KR20000013659A - B형 간염바이러스의 표면항원 s에 대한 인간화 항체 및 이의제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 B형 간염바이러스 (hepatitis B virus, 이하 "HBV"로 약칭함)에 대한 인간화 항체 (Humanized antibody)에 관한 것으로, 구체적으로 HBV의 표면항원 S에 대한 생쥐 단일클론항체의 가변영역과 가장 유사한 사람 유전자를 대상으로 제조하여 HBV의 표면항원 S에 대한 기존의 인간화 항체보다 생쥐 유래의 아미노산 잔기가 많이 감소된 인간화 항체의 중쇄 (Heavy chain) 유전자 및 경쇄 (light chain) 유전자, 이를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 그리고 상기 형질전환체를 배양하여 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체를 제조함으로써, 본원 발명의 인간화 항체는 기존의 인간화 항체와 유사한 항원결합능을 유지하면서도 기존의 인간화 항체보다 면역유발능이 현저히 감소되어 B형 간염 바이러스를 효과적으로 예방할 수 있다.

Description

Ｂ형 간염바이러스의 표면항원 Ｓ에 대한 인간화 항체 및 이의 제조방법
본 발명은 B형 간염바이러스 (hepatitis B virus, 이하 "HBV"로 약칭함)에 대한 인간화 항체 (Humanized antibody)에 관한 것으로, 구체적으로 HBV의 표면항원 S에 대한 생쥐 단일클론항체의 가변영역과 가장 유사한 사람 유전자를 대상으로 제조하여 HBV의 표면항원 S에 대한 기존의 인간화 항체보다 생쥐유래의 아미노산 잔기가 많이 감소되어 기존의 인간화 항체보다 인체면역반응을 현저히 개선할 수 있는 인간화 항체의 중쇄 (Heavy chain) 유전자 및 경쇄 (light chain) 유전자, 이를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체, 그리고 상기 형질전환체를 배양하여 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체를 제조하는 방법에 관한 것이다.
HBV는 인체에 침입하여 만성 및 급성 간염을 일으키며, 악화될 경우 간경화와 간암의 원인이 되는 병원체로, 전세계적으로 환자가 3억명에 이르는 것으로 추산하고 있다 (Tiollais and Buendia, Sci. Am., 264, 48, 1991). HBV의 피막은 3개의 단백질로 구성되는데, 구체적으로 S항원을 포함하는 주 (major) 단백질, S항원과 프리 S2 항원을 포함하는 중 (middle) 단백질 및 S항원, 프리 S2 항원과 프리 S1 항원을 포함하는 대 (large) 단백질로 구성된다. (Neurath, A.R. and Kent, S.B.H., Adv. Virus Res., 34: 65-142, 1988). 이 모든 표면항원 단백질들은 HBV를 중화시키고 무력화하는 항체를 유도하는데, 그 중 S항원은 전체 피막 단백질의 80 %를 차지하며, 모든 아형 HBV에 공통으로 존재하는 "Common a" 라는 중화 에피토프 (Neutralizing epitope)를 가지고 있다.
HBV에 감염된 경우, 예를 들어 HBV 양성인 모친으로부터 태어나는 신생아나 HBV에 노출된 의료기관 종사자들 또는 HBV관련 간질환으로 인한 간이식 수술환자 등의 HBV 감염을 방지하기 위해 현재까지는 HB 면역글로불린 (이하 "HBIG"로 약칭함)을 사용하였다 (Beasley et al., Lancet, 2, 1099, 1983; Todo et al., Hepatol., 13, 619, 1991). 그러나 현재 사용되고 있는 HBIG는 혈장으로부터 추출되기 때문에, 항원에 대한 특이성 (specificity)이 낮고, 제조과정 중 오염원에 노출될 우려가 있으며, 사람의 혈액을 계속 공급해야 한다는 문제점이 있다.
