성을 나타내지 않았음을 나타낸다. 서열 1은 이후에 "GAGE"로 불리는, 확인된 유전자에 대한 cDNA 뉴클레오티드 정보를 제공한다. 추정 오픈 리딩 프레임은 이 분자의 염기 51-467에 위치한다. 이 서열의 첫번째 2개의 염기는 cDNA 서열을 갖는 벡터로부터 유래한 것이므로 cDNA 자체의 일부가 아니다.

실시예 7

cDNA의 서열 분석에 이어서, 실시예 6에서와 같이 실험을 실시하여 정상 조직의 세포가 이 유전자를 발현하는지를 확인하였다. 이것을 확인하기 위하여, 하기한 바와 같이 조직 및 종양 세포주 상에서 노던 블롯팅을 실시하였다. 블롯팅 실험에서는 서열 1의 완전 서열에 대한 cDNA를 이용하였다. PCR을 이용하여 그 결과를 확인하였다.

유전자 GAGE의 발현

정상 조직
PHA 활성화된 T 세포	-
CTL 클론 82/30	-
간	-
근육	-
폐	-
뇌	-
신장	-
태반	-
심장	-
피부	-
정소	+
종양 세포주
흑색종	7/16
폐암	1/6
육종	0/1
갑상선 수양암	0/1
종양 샘플
흑색종	1/1

실시예 8

중합효소 연쇄 반응("PCR") 및 상기한 GAGE 유전자 정보를 이용하여 정상 조직 및 종양의 상세한 분석을 실시하였다.

먼저, 당업계에 공지된 기술을 이용하여 특별한 샘플로부터 전체 RNA를 취하였다. 이것을 이용하여 cDNA를 제조하였다. cDNA를 제조하는데 이용된 프로토콜은 역전사효소 완충액 5x 4 ㎕, 각 dNTP(10 mM) 1 ㎕, 디티오트레이톨(100 mM) 2 ㎕, dT-15 프라이머(20 ㎛) 2 ㎕, RNasin(40 유닛/㎕) 0.5 ㎕ 및 MoMLV 역전사효소(200 유닛/㎕) 1 ㎕를 배합하는 것을 포함한다. 다음에, 주형 RNA(1 ㎍/물 3.25 ㎕를 또는 총 주형 RNA 2 ㎍) 6.5 ㎕를 첨가하였다. 혼합물의 총 부피는 20 ㎕였다. 이것을 혼합하고 42 ℃에서 60분 동안 인큐베이션시키고, 그후에 빙냉시켰다. 물 80 ㎕를 총 100 ㎕가 되도록 첨가하였다. 이 혼합물을 PCR에 사용할 때 까지 -20 ℃에서 저장하였다.

PCR을 실시하기 위하여, 프라이머 5'-AGA CGC TAC GTA GAG CCT-3' (센스) 및 5'-CCA TCA GGA CCA TCT TCA-3' (안티센스) 각각 서열 2 및 3을 이용하였다. 시약은 물 30.5 ㎕, PCR 완충액 10x 5 ㎕, 각 dNTP(10 μM) 1 ㎕, 각 프라이머(20 μM) 2.5 ㎕ 및 중합 효소 "다이나짐(Dynazyme)"(2 유닛/㎕) 0.5 ㎕를 포함하였다. 총 부피는 45 ㎕였다. cDNA 총 5 ㎕를 첨가하였다(이것은 전체 RNA 100 ng에 해당함). 혼합물을 배합하고, 광유 1 방울로 층 형성하였다. 혼합물을 열순환 블록으로 전달하고, 94 ℃로 예열하고, 30 사이클 동안 증폭을 실시하였으며, 각 사이클은 다음과 같이 이루어진다:

제1 변성: 94 ℃, 4분

변성: 94 ℃, 1분

어닐링: 55 ℃, 2분

연장: 72 ℃, 3분

최종 연장: 72 ℃, 15분

증폭 반응 후, 분액 10 ㎕를 1.5% 아가로스 겔 상에 전개하고, 에티듐 브로마이드로 염색하였다.

상기 프라이머를 이용하여 증폭시킨 cDNA는 238 염기쌍 단편을 형성하였다. 오염물인 게놈 DNA가 존재한다고 해도 이의 증폭은 이루어지지 않았다.

그 결과를 다음 표 2에 나타내었다. 이것은 GAGE를 발현하는 유일한 정상 조직은 정소인 반면, 흑색종, 폐, 유방, 후두, 인두, 육종, 정소 정상피종, 방광 및 결장을 비롯한 많은 종양이 유전자를 발현한다는 것을 확인시켜 주는 것이다. 따라서, 이 종양 중 어떠한 것이라도 GAGE 유전자의 발현에 대해 분석함으로써 분석될 수 있다.

유전자 GAGE 발현의 RT-PCR 분석

정상 조직
심장	-
뇌	-
간	-
폐	-
신장	-
비장	-
임파구	-
골수	-
피부	-
모반	-
흑혈구	-
섬유아세포	-
전립선	-
정소	+
난소	-
유방	-
부신	-
근육	-
태반	-
제대	-
종양
	세포주	종양 샘플
흑색종	40/63	46/146 (32%)
폐암	유표피암		10/41 (24%)
	선암		4/18
	소세포 폐암	6/23	0/2
유방암		15/146 (10%)
머리 및 목 종양	후두		6/15 (40%)
머리 및 목 종양	인두		3/13
육종	1/4	6/18 (33%)
정소 정상피종		6/6 (100%)
방광암		5/37 (14%)
전립선암		2/20
결장암	5/13	0/38
신장암	0/6	0/45
백혈병	3/6	0/19

실시예 9

상기 실시예에서 언급된 핵산 분자의 확인은 HLA-Cw6 분자에 의해 제공되며 GAGE 유전자로부터 유래된 종양 거부 항원의 확인에 관련된 추가의 연구를 유도한다.

발현 벡터 pcDNAI/Amp 중의 GAGE의 완전한 cDNA를, 제한 엔도뉴클레아제 NotI 및 SpHI와 뒤이어 엑소뉴클레아제 III로 제조업자의 지시(Erase-a-base System, Promega)에 따라서 분해하였다. 이 처리 결과 3' 말단에서 시작한 일련의 진행성 결실이 이루어졌다.

