KR20000003837A

KR20000003837A - 롬브리신을 유효성분으로 하는 면역증강제

Info

Publication number: KR20000003837A
Application number: KR1019980025129A
Authority: KR
Inventors: 한신; 조일환; 황의진; 이철규; 신장식
Original assignee: 장용택; 신풍제약 주식회사
Priority date: 1998-06-29
Filing date: 1998-06-29
Publication date: 2000-01-25

Abstract

본 발명은 롬브리신을 유효성분으로 하는 면역증강제, 특히 단독으로 항균제 또는 항암제로 사용되거나, 기타 항균제, 항생제 또는 항암제와 함께 사용되어 그 독성은 극소화하면서 효능은 극대화할 수 있는 롬브리신을 유효성분으로 하는 면역증강제에 관한 것이다.

Description

롬브리신을 유효성분으로 하는 면역증강제

[산업상 이용분야]

본 발명은 롬브리신(lombricine: 2-구아니디노에틸-2-아미노-2-카르복시에틸 하이드로겐 포스페이트(2-guanidinoethyl 2-amino-2-carboxyethyl hydrogen phosphate))을 유효성분으로 하는 면역증강제에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 롬브리신을 유효성분으로 하는 면역증강제, 특히 단독으로 항균제 또는 항암제로 사용되거나, 기타 항균제, 항생제 또는 항암제와 함께 사용될 수 있는 롬브리신을 유효성분으로 하는 면역증강제에 관한 것이다.

[종래기술]

롬브리신은 무척추 동물에서만 발견되고 대부분이 장관계(腸管係)에 존재하는 물질로서, 환형동물문에서는 D-형 이성체로, 의충동물문에서는 L-형 이성체로 발견되며, 트랜스아미나아제(transaminase)에 의해 아르기닌(arginine)과 세린 에탄올아민 포스포디에스테르(serine ethanolamine phosphodiester)로부터 생성된다(반응식 1)(문헌[R. J. Rossiter et al., Biochem. J. 76, 1960, pp603∼610).

[반응식 1]

롬브리신은 척추 동물의 크레아틴(creatine)과 같이 아데노신 삼인산화물(ATP) 레벨 조절자로서의 역할을 수행하는 바, 롬브리신 키나아제(lombricine kinase)에 의해 ATP와 반응하여 롬브리신 포스페이트(lombricine phosphate)와 아데노신 이인산화물(ADP)로 변환된다(반응식 2)(문헌[Aren Van Waarde et al., American Journal of Physiology 258, 1990, pp1132∼1139)).

[반응식 2]

롬브리신은 1954년 Van Thoai 및 Robin에 의해 지렁이(롬브리쿠스 테레스트리스(Lombricus terrestris))로부터 최초로 분리된 이래, 지금까지 의·약학 분야에서 특정 용도로 응용된 바가 없었다. 단지 문헌[Hiroshi Nagasawa et al., Anticancer Research 11, 1991, pp1061∼1064)에서 SHN 마우스에서 지렁이로부터 추출·정제한 롬브리신의 자발성 유방암의 성장에 대한 영향을 연구한 결과를 발표한 바 있으나, 롬브리신의 작용기전에 대해서는 전혀 언급한 바 없었던 바, 지금까지 의·약학적으로 롬브린신이 어떠한 작용기전을 통하여 어떠한 효과를 가질 수 있는지는 전혀 알려져 있지 않았다.

