KR20000001280A

KR20000001280A - 계피 추출물 또는 초두구 추출물을 포함하는 동맥경화증 예방및 치료용 조성물

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Publication number: KR20000001280A
Application number: KR1019980021474A
Authority: KR
Inventors: 류성호; 서판길; 허영미; 김희숙; 김지영; 이중훈; 최종원
Original assignee: 정명식; 학교법인 포항공과대학교
Priority date: 1998-06-10
Filing date: 1998-06-10
Publication date: 2000-01-15
Also published as: KR100294091B1

Abstract

본 발명은 계피 추출물 또는 초두구 추출물을 포함하는 동맥경화증(atherosclerosis) 예방 및 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물은 췌장 콜레스테롤 에스터레이즈(pancreatic cholesterol esterase; pancreatic cholesteryl ester hydrolase: pCEH)의 활성을 특이적으로 저해함으로써, 음식물로부터 섭취된 콜레스테롤의 체내흡수를 현저하게 감소시킨다.

Description

계피 추출물 또는 초두구 추출물을 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료용 조성물

본 발명은 계피 추출물 또는 초두구 추출물을 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

동맥경화증은 동맥벽이 비후해지면서 딱딱해져 탄력성을 잃은 병변으로, 대동맥으로부터 세동맥에 이르는 동맥계의 모든 부위에서 일어난다. 죽상동맥경화의 발병요인으로는 동물실험, 역학조사, 병리학적 검토, 임상성적 등의 결과에 따라 고지혈증, 고혈압, 비만, 당뇨, 흡연 등 많은 인자가 지적되고 있다.

이중 고콜레스테롤혈증이 중요한데, 이 혈중 콜레스테롤은 관상동맥경화증의 발생빈도, 심근경색과 높은 정의 상관관계를 보이는 것으로 보고되고 있으며 이러한 보고는 콜레스테롤 섭취가 많은 국가에서는 관상동맥질환 또는 허혈성심장질환에 의한 사망율이 높다는 보고(Keys, A., Circulation, 41(Suppl), 1(1970); The Lipid Research Clinic Program, JAMA, 251, 365(1984); 및 The Expert Panel, Arch. Intern. Med., 148, 36(1988))와도 일치한다.

콜레스테롤은 세포를 구성하는 필수성분으로 세포의 성장, 분화 및 발육에 중요한 역할을 한다. 성인의 경우 콜레스테롤 요구량은 매일 1,300㎎ 정도로, 이중 약 1,000㎎ 정도의 콜레스테롤은 신체의 거의 모든 세포에서 생산되고 약 300㎎ 정도의 콜레스테롤은 음식물로부터 섭취된다.

따라서 음식물로부터 과다하게 섭취된 콜레스테롤은 세포의 요구를 충족시키고도 남게되어(Gurr, M.I., Proceedings of Nutrition Society, 47, 277(1981); Goldstein, J.L. et al., Circulation, 76, 504(1987)), 혈액을 따라 떠돌다가 단핵구, 거핵세포 등과 함께 혈관내막에 흡착되어 거품세포로 전환되는 원인이 되고 결국 동맥을 막음으로써 심장마비를 유발하며(Johan, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 904(1990)), 혈관에 축적되어 동맥경화, 협심증 등의 심각한 심혈관질환을 초래한다. 음식물로부터 섭취된 콜레스테롤(이하 "식이 콜레스테롤"이라 함)과 심혈관계 질환의 관계에 대한 LRH-CPPT(The Lipid Research Clinics-Coronary Primary Prevention Trial) 연구결과(The Lipid Research Clinic Program, J. Am. Med. Assoc., 251, 365(1984))와 헬싱키 심장 연구(Helsinki Heart Study) 결과(Frick, M.H. et al., N. Eng. J. Med., 317, 1237(1987))에 따르면, 식이 콜레스테롤의 섭취가 1% 정도 감소되면 심혈관계 질환이 2% 정도 감소된다.

최근 육류 소비의 증가와 햄버거, 피자, 치킨류와 같은 패스트 푸드(fast food)의 보편화 등에 따른 고지질 가공식품의 대량 섭취로 인해 심혈관계 질환자가 매년 2배 이상으로 급증하는 추세를 보이는 등(경북대 병원 내과 임상자료), 콜레스테롤에 의한 동맥경화 등의 성인병이 심각한 문제로 대두되고 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 혈중 콜레스테롤을 감소시키는 물질의 개발이 절실하다.