상기 문제점을 해결하기 위하여 생쥐의 HBV 표면항원에 대한 단일클론항체를 사용하는 방법이 개발 되었다. 생쥐 단일클론항체는 일반적으로 항원에 대한 친화도가 높고 대량생산이 가능하지만, 사람에게 주사하였을 때에 체내에서 면역반응을 유발한다는 단점이 있었다 (Shawler et al., J. Immunol., 135, 1530, 1985).
상기 문제점을 해결하고자 사람의 단일클론항체를 사용하는 기술이 보고되었으나, 아직까지는 HBV 표면항원 S에 대한 친화도가 높은 사람의 단일클론항체를 대량으로 생산한는 기술은 실용화되어 있지 않다.
최근에 생쥐유래 단일클론항체의 높은 친화도와 특이성을 유지한 채 인체 내에서의 면역유발능을 최대한 줄일 수 있는 방법으로 생쥐의 항원결합부위만을 사람항체에 이식시킨 "인간화 항체"가 개발되었다. 이와 같은 인간화 항체는 유전공학적으로 대량배양이 가능하고, 유전자의 대부분을 인간화 하였으므로 인체 내에서의 면역반응을 대폭 줄일수 있게 되었다는 장점이 있으나 (Riechmann et al., Nature, 332, 323, 1988; Nakatani et al., Protein Engineering, 7,435, 1994), 인간화 항체에 있어서 여전히 존재하는 인체내에서의 면역반응을 일으키는 부작용을 감소시켜야 한다는 과제가 남아 있다.
이에 본 발명자들은 기존의 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체보다 생쥐유래의 아미노산 잔기들이 많이 감소되어 인체 면역 유발능이 개선된 인간화 항체를 제조하기 위하여, HBV의 표면항원 S에 대한 생쥐 항체의 가변영역 서열과 가장 유사한 사람 유전자를 검색하고 이를 대상으로 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자를 제조한 후 이들을 발현벡터에 클로닝하여 숙주세포를 형질전환한 다음 이를 배양하여 인간화 항체를 얻어 본 발명의 인간화 항체가 기존의 인간화 항체보다 몇 개의 아미노산 잔기가 더 인간화되었으나 기존의 인간화 항체와 유사한 항원결합능을 유지하는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 생쥐 유래의 아미노산 잔기들이 보다 더 인간화되어, HBV 표면항원 S에 대한 기존의 인간화 항체보다 면역유발능이 현저히 감소된 새로운 HBV 표면항원 S에 대한 인간화 항체를 제공하는 것이다.
도 1은 HBV 표면항원 S에 대한 생쥐 단일클론 항체 및 인간화 항체 중쇄의 아미노산 서열 및 염기 서열을 비교하여 나타낸 것이고,
도 2는 인간화 항체 중쇄 유전자 발현 벡터 pRc/CMV-HC-huS 를 주형으로 재조합 PCR을 수행하여 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체의 중쇄 유전자 pHHC-HZⅡS 를 얻는 과정을 개략적으로 나타낸 것이며,
도 3은 HBV 표면항원 S에 대한 생쥐 단일클론 항체 및 인간화 항체 경쇄의 아미노산 서열 및 염기 서열을 비교하여 나타낸 것이고,
도 4는 인간화 항체 경쇄 유전자 발현 벡터 pKC-dhfr-huS 를 주형으로 재조합 PCR을 수행하여 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체의 경쇄 유전자 pHKC-HZⅡS 를 얻는 과정을 개략적으로 나타낸 것이며,
도 5는 본 발명의 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체의 중쇄 발현 벡터 pRc/CMV-HC-HZⅡS 를 나타낸 것이고,
도 6은 본 발명의 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체의 경쇄 발현 벡터 pKC-dhfr-HZⅡS 를 나타낸 것이며,
도 7은 본 발명의 인간화 항체 HZⅡ-H67 의 항원 결합친화도를 CS131A와 비교하여 나타낸 것이다.
----◇---- CS131A
----□---- HZⅡ-H67
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 HBV의 표면항원 S에 대한 기존의 인간화 항체보다 생쥐유래의 아미노산 잔기들이 많이 감소된 인간화 항체 및 이의 경쇄 또는 중쇄의 아미노산 서열을 제공한다.