한편, 각종 질병은 인체가 외부 항원에 대하여 적절히 대항할 수 있는 면역능을 상실하거나 체내 항상성의 파괴로부터 기인하는데, 불의로 인체가 세균에 감염되거나 암조직이 발생하면 흔히 항생제나 항암제를 투여함으로서 세균과 암세포를 살상하여 치료한다. 그러나 항생제의 남용은 항생제 내성 균주를 발생시켜 또다른 강력한 항생제를 요구하며, 항암제는 암세포 뿐만 아니라 정상세포까지 공격하여 인체에 심각한 부작용을 야기한다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 인체의 면역능을 증강시켜 세균 및 암세포를 인체 스스로가 제거하도록 하는 면역증강제의 개발이 이루어지고 있다. 그러므로 면역증강제는 그 자체로 치료 목적으로 사용되기도 하나 기존의 항생제(1세대 항생제) 및 항암제의 보조제로 사용되는 경우가 많고, 치료 목적 보다는 예방 목적에 근접한 면이 있다. 상술하면, 현재 사용되고 있는 항암제는 독성이 강하여 인체에 부작용이 심하기 때문에 독성을 줄이면서 약효를 극대화할 수 있는 보조제의 개발이 시급한 과제인 바, 이러한 보조제로서 면역증강제를 항암제와 병용 투여하면 독성이 강한 항암제의 투여량을 줄이면서 약효를 상승시킬 수 있으며, 또한 예를 들어, 대수술을 받았거나 면역능이 저하된 환자가 많은 병원 중환자실에서 급작스런 세균 감염에 의한 패혈증 환자가 빈번히 발생하고 있는데, 이 경우 환자들에게 예방 차원에서 안전성이 뛰어난 항균·항패혈증제를 투여해주면 이상적일 것이다.

이에 본 발명자들은 공지 물질인 롬브리신의 안전성, 면역세포 활성화 작용에 의한 면역증강 효과, 항균 효과 및 항암 효과에 대한 연구를 지속한 결과, 롬브리신이 면역증강제, 항균제, 또는 항암제로 사용될 수 있을 뿐만 아니라 기타 항균제, 항생제 또는 항암제와 병용되어 그 보조제로 사용될 수 있는 새로운 사실을 발견해내고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명은 공지의 물질인 롬브리신의 신규 용도로서, 롬브리신을 유효성분으로 하는 면역증강제를 제공하기 위한 것이다. 특히 본 발명은 단독으로 항균제 또는 항암제로 사용되거나, 기타 항균제, 항생제 또는 항암제와 함께 사용될 수 있는 롬브리신을 유효성분으로 하는 면역증강제를 제공하기 위한 것이다.

도 1은 롬브리신에 의한 iNOS 발현을 나타내는 웨스턴 블랏팅 분석 결과를 나타내는 도면.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 롬브리신을 유효성분으로 하는 면역증강제를 제공한다. 바람직하게는, 상기 롬브리신은 L-롬브리신이다. 또한 상기 면역증강제는 경구 또는 정맥주사에 의해 투여되는 것이 바람직하다.

상기 면역증강제는 단독으로 항균제 또는 항암제로 사용되거나, 기타 항균제, 항생제 또는 항암제와 함께 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 상세하게 설명하면 하기와 같다.

본 발명에 있어서, "롬브리신"은 D-롬브리신, L-롬브리신, D,L-롬브리신을 포함하는 개념이다.

한편 구인은 동양권에서 강장제, 해열제 및 풍증 치료제로 널리 사용되어 온 전통 한방약제이나, 지금까지 그의 성분이나 작용기전에 대한 과학적이고도 체계적인 연구는 미흡한 실정이었다. 본 발명자들은 수년간 구인에 대한 현대 의·약학적 연구를 수행하던 중, 구인의 성분중에는 면역을 활성화하는 물질이 존재하고 있다는 사실을 발견하였다. 그 물질을 구인으로부터 순수하게 분리·정제하고 구조를 규명한 결과, 그 물질이 공지의 물질인 롬브리신임을 밝혀내었다.

이에 본 발명자들은 문헌[J. Chem. Research(S), 1987, pp74∼75] 및 문헌[J. Chem. Research(M), 1987, pp815∼830]에 기재된 제조방법에 따라(상기 문헌들은 본 발명에서 참고로 인용한다), 세린으로부터 광학 이성체 D-, L- 및 D,L-형의 롬브리신을 화학적으로 합성한 후 그들의 면역세포 활성화 작용에 따른 면역증강, 항균 및 항암 효과를 규명하였다. 따라서 본 발명은 D-롬브리신, L-롬브리신 또는 D,L-롬브리신을 유효성분으로 하고, 면역세포의 활성화를 그 작용기전으로 하는 경구투여용 또는 정맥주사용 면역증강제, 항균제, 항암제 또는 기타 항균제, 항생제, 항암제의 보조제를 제공한다. 롬브리신의 면역세포 활성화 작용에 의한 면역증강, 항균, 항생 및 항암 효과는 하기하는 독성시험 및 약리시험과 그 결과로부터 명백해질 것이다.