식이 콜레스테롤의 체내 흡수과정에 대한 연구결과에 따르면, 섭취된 콜레스테롤 에스테르는 소장에서 췌장 분비 효소액에 포함된 췌장 콜레스테롤 에스터레이즈(pancreatic cholesterol esterase: pancreatic cholesteryl ester hydrolase: pCEH)에 의해 유리 콜레스테롤과 지방산으로 가수분해되어 소장내로 흡수되며, 이때 유리 콜레스테롤의 흡수가 소장 점막에 있는 pCEH에 의해 촉진되는 것으로 알려졌다(Gallo, L.L. et al., J. Lipid Res., 25, 604(1984); Bhat, S.G. et al, Biochem. Biophys. Res. Commun., 109, 486(1982); Riley, D.J.S. et al., Biochemistry, 29, 3848(1990); Vuoristo, M. et al., Gastroenterology, 102, 647(1992)). 소장점막에 흡수된 유리 콜레스테롤은 다시 지방산과 함께 에스테르를 형성하는데, 이 에스테르화 과정에는 CEH와 아실코에이: 콜레스테롤 아실트랜스퍼레이즈(acyl CoA: Cholesterol acyltransferase: ACAT)가 작용한다(Gallo, L.L. et al., J. Lipid Res., 25, 604(1984)).

식이 콜레스테롤의 흡수에 대한 초기의 연구에서는, 췌장이 절제된 흰 쥐에서 소장 점막의 CEH 활성과 콜레스테롤 흡수가 감소하였는데, 이는 소장점막의 CEH가 췌장에서 유래한다는 가설을 뒷받침한다. 또한 pCEH가 소장의 흡수융모에 흡수된다는 사실도 실험에 의해 확인되었다. 췌장 소화액에서 pCEH를 제거하고 ACAT를 정상으로 유지시키면 혈류로의 콜레스테롤 흡수가 약 80%정도로 저해된다. 이러한 결과를 종합하면, 외재성 콜레스테롤의 흡수는 ACAT 단독만으로는 유지될 수 없고, 이외에 pCEH가 가장 필수적임을 알 수 있다. 또한 pCEH는 장내 흡수효율에도 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Lopez-Candales, A. et al., Biochemistry, 32, 12085(1993)).

따라서, pCEH 저해제는 식이 콜레스테롤의 분해 및 흡수를 막음으로써 섭취된 콜레스테롤에 의한 동맥경화, 심혈관계 질환을 예방 및 치료할 수 있게 된다. 최근 와이어스-어스트 연구소(Wyeth-Ayerst Research)에 의해 개발된 WAY-121,751과 WAY-121,898은 효과적인 pCEH 저해제로, 콜레스테롤과 함께 투여되는 경우 콜레스테롤에 의한 고콜레스테롤혈증의 유발을 억제한다고 보고된 바 있다(Mckean, M.I. et al., FASEB J., 6, A1388 Abs.(1992); Clark, D.E. et al., FASEB J., 6, A1388(1992); 및 Gallo, L. et al., FASEB J., 6, A1388 Abs.(1992)).

이밖에도 pCEH는 간 CEH와도 큰 연관성을 가지는 것으로 다수 보고되고 있다. 예를 들어, 첫째, 흰쥐 간 마쇄액으로부터 정제된 CEH는 pCEH에 대한 항체와도 반응하며, 전기영동 패턴, N-말단 아미노산 서열 등에 있어서도 pCEH와 동일한 것으로 확인되었다. 둘째, 이미 알려진 pCEH의 cDNA를 사용하여 간 mRNA에 대해 노던 블랏(Northern Blot)한 결과 pCEH와 동일한 크기의 간 CEH의 mRNA가 확인되었다. 셋째, 간 CEH의 mRNA를 지노푸스 난모세포(Xenopus oocytes)에 주입하여 발현시킨 결과, 코스 세포(Cos cell) 또는 차이니즈 햄스터 난소 세포(chinese hamster ovary cell)에서 pCEH의 cDNA로부터 발현된 것과 동일한 효소 활성을 나타내었다(Zolfaghari, R. et al., J. Biol., Chem., 268, 13532(1993)). 이러한 보고들로부터 pCEH와 간 CEH는 높은 상관성이 있음을 알 수 있다.