또한 본 발명은 HBV의 표면항원 S에 대한 기존의 인간화 항체보다 생쥐유래의 아미노산 잔기들이 많이 감소된 인간화 항체 경쇄 및 중쇄를 암호하는 인간화 항체 경쇄 및 중쇄 유전자를 제공한다.
본 발명은 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체를 배양하여 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는 서열 19의 아미노산 서열의 가변영역을 포함하는 인간화 중쇄로 된 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체 및 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 인간화 경쇄로 된 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체를 제공한다.
또한, 본 발명에서는 서열 19의 아미노산 서열을 암호하는 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 중쇄 유전자 pHHC-HZⅡS 및 서열 20의 아미노산 서열을 암호하는 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 경쇄 유전자 pHKC-HZⅡS 를 제공한다.
또한, 본 발명에서는 상기 유전자 pHHC-HZⅡS를 포함하는 발현 벡터 pRc/CMV-HC-HZⅡS (기탁번호: KCTCO489BP) 및 상기 유전자 pHKC-HZⅡS를 포함하는 발현 벡터 pKC-dhfr-HZⅡS (기탁번호: KCTCO490BP)를 제공한다.
또한, 본 발명에서는 발현 벡터 pRc/CMV-HC-HZⅡS 와 발현 벡터 pKC-dhfr-HZⅡS 로 COS7 세포를 형질전환하여 얻은 형질전환체 HZⅡ-H67를 제공한다.
또한, 본 발명에서는 상기 형질전환체 HZⅡ-H67를 배양하여 HBV 표면항원 S에 대한 인간화 항체를 얻는 HBV 표면항원 S에 대한 인간화 항체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서는 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체를 제조하기 위하여, 우선 HBV의 표면항원 S에 대한 생쥐 단일클론항체 H67의 가변영역 서열과 가장 유사한 사람 유전자를 검색한다.
진뱅크 데이터 베이스 (GenBank data base)로부터 사람의 유전자를 선별한 결과 사람 VH21/28 (J. Mol. Biol., 227, 776, 1992)가 생쥐항체 H67 중쇄의 가변영역 유전자와 가장 유사한 유전자이고, 사람 B1 (Eur. J. Immunol., 24, 827, 1994)이 생쥐항체 H67 경쇄의 가변영역 유전자와 가장 유사한 유전자임을 확인하였다.
따라서 상기 유전자를 대상으로 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자를 제조한다.
구체적으로 인간화 항체의 중쇄 유전자를 제조하기 위하여, HBV 표면항원 S에 대한 생쥐 단일클론항체 H67 (Ryu, et al., Gene., 144, 313, 1994)의 중쇄 가변영역 중에서 항원결합부위의 전체 또는 부분을 사람 항체의 중쇄 (γ1)에 이식시켜 제조한 인간화 중쇄를 포함하는 발현벡터 pRc/CMV-HC-huS (대한민국특허출원 제 96-17625호)를 주형으로 하여 서열 1과 서열 2, 서열 3과 서열 4, 서열 5와 서열 6 그리고 서열 7과 서열 8의 시발체를 각각 이용하여 PCR을 수행한다. 상기 서열 1과 서열 2, 서열 3과 서열 4, 서열 5와 서열 6에 의한 PCR 산물을 접합 (annealing)시켜 이를 다시 주형으로 하여 서열 1과 서열 6의 시발체를 이용하여 재조합 PCR을 수행함으로 약 291bp 의 단편을 얻는다. 이를 서열 7과 서열 8의 시발체를 각각 이용한 PCR 산물과 함께 주형으로 하여 서열 1과 서열 8의 시발체를 이용하여 PCR을 수행함으로 1428bp 의 인간화 중쇄 유전자를 얻어 pBluescript SK(+)에 클로닝하고 pHHC-HZⅡS라 명명하였다.