[실시예]

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 기재하나 이는 본 발명의 구성 및 효과에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.

[실시예 1] 롬브리신의 급성독성시험

특정 병원체가 없는 체중 20±3g의 ICR계 웅성 마우스 5마리를 사용하여 롬브리신의 경구 투여 및 정맥 투여에서의 급성독성시험을 수행하였다. 화학 합성한 D-롬브리신, L-롬브리신 또는 D,L-롬브리신의 투여량을 7.5mg/kg으로부터 7,500mg/kg까지 10배수로 증가시키면서 상기 마우스에 경구 또는 복강 투여하였다. 시험기간 중 동물은 사육환경으로서 온도 22±3℃, 습도 55±5%, 명암주기 12시간, 조도 3,000Lux인 동물실에서 사육하면서 투약후 14일간 임상 증상에 대해 관찰하였다. 그 결과 실험기간 중 치사하거나 이상 증상을 보인 개체는 관찰되지 않았다. 따라서 합성 D-, L-, DL-형 롬브리신 모두가 경구 및 복강 투여에서 LD₅₀값이 7,500mg/kg 이상으로서 매우 안전함을 알 수 있었다.

롬브리신의 면역증강 효과 실험

[실시예 2-1] 롬브리신의 대식세포 활성화 작용(산화질소 생성) 실험

마우스의 대식세포는 그람 양성균의 세포외벽 성분인 지질다당류(lipopolysaccharide; 내독소) 또는 사이토카인 등의 면역학적 자극에 의해 활성화되면 반응성 질소종인 산화질소(nitric oxide, NO)를 생성하여 세포외로 방출하는데, NO는 기체 상태의 저분자로 매우 강력한 독성을 나타내어 항암 및 항미생물 작용을 하게 된다. 따라서 NO의 생성 여부로부터 롬브리신이 대식세포의 활성물질로 작용하는지 여부를 검정하고자 하였다.

실험동물로는 특정 병원체가 없는 체중 20∼25g의 5주령 웅성 ICR계 마우스를 일본의 찰스 리버(Charles River)사로부터 분양받아 사용하였다. 먼저 상기 마우스의 복강내에 차가운 세포배양액 RPMI 1640을 약 15㎖ 가량 주입한 후 복수액을 수확하였다. 대식세포가 대부분을 차지하는 복수액을 원심력 500g로 4℃에서 5분간 원심분리하여 세포를 침전시키고 상층액을 버린 후 새로운 세포배양액으로 현탁하였다. 이 세포현탁액을 1.5×10⁶세포/㎖로 보정하여 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 분주하여 2시간 동안 배양하였으며, 그 후 플레이트에 부착되지 않은 세포는 생리식염수로 세척하여 제거하였다. 그런 다음 그 플레이트에 합성 D-, L-, D,L-형 롬브리신을 각각 0.1mg/㎖과 0.2mg/㎖으로 단독 첨가하거나, T-세포 방출 사이토카인의 일종인 인터페론-γ(IFN-γ) 10유닛/㎖과 함께 첨가하여, 5% CO₂-95% 공기 세포배양기에서 20시간 동안 배양한 후, 배양액내에 함유된 NO의 양을 그리에스 에세이(Griess assay)법으로 정량하였고, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