결실 생성물을 pcDNAI/Amp에 역으로 라이게이션시키고, 공지 기술을 이용하여 대장균 균주 DH5α'IQ로 일렉트로포레이팅시켰다. 암피실린(50 ㎍/㎖)을 사용하여 형질전환체를 선택하였다.

플라스미드 DNA를 각 재조합 클론으로부터 추출한 후, HLA-Cw6을 코딩하는 벡터로 COS-7 세포를 형질감염시켰다. 이용된 프로토콜은 상기한 프로토콜에 따른 것이다.

형질감염체를 TNF 분비량 분석에서 시험하였다. 그 결과 양성 및 음성 클론의 분리가 일어났다. 모든 음성 클론은 전체 GAGE 서열의 결실을 의미했다. 가장 작은 양성 클론은 서열 1의 처음 170 뉴클레오티드를 포함하였다. 이 서열 분석 결과는 오픈 리딩 프레임이 뉴클레오티드 51에서 시작한다는 것을 의미한다. 따라서, 이 단편은 GAGE TRAP의 처음 40 아미노산을 코딩하는 서열을 포함한다.

실시예 10

TRA 펩티드를 더욱 정확히 코딩하는 영역을 한정하기 위하여 추가의 실험을 실시하였다. 이 실험에 중합효소 연쇄 반응("PCR") 증폭을 이용하였다.

2개의 프라이머를 합성하였다. 첫번째 프라이머는 플라스미드 벡터 pcDNAI/Amp 위치한 BamHI 부위의 업스트림내의 서열에 상보적인 22-mer였다. 두번째 프라이머는 3' 말단에서 서열 1의 뉴클레오티드 102-119를, 5' 말단에서 XbaI 제한 부위를 포함하는 11 뉴클레오티드의 연장을 포함하는 29-mer였다.

증폭에 이어서, PCR 생성물을 BamHI 및 XbaI에 의해 분해하고 플라스미드 pcDNA-3의 BamHI-XbaI 부위로 클로닝시켰다. 재조합 콜로니를 실시예 4에 따라서 HLA-Cw6을 코딩하는 cDNA를 이용하여 COS-7 세포로 동시 형질감염시키고, 또한 상기한 바와 같이 CTL 76/6을 이용하여 TNF 분비량 분석을 실시하였다.

TNF 분비의 관찰 결과는 "미니유전자"가 TRA로 프로세싱되었음을 나타낸다. 코딩 영역이 뉴클레오티드 51-119로부터 전개되는 미니유전자, 즉 서열 1의 뉴클레오티드 1-119는 서열 1의 cDNA의 처음 23 아미노산을 코딩한다. 이 정보는 다음 세트의 실험에 대한 기초로서 제공된다.

실시예 11

서열 1의 처음 23 아미노산을 기초로 하여 2개의 펩티드를 합성하였다. 이것은 다음과 같다:

Met Ser Trp Arg Gly Arg Ser Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg (서열 2)

Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val Glu Pro Pro Glu Met Ile (서열 3)

HLA-Cw6 cDNA로 미리 형질감염시킨 COS-7 세포 내로 각 펩티드를 펄스시키고, CTL 76/6과 배합하여 TNF 분비가 유도되는지를 확인하였다. 펩티드(20 ㎍/㎖)를 24시간 전에 미리 HLA-Cw6 cDNA로 형질감염시킨 COS-7 세포에 첨가하였다. 37 ℃에서 90분 동안 인큐베이션시킨 후에, 배지를 제거하고, 25 유닛/㎖의 IL-2를 함유하는 배지 100 ㎕에 3000 CTL을 첨가하였다. 18시간 후에, 상층물의 TNF 함량을 WEHI-164-13 세포에 대한 독성을 확인함으로써 시험하였다. 제2 펩티드(서열 3)는 30 pg/㎖를 초과하는 TNF를 유도하는 반면, 제1 펩티드(서열 2)는 10 pg/㎖ 미만의 TNF를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 제2 펩티드는 다음 실험에 사용하였다.

실시예 12

서열 3을 기초로 한 각종 펩티드를 합성하고, 시험하였으며, 그중 일부를 아래에 나타내었다. 이 시험을 실시하기 위하여, HLA-Cw6 양성인⁵¹Cr 표지된 LB33-EBV 세포를 다음 펩티드 중의 하나와 함께 인큐베이션시켰다.

Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr (서열 4)

Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr (서열 5)

Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val (서열 6)

Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val (서열 7)

Arg Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val Glu (서열 8)

Met Ser Trp Arg Gly Arg Ser Thr Tyr Arg Pro Arg Pro Arg Arg (서열 2)

펩티드 농도는 도 3에 나타낸 바와 같이 변화되었고 CTL:LB33-EBV의 비("작용제:표적 비")는 10:1이었다. 37 ℃에서 인큐베이션시킨지 4시간 후에⁵¹Cr 방출을 측정하였다. 양성("F⁺"; MZ2-MEL.3.1) 및 음성("F^-"; MZ2-MEL.2.2.5) 대조 세포에 대한 용해 정도를 도 3에 나타내었다.

아주 놀랍게도, 서열 4의 옥타머가 최상의 펩티드이며 종양 거부 항원인 것으로 나타났다. 이것은 옥타머가 인간 MHC 분자에 의한 제공과 관련되어 처음 보고된 것이다. 엥겔하드(상기 참조; 199)에 의해 보고된 바와 같이, 쥐과 동물계에 대해 H-2K^b및 H-2K^k분자에 대해 약간의 관계가 있다. 서열 5 및 서열 6의 노나머는 또한 비록 서열 4의 옥타머 보다 적은 정도이지만 CTL 분해를 유도하였다.

결과는 여기에 보고되지 않았지만, 제2 CTL을 시험하였다(CTL 82/31). 이 CTL은 MZ2-F를 제공하는 세포를 용해하는 것으로 알려졌다. 그것은 서열 4의 펩티드에 의한 펄스화에 이어서 HLA-Cw6 양성 세포를 너무 많이 용해하였다.