상기 인간화 중쇄 유전자를 합성하는 과정에 사용된 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8의 시발체를 도 2에 나타내었다. 구체적으로 서열 1의 시발체는 그 말단에 제한효소 EcoRI서열을 가지고 서열 8의 시발체는 그 말단에 제한효소 SalI서열을 가진다.
상기와 같이 제조된 pHHC-HZⅡS 인간화 중쇄의 가변영역은 기존의 인간화 항체 중쇄의 7개의 생쥐 항체의 가변영역 아미노산 잔기를 사람 항체 VH 21/28 중쇄의 것으로 치환한 것이다 (도 1 참조). 본원 발명의 인간화 중쇄는 서열 19의 아미노산 서열로 이루어진 가변영역을 포함한다.
아미노산의 치환은 기존의 인간화 항체에서 항체의 구조에 영향을 줄것으로 추정되어 생쥐것으로 그대로 사용된 생쥐 프레임워크 아미노산 잔기 중 항원결합 친화도에 미미한 영향을 줄 것으로 예상되는 몇 몇 잔기와 항원-항체결합에 관한 단백질 데이터베이스 분석에서 항원과의 결합에 참여하지 않을 것으로 여겨지는 항원결합부위 아미노산 잔기에 대하여 사람항체의 잔기를 사용하는 방향으로 이루어진 것이다.
또한 인간화 항체의 경쇄 유전자를 제조하기 위하여, HBV 표면항원 S에 대한 생쥐 단일클론항체 H67의 경쇄 가변영역 중에서 항원결합부위의 전체 또는 부분을 사람항체의 경쇄(κ)에 이식시켜 제조한 인간화 경쇄를 포함하는 발현벡터 pKC-dhfr-huS (한국특허출원 제 96-17625호)를 주형으로 하여 서열 9와 서열 10, 서열 11과 서열 12, 서열 13과 서열 14, 서열 15와 서열 16 그리고 서열 17과 서열 18의 시발체를 각각 이용하여 PCR을 수행한다. 상기 서열 9과 서열 10, 서열 11과 서열 12에 의한 PCR 산물을 접합시켜 이를 다시 주형으로 하여 서열 9와 서열 12의 시발체를 이용하여 재조합 PCR을 수행함으로 약 274bp 의 단편을 얻는다. 이를 서열 13과 서열 14, 서열 15와 서열 16의 시발체를 각각 이용한 PCR 산물과 함께 주형으로 하여 서열 9와 서열 16의 시발체를 이용하여 PCR을 수행함으로 407bp 의 단편을 합성한다. 이를 다시 서열 17과 서열 18의 시발체를 각각 이용한 PCR 산물과 함께 주형으로 하여 서열 9와 서열 18의 시발체를 이용하여 PCR을 수행함으로 736bp 의 인간화 경쇄 유전자를 얻어 pBluescript SK(＋)에 클로닝하고 pHKC-HZⅡS라 명명하였다.
상기 인간화 경쇄 유전자를 합성하는 과정에 사용된 서열 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18의 시발체를 도 4에 나타내었다. 구체적으로 서열 9의 시발체는 그 말단에 제한효소 HindⅢ서열을 가지고 서열 18의 시발체는 그 말단에 제한효소 SalI서열을 가진다.
상기와 같이 제조된 pHKC-HZⅡS 인간화 경쇄의 가변영역은 기존의 인간화 항체 중쇄의 9개의 생쥐항체의 가변영역 아미노산 잔기를 사람항체 VH 21/28 중쇄의 것으로 치환한 것이다 (도 3 참조). 본원 발명의 인간화 경쇄는 서열 20의 아미노산 서열로 이루어진 가변영역을 포함한다.
아미노산의 치환은 인간화 중쇄와 마찬가지로 기존의 인간화 항체에서 항체의 구조에 영향을 줄것으로 추정되어 생쥐것으로 그대로 사용된 생쥐 프레임워크 아미노산 잔기 중 항원결합 친화도에 미미한 영향을 줄 것으로 예상되는 몇 몇 잔기와 항원-항체결합에 관한 단백질 데이터베이스 분석에서 항원과의 결합에 참여하지 않을 것으로 여겨지는 항원결합부위 아미노산 잔기에 대하여 사람항체의 잔기를 사용하는 방향으로 이루어진 것이다.