한편, 계피(Cinnamomi cortex; Cinnamon bark)는 녹나무(Lauraceae)과에 속하는 생약으로, 중국 남부와 북 베트남이 주 산지이고, 하열, 중추억제, 지속적인 말초혈관확장, 혈소판응집억제, 피부 흑화(skin darkening) 방지, 혈액순환 증진 등의 작용을 가지며 주로 발한 해열, 방향건위, 진토효과로 인해 감기, 진통, 진경 등에 사용되고 있다.

또한 초두구(Alpinia Katsumadai semen)는 생강과(Zingiberaceae)에 속하는 생약으로, 건위, 진토 등의 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명자들은 동맥경화증을 포함한 각종 심혈관계질환을 예방 및 치료하기 위해 식이 콜레스테롤 및 중성지질의 흡수방지제를 연구하던 중, 생약중 계피 추출물 또는 초두구 추출물이 pCEH 저해 활성을 가짐을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 계피 추출물 또는 초두구 추출물을 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

도 1은 계피 또는 초두구의 에탄올 추출물로부터 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획을 얻는 과정을 나타낸 것이다.

도 2는 계피 또는 초두구의 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 또는 물 추출물의 pCEH 저해활성을 나타낸 그래프이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 계피 추출물 또는 초두구 추출물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 동맥경화증 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

상기 계피로는 신나모멈 카시아(Cinnamomum cassia), 실론 계피(Cinnamomum zeylanicum), 자바 계피(Cinnamomum burmanii), 베트남 계피(Cinnamomum obtusifolium), 사이공 계피(Cinnamomum sieboldii) 등의 심나모멈속 식물의 수피를 그대로 사용하거나 주피를 제거하여 사용할 수 있다.

또한 상기 초두구로는 알피니아 카추마다이(Alpinia Katsumadai Hayata)의 열매중 과피를 제거한 씨 부분을 사용할 수 있다.

상기 계피 또는 초두구 추출물은 잘게 부순 계피 또는 초두구의 에탄올 추출물을 클로로포름으로 다시 추출한 추출물(이하 "계피 또는 초두구 클로로포름 추출물"이라 함), 클로로포름 추출후 남은 물층을 에틸아세테이트로 추출한 추출물(이하 "계피 또는 초두구 에틸아세테이트 추출물"이라 함), 또는 에틸아세테이트 추출후 남은 물층을 부탄올로 추출한 추출물(이하 "계피 또는 초두구 부탄올 추출물"이라 함)이고, 클로로포름 추출물이 바람직하다.

계피 또는 초두구 추출물은 클로로포름, 에틸아세테이트 또는 부탄올과 같은 추출용매를 넣고 끓이거나 진탕하여 제조할 수 있는다. 예를 들면, 먼저 세절한 계피 또는 초두구를 95% 에탄올에 가하고 78 내지 85 ℃로 가열하면서 환류냉각하고 여과한 후 회전증발기를 이용하여 감압농축하여 계피 또는 초두구 에탄올 추출물을 얻으며, 이때 여과후 남은 잔사에 대하여 여과 과정을 2회 이상 반복하여 실시할 수 있다. 얻어진 에탄올 추출물을 10% 메탄올에 현탁하고 동량의 클로로포름과 함께 분액깔대기에 넣고 흔들어 혼합한 후 정치시켜 클로로포름층과 물층을 얻고 클로로포름층을 진공회전증발기를 이용하여 감압건조시켜 계피 또는 초두구 클로로포름 추출물을 얻으며, 이때 물층에 대한 추출 과정을 4 내지 5회 반복하여 실시할 수 있다. 클로로포름 추출후 남은 물층과 동량의 에틸아세테이트를 분액깔대기에 넣고 상기 클로로포름 추출단계에서와 동일한 과정을 반복하여 계피 또는 초두구 에틸아세테이트 추출물을 얻는다. 에틸아세테이트 추출후 남은 물층과 동량의 부탄올을 분액깔대기에 넣고 상기 클로로포름 추출 단계에서와 동일한 과정을 반복하여 계피 또는 초두구 부탄올 추출물과 계피 또는 초두구 물층을 얻는다.

본 발명의 추출물은 소장에서 식이 콜레스테롤의 분해 및 흡수를 매개하는 pCEH 활성을 저해하는 작용을 하여, 식이 콜레스테롤의 체내 흡수를 막음으로써 식이 콜레스테롤에 의한 혈중 콜레스테롤 농도 증가를 방지하고 최종적으로는 동맥경화증을 예방하고 치료한다.