실시예 13

상기한 GAGE DNA가 유일한 것인지를 확인하기 위하여, MZ2-MEL.43으로부터 RNA로 제조된 cDNA 라이브러리(GAGE의 클로닝을 위해 사용한 동일한 라이브러리)를 GAGE cDNA로부터 유래된 프로브로 혼성화시켰다. 프로브는 서열 1의 위치 20과 328 사이의 308 염기쌍의 PCR 단편이었다. 20개의 양성 cDNA를 얻었다. 그것들 중 6개는 완전히 서열 분석했다. 그것들은 모두 GAGE 서열과 많은 관련이 있지만, 다소 상이하였다. 6개의 클론 중 2개는 서로 동일하지만, 다른 것은 모두 서로 상이하였다. 따라서, GAGE와 상이하지만 많은 관련이 있는 5개의 새로운 서열이 확인되었다. 이들을 GAGE-2, 3, 4, 5 및 6으로 이름 붙였다(도 4). 14개의 다른 클론은 5' 말단에서 부분적으로 서열 분석되었으며 그의 서열은 6개의 GAGE cDNA 중의 하나에 상응한다.

cDNA와 GAGE-1 사이의 주요 차이점은 서열 1의 GAGE 서열의 위치 379 내지 521에 위치한 143 염기의 스트레치의 부재이다. 서열의 나머지는, GAGE-3의 5' 말단이 처음 112 염기에 대해 다른 GAGE와 완전히 다른 것을 제외하고는, 19개의 다른 위치에서만 부조화를 보여준다. GAGE-3 cDNA의 이러한 영역은 긴 반복부 및 헤어핀 구조를 포함한다.

종양 거부 항원 전구체에 해당하는 추론된 GAGE-1 단백질은 5개의 다른 단백질 보다 더 긴 약 20 아미노산이며, 그의 최종 7개의 잔기도 또한 GAGE-1의 상동성 잔기와 상이하다(도 5). 단백질 서열의 나머지는 10개의 부조화만을 나타낸다. 이들 중 하나는 서열 4의 항원성 펩티드에 해당하는 영역내에 있다. 이 펩티드의 서열은 GAGE-3, 4, 5 및 6내에서 변형되므로 위치 2가 현재는 R 대신에 W이다.

실시예 14

위치 2에서의 변화가 펩티드의 항원성에 영향을 미치는가를 평가하기 위하여, 6 GAGE cDNA의 cDNA를 HLA-Cw6의 cDNA와 함께 COS 세포로 개별적으로 형질감염시키고, 형질감염체를 상기한 바와 같이 CTL 76/6에 의한 인지에 대해 시험하였다. GAGE-1 및 GAGE-2 형질감염된 세포만이 인지되었으며, 이것은 GAGE-3, 4, 5 및 6에 의해 코딩된 변형된 펩티드가 이 실험에서 항원성이 아니라는 것을 나타낸다. 상기한 14개의 다른 클론의 5' 말단의 서열 분석은 그들 중 7개가 항원성 펩티드를 코딩하는 서열을 포함하였음을 나타내었으며, 따라서 아마 GAGE-1 또는 GAGE-2 중 어느 하나에 해당한다.

실시예 15

종양 샘플내에서의 GAGE의 발현을 시험하기 위해 사용된 PCR 프라이머(상기 참조)는 GAGE-1 또는 2와 항원 MZ2F를 코딩하지 않는 4개의 다른 GAGE cDNA를 구별하지 않는다. GAGE-3, 4, 5 및 6이 아니라 GAGE-1 및 2를 특별하게 증폭시키는 새로운 프라이머 세트를 제조하였다. 이 프라이머는 다음과 같다:

VDE44 5'-GAC CAA GAC GCT ACG TAG-3' (서열 9)

VDE24 5'-CCA TCA GGA CCA TCT TCA-3' (서열 10)

이 프라이머를 상기한 바와 같이 다음 온도 조건에서 중합효소 효소를 이용하여 RT-PCR 반응에 사용하였다:

94 ℃에서 4분

94 ℃에서 1분, 56 ℃에서 2분, 72 ℃에서 3분으로 30 사이클

72 ℃에서 15분

이 분석 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

종양 샘플 및 종양 세포주에 의한 GAGE 유전자의 발현

조직학적 유형	GAGE 양성 종양의 수
	모든 GAGE 유전자^*	GAGE-1 및 2^**
종양 샘플
흑색종	원발진	5/39	5/39 (13%)
흑색종	전이	47/132	36/131 (27%)
육종	6/20	6/20 (30%)
폐암 NSCLC	14/65	12/64 (19%)
두경린 세포암	13/55	10/54 (19%)
전립선 암	2/20	2/20
유암	18/162	14/162 (9%)
방광암	표재성	1/20	1/20
방광암	침윤성	5/26	3/26
정소 정상피종	6/6	5/6
결장직장암	0/43
백혈병 및 임파종	0/25
신장암	0/46
종양 세포주
흑색종	45/74	40/74(54%)
육종	1/4	1/4
폐암	SCLC	7/24	7/24(29%)
폐암	NSCLC	1/2	1/2
중피종	5/19	5/19(26%)
두경린 세포암	0/2
유암	1/4	0/4
방광암	0/3
결장암	5/13	5/13
백혈병	3/6	1/6
임파종	0/6
신장암	0/6
* GAGE의 발현은 GAGE 유전자를 검출하는, 프라이머 VDE-18 및 VDE-24를 이용한 전체 RNA에 대한 RT-PCR에 의해 시험되었다. 이러한 프라이머가 MZ2-MEL로부터의 DNA에 대해 분석될 때 PCR 생성물은 관찰되지 않았다.** GAGE-1 및 2의 발현은 4개의 다른 GAGE 유전자와 GAGE-1 및 2를 구별하는, 프라이머 VDE-44 및 VDE-24를 이용한 전체 RNA에 대한 RT-PCR에 의해 시험되었다. 이러한 프라이머가 MZ2-MEL로부터의 DNA에 대해 분석될 때 PCR 생성물은 관찰되지 않았다.

