KR20000002723A - 개질효소 및 그 개질방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 개질효소 및 그 개질방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 탄수화물 분해효소인 셀룰라아제 또는 헤미셀룰라아제내의 아미노산 잔기중의 아민기(-NH2)에 다음 화학식 1로 표시되는 폴리옥시에틸렌 지방족알콜에테르의 말단에 존재하는 수산기(-OH)를 화학적으로 공유결합시켜 당해효소를 개질시킴으로써, 이들 효소의 역가향상은 물론 온도 및 pH 변화에 대하여 역가 안정성이 유지되도록 개선시킨 개질효소 및 그 개질방법에 관한 것이다.
상기 화학식 1에서: R은 탄소원자수 14 ∼ 18의 알킬기이고, n은 3 ∼ 12의 정수이다.

Description

개질효소 및 그 개질방법
본 발명은 개질효소 및 그 개질방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 탄수화물 분해효소인 셀룰라아제 또는 헤미셀룰라아제내의 아미노산 잔기중의 아민기(-NH2)에 다음 화학식 1로 표시되는 폴리옥시에틸렌 지방족알콜에테르의 말단에 존재하는 수산기(-OH)를 화학적으로 공유결합시켜 당해효소를 개질시킴으로써, 이들 효소의 역가향상은 물론 온도 및 pH 변화에 대하여 역가 안정성이 유지되도록 개선시킨 개질효소 및 그 개질방법에 관한 것이다.
화학식 1
상기 화학식 1에서: R은 탄소원자수 14 ∼ 18의 알킬기이고, n은 3 ∼ 12의 정수이다.
효소는 균(fungi) 또는 세균(bacteria) 등에 의해 만들어지는 생화합물로서, 그것이 나타내는 기질 특이성에 의해 생체 촉매의 하나로서 각종 반응에 이용되고 있다. 특히, 화학약품의 사용으로 인한 환경오염이 심각해지면서 보다 환경친화적인 효소를 사용하고자 하는 시도가 계속되고 있다.
예컨데, 탄수화물의 분해에 있어 효소를 사용하는 것은 종래의 산 가수분해 방법에 비하여 반응조건이 격렬하지 않고 장치 부식이나 환경오염문제가 없는 등 여러 가지 장점은 있지만, 효소에 의한 분해과정에 있어서 반응속도가 느리고 기질인 탄수화물에 강하게 흡착하여 역가를 잃어버리며, 반응환경(즉, pH와 온도변화 및 계내의 이물질 등)의 변화에 따른 적응성 및 안정성이 떨어지게 되므로 실제 공업적으로 적용하기에는 많은 어려움이 있다.
이에, 기존에는 물리적 흡착, 이온결합, 생화학적 결합, 공유결합 등을 이용한 담체 결합법; 효소를 마이크로 캡슐로 포장하는 방법; 가교제로 결합시키는 가교법; 및 이러한 방법을 조합한 복합법 등 효소를 고정화하여 사용하는 기술이 여러 가지로 고안되었다. 일부 문헌중에는 카탈라제, 리파제, 퍼옥시다제, 키모트립신과 같은 효소를 모노메톡시 폴리에틸렌글리콜과 시아누릭 클로라이드의 공중합체로 개질시키는 방법에 대해 보고한 바 있다[Trends Biotechnol., 4, 190 (1986); Biotechnol. Lett., 9, 187 (1987)].
그러나, 탄수화물류를 분해하는 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제계 효소에 대해서는 화학 개질의 연구사례가 거의 없으며, 셀룰라아제에 대한 처리방법도 그 대부분이 셀룰라아제로 총칭되는 효소를 정제·분리하여 각 성분의 역가를 조절하는 효소학적 연구이거나, 동·식물로부터 새로운 효소를 얻는 방향으로만 진행되어 왔다.
또한, 계면활성제와의 병용이 효소의 역가유지에 효과가 있다고 밝힌 바 있으며[Biotechnol. Bioeng., 23, 1365 (1981); Biotechnol. Bioeng., 28, 1727 (1986)], 근래에 시판되는 효소들은 대부분 계면활성제가 배합되어 있다. 그러나, 효소와 계면활성제의 단순 혼합물은 온도 및 pH를 비롯한 주위환경 변화에 따라 그 특성이 민감하게 변화하여 그 사용에 있어 많은 제약이 따른다.