롬브리신의 대식세포 활성화에 의한 NO 방출

처 리	IFN-γ(10유닛/㎖)	*아질산(nM/2×10⁵세포)
배양액	-	측정안됨
배양액	+	0.008±0.028
L-롬브리신 0.1mg/㎖	-	0.004±0.011
L-롬브리신 0.1mg/㎖	+	0.605±0.079
L-롬브리신 0.2mg/㎖	-	0.015±0.013
L-롬브리신 0.2mg/㎖	+	0.793±0.036
D-롬브리신 0.1mg/㎖	-	0.004±0.015
D-롬브리신 0.1mg/㎖	+	0.034±0.017
D-롬브리신 0.2mg/㎖	-	0.012±0.013
D-롬브리신 0.2mg/㎖	+	0.143±0.034
D,L-롬브리신 0.1mg/㎖	-	측정안됨
D,L-롬브리신 0.1mg/㎖	+	측정안됨
D,L-롬브리신 0.2mg/㎖	-	0.008±0.014
D,L-롬브리신 0.2mg/㎖	+	0.026±0.034

* NO는 배지내에 축적된 NO의 산화형인 아질산으로 측정하였다.

상기 표 1로부터 D-, L-, D,L-형 롬브리신이 모두 농도의존적으로 대식세포를 활성화하여 NO를 생성하고, IFN-γ와 함께 첨가한 경우 산화질소의 발생량이 더욱 증가하며 그 중에서도 L-롬브리신을 사용한 경우 효과가 가장 큰 것을 알 수 있다. 따라서 합성 D-, L, D,L-형 롬브리신은 대식세포의 면역학적 활성물질로서 작용하며 IFN-γ와 병용할 경우 더욱 큰 효과를 얻을 수 있다는 결론을 얻었다.

[실시예 1-2] 롬브리신의 단핵세포(백혈구)내 iNOS 생합성 유도 작용 실험

상기 실시예 1-1의 대식세포의 NO 생성 실험 이외에, 롬브리신이 단핵세포내에서 유도성 산화질소 합성효소(inducible nitric oxide synthase, iNOS)를 생성하도록 유도하는지 확인하고자 하였다. iNOS는 면역학적으로 자극을 받을때에만 그것을 코딩하는 핵내 유전자가 유도되어 그것로부터 생합성되어 세포질내에 존재하게 된다. 즉 롬브리신의 처리가 iNOS의 생합성을 유발하는지를 관찰함으로서 롬브리신이 iNOS 유전자를 면역학적으로 활성화하는 작용을 하는지 여부를 검정하고자 하였다.

실험동물로는 특정 병원체가 없는 5주령 웅성 S.D.계 흰쥐를 일본의 찰스 리버사로부터 분양받아 사용하였다. 단핵세포를 분리하기 위하여, 상기 S.D.계 흰쥐의 복부 대동맥에서 채혈한 혈액에 헤파린을 10유닛/㎖로 첨가한 다음 HBSS와 혈액을 1:1로 희석하였다. 조심스럽게 희석한 30㎖의 혈액을 12.5㎖의 피콜-하이팩(Ficoll-Hypaque)에 넣어 층이 지게 한 후 800g로 20분간 원심분리하였다. 희석된 혈장층과 임파구층의 경계면에서 단핵세포를 조심스럽게 수확하였다. 상기 과정은 모두 실온에서 실시하였다.

상기한 바와 같이 분리한 단핵세포 2×10⁶개를 배양접시(100×20mm)에 분주하고 10유닛/㎖의 IFN-γ(레인 2), 10유닛/㎖의 IFN-γ와 함께 L-롬브리신 500㎍/㎖(레인 4), 100㎍/㎖(레인 6), 20㎍/㎖(레인 8), L-롬브리신 단독으로 500㎍/㎖(레인 3), 100㎍/㎖(레인 5), 20㎍/㎖(레인 7)을 각각 첨가한 후 세포배양기에서 16시간 배양하였다(대조군: 미처리(레인 1)). 배양 종료후 세포를 수확하여 초음파로 파쇄한 후 원심분리하여 침전물은 버리고 상층액을 효소액으로 사용하였다. 이 효소액을 10% SDS-PAGE로 전기영동한 후 웨스턴 블랏팅을 실시하고 ECL 키트를 사용하여 iNOS 단백질의 생성을 확인하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1로부터 L-롬브리신 단독 처리에 의해서도 iNOS 생합성이 유도되었으며 IFN-γ와 함께 투여한 경우 그 유도 정도가 급격히 상승하였음을 알 수 있다. 따라서 L-롬브리신이 단핵세포의 iNOS 유전자를 면역학적으로 활성화하여 iNOS가 생합성됨을 알 수 있으며, 이것은 L-롬브리신이 유전자 수준에서 인체 면역계를 조절할 수 있음을 나타내는 것이다.