본 발명은 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체의 상기 경쇄 및 중쇄 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환시킨 형질전환체를 배양하여 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체를 제조하기 위하여, 우선 본 발명에서는 상기 인간화 항체의 경쇄 및 중쇄 유전자를 포함하는 발현벡터를 제작한다.
구체적으로, 인간화 중쇄를 포함하는 상기 pHHC-HZⅡS로부터 본 발명의 인간화 중쇄를 제한효소를 이용하여 분리한 다음 pRc/CMV 에 삽입하여 본 발명의 인간화 중쇄 발현 플라스미드 pRc/CMV-HC-HZⅡS를 제조하였다. 또한 인간화 경쇄를 포함하는 상기 pHKC-HZⅡS로부터 본 발명의 인간화 경쇄를 제한효소를 이용하여 분리한 다음 pCMV-dhfr에 삽입하여 본 발명의 인간화 경쇄 발현 플라스미드 pKC-dhfr-HZⅡS를 제조하였다.
상기 발현벡터 pRc/CMV-HC-HZⅡS 또는 pKC-dhfr-HZⅡS로 대장균(E. coli) DH5α균주를 각각 형질전환하여 대장균 형질전환체를 제조하고 이를 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 1998년 6월 5일자로 기탁하였다 (수탁번호:KCTC 0489BP, KCTC 0490BP).
본 발명에서는 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체를 제조하기 위하여, 본 발명의 인간화 중쇄 및 인간화 경쇄 유전자를 포함하는 발현 벡터 pRc/CMV-HC-HZⅡS 와 pKC-dhfr-HZⅡS 를 각각 COS7 세포에 형질전환시켜 형질전환체 HZⅡ-H67을 얻은 다음 이를 배양하여 본원 발명의 인간화 항체를 분리한다.
상기와 같은 과정으로 얻어진 인간화 항체의 HBV 표면항원 S에 대한 결합능과 항원결합 친화도를 조사한 결과, 본 발명의 HBV 표면항원 S에 대한 인간화 항체는 기존의 인간화 항체와 유사한 항원결합능을 유지하면서도 기존의 인간화 항체보다 현저히 감소된 면역유발능을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 인간화 중쇄 유전자의 제조
인간화 중쇄 가변영역을 제조하기 위하여 우선, H67의 가변영역 유전자 (대한민국 특허등록 제 102173호)와 아미노산 서열이 가장 유사한 사람 VH21/28 (J. Mol. Biol. 227, 776, 1992)을 진뱅크 (GenBank) 데이타베이스로부터 선발하였다. 상기 H67의 중쇄 가변영역과 VH21/28 항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 비교하여 이를 근거로 첫 번째 인간화 항체 HzⅠ를 고안한 후, 고안된 첫 번째 인간화 항체를 개선하여 두 번째 인간화 항체 HzⅡ를 고안하였다 (도 1 참조).
또한, 두 번째 인간화 항체의 중쇄 유전자를 만들기 위하여 선행 출원한 인간화 항체 중쇄 유전자 발현 벡터 pRc/CMV-HC-huS (대한민국특허출원 제 96-17625호)를 주형으로 재조합 PCR를 수행하였다 (도 2 참조). 개선된 두 번째 인간화 항체에서는, 첫 번째 인간화 항체에서 항체의 구조에 영향을 줄것으로 추정되어 생쥐것으로 그대로 사용된 생쥐 프레임워크 아미노산 잔기 중 항원결합 친화도에 미미한 영향을 줄 것으로 예상되는 몇 몇 잔기와 항원-항체결합에 관한 단백질 데이터베이스 분석에서 항원과의 결합에 참여하지 않을 것으로 여겨지는 항원결합부위 아미노산 잔기에 대해서는 사람항체의 잔기를 그대로 사용하였다. 아미노산 변화를 유도한 재조합 PCR의 시발체를 서열 1 내지 서열 8에 기술하였다.