최근에는 효소의 역가 안정성을 확보할 목적으로 폴리에틸렌글리콜 알킬알릴에테르와 말레인산 무수물의 합성 공중합체를 사용하여 효소를 화학적으로 개질시킨 바도 있으나[J. Chem. Eng. Japan, 25(2), 202 (1992)], 역가 안정성은 어느 정도 확보할 수 있었지만 단순 역가면에서는 순수한 효소의 역가보다 저하되는 단점이 있다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 현재까지 알려져 있는 효소 개질화는 주로 계면활성제와 효소를 단순히 물리적으로 혼합하는 것이어서 본원 발명의 화학적 개질화와는 전혀 다른 것이며, 또한 화학적 개질화를 시도하고 있는 J. Chem. Eng. Japan, 25(2), 202 (1992)와 비교하여서도 개질화를 위해 사용된 물질의 화학적 구조가 다르고 이에 따른 개질효소의 역가 및 역가 안정성에 있어서도 상당한 차이를 나타낸다.
본 발명의 발명자들은 효소의 역가를 향상시키기 위해 노력하던 중, 효소와 계면활성제를 단순히 물리적으로 혼합하기 보다는 이를 화학적으로 결합시키면 효소와 계면활성제의 단일물질로 존재하게 되므로 특정한 개질화도 범위에서는 역가 안정성을 향상시킬 수 있고, 또한 계면활성제로서는 기질과 효소의 결합 및 해리가 용이하도록 하는 폴리옥시에틸렌 지방족알콜에테르를 특별히 선정하여 사용하면 효소의 역가를 현저히 향상시킬 수 있음을 알게 됨으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명은 분자의 말단에 수산기를 지니고 있는 특정 비이온성 계면활성제를 선택적으로 사용하여 효소의 아미노산 그룹내 아민기(-NH2)와 탈수반응에 의해 화학결합을 시킴으로써, 종래보다 향상된 효소의 활성역가와 온도 및 pH 변화에 대해서도 높은 안정성을 갖는 신규 개질효소와 이의 개질방법을 제공하는 데에 그 목적이 있다.
도 1은 반응시간에 따른 반응계의 pH 변화를 도시한 것이다.
본 발명은 효소와 계면활성제로 이루어진 개질효소에 있어서, 셀룰라아제 또는 헤미셀룰라아제 중에서 선택된 탄수화물 분해효소에 다음 화학식 1로 표시되는 폴리옥시에틸렌 지방족알콜에테르가 화학적으로 공유결합되어 있는 신규 개질효소를 그 특징으로 한다.
화학식 1
상기 화학식 1에서: R은 탄소원자수 14 ∼ 18의 알킬기이고, n은 3 ∼ 12의 정수이다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 폴리옥시에틸렌 지방족알콜에테르를 피리딘 촉매하에서 파라-톨루엔설포닐 클로라이드(p-TsCl)와 반응시켜 파라-토실레이티드 폴리옥시에틸렌 지방족알콜에테르를 제조한 다음, 여기에 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제 중에서 선택된 탄수화물 분해효소를 반응시켜 개질효소를 제조하는 방법을 포함한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 분자중에 수산기를 지니고 있는 특정 비이온성 계면활성제를 사용하여 이들 수산기와 탄수화물 분해효소의 아민기(-NH2) 사이에 트랜스-에스터화반응(trans-esterification)에 의한 공유결합을 유도함으로써, 온도 및 pH 변화에 대하여 높은 안정성과 고효율의 역가를 지니게 되는 개질효소 및 이들의 개질화 방법에 관한 것이다.
본 발명에 적용되는 탄수화물 분해효소로서 셀룰라아제는 셀룰로오스-가수분해 활성을 갖는 효소의 총칭이며, 헤미셀룰라아제(Hemicellulase)는 헤미셀룰로오스를 가수분해하는 효소의 총칭으로서 일명 사이타제(cytase)라고도 한다. 본 발명에서 셀룰라아제의 경우는 셀룰로오스의 견고한 결정성 부분을 분해하는 아비셀라아제(Avicelase) 역가와, 셀룰로오스의 무정형 부분을 주로 분해하는 씨엠씨아제(CMCase) 역가로 표시하였으며 헤미셀룰라아제는 크실란아제 역가로 표시하였다.