[실시예 1-3] 롬브리신의 단핵세포 활성화 작용(TNF-α 생성) 실험

혈액내에 존재하는 식균세포의 일종인 단핵세포는 면역학적으로 활성화되면 사이토카인의 일종인 종양괴사인자 α(TNF-α)를 방출하여 종양 등을 제거한다. 따라서 롬브리신의 처리가 단핵세포로부터 TNF-α 방출을 유발하는지 여부를 조사함으로서 롬브리신이 단핵세포를 활성화하는 작용을 하는지 여부를 검정하였다.

L929 세포는 TNF-α의 농도에 반비례하여 성장하는 바, TNF-α의 생성량을 측정하기 위하여 상기 실시예 1-2에서와 같이 S.D.계 흰쥐의 정맥혈액으로부터 단핵세포를 분리하고 96-웰 마이크로타이터 플레이트 각 웰에 2×10⁵세포/100㎕씩 분주한 후 18시간 동안 IFN-γ 1유닛/㎖, L-롬브리신 1mg/㎖, IFN-γ 1유닛/㎖과 L-롬브리신 1mg/㎖으로 각각 처리한 후 그 배양액을 L929 세포가 들어있는(2×10⁵세포/100㎕) 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 첨가하여 이들 세포의 생존율을 MTT 에세이법에 의하여 측정하였다. TNF-α의 활성을 나타내는 1유닛은 L929 세포가 50% 괴사하는데 필요한 TNF-α의 양으로 정의하였다. 그 결과를 표 2에 나타내었다.

L929세포를 이용한 TNF-α 정량

처 리	TNF-α(×10⁵유닛/2×10⁶L929 세포)
대조군	1.7±0.2
IFN-γ	1.8±0.2
L-롬브리신	4.6±0.2
L-롬브리신+IFN-γ	5.4±0.4

상기 표 2 로부터 L-롬브리신이 단독으로 단핵세포를 활성화하여 TNF-α를 방출하고, IFN-γ와 함께 처리한 경우 TNF-α의 생성량이 더욱 증가하였음을 알 수 있다.

결론적으로, 상기 결과들로부터 롬브리신이 생체의 면역세포를 활성화시키는 작용을 함으로서 생체 면역을 증강시키는 효과를 갖는다는 사실을 확인하였다.

[실시예 3] 롬브리신의 항균 효과 실험

실험동물로 특정병원체가 없는 체중 20∼25g의 5주령 웅성 ICR계 마우스를 일본의 찰스 리버사로부터 분양받아 1주일 동안 동물실에서 순화한 후 사용하였다. 실험기간 중 동물은 사육환경으로서 온도 22±3℃, 습도 55±5%, 명암주기 12시간, 조도 3000Lux인 동물실에서 사육하면서 임상증상을 관찰하였다.

L-롬브리신의 경구 투여에 의한 항균 효과를 실험하기 위하여, 1군당 7마리씩 3개의 군으로 분리하였다. 영양 액체배지에서 배양중인 대수기의 슈도모나스 에루기노사(P. aeruginosa)를 원심분리하여 수확하고 계수한 후, 상기 마우스당 1.8×10⁸CFU 씩 복강내에 접종하였다. 접종 1시간 후부터 매일 L-롬브리신 10mg 또는 20mg을 1회씩 경구투여하여 7일 후 최종 생존률을 구하였다.

그 결과를 표 3에 나타내었다.