추가의 연구에서, 정상 조직에서 이들 중 어느 것의 발현도 일어나지 않았음을 확인하기 위하여 모든 GAGE 유전자를 증폭시키는 새로운 프라이머를 고안하였다. 이 프라이머는 다음과 같다:

VDE43 5'-GCG GCC CGA GCA GTT-3' (서열 11)

VDE24 5'-CCA TCA GGA CCA TCT TCA-3' (서열 10)

이것은 VDE44 및 VDE24 프라이머를 이용한 PCR에 대해 정확하게 이용되었다. 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 정상 조직은 정소를 제외하고는 음성인 것으로 확인하였다.

정상 성인 및 태아 조직내의 GAGE 유전자의 발현

성인 조직	GAGE 발현^*
부신	-
양성 모반	-
골수	-
뇌	-
유방	-
소뇌	-
결장	-
심장	-
신장	-
간	-
폐	-
흑혈구	-
근육	-
난소	-
전립선	-
피부	-
비세포	-
위	-
정소	+
흉선세포	-
방광	-
자궁	-
태반	-
제대	-
태아 조직^#
섬유아세포	-
뇌	-
간	-
비장	-
흉선	-
정소	+
* GAGE의 발현은 모든 GAGE 유전자를 검출하는, 프라이머 VDE43 및 VDE24를 이용한 전체 RNA에 대한 RT-PCR 증폭에 의해 시험되었다(도 7). PCR 생성물의 부재는 -로 표시되고 존재는 +로 표시된다. 이러한 프라이머가 MZ2-MEL로부터의 DNA에 대해 분석될 때 PCR 생성물은 관찰되지 않았다.# 태아 조직은 20주 이상의 태아로부터 유래된 것이다.

실시예 16

여기에 보고되지 않은 연구에서, 세포용해 T 세포 클론 CTL 22/23(Van den Eynde, et al., Int. J. Cancer 44: 634-640 (1989), 참고로 인용됨)이 흑색종 세포주 MZ2-MEL.3.1.을 인지하지 않았음을 확인하였다. 이 흑색종 세포주는 MHC 분자 HLA-A29, HLA-B24 및 HLA-Cw·1601의 발현 능력을 상실한 것으로 문헌(Van der Bruggen, et al., Eur. J. Immunol. 24: 2134-2140 (1994))에 보고되었다. 이들 MHC 분자 중의 하나에 의한 형질감염이 세포주를 CTL 22/23에 민감하게 하는지를 확인하기 위해 연구를 실시하였다. 처음 시험한 분자는 HLA-A29였다. 이를 위해, 폴리 A⁺RNa를 시판되는 추출 키트를 이용하여 제조업자의 지시에 따라서 HLA-A29⁺세포주 MZ2-MEL.43으로부터 추출하였다. 그후에, mRNA를 표준 방법을 이용하여 cDNA로 전환하고, 크기 분별화하고 그후에 단일 방향으로 플라스미드 pcDNA-I/Amp의 Bstx1 및 NotI 부위에 삽입하였다. 플라스미드를 대장균 균주 DH5α'IQ에 일렉트로포레이팅시키고 암피실린(50 ㎍/㎖)으로 선택하였다. 박테리아를 니트로셀룰로오스 필터 상에 평판 배양시키고 복제하였다. 필터를 제조하고,³²P 표지된 프로브 5'-ACTCCATGAGGTATTTC-3' (서열 19)를 이용하여 40 ℃에서 6xSSC/0.1% SDS/1x 덴하르트(Denhardt) 용액에서 밤새 혼성화하였다. 이 프로브는 HLA 서열의 출발 코돈을 둘러싸는 서열이다.

필터를 6xSSC에서 각각 5분 동안 실온에서 2회 세척하고 43 ℃에서 6xSSC에서 2회 세척하였다. 양성 서열은³²P로 표지되었던 프로브5'-TTTCACCACATCCGTGT-3' (서열 20)로 스크리닝하였다. 이 서열은 참고로 삽입된, 면역학적 특성의 서열 및 단백질의 카바트 데이터베이스(Kabat Database)를 참고로 하여 확인된 바와 같이 HLA-A29에 대해 특이적이다. 이 데이터베이스는 NCBI(USA)에서 또는 인터넷 웹사이트 (WWW.NCBI.NLM.NIH.GOV) 상에서 활용할 수 있다. 이 필터를 실온에서 6xSSC에서 각각 5분 동안 2회, 이어서 42 ℃에서 6xSSC에서 2회(세척 당 5분) 세척하였다.

실시예 17

양성 HLA-A29 클론을 단리한 후 이것으로 DEAE-덱스트란 클로로퀴닌 방법(상기 참조)을 이용하여 COS-7을 형질감염시켰다. 간단하게 요약하면, 각각 플라스미드 pcDNAα-I/Amp 또는 pcDSRα 중의 선행 기술 MAGE 또는 BAGE 서열 중 하나에 대한 cDNA 또는 상기 GAGE 서열 중 하나에 대한 cDNA를 포함하는 cDNA 100 ng 및 HLA-A29를 포함하는 플라스미드 pcDNA-I/Amp 50 ng으로 1.5 x 10⁴COS-7 세포를 처리하였다. 그 다음 이 형질감염체를 37 ℃에서 24시간 동안 인큐베이션시켰다.

형질감염체를 상기 실시예 4의 후반부에서 설명된 분석법을 이용하여 CTL에 의한 TNF 생성을 자극하는 이들의 능력에 대해 시험하였다.

이 약물의 결과를 나타내는 도 7은 GAGE-3, 4, 5 또는 6 및 HLA-A29 중의 어느 것을 형질감염체로서 사용하여도 TNF를 고도로 생성하였다는 것을 나타낸다. 대조적으로, GAGE-1 및 GAGE-2는 CTL 클론 22/23을 자극하지 않으므로, GAGE 3, 4, 5 및 6이 HLA-A29 분자에 의해 제공되고 CTL 22/23에 의해 인지되는 항원(들)로 프로세싱된다는 결론에 이르게 된다.