일반적으로 효소는 아미노산이 펩티드결합에 의해 연결된 폴리펩티드 형태로서, 이들 아미노산 각각은 아민기를 지니고 있으므로 수산기를 지닌 물질과 탈수반응을 통해 쉽게 결합시킬 수 있으나, 그 반응조건이 격렬하기 때문에 반응 시 효소 자체의 역가를 대부분 상실하게 된다. 따라서, 본 발명에서는 먼저, 비이온성 계면활성제를 파라-톨루엔설포닐 클로라이드와 반응시켜 파라-토실레이티드 폴리옥시에틸렌 지방족알콜에테르를 제조한 다음, 이 물질을 상기한 탄수화물 분해효소에 상온의 온화한 조건에서 화학결합시켜 효소와 계면활성제의 신규 단일물질을 얻는데 그 특징이 있다.
본 발명에 따른 개질된 효소는 탄수화물 분해효소의 일반적인 최적 pH 범위인 3 ∼ 6보다 훨씬 광범위한 영역(pH 2 ∼ 9)에서도 높은 역가안정성을 나타내고 있어, 산성 영역으로 적용범위가 제한되는 기존의 탄수화물 분해효소에 비해 알칼리성 영역에서도 역가를 유지하는 본 발명의 신규물질은 적용 pH 범위를 크게 확장시킬 수 있는 장점이 있다.
본 발명에 따른 개질효소의 제조방법을 간략히 도시하면 다음 반응식 1과 같다.
상기 반응식 1에서:은 해당 탄수화물분해효소이고, R은 탄소원자수 14∼ 18의 알킬기이고, n은 3 ∼ 12의 정수이다.
상기 반응식 1에 나타낸 바와 같이, 상기 화학식 1로 표시되는 비이온성 계면활성제를 파라-톨루엔설포닐 클로라이드(p-TsCl) 및 피리딘과 함께 반응시키면 상기 화학식 2로 표시되는 파라-토실레이티드 폴리옥시에틸렌 지방족알콜에테르가 중간체로서 제조되며, 여기에 적용시키고자 하는 효소를 첨가하여 효소를 구성하고 있는 아미노산내의 아민기를 트랜스-에스트화 반응에 의해 상기 계면활성제와 화학적으로 공유결합 시킴으로써 상기 화학식 3으로 표시되는 형태로 효소를 개질화시킨다.
상기 개질효소의 제조방법에 있어서 특히 주목할만한 사항은 우수한 이탈기(good leaving group)로서 파라-톨루엔술포닐기(p-tosyl group)를 선택하여 사용하는 것이다. 파라-톨루엔술포닐기는 화학식 1로 표시되는 비이온성 계면활성제와 쉽게 반응하여 본 발명의 중간체(화학식 2)를 형성하고, 또한 중간체와 효소의 반응시 상온의 온화한 반응조건(mild condition)에서도 쉽게 이탈이 가능하므로 반응온도에 민감하게 역가가 변화되는 효소 반응에의 적용이 적합하다.
또한, 상기 화학식 1로 표시되는 비이온성 계면활성제는 효소 100 중량부에 대하여 20 ∼ 100 중량부를 사용하는데, 이들 계면활성제의 사용량이 20 중량부 미만이면 효소안정화에 미치는 영향이 미소한 문제가 발생하며, 100 중량부를 초과하는 경우 오히려 효소역가가 저하됨은 물론이고 필요이상의 사용으로 인한 원가상승을 초래하는 문제도 있어 역시 바람직하지 않다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따라 개질된 효소는 효소자체의 역가향상은 물론, 온도 및 pH 변화에 대하여 역가 안정성을 유지할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의거 더욱 상세히 설명하겠는 바, 본 발명이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 : 개질효소의 제조
RO(CH2CH2O)nH(R=탄소수 14∼18의 알킬기, n=10)로 표시된 비이온성 계면활성제 272 g, 파라-톨루엔설포닐 클로라이드(p-TsCl) 143 g와 피리딘 60 g을 용매인 메틸렌 클로라이드 400 ㎖에 첨가하여 반응시켰다. 그리고, 결과된 반응물을 2 ∼ 6시간 동안 환류(reflux)시킨 후, 상온으로 온도를 강하시켜 4시간 동안 방치하였다. 그 후, 침전된 피리디니움 클로라이드의 침상형 결정을 여과시키고, 반응물 중의 잔류 피리딘을 제거하기 위하여 0.1N의 묽은 염산용액 100 ㎖로 세척 후 다시 물로 3회 세척하고, 용매를 증발시켜 파라-토실레이티드 폴리옥시에틸렌 지방족알콜에테르를 얻었다. 본 반응의 수율은 92% 였으며, 피리디니움 클로라이드의 생성이 상기 화학식 2의 생성을 화학적으로 입증하고 있다.