PCR 반응조건은 94 ℃에서 1분, 55 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분으로 Taq DNA 중합효소 (polymerase)를 사용하여 30회 수행하였다. 먼저, 서열 1과 서열 2, 서열 3과 서열 4, 서열 5와 서열 6, 서열 7과 서열 8의 시발체를 사용하여 얻어진 DNA 단편들중 서열 1과 서열 2 (134bp), 서열 3과 서열 4 (111bp), 서열 5와 서열 6 (96bp)의 시발체를 사용하여 얻어진 DNA 단편들을 어닐닝하여 서열 1과 서열 6의 시발체로 재조합 PCR하여 연결하였고, 상기 합성된 단편 (281bp)을 서열 7과 서열 8의 시발체를 사용하여 합성된 DNA단편 (1165bp)과 서열 1과 서열 8의 시발체를 사용하여 연결하였다. 최종적으로 합성된 인간화 항체 중쇄 유전자 (약 1428bp)를 제한효소 EcoRI와 제한효소 SalI로 양끝을 잘라 pBluescript SK(＋)에 클로닝하여 pHHC-HZⅡS라 명명하였다. 제조된 인간화 항체 중쇄 유전자의 염기서열은 DNA 시퀀싱 (sequencing)에 의해 확인하였다.
<실시예 2> 인간화 경쇄 유전자의 제조
인간화 경쇄 가변영역을 제조하기 위하여 우선, H67의 가변영역 유전자와 아미노산 서열이 가장 유사한 사람 B1(Eur. J. Immunol. 24, 827, 1994)을 진뱅크 데이터베이스로부터 선발하고, 상기 H67의 경쇄 가변영역과 B1 항체의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열 및 염기 서열을 비교하여 이를 근거로 첫 번째 인간화 항체 HzⅠ를 고안한 후, 고안된 첫 번째 인간화 항체를 개선하여 두 번째 인간화 항체 HzⅡ를 고안하였다.
또한, 두 번째 인간화 항체의 경쇄 유전자를 만들기 위하여 선행 출원한 인간화 항체 경쇄 유전자 발현 벡터 pKC-dhfr-huS (한국특허출원 제 96-17625호)를 주형으로 재조합 PCR를 수행하였다 (도 4 참조).
개선된 두 번째 인간화 항체에서는, 첫 번째 인간화 항체에서 항체의 구조에 영향을 줄것으로 추정되어 생쥐것으로 그대로 사용된 생쥐 프레임워크 아미노산 잔기 중 항원결합 친화도에 미미한 영향을 줄 것으로 예상되는 몇 몇 잔기와 항원-항체결합에 관한 단백질 데이터베이스 분석에서 항원과의 결합에 참여하지 않을 것으로 여겨지는 위치의 아미노산 잔기에 대해서는 사람항체의 잔기를 그대로 사용하였다. 아미노산 변화를 유도한 재조합 PCR의 시발체를 서열 9 내지 서열 18에 기술하였다.
PCR반응 조건은 94 ℃에서 1분, 55 ℃에서 1분, 72 ℃에서 1분으로 30회 수행하였다. 먼저 서열 9와 서열 10, 서열 11과 서열 12, 서열 13과 서열 14, 서열15와 서열 16, 서열 17과 서열 18의 시발체를 사용하여 얻어진 DNA 단편들중 서열 9와 서열 10 (188bp), 서열 11과 서열 12 (96bp)의 시발체를 사용하여 얻어진 DNA단편들을 어닐닝하여 서열 9와 서열 12의 시발체로 재조합 PCR하여 연결하고, 이 합성된 단편 (274bp)을 다시 서열 13과 서열 14, 서열 15와 서열 16의 시발체로 합성한 DNA단편 99bp, 81bp과 어닐닝하고 서열 9와 서열 16의 시발체로 재조합 PCR하여 연결하였다. 이렇게 제조된 DNA단편 (407bp)과 서열 17, 서열 18의 시발체로 합성된 DNA 단편 (350bp)을 서열 9와 서열 18의 시발체로 연결하여 최종적으로 인간화 항체 경쇄 유전자 (736bp)를 합성하였다. 합성된 인간화 항체 경쇄 유전자를 제한효소 HindⅢ와 제한효소 SalI로 양끝을 잘라 pBluescript SK(＋)에 클로닝하여 pHKC-HZⅡS라 명명하였다. 합성된 인간화 항체 경쇄 유전자의 염기서열은 DNA 시퀀싱에 의해 확인하였다.