L-롬브리신의 항균 효과

처 리	처 리 일	치사율(%)
처 리	1	치사율(%)	2	3	4	5	6	7
대 조 군		1	5	1				100(7/7)
L-롬브리신 10mg/마우스/일		1	5					85.7(6/7)
L-롬브리신 20mg/마우스/일	1		2					42.9(3/7)

상기 표 3으로부터 P. 에루기노사를 복강에 투여한 후 아무런 처리도 하지 않은 대조군은 4일 이내에 모든 개체가 사망한 반면, L-롬브리신을 투여한 경우에는 치사율이 낮아져 매일 20mg씩 투여한 경우에는 치사율이 42.9%까지 낮아짐을 알 수 있다.

[실시예 4] 롬브리신의 인 비트로 항암효과 실험

특정 병원체가 없는 체중 20∼25g의 5주령 웅성 C57BL/6계 마우스를 일본의 찰스 리버사로부터 분양받아 동물실에서 순화한 후 실험에 사용하였다.

L-롬브리신의 대식세포 활성화가 실제로 항암 효과를 나타내는가를 확인하기 위해 대식세포를 L-롬브리신으로 활성화시킨 후 HT1080(섬유종), A549(폐암) 및 HL60(백혈병)의 암세포를 동시 배양하여 암세포 증식억제 효과에 대해 조사하였다. 즉 대식세포 수확 3일전 4% 티오글리콜레이트를 투여한 웅성 C57BL/6계 마우스의 복강에 저온의 RPMI 1640 배지 2㎖을 주입한 후 복강 대식세포를 수확하였다. 수확한 대식세포는 RPMI 1640 배지로 4℃에서 500g로 5분간 원심분리하여 수확하고 세척한 후, 10% FBS가 포함된 RPMI 1640 배지로 현탁하여 2×10⁶세포/㎖이 되도록 세포수를 보정하였다. 상기 세포현탁액을 96-웰 마이크로플레이트에 웰당 100㎕씩 분주하여 37℃ CO₂배양기에서 2시간 동안 배양하였다. 배양 후 플레이트에 부착되지 않은 세포를 제거하기 위해 따뜻한 배양액으로 2회 세척한 다음, L-롬브리신 및/또는 IFN-γ가 포함된 배양액으로 교체하고, CO₂배양기에서 17시간 동안 배양한 후, 그리에스 시약을 이용하여 배양액에 축적된 아질산을 측정하였다. 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 부착된 세포는 배지로 2회 세척한 후 상기 암세포들을 5×10³세포/㎖이 되도록 첨가하여 CO₂배양기에서 60시간 동안 배양하였다. 종양세포의 증식억제 효과를 배양 종료후 10㎕ MTT(5mg/㎖)를 각 웰에 첨가하고 3시간 배양한 후, 형성된 포마잔(formazan) 크리스탈을 MTT 가용화 용액으로 용해시킨 후 550nm(참조 650nm)에서의 흡광도를 마이크로-ELISA 리더를 이용하여 측정하였다.

그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.

L-롬브리신의 대식세포 활성화에 의한 암세포의 성장 억제 효과

암세포종	IC₅₀(㎍/㎖)
HT-1080	49.3
A-549	228.6
HL-60	50.7

C57BL/6계 마우스의 복강내 대식세포에 L-롬브리신을 단독 처리하였을 때 NO의 생성은 측정되지 않았으나, 10유닛/㎖의 IFN-γ와 함께 첨가한 경우 NO의 생성이 측정되었고 그 양은 농도 의존적으로 증가하였다. 이때 생성된 NO가 직접적으로 인체 암세포의 증식을 억제하는가를 확인하기 위하여 실시한 상기 대식세포와 암세포의 혼합배양 결과, 첨가한 L-롬브리신의 농도에 의존하여 HT1080, A549 및 HL60의 증식이 억제되었으며 IFN-γ와 함께 첨가한 경우 그 억제효과가 증대하였다. 특히 저농도의 L-롬브리신을 단독으로 대식세포에 처리하였을 때 NO 생성량을 정량할 수 없었음에도 불구하고 이 경우에도 대식세포의 암세포 증식억제능은 L-롬브리신의 처리 농도에 의존적으로 증가함을 확인하였다. 이것은 L-롬브리신이 대식세포에 작용하여 NO의 생성 뿐만이 아니라 TNF-α 등 기타 사이토카인을 방출하게 하는 면역계를 활성화시킴으로써 항암 효과를 나타내기 때문인 것으로 판단된다.