또한 본 발명의 추출물은 동맥경화증 치료외에도 혈중 중성지질 농도를 감소시켜 결국 고지혈증(hyperlipidemia)을 치료하는 효과를 가진다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 주사 투여에 의해 투여될 수 있으며, 다음과 같은 다양한 형태로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 캅셀제 등이 있는데, 이들 제형은 활성성분이외에 희석제(예 : 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활탁제(예 : 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/ 또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피콜리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다. 주사용 제형으로는 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다.

상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있다.

상기 제형은 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있으며 활성 성분으로서 계피 추출물 또는 초두구 추출물을 약 0.1 내지 75%, 바람직하게는 약 1 내지 50%의 범위에서 함유할 수 있다. 계피 추출물 또는 초두구 추출물은 하루에 체중 1㎏당 50 내지 300 ㎎, 바람직하게는 100 내지 150 ㎎의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 단, 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

이하 본 발명을 다음과 같은 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 다음의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이것들 만으로 한정되는 것은 아니다.

참고예 1: pCEH의 정제

(단계 1) pCEH 조효소액의 제조

신선한 소 췌장 120g을 완충용액 A(50mM Tris/HCl, pH 7.4, 5mM EDTA, 2mM EGTA, 2mM PMSF 및 0.1mM DTT) 250㎖에 가하고 균질화한 후 13,000 x g에서 1시간 동안 원심분리하였다. 상층액에 1M 아세트산을 가하여 pH를 5로 조절한 후 다시 13,000 x g에서 1시간 동안 원심분리하였다. 상층액에 고체 암모늄설페이트를 가하여 60% 포화되게 한 후 13,000 x g에서 30분 동안 원심분리하여 침전물을 모았다.

이 침전물을 완충용액 B (20mM Hepes/NaOH, pH 7.0, 1mM EDTA, 1mM EGTA 및 0.1mM DTT)에 녹여, 다음 크로마토그래피 단계에서 pCEH 조효소액으로 사용하였다.

(단계 2) 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용한 pCEH 정제

단계 1에서 얻은 조효소액 20㎖를 3M 염화칼륨이 함유된 완충용액 B로 미리 평형시킨 TSKgel 페닐-5PW 칼럼(21.5x150㎜, TOSOH 사)에 주입하고, 단백질을 완충용액 B와 염화칼륨의 혼합액을 이용하여 염화칼륨의 농도를 3M부터 0M까지 변화시키면서 농도구배법으로 용출시킨 후 증류수로 20분동안 다시 용출시켰다. 용출된 분획 5㎕를 반응 혼합액(10μM 콜레스테릴 올레이트, 10μM 디팔미토일-포스파티딜 콜린, 100mM 콜레이트, 50mM 트리스-염산 pH 8.0) 200 ㎕과 반응시켜 콜레스테롤 올레이트-가수분해능을 측정함으로써 pCEH 활성을 결정하였다. 그 결과 pCEH 활성이 있는 단백질은 증류수 용출분획에서 용출되었다. 동일한 크로마토그래피를 4번 반복한 후 이 pCEH 활성 분획을 모아 한외여과농축기(Amicon ultrafiltration apparatus)를 이용하여 농축하였다.

농축된 pCEH 활성 분획을 완충용액 B로 미리 평형시켜 놓은 TSKgel 헤파린-5PW 칼럼(7.5x75㎜, TOSOH 사)을 이용하여 더욱 정제하였다. 흡착된 단백질을 완충용액 B와 염화나트륨의 혼합액을 이용하여 염화나트륨의 농도를 0M에서 1M까지 변화시키면서 농도구배법으로 용출하였다. 그 결과, pCEH 활성은 400mM 염화나트륨 용출 분획에서 넓은 봉우리로 용출되었다. 이 분획을 SDS-PAGE로 분석한 결과, 60 kDa과 70 kDa 크기의 두가지 pCEH로 확인되었다.

이 활성 분획을 pCEH 저해제 활성 측정을 위한 효소액으로 사용하였다.