<실시예 3> 인간화 중쇄 발현 플라스미드의 제조
플라스미드 pHHC-HZⅡS를 제한효소 SalI으로 자른 후 클레나우 (Klenow)효소로 끝을 블런트 (blunt)하게 만든 다음, 제한효소 NotI으로 다시 잘라서 인간화 중쇄 유전자를 분리하였다. 한편 pRc/CMV (Invitrogen사 제품)를 제한효소 XbaI으로 자르고 클레나우 효소로 끝을 블런트하게 만든 다음, 제한효소 NotI으로 다시 잘라서 벡터를 분리하였다. 분리한 벡터에 상기의 인간화 중쇄 유전자를 연결하여 인간화 중쇄 발현 벡터 pRc/CMV-HC-HZⅡS를 제작하였다. 제작된 인간화 중쇄 발현 벡터 pRc/CMV-HC-HZⅡS는 KCTC에 기탁하였고 (기탁번호: KCTC0489BP), 완성된 벡터는 도 5에 나타내었다.
<실시예 4> 인간화 경쇄 발현 플라스미드의 제조
플라스미드 pHKC-HZⅡS를 제한효소 HindⅢ와 ApaI으로 잘라 인간화 경쇄 유전자를 분리하고 이를 pCMV-dhfr (KCTC8671P)의 HindⅢ와 ApaI 위치에 삽입하여 인간화 경쇄 발현 벡터 pKC-dhfr-HZⅡS를 제작하였다. 제작된 인간화 경쇄 발현 벡터 pKC-dhfr-HZⅡS를 KCTC에 기탁하였고 (기탁번호: KCTC0490BP), 완성된 벡터는 도 6에 나타내었다.
<실시예 5> 인간화 항체의 COS7 세포에서 발현
송아지혈청이 10 % 첨가된 DMEM 배양배지 (GIBCO사 제품)에서 37 ℃, 5 % 탄산가스를 유지하면서 COS7 세포를 계대배양하였다. 상기 세포를 100 mm 접시에 1×106개 접종하고 37 ℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 한편, 상기 실시예 3과 실시예 4에서 얻은 발현 벡터 pRc/CMV-HC-HZⅡS과 pKC-dhfr-HZⅡS의 5 ㎍을 각각 OPTI MEM I 800 ㎕로 희석하고 50 ㎕의 리포펙타민 (Lipofectamine, GIBCO사 제품)도 OPTI MEM I 800 ㎕로 희석하였다. 상기 혼합물들을 15 ㎖ 튜브에서 혼합한 후 15분 이상 실온에서 방치하였다. 혼합물을 방치하는 사이에 전날 접종해둔 COS7 세포를 OPTI MEM I (GIBCO사 제품)으로 2회 세척하였다. DNA-리포펙타민 혼합물에 6.4 ㎖의 OPTI MEM I를 첨가하고 혼합한 후 상기에서 세척한 COS7 세포 위에 균일하게 부어 주었다. 탄산가스 항온기에서 72시간 동안 배양한 후, 배양액의 상층액을 모아 초원심 여과장치 (Ultrafiltration Kit)로 농축한 다음, 샌드위치 엘리자 (Sandwich ELISA)를 이용하여 항체의 농도를 측정하였다.