실시예 18

GAGE 3, 4, 5 및 6이 HLA-A29⁺세포에 의해 제공되는 펩티드로 프로세싱되며 GAGE-1 및 GAGE-2는 그렇지 않다는 사실은, GAGE-1 및 GAGE-2에는 없고 GAGE 3, 4, 5 및 6에는 공통적인 아미노산 서열을 추정 조사할 필요를 제기한다. 서열 Arg Ser Thr Tyr Tyr Trp Pro Arg Pro Arg Arg Tyr Val Gln (서열 21)을 확인했다. 이 펩티드를 합성하고, 동결건조시키고, 그후에 DMSO 1 부피, 물 중의 10 mM 아세트산 9 부피에 용해시켰다. 이 방법을 합성된 다른 펩티드(아래에 논의됨)에 이용하였다.

펩티드(서열: 21)를 상기 방법에 따라⁵¹Cr 방출 실험에 시험하였다.

이 펩티드가 용해를 일으키게 하였다는 것을 밝혀냈다. 이어서 연달아 결실을 일으키고, 다시⁵¹Cr 용해 분석을 통해, 용해를 일으키게 하는 능력에 대해 시험하였다. 이 연구는 도 8에 나타내었다. 용해를 일으키게 하는 최단 펩티드는 GAGE-3 내지 6 모두에 공통적인 서열인 Tyr Tyr Trp Pro Arg Pro Arg Arg Tyr (서열 22)인 것으로 밝혀졌다. 구체적으로는, GAGE-3의 아미노산 10-18 및 GAGE-4, 5 및 6의 아미노산 9-17이 이 펩티드에 상응한다.

도 8에 나타내고 예를 들면 서열 21 및 22로 표시된 펩티드 족의 일원은 참고로 인용된 문헌(Toubert, et al., "HLA-A29 Peptide Binding Motif", Abstract No. 4183, Ninth International Congress of Immunology, July 23-29, 1995, San Francisco, CA)에 제시된 데이터에 따르지 않는다. 토버트(Toubert) 등에 따르면, HLA-A29에 결합하는 임의의 펩티드의 제3 위치에서 적어도 Phe 잔기가 필요하다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, 그러한 것은 이 경우가 아니다.

실시예 19

GAGE TRAP를 코딩하는 게놈 DNA 서열을 분리하고 클로닝하는 한 세트의 실험을 실시하였다.

환자 MZ2의 말초 혈액 임파구로부터 단리된 게놈 DNA로부터 라이브러리를 제조하였다. DNA의 분리 및 제조를 참고로 인용된 문헌(Woelfel et al., Immunogenetics 26: 178-187 (1987))에 따라 실시하였다. 단리된 DNA를 제한 효소 Sau3A로 부분적으로 자르고, 그후에 NaCl 농도 구배 초원심분리를 이용하여 분획화하였다. 이것은 DNA의 10-20 kb 단편이 풍부한 분획물을 제공한다(Grosveld et al., Nucl. Acids. Res. 10: 6715-6732 (1982) 참조). 이 단편은 알칼리 포스파타제를 이용하여 탈인산기화하고, BamHI/EcoRI로 잘린 λ-Gem11 DNA에 라이게이션시켰다. 간단하게 요약하면, 게놈 DNA 2 ㎍을 10 ㎕ 부피 중의 λ 파아지 DNA 2 ㎍과 혼합하고, 16 ℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 라이게이션된 DNA를 함유하는 라이게이션 혼합물 4 ㎕를 시험관내에서 시판되는 파아지 포장 추출물로 포장하였다. 스크리닝용으로 평판 배양시키기에 적절한 수의 파아지를 계산하기 위하여, 형성된 파아지를 대장균 NM539(시판되는 균주) 상에 적정하였다. 결과 생성물을 대장균 균주 NM539의 세포 상에 적정하였다.

실시예 20

평판 당 약 33,333 재조합 파아지를 평판 배양시켜 총 500,000개의 피검 파아지를 얻었다. 총 20 ㎕의 포장 혼합물을 10 mM MgSO₄중의 대장균 NM539의 현탁액 1 ㎖와 혼합하여 0.5의 OD₆₀₀을 얻었다. 이 혼합물을 37 ℃에서 15분 동안 인큐베이션시키고, 45 ℃에서 0.7% 아가로스를 함유하는 배양 배지 BTCYM 15 ㎖와 혼합하고, BTCYM을 함유하는 아가 평판 상에 배양시켰다. 형성된 혼합물을 37 ℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 형성된 파아지 플라크를 혼성화 실험에 이용하였다. 약 500,000개의 재조합 파아지 플라크를 나일론 막에 고정시키고, 참고로 인용된 문헌(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989))에 따라서 원위치에서 혼성화시켰다.

서열 1의 뉴클레오티드 18 내지 326으로 이루어진 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하였다. 중합효소 연쇄 반응을 이용하고 프라이머로서 뉴클레오티드 18-34로 이루어진 뉴클레오티드 서열 및 이 서열의 뉴클레오티드 309-326의 보체를 이용하여 프로브를 제조하였다. 프라이머를 10x 농축 다이나짐(Dynazyme) 완충액 10 ㎕, 각 dNTP 0.2 mM, 각 프라이머 50 pmole, 및 다이나짐 DNA 중합효소 2.5 유닛을 함유한 총 부피 100 ㎕ 중에서 30 사이클 PCR (1 사이클: 94 ℃에서 1분, 46 ℃에서 2분, 72 ℃에서 3분)에 사용하였다.

문헌(Sambrook et al., 상기 참조)에 기재된 바와 같이 저온 융해 아가로스에서의 전기영동을 통해 프로브를 정제하였다. 정제에 이어서, 프로브를 시판되는 랜덤 프라이밍 키트를 이용하여 α³²P로 방사 표지하였다(방사성 뉴클레오티드는 α³²P dCTP였다).