참고예 2: pCEH 효소 활성 및 저해활성 측정

방사선 동위원소[¹⁴C-1]로 표지된 콜레스테릴 올레이트 20,000cpm, 10μM 콜레스테릴 올레이트, 10μM 포스파티딜 콜린, 100mM 소디움 콜레이트, 50mM 트리스/염산(pH 8.0)과 참고예 1에서 얻은 pCEH 효소액 적당량이 함유된 반응 혼합물 100㎕를 37℃에서 10분동안 반응시킨 후, 메탄올/클로로포름/헵탄 혼합용액(혼합비 1.41:1.25:1.0) 1.625㎖과 50mM 소디움 카보네이트/50mM 보레이트 혼합용액(pH 10.0) 0.525㎖를 가하여 반응을 중단시켰다. 반응액을 실온에서 1,500 x g에서 10 분동안 원심분리하고 수용액층 0.75㎖중에 포함된 방사능양을 액체 신틸레이션 계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 측정하였다.

pCEH 저해 활성을 측정하는 경우에는, pCEH 저해제를 증류수에 현탁시키거나, 반응시험관에 미리 pCEH 저해제를 넣고 질소가스로 건조시킨 후 완충용액(50mM Tris-Cl pH 8.0, 100mM 소디움 콜레이트)을 넣고 초음파 파쇄기를 이용하여 균질화시킨 다음 상기 pCEH 효소 반응에 사용하였다.

실시예 1: 계피 및 초두구 추출물의 pCEH 저해 활성 분획

도 1의 순서에 따라 계피 또는 초두구로부터 에탄올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 추출물을 얻었다.

(1) 에탄올 추출물의 제조

계피 또는 초두구로부터 pCEH 활성 저해제를 분리하기 위해, 먼저 소량으로는 인체에 영향을 주지 않는 에탄올을 추출용매로 선택하였다.

즉, 잘게 부순 중국산 계피 또는 중국산 초두구 1㎏을 500g씩 나누고, 이 계피 또는 초두구 500g과 95% 에탄올 1ℓ를 2ℓ 용량의 환저플라스크에 넣고 78 ℃로 가열하면서 환류냉각시켰다. 이 용액을 여과지에 통과시켜 여액을 얻고 남은 잔사를 다시 에탄올로 2회 더 가열추출하고 여액을 얻었다. 이 여액들을 합하고 회전증발기를 이용하여 감압농축하여 얻은 에탄올 추출물을 다음의 클로로포름 분획 제조에 이용하였다.

(2) 클로로포름 분획

상기 에탄올 추출물을 10% 메탄올에 현탁하고 이 현탁액을 동량의 클로로포름과 함께 분액깔대기에 넣고 격렬하게 흔들어 혼합한 후 정치시켜, 클로로포름층, 클로로포름과 물이 혼합된 중간층 및 물층을 얻었다. 물층을 동량의 클로로포름과 함께 분액깔대기에 넣고 동일한 방법으로 5회 반복하여 추출하였다. 얻어진 각층을 클로로포름층, 중간층 또는 물층별로 합한 다음 진공회전증발기를 이용하여 감압건조하여, 클로로포름 분획으로부터 계피 클로로포름 추출물 28.5g(150㎖) 또는 초두구 클로로포름 추출물 62.4g(120㎖)을 얻었다.

이 분획 10㎕을 취하여 참고예 2에서와 동일한 방법으로 pCEH 저해활성을 측정한 결과, 도 2에서 보듯이, 계피 클로로포름 추출물은 78%, 초두구 클로로포름 추출물은 91%의 pCEH 저해활성을 나타내었다. 물층은 다음의 에틸아세테이트 분획 제조에 사용하였다.

(3) 에틸아세테이트 분획

상기 물층을 회전증발기를 이용하여 감압농축하여 물층에 녹아있는 클로로포름을 제거하고, 남은 물층을 동량의 에틸아세테이트와 함께 분액깔대기에 넣고 격렬하게 흔들어 혼합한 후 정치시켜, 에틸아세테이트층과 물층을 얻었다. 물층을 동량의 에틸아세테이트와 함께 분액깔대기에 넣고 동일한 방법으로 5회 반복하여 추출하였다. 얻어진 각층을 에틸아세테이트층 또는 물층별로 합한 다음 진공회전증발기를 이용하여 감압건조하여, 에틸아세테이트 분획으로부터 계피 에틸아세테이트 추출물 0.48g(24㎖) 또는 초두구 에틸아세테이트 추출물 7.8g(30㎖)을 얻었다.