[실시예 5] 롬브리신의 인 비보 항암 효과 실험

실험동물로서 특정 병원체가 없는 체중 20-25g의 5주령 웅성 ICR계 마우스를 일본 찰스 리버사로부터 분양받아 동물실에서 순화한 후 사용하였다. 실험기간중 동물은 사육환경으로서 온도 22±3℃ 습도 55±5%, 명암주기 12시간, 조도 3000Lux인 동물실에서 사육하면서 임상증상을 관찰하였다.

ICR계 마우스의 복강내에서 배양중인 마우스 근육종 사코마(sarcoma) 180 세포를 수확하여 생리식염수로 1×10⁷세포/㎖이 되도록 세포수를 보정한 다음 0.1㎖씩 상기 ICR계 마우스 복강내에 이식하였다. 종양세포 이식후 30일간 처리군에서는 L-롬브리신 5, 10, 20mg을 각각 경구로 강제 투여하였고 대조군에서는 생리식염수를 투여하였다.

그 결과를 표 5에 나타내었다.

L-롬브리신의 항암 효과

처 리	관 찰 일	평균(T/C)	%ILS	30일 평균생존수
처 리	1-8 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 30	평균(T/C)	%ILS	30일 평균생존수
-	3 1 1 1 1	-	-	0/7
5mg/개체/일	1 1 2 1 1	22.3/20.3	9.9	1/7
10mg/개체/일	3 1 2	24.0/20.3	18.2	1/7
20mg/개체/일	1 1 2 1	25.7/20.3	26.6	2/7

* 평균 (T/C)는 실험군의 평균 생존일을 대조군의 평균 생존일로 나눈 값.

* % ILS(Increasing life span)는 하기 식으로부터 계산되는 값:

% ILS = (실험군 평균 생존일/대조군 평균생존일 - 1)×100%

* 30일 평균 생존수는 총실험 개체수중 생존한 개체수를 나타내는 값.

이상의 결과로부터 L-롬브리신이 경구투여에 의해 항암 효과가 있음이 확인되었다. 또한 L-롬브리신을 기존 항암제와 병용 투여할 경우 기존 항암제의 독성을 감소시키면서 제암 효과는 증가시키는 결과를 기대할 수 있어 기존 항암제와의 병용하는 신규 제형의 항암제로 사용이 가능함을 알 수 있다.

상기와 같은 롬브리신의 효능·효과를 근거로 롬브리신을 유효성분으로 하고 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 정제, 캅셀제 또는 주사제 등의 제조가 가능한 바, 각각의 제형에 대한 제조방법은 하기와 같다.

경구 투여용 롬브리신 함유 정제의 제조

[제조예 1-1]

혼합기에 L-롬브리신(또는 이성체 D, D,L-형) 100g, 전분 글리콜산나트륨 400g, 루디프레스 1.45kg과 스테아린산마그네슘 50g을 첨가하여 균질하게 혼합하고 타정하여 정제당 L-롬브리신(또는 이성체 D, D,L-형) 10mg을 함유하는 경구 투여용 정제를 제조하였다.

[제조예 1-2]

혼합기에 L-롬브리신(또는 이성체 D, D,L-형) 100g, 전분 글리콜산나트륨 400g, 유당 620g, 미결정 셀룰로오스 400g, 옥수수 전분 400g을 첨가하여 균질하게 혼합하였다. 히드록시프로필셀룰로오스 30g을 물 200g과 주정 200g의 혼합용액에 용해시키고 이 용액을 상기 혼합물에 가하여 충분히 연합시킨 후 과립으로 제조하여 수분 2∼4%가 될 때까지 건조하였다. 건조된 과립물에 스테아린산마그네슘 50g을 가해 고루 혼합한 후 타정하여 정제당 L-롬브리신(또는 이성체 D, D,L-형) 10mg을 함유하는 경구 투여용 정제를 제조하였다.