일단 프로브를 표지화시키고, 그것을 혼성화 완충액(덱스트란 설페이트의 10% 나트륨염, MW 500,000; 1% SDS; 1M NaCl, 및 변질된 연어 정자 DNA 50 ㎍/㎖)에 사용하였다. 총 부피 200 ㎖의 완충액에³²P 표지된 프로브(약 1.6x10⁸cpm) 약 150 ng을 넣었다. 65 ℃에서 약 15시간 동안 함유하는 나일론막과 합한 혼성화 필터 상에서 약 500,000개의 플라크가 고정되었다. 그 다음, 그 막을 65 ℃에서 0.2xSSC, 0.1% SDS로 세척하였다.

방사선 자동사진술에 이어서, 하나의 양성 클론을 발견하였다. 절제하였을 때, 삽입물은 약 11 kb 길이인 것으로 밝혀졌다. 삽입물을 엔도뉴클레아제 SstI로 처리하여 3개의 단편(175 염기쌍, 4.5 kb 및 6.5 kb)으로 만들고, 이것을 시판되는 플라스미드 pBluescript SK(-), 및 pTZ19R에 서브클로닝시켰다. 이 단편을 시판되는 효소, 및 [γ³³P]ATP로 표지된 프라이머 5'을 이용하여 완전히 서열을 분석했다. 게놈 클론의 서열은 서열 24로서 제공된다.

상기 실시예는 종양 거부 항원 전구체 및 종양 거부 항원을 코딩하는 핵산 분자의 분리를 나타낸다. 그러나, 이 분자는 이미 기재된 MAGE 및 상기 참고 문헌에 기재된 BAGE 코딩 서열 중 어느 것과도 상동성이 없다. 그러므로, 본 발명의 한 면은 서열 1과 서열 1의 단편 예를 들면, 뉴클레오티드 1-170 및 51-170 및 종양 거부 항원으로 프로세싱되는 기타 단편에 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자이다. 서열 1의 서열은 MAGE 또는 BAGE 코딩 서열 어느 것도 아니며, 그것은 인용된 참고 문헌에 기재된 임의의 이들 유전자의 서열과 그것을 비교함으로써 알 수 있다. 또한, 본 발명의 일부는 비-MAGE 및 비-BAGE 종양 거부 항원 전구체를 코딩하지만 엄격한 조건하에서 기재된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자에 혼성화되는 핵산 분자이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "엄격한 조건"이란 용어는 당업계에 공지된 한정요소를 의미한다. 더욱 상세하세는, 본 명세서에 사용된 엄격한 조건이란 1M NaCl, 1% SDS 및 10% 덱스트란 설페이트에서의 혼성화를 의미한다. 이에 이어서 2xSSC에서 실온에서 5분 동안 필터를 2회 세척하고, 2xSSC, 0.1% SDS에서 30분 동안 1회 세척하였다. 동일하거나 또는 더욱 고도의 엄격함을 형성하게 되는, 다른 이용 조건, 시약 등이 있다. 그러한 조건은 당업계의 숙련인에게 공지된 바이므로, 본 명세서에 기재하지 않았다.

본 발명이 발현 벡터내의 서열의 용도 뿐만 아니라 원핵 생물(예를 들면, 대장균), 또는 진핵 생물 (예를 들면, CHO 또는 COS 세포)인 숙주 세포 및 세포주를 형질전환시키거나 또는 형질감염시키는 것을 포함한다는 것을 실시예로부터 알 수 있을 것이다. 발현 벡터는 적절한 서열, 즉 상기한 것이 프로모터에 기능적으로 연결되어야 한다. 인간 백혈구 항원 HLA-Cw6이 이들 유전자로부터 유래된 종양 거부 항원을 제공한다는 것이 밝혀진 바와 같이, 발현 벡터는 HLA-Cw6을 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수도 있다. 벡터가 양쪽 코딩 서열을 포함하는 상황에서, 그것은 둘 중 어느 하나를 정상적으로 발현하지 않는 세포를 형질감염시키는데 이용될 수 있다. 종양 거부 항원 전구체 코딩 서열은, 예를 들면 숙주 세포가 이미 HLA-Cw6을 발현하였을 때 단독으로 사용될 수 있다. 물론, 사용될 수 있는 특별한 숙주 세포에 대한 제한은 없다. 2개의 코딩 서열을 포함하는 벡터가 필요시에 HLA-Cw6 제공 세포에 사용될 수 있고, 종양 거부 항원 전구체에 대한 유전자가 HLA-Cw6을 발현하지 않는 숙주 세포에 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 당업자들로 하여금 목적하는 발현 벡터(들)을 제조 가능하게 하는 소위 발현 키트를 포함한다. 그러한 발현 키트는 상기 논의된 코딩 서열 각각의 적어도 단리된 일부를 포함한다. 필요한 상기 서열이 포함되기만 하면 필요한 만큼 다른 성분이 포함될 수 있다.

본 발명의 핵산 분자 및 TRAP를 상기한 MAGE 및 BAGE 물질과 구별하기 위하여, 본 발명은 GAGE족의 유전자 및 TRAP로서 명명될 것이다. 그러므로, "GAGE"가 본 명세서에 사용될 때는 언제나, 그것은 상기한 서열에 의해 코딩되는 종양 거부 항원 전구체를 의미한다. "GAGE 코딩 분자" 및 유사한 용어는 핵산 분자 그 자체를 설명하는데 이용된다.

본 명세서에 설명된 본 발명은 많은 용도를 가지며, 그 일부만이 본 명세서에 기재되어 있다. 먼저, 본 발명은 TRAP의 발현, 또는 종양 거부 항원의 제공에 의해 특징지워지는, 흑색종과 같은 질환의 진단을 가능하게 한다. 이 방법은 TRAP 유전자, 및(또는) HLA-Cw6에 의해 제공된 TRA와 같은, 그들로부터 유래된 TRA의 발현을 확인하는 것을 포함한다. 전자의 상황에서, 그러한 확인은 중합효소 연쇄 반응을 포함한 임의의 표준 핵산 확인 분석, 또는 표지된 혼성화 프로브에 의한 분석을 통해 실시될 수 있다. 후자의 상황에서, 항체와 같은, TRA 및 HLA의 복합체에 대한 결합 파트너에 의한 분석이 특히 바람직하다. 또다른 확인 방법은 상기 유형의 TNF 분비 분석이다. 이 분석을 실시하기 위하여, GAGE를 정상적으로 발현할 때 정소 세포가 존재하지 않는지를 확인하는 것이 바람직하다. 그러나, 당업자가 정소와 다른 세포 유형을 통상적으로 구별할 수 있을 때 이것은 필수적인 것이 아니다. 또한, 비정소성 샘플에 존재하는 정소 세포를 갖는 것이 실제적으로 불가능하다.