<실시예 6> 인간화 항체의 HBV 표면항원 S에 대한 결합능
HBV의 표면항원 S를 마이크로플레이트의 각 웰에 1μg씩 코팅하고, 항-인간 항체 (anti-human IgG)의 전체를 포획 항체 (capture antibody)로 사용한 샌드위치 엘리자를 이용하여 실시예 5에서 얻은 항체 배양액의 항체 농도를 정량하였다. 정량된 항체의 농도에 기초하여 항체 0, 0.25, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 7.5, 10, 20, 50ng씩을 첨가한 후, 항-인간 항체 (Fc specific)에 양고추냉이 과산화수소 (horseradish peroxidase)효소가 결합 (conjugation)된 항체를 2차 항체로 결합시키는 간접 엘리자를 수행하여 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군으로는 정제한 CS131A (Ryu et al., J. Med. Virol., 52, 226, 1997)를 사용하였으며, 그 결과는 표 1 에 나타내었다.
CS13와 HZⅡ-H67의 HBV 표면항원 S에 대한 결합능 (흡광도, 492nm)
첨가량 (ng) 0 0.25 0.5 1 2 3 4 5 7.5 10 20 50
CS13 0.04 0.26 0.43 0.79 1.23 1.67 1.98 2.23 2.64 2.90 3.34 3.40
HZⅡ-H67 0.04 0.15 0.22 0.42 0.67 0.94 1.16 1.37 1.73 2.02 2.69 3.24
<실시예 7> 인간화 항체의 항원결합 친화도
인간화 항체의 HBV 항원에 대한 친화도를 알아보기 위하여 경쟁적 엘리자 방법 (Competitive ELISA; Ryu et al., J. Med. Virol., 52, 226, 1997)을 이용하여 항원 결합친화도를 측정하였다. 먼저, 1 × 10-7∼1 × 10-12M 농도의 HBV 항원에 대하여 각각 COS7에서 생산한 항체와 대조군인 CS131A 5 ng씩을 37 ℃에서 2시간 동안 결합시킨 다음, 이 때 결합하지 않은 항체를 96웰에 코팅되어 있는 항원과 결합시켰다. 상기 결과로부터 HBV와 결합한 항원의 양을 최종적으로 측정하여 그 결과를 도 7에 나타내었다. CS131A와 HZⅡ-H67의 항원 결합친화도를 비교해 본 결과, CS131A는 약 6 × 108M-1, HZⅡ-H67은 5 × 108M-1로 두 항체 사이의 항원 결합친화도에 큰 차이가 없다는 것을 확인하였다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 HBV 표면항원 S에 대한 인간화 항체는 기존의 인간화 항체와 유사한 항원결합능을 나타내는 반면, 기존의 인간화 항체보다 아미노산 잔기가 더 인간화되어 인체내에서의 면역유발능이 현저히 감소된 항체로 B형 간염 바이러스의 예방에 유용하게 이용될 수 있다.
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Claims (8)

  1. 서열 19의 아미노산 서열의 가변영역을 포함하는 인간화 중쇄로 된 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체.
  2. 서열 20의 아미노산 서열의 가변영역을 포함하는 인간화 경쇄로 된 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체.
  3. 서열 19의 아미노산 서열을 암호하는 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 중쇄 유전자.
  4. 서열 20의 아미노산 서열을 암호하는 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 경쇄 유전자.
  5. 제 3 항의 유전자를 포함하는 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체의 중쇄 발현 벡터 pRc/CMV-HC-HZⅡS (기탁번호: KCTC0489BP).
  6. 제 4 항의 유전자를 포함하는 HBV의 표면항원 S에 대한 인간화 항체의 경쇄발현 벡터 pKC-dhfr-HZⅡS (기탁번호: KCTC0490BP).
  7. 발현 벡터 pRc/CMV-HC-HZⅡS 와 발현 벡터 pKC-dhfr-HZⅡS 로 COS7 세포를 형질전환하여 얻은 형질전환체 HZⅡ-H67.
  8. 제 7항의 형질전환체를 배양하여 HBV 표면항원 S에 대한 인간화 항체를 얻는 HBV 표면항원 S에 대한 인간화 항체의 제조방법.
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