경구 투여용 롬브리신 함유 캅셀제의 제조

[제조예 2-1]

혼합기에 L-롬브리신(또는 이성체 D, D,L-형) 100g, 유당 500g, 옥수수 전분 350g, 탈크 30g 및 스테아린산마그네슘 20g을 첨가하여 균질하게 혼합하고 공캅셀에 충전하여 캅셀당 L-롬브리신(또는 이성체 D, D,L-형) 10mg을 함유하는 경구 투여용 캅셀제를 제조하였다.

[제조예 2-2]

혼합기에 L-롬브리신(또는 이성체 D, D,L-형) 100g, 미결정 셀룰로오스 300g, 히드록시프로필셀룰로오스 550g 및 스테아린산마그네슘 50g을 첨가하여 균질하게 혼합하고 공캅셀에 충전하여 캅셀당 L-롬브리신(또는 이성체 D, D,L-형) 10mg을 함유하는 경구 투여용 캅셀제를 제조하였다.

[제조예 2-3]

혼합기에 L-롬브리신(또는 이성체 D, D,L-형) 100g, 유당 650g, 전분 글리콜산나트륨 200g, 탈크 30g 및 스테아린산마그네슘 20g을 첨가하여 균질하게 혼합하고 공캅셀에 충전하여 캅셀당 L-롬브리신(또는 이성체 D, D,L-형) 10mg을 함유하는 경구 투여용 캅셀제를 제조하였다.

롬브리신 함유 주사제의 제조

[제조예 3-1]

주사용 증류수를 90-100℃로 가온하고 파라옥시안식향산메틸 6g을 가해 용해시킨 후 상온으로 냉각하고 L-롬브리신(또는 이성체 D, D,L-형) 50g을 넣어 교반 용해한 후 용액량을 10ℓ로 조정하였다. 이 용액을 0.22㎛ 여과막으로 여과하여 ㎖당 L-롬브리신(또는 이성체 D, D,L-형) 5mg을 함유하는 주사제를 제조하였다.

[제조예 3-2]

주사용 증류수에 L-롬브리신(또는 이성체 D, D,L-형) 50g, 아황산수소나트륨 11.25g, 에데트산나트륨 1g을 첨가하여 교반 용해하고, 이 용액에 벤질알콜 90㎖를 첨가하여 혼합한 후 용액량을 10ℓ로 조정하였다. 이 용액을 0.22㎛ 여과막으로 여과하여 ㎖당 L-롬브리신(또는 이성체 D, D,L-형) 5mg을 함유하는 주사제를 제조하였다.

[제조예 3-3]

주사용 증류수에 L-롬브리신(또는 이성체 D, D,L-형) 50g, 인산이수소나트륨 27.12g, 인산일수소나트륨 110g, 아황산수소나트륨 11.25g, 에데트산나트륨 1g을 첨가하여 교반 용해하고, 이 용액에 벤질알콜 90㎖를 첨가하여 혼합한 후 용액량을 10ℓ로 조정하였다. 이 용액을 0.22㎛ 여과막으로 여과하여 ㎖당 L-롬브리신(또는 이성체 D, D,L-형) 5mg을 함유하는 주사제를 제조하였다.

본 발명에 따른 롬브리신을 유효성분으로 하는 면역증강제는 생체의 면역세포를 활성화하는 작용을 함으로써 생체의 면역을 증강시키는 효과를 가지며, 이에 따라 단독으로 항균제 또는 항암제로 사용되거나, 기타 항균제, 항생제 또는 항암제와 함게 사용됨으로써 그 독성은 극소화하면서 효능은 극대화할 수 있다.

Claims

롬브리신을 유효성분으로 하는 면역증강제.
제 1 항에 있어서, 상기 롬브리신이 L-롬브리신인 면역증강제.
제 1 항에 있어서, 경구 또는 정맥주사에 의해 투여되는 면역증강제.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역증강제는 단독으로 항균제 또는 항암제로 사용되거나, 기타 항균제, 항생제 또는 항암제와 함께 사용되는 것인 면역증강제.