상기에서 제조한 파라-토실레이티드 폴리에틸렌 지방족알콜에테르 100 g에 셀룰라아제[Penicillium funiculosum(EC 3.2.1.4.); 미국 Sigma사] 100 g를 첨가하여 물속에서 상온으로 4시간 동안 교반하여 반응시킴으로써 개질효소를 제조하였다.
상기 효소개질반응을 추적하기 위하여, 반응시간에 따른 반응계의 pH 변화를 측정하였으며, 그 결과는 첨부도면 도 1에 나타내었다. 상기 반응식 1의 반응 메카니즘에 따르면, 효소가 파라-토실레이티드 폴리옥시에틸렌 지방족알콜에테르와 결합하게 되면 반응 부산물로서 파라-톨루엔 설폰산이 형성되고, 이에 반응이 진행됨에 따라 반응계(Reaction system)의 pH가 감소됨을 알 수 있다.
실험예
본 발명에 따른 개질효소와 단순혼합에 의해 얻어진 혼합효소의 역가를 비교하기 위하여, 본 실험에서는 셀룰라아제의 경우, 상대적 아비셀라아제 역가(relative avicelase activity)와 상대적 씨엠씨아제 역가(relative CMCase activity)를 DNS법(Dinitrosalicilic Method)에 의거하여 자외선 분광분석기를 이용한 575 ㎚에서의 흡광도(absorbance; O.D)를 각각 측정하여 비교하였다. 또한, 헤미셀룰라아제의 경우 DNS법에 의거하여 상대적 크실란아제 역가(relative xylanase activity)를 측정하였다. 여기서, 상대적 역가(relative activity)라 함은 각각의 사용조건에서 순수한 효소(이하, "미개질 효소"라 함)의 역가를 1.0으로 계산했을 때 계면활성제를 효소에 단순혼합하여 사용한 경우(이하, "혼합효소"라 함)와 계면활성제로 효소를 개질한 경우(이하, "개질효소"라 함)의 역가를 상대적 증감비율로 표현한 것이다.
실험예 1 : 비이온성 계면활성제 사용량에 따른 역가측정
상기 실시예와 동일한 방법에 의해 개질효소를 제조하였으며, 다만 RO(CH2CH2O)nH(R=탄소수 14∼18의 알킬기, n=10)로 표시되는 비이온성 계면활성제를 효소 100 중량부에 대하여 다음 표 1에 나타낸 양을 사용하였다.