TRAP 유전자의 분리는 또한 TRAP 분자 그 자체, 특히 서열 2-6에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 포함하는 TRAP 분자를 단리하는 것을 가능하게 한다. TRA로서 또는 HLA-Cw6 또는 HLA-A29와 같은 HLA 및 TRA의 복합체로서 존재할 때의 이들 단리된 분자를 보조제와 같은 물질과 배합하여 TRAP 분자의 발현에 의해 특징지워지는 질환을 치료하는데 유용한 백신을 제조할 수 있다.

예시적인 보조제로는 프로인드 완전 및 불완전 보조액, B. 백일해 사균, "BCG", 또는 바실 칼멘테-구에린(Bacille Calmente-Guerin), Al(OH)₃, 물질대사 가능한 오일에 유화될 수 있는 무라밀 디펩티드 및 그의 유도체, 예를 들면 스쿠알렌, 모노포스포릴 리피드 A(MPL), 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH), 사포닌 추출물, 예를 들면 QA-7, QA-19 및 QA-21(QS-21로서도 명명됨)(이들은 참고로 인용된 미국 특허 제5,057,540호(Kensil et al.)에 기재됨), MTP-MF59, N-[1-(2,3-디올레오일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 메틸 설페이트(DOTAP), 양이온성 암피필 DOTMA, DOPE와 같은 중성 포스포피리드 및 이들의 배합물을 들 수가 있다. 이 목록은 결코 포괄적인 것이 아니며, 당업계의 숙련인은 이 목록을 추가할 수 있을 것이다. 모든 추가의 보조제가 본 발명에 포함된다.

또한, 백신은 비증식성 암 세포, 비증식성 형질감염체 등과 같은, 표면 상에 TRA/HLA 복합체가 존재하는 세포로부터 제조될 수 있다. 세포가 백신으로서 사용되는 모든 경우에, 이것은 CTL 반응을 제공하는데 필요한 성분 중 하나 또는 양쪽에 대한 코딩 서열로 형질감염된 세포이거나 또는 형질감염 없이 양 분자를 발현하는 세포일 수 있다. 또한, TRAP 분자, 그의 조합된 TRA 뿐만 아니라 TRA 및 HLA의 복합체를 이용하여 당업계에 공지된 표준 기술로 항체를 형성할 수 있다.

"질환"이란 용어가 본 명세서에 사용될 때, 그것은 종양 거부 항원 전구체가 발현되는 임의의 병리 상태를 의미한다. 그러한 질환의 예는 암, 특히 흑색종이다. 흑색종은 색소 형성 세포의 암으로서 잘 알려져 있다.

상기한 바와 같이, 서열 4에 나타낸 것과 같은 종양 거부 항원도 또한 본 발명의 일부이다. 또한, 본 발명의 일부는 8 내지 16 아미노산을 포함하는 분자와 같은 폴리펩티드이며, 그 폴리펩티드는 서열 4에 기재된 아미노산 서열을 포함한다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 서열 4의 옥타머 보다 더 긴 펩티드는 HLA-Cw6 제공 암 세포에 의해 서열 4의 종양 거부 항원으로 프로세싱되어 제공된다. 이러한 상태는 복합체를 제공하는 세포에 접촉하는 체액 샘플에 존재하는 세포용해 T 임파구에 의한 용해를 유발한다. 마찬가지로, 서열 21과 같은, 서열 22 보다 더 긴 펩티드는 적절한 TRA로 프로세싱되고 HLA-A29 양성 세포와 같은 암 세포에 의해 제공된다.

따라서, 본 발명의 다른 특징은 9 내지 16 아미노산 길이의 펩티드이며, 그것은 Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp (여기서, Xaa는 임의의 아미노산임) (서열 23)이다. 이 펩티드는 구부러지고 및(또는) HLA-A29 분자에 결합하는 펩티드로 프로세싱된다. 이 펩티드가 종양 거부 항원으로 프로세싱된다는 사실은 실시예에 나타나 있다.

이러한 특성은 암, 특히 흑색종과 같은 병리 상태의 진단을 확인하는데 다른 파라메터와 관련하여 이용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명자는 혈액 또는 뇨로의 항원의 발산을 연구하고, 생리학적 변화를 관찰하고, 그후에 본 명세서에 기재된 CTL 증식 방법을 이용한 흑색종의 진단을 확인할 수 있다.

독립적으로, 본 발명에 따른 펩티드는 HLA-타입 분석을 실시하는데 이용될 수 있다. 피부 이식, 기관 이식 등이 필요할 때, 당업자는 이식 거부의 가능성을 최소화하도록 HLA 타이핑을 수행해야만 한다는 것은 잘 알려진 사실이다. 본 발명의 펩티드는 개체가 HLA-Cw6 양성인지 아닌지를 확인하는데 사용될 수 있으므로, 적절한 공여체가 선택될 수 있다. 이 타입의 분석이 수행하기가 간단하다. 본 발명의 펩티드는 당해 샘플로 접촉되고, 그 샘플내의 세포에 대한 결합은 샘플이 취해진 개체가 HLA-Cw6 양성인지 아닌지를 나타낸다. 당업자는 그러한 분석을 최적화하기 위하여 펩티드 자체를 표지화하고, 그것을 표지된 링커에 융합시키거나 또는 결합시키고, 그것을 고상에 고정시킬 수 있다. 다른 표준 방법은 당업자에게 자명할 것이므로 본 명세서에 나타낼 필요가 없다.

본 발명을 기초로 한 치료 방법은 대상자의 면역계에 의한 반응에 전제를 두어 HLA-Cw6 세포와 같은 TRA 제공 세포의 용해를 유발한다. 그러한 방법 중 한가지는 해당 페노형의 이상 세포를 갖는 대상자에게 복합체에 특이적인 CTL를 투여하는 것이다. 시험관내에서 그러한 CTL를 발생시키는 것은 당업계의 숙련인의 기술내에 드는 것이다. 특별하게는, 혈액 세포와 같은 세포의 샘플은 복합체를 제공하는 세포에 접촉되어 특이적인 CTL을 증식시킬 수 있다. 표적 세포는 상기 유형의 COS 세포와 같은 형질감염체일 수 있다. 이러한 형질감염체는 그의 표면 상에 목적하는 복합체를 존재시키며, 당해 CTL과 합해질 때 그의 증식을 자극한다. 본 명세서에 사용된 것과 같은 COS 세포는 다른 적합한 숙주 세포와 같이 널리 이용가능하다.

채택 전이(adoptive transfer)로서 불리는 치료 방법을 상세히 하면(Greenberg, J. Immunol. 136(5): 1917 (1986); Riddel et al., Science 257: 238 (7-10-92); Lynch et al., Eur. J. Immunol. 21: 1403-1410 (1991); Kast et al., Cell 59: 603-614 (11-17-89)), 목적하는 복합체를 제공하는 세포를 CTL와 합하여 그에 특이적인 CTL의 증식을 유도한다. 적절한 HLA 분자를 포함하는 특별한 복합체를 제공하는 특정 이상 세포에 의해 특징지워지는 세포 이상을 가진 개체에게 증식된 CTL를 투여한다. 그후에, CTL는 이상 세포를 용해하고, 그럼으로써 목적하는 치료 목표를 성취하게 된다.

상기 요법은 대상자의 이상 세포의 적어도 일부가 관련 HLA/TRA 복합체를 제공한다는 것을 가정한다. 당업자는 특별한 HLA 분자를 제공하는 세포를 확인하는 방법 뿐만 아니라 관련 서열, 이 경우에 GAGE 서열의 RNA를 발현하는 세포를 확인하는 방법에 매우 익숙하므로 이것은 매우 쉽게 측정될 수 있다. 관련 복합체를 제공하는 세포가 일단 상기 스크리닝 방법을 통해 확인되면, 그것은 샘플이 CTL를 함유하는 환자로부터 얻은 샘플과 합해질 수 있다. 복합체 제공 세포가 혼합된 CTL 샘플에 의해 용해된다면, GAGE 유도된 종양 거부 항원이 제공되고 대상자가 상기 치료 방법의 적절한 후보임이 추정될 수 있다.

채택 전이는 본 발명에 따라 이용가능한 요법의 유일한 형태가 아니다. CTL는 또한 많은 방법을 이용하여 생체내에서 형성될 수도 있다. 한가지 방법, 즉, 복합체를 발현하는 비증식성 세포의 이용은 위에 상술되었다. 이 방법에 이용된 세포는 복합체의 제공에 필요한 유전자 중 하나 또는 양쪽으로 형질감염된 조사된 흑색종 세포(들)과 같은, 복합체를 정상적으로 발현하는 것일 수 있다. 문헌(Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 110-114 (January, 1991))에는 치료 양식에서 HPV E7 펩티드를 발현하는 형질감염된 세포의 사용을 나타내는 이 방법이 예증되어 있다. 각종 세포 유형이 이용될 수 있다. 마찬가지로, 당해 유전자 중 하나 또는 양쪽을 갖는 벡터가 이용될 수 있다. 바이러스 또는 박테리아 벡터가 특히 바람직하다. 이 시스템에서, 당해 유전자는, 예를 들면 우두 바이러스 또는 박테리아 BCG, 및 물질, 사실상 "감염" 숙주 세포에 의해 옮겨진다. 형성된 세포는 당해 복합체를 제공하며, 후에 증식되는 자기이식 CTL에 의해 인지된다. 종양 거부 항원 또는 그의 전구체 자체를 보조제와 배합함으로써 유사한 효과를 얻어 그후에 당해 HLA/펩티드 복합체를 제공하는 HLA-Cw6 제공 세포로의 혼입을 용이하게 한다. TRAP는 HLA 분자의 펩티드 파트너를 형성하도록 프로세싱되는 반면, TRA는 추가의 프로세싱의 필요 없이 제공된다.

본 발명의 다른 면은 당업자에게 자명할 것이므로 여기에 반복될 필요가 없다.

본 명세서에 이용된 용어 및 표현은 제한의 목적이 아니라 설명을 위해 사용되며, 기재되고 설명된 특징 또는 그의 일부의 등가 사항을 제외하고 그러한 용어 및 표현의 사용에 의도가 있는 것은 아니며, 각종 변형이 본 발명의 영역내에서 가능하다는 것이 인지된다.

<서열 29a>

<서열 29b>

<서열 29c>

<서열 29d>

<서열 29e>

<서열 29f>

<서열 29g>

Claims

상보적 서열이 엄격한 조건하에서 서열 29에 혼성화되는, GAGE 종양 거부 항원 전구체를 코딩하는 단리된 핵산 분자.
제1항에 있어서, 서열 29로 이루어진 단리된 핵산 분자.
제1항의 단리된 핵산 분자를 프로모터에 기능적으로 연결된 상태로 포함하는 발현 벡터.
제2항의 단리된 핵산 분자를 프로모터에 기능적으로 연결된 상태로 포함하는 발현 벡터.
제3항의 발현 벡터로 형질전환되거나 또는 형질감염된 단리된 진핵 세포.
제4항의 발현 벡터로 형질전환되거나 또는 형질감염된 단리된 진핵 세포.
제1항의 단리된 핵산 분자를 프로모터를 포함하는 벡터에 프로모터에 대한 기능적인 연결 방향으로 삽입하는 것을 포함하는, GAGE 종양 거부 항원 전구체를 코딩할 수 있는 발현 벡터의 제조 방법.
제2항의 단리된 핵산 분자를 프로모터를 포함하는 벡터에 프로모터에 대한 기능적인 연결 방향으로 삽입하는 것을 포함하는, GAGE 종양 거부 항원 전구체를 코딩할 수 있는 발현 벡터의 제조 방법.