효소 100중량부에 대한 비이온성 계면활성제 사용량에 따른 상대적 역가비교
구 분 셀룰라아제1) 헤미셀룰라아제2)
아비셀라아제 씨엠씨아제 크실란아제
개질효소 혼합효소 개질효소 혼합효소 개질효소 혼합효소
계면활성제(중량부) 20 1.06 0.68 0.99 0.59 1.17 0.72
40 1.12 0.75 1.07 0.61 1.24 0.84
60 1.18 0.88 1.18 0.64 1.29 0.90
80 1.25 1.07 1.29 0.98 1.33 1.13
100 1.23 1.10 1.18 1.02 1.35 1.22
140 0.89 1.22 1.09 1.09 0.91 1.32
160 0.88 1.20 1.04 1.30 0.87 1.30
180 - 1.21 1.02 1.33 0.88 1.32
200 - 1.20 1.01 1.33 0.89 1.31
1) 셀룰라아제[Penicillium funiculosum(EC 3.2.1.4.); 미국 Sigma사]2) 헤미셀룰라아제[Aspergillus niger(EC 3.2.1.4.); 미국 Sigma사]
미개질된 순수효소에 비하여 개질효소의 역가는 계면활성제의 양이 증가함에 따라 최고 30% 정도까지 증가하였으며, 혼합효소에 비해서도 우수하였다. 그러나, 효소에 대한 계면활성제의 사용량이 100 중량부를 초과할 경우 아비셀라아제 역가와 씨엠씨아제 역가 모두 감소하였으며, 아비셀라아제 역가의 경우가 좀 더 현격한 감소를 나타내었다. 헤미셀룰라아제로서 크실란아제 역가의 경우에도 비슷한 경향을 나타내었다. 이러한 현상으로 보아, 계면활성제에 의한 개질이 효소의 역가를 향상시키지만 개질의 정도가 과도하게 되면 효소의 물리적 구조가 변함으로서 역가는 오히려 감소함을 알 수 있었다.
또한, 계면활성제를 단순혼합한 경우에 있어서, 효소에 혼합된 계면활성제의 사용량이 100 중량부 이상으로 증가되면 혼합효소의 역가는 개질효소의 역가와 비슷한 수준으로 향상되지만 개질효소보다 훨씬 더 많은 양의 계면활성제가 요구됨을 알 수 있었다.
실험예 2 : 비이온성 계면활성제내 에틸렌옥사이드 중합도에 따른 역가측정
개질에 사용된 계면활성제 분자중에 존재하는 에틸렌 옥사이드의 중합도가 개질효소의 역가에 미치는 영향을 알아보기 위해 상기 실시예와 동일한 방법에 의해 개질효소를 제조하였으며, 다만 RO(CH2CH2O)nH(R=탄소수 14∼18의 알킬기, n=10)로 표시되는 비이온성 계면활성제를 효소 100 중량부에 대하여 80 중량부를 사용한 결과를 다음 표 2에 나타내었다.
비이온성 계면활성제의 에틸렌옥사이드(EO) 단위수에 따른 상대적 역가비교
구 분 셀룰라아제1) 헤미셀룰라아제2)
아비셀라아제 씨엠씨아제 크실란아제
개질효소 혼합효소 개질효소 혼합효소 개질효소 혼합효소
계면활성제(EO단위수) 3 1.02 0.62 1.00 0.57 1.10 0.73
5 1.10 0.73 1.04 0.68 1.21 0.82
7 1.18 0.89 1.13 0.86 1.29 0.97
10 1.25 1.04 1.29 1.04 1.32 1.15
12 1.08 1.20 1.12 1.27 1.18 1.31
15 0.78 1.18 0.70 1.31 0.86 1.29
1) 셀룰라아제[Penicillium funiculosum(EC 3.2.1.4.); 미국 Sigma사]2) 헤미셀룰라아제[Aspergillus niger(EC 3.2.1.4.); 미국 Sigma사]
상기 결과에서 보듯이, EO 단위수가 증가함에 따라 상대적 아비셀라아제 역가는 거의 직선적으로 증가하여 EO 단위수가 10일때 역가는 20% 이상 증가하였으나, EO 단위수가 10이상으로 증가하면 역가는 감소하기 시작하여 12 이상이 되면 순수효소의 역가보다 현격히 감소하였다. EO 단위수가 큰 계면활성제일수록 친수성을 띄기 때문에, 개질된 효소의 소수성은 EO 단위수가 증가함에 따라 감소하였다. 따라서, 본원 발명의 효소개질 시스템에서는 계면활성제의 친수성-소수성의 균형(HLB)값이 중요한 것으로 보인다.
실험예 3 : pH에 따른 상대적 아비셀라아제 및 씨엠씨아제 역가
상기 실시예와 동일한 방법에 의해 개질효소를 제조하였으며, 다만 RO(CH2CH2O)nH(R=탄소수 14∼18의 알킬기, n=10)로 표시되는 비이온성 계면활성제를 효소 100 중량부에 대하여 80 중량부 사용하였다. 그리고, 준비된 개질효소 및 혼합효소 분산액의 pH를 각각 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10으로 조절하여, 50℃에서 20시간 방치한 후 온도및 pH에 대한 개질 효소의 안정성을 측정하였다. 그 결과는 다음 표 3에 요약하여 나타내었다.
구 분 셀룰라아제1) 헤미셀룰라아제2)
아비셀라아제 씨엠씨아제 크실란아제
개질효소 혼합효소 개질효소 혼합효소 개질효소 혼합효소
pH 2 0.53 0.41 0.72 0.60 0.62 0.49
3 0.63 0.50 0.73 0.63 0.74 0.60
4 0.65 0.55 0.74 0.67 0.79 0.66
5 0.61 0.55 0.79 0.69 0.75 0.67
6 0.62 0.53 0.81 0.65 0.75 0.64
7 0.61 0.48 0.80 0.59 0.73 0.60
8 0.60 0.45 0.79 0.56 0.71 0.57
9 0.59 0.40 0.82 0.53 0.72 0.53
10 0.31 0.23 0.49 0.50 0.44 0.35
1) 셀룰라아제[Penicillium funiculosum(EC 3.2.1.4.); 미국 Sigma사]2) 헤미셀룰라아제[Aspergillus niger(EC 3.2.1.4.); 미국 Sigma사]
아비셀라아제 역가와 씨엠씨아제 역가, 크실란아제 역가 모두에 있어서, 계면활성제와 단순 혼합된 효소의 역가는 pH 3.0 ∼ 6.0에서 최대값을 가지며 적용 pH 범위가 7.0 이상의 알칼리성에서는 민감하게 변화하여 크게 감소하지만, 개질효소의 경우는 pH 2.0 ∼ 9.0의 비교적 넓은 범위의 pH 영역에서도 그 역가가 안정적으로 유지되었다.
상기 결과에서 보듯이, 본 발명에 따라 비이온성 계면활성제를 사용하여 개질된 효소는 그 역가를 상당히 증가시킬 수 있음을 알 수 있다. 특히, 탄수화물 분해효소 100 중량부에 대한 계면활성제의 사용량이 80 ∼ 100 중량부까지 증가함에 따라 상대적 아비셀라아제 역가와 상대적 씨엠씨아제 역가, 그리고 크실란아제 역가 모두가 25 ∼ 30%까지 향상되었다. 또한, 일반적으로 알칼리 조건에서 실활되는 탄수화물 분해효소들을 비이온성 계면활성제로 개질시킴으로서 pH 2.0 ∼ 9.0의 비교적 넓은 범위의 pH와 탄수화물 분해효소가 주로 적용되는 50℃의 온도에서도 높은 안정성을 갖는 개질효소를 얻을 수 있었다.

Claims (4)

  1. 효소와 계면활성제로 이루어진 개질효소에 있어서, 셀룰라아제 또는 헤미셀룰라아제 중에서 선택된 탄수화물 분해효소에 다음 화학식 1로 표시되는 비이온성 계면활성제가 화학결합된 것임을 특징으로 하는 개질효소.
    화학식 1
    상기 화학식 1에서: R은 탄소원자수 14 ∼ 18의 알킬기이고, n은 3 ∼ 12의 정수이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 개질효소가 pH 2.0 ∼ 9.0 범위에서 역가안정성을 가지는 것임을 특징으로 하는 개질효소.
  3. 효소의 개질방법에 있어서,
    다음 화학식 1로 표시되는 폴리옥시에틸렌 지방족알콜에테르를 피리딘 촉매하에서 파라-톨루엔설포닐 클로라이드(p-TsCl)와 반응시켜 다음 화학식 2로 표시되는 파라-토실레이티드 폴리에틸렌 지방족알콜에테르를 제조한 다음, 여기에 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제 중에서 선택된 탄수화물 분해효소를 반응시키는 것을 특징으로 하는 다음 화학식 3으로 표시되는 개질효소의 제조방법.
    화학식 1
    상기 화학식 1에서:은 해당 탄수화물 분해효소이고, R은 탄소원자수 14∼ 18의 알킬기이고, n은 3 ∼ 12의 정수이다.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 비이온성 계면활성제는 효소 100 중량부에 대하여 20 ∼ 100 중량부 사용하는 것을 특징으로 하는 효소의 개질방법.
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