이 분획 10㎕을 취하여 참고예 2에서와 동일한 방법으로 pCEH 저해활성을 측정한 결과, 도 2에서 보듯이, 계피 에틸아세테이트 추출물은 27%, 초두구 에틸아세테이트 추출물은 80%의 pCEH 저해활성을 나타내었다. 물층은 다음의 부탄올 분획 제조에 사용하였다.

(4) 부탄올 분획과 물 분획

상기 물층을 회전증발기를 이용하여 감압농축하여 물층에 녹아있는 에틸아세테이트를 제거하고, 남은 물층을 동량의 부탄올과 함께 분액깔대기에 넣고 격렬하게 흔들어 혼합한 후 정치시켜, 부탄올층과 물층을 얻었다. 물층을 동량의 부탄올과 함께 분액깔대기에 넣고 동일한 방법으로 5회 반복하여 추출하였다. 얻어진 각층을 부탄올층 또는 물층별로 합한 다음 진공회전증발기를 이용하여 감압건조하여, 부탄올 분획으로부터 계피 부탄올 추출물 0.7g(35㎖) 또는 초두구 부탄올 추출물 5.6g(35㎖)을, 물 분획으로부터 계피 물 추출물 1.4g(20㎖) 또는 초두구 물 추출물 8.58g(17.5㎖)을 얻었다.

부탄올 분획 또는 물 분획 10㎕을 취하여 참고예 2에서와 동일한 방법으로 pCEH 저해활성을 측정한 결과, 도 2에서 보듯이, 부탄올 분획으로부터 얻은 계피 부탄올 추출물과 초두구 부탄올 추출물은 각각 22% 및 62%의 pCEH 저해활성을 나타내었으나, 물 분획으로부터 얻은 계피 물 추출물은 pCEH 저해활성을 보이지 않았고 초두구 물 추출물은 41%의 pCEH 저해활성을 나타내었다.

실시예 2: 동물실험을 이용한 계피 추출물 또는 초두구 추출물의 pCEH 저해활성 측정

(1) 실험동물의 식이 및 계피 클로로포름 추출물 또는 초두구 클로로포름 추출물의 투여

실험동물로는 대한실험동물센터(충청북도 음성)로부터 분양받은 스프라그-다우리(Sprague-Dawley)계 래트(체중 210g 정도)를 22 내지 26℃, 습도 55 내지 60%, 명암주기 12시간/12시간의 조건하에 적응시킨 후 사용하였다.

이 래트에 1% 콜레스테롤과 0.5% 소디움-콜린산이 함유된 사료를 5주동안 섭취시켜 사육하여 식이성 고지혈증을 유발하였으며, 5주째의 7일 동안 계피 클로로포름 추출물 또는 초두구 클로로포름 추출물을 50, 100, 또는 150㎎/㎏의 양으로 니들 존(needle zone)을 통해 구강투여하였다. 이때 정상군으로는 식이성 고지혈증이 유발되지 않은 래트를 사용하였고, 대조군으로는 식이성 고지혈증이 유발되었으나 계피 클로로포름 추출물 또는 초두구 클로로포름 추출물이 투여되지 않은 래트를 사용하였다.

(2) 혈청 인지질 및 중성지질 함량에 미치는 영향

식이성 고지혈증이 유발된 래트에서 계피 클로로포름 추출물 또는 초두구 클로로포름 추출물이 혈청중 인지질과 중성지질의 함량에 미치는 영향을 확인하기 위해, 인지질 및 중성지질의 함량을 다음과 같이 측정하였다.

인지질의 함량은 첸 등의 효소법(Chen, P.S. et al., Anal. Chem., 28, 1756(1956))을 이용한 키트(RM 142-K, Iatron Chem. Co.)를 사용하여 측정하였다. 즉, 효소시약(포스포리파제 3.9 U, 콜린 옥시다제 5.6 U, 퍼옥시다제 3.6 U 및 4-아미노안티피린 0.3252㎎을 포함함)을 효소시약 용해액[트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 6.057㎎을 함유함] 35㎖에 빙냉상에서 가하여 용해시켜 효소시액을 제조하고, 이 효소시액 3.0㎖에 상기 식이성 고지혈증 래트의 혈청 20㎕를 가하고 37℃에서 20분 동안 반응시킨 후, 500㎚에서 흡광도를 측정하였다. 혈청을 포함하지 않는 반응액을 대조로하여, 검량선에 준해 중성지질의 함량을 ㎎/㎗로 나타내었다.

중성지질의 함량은 맥고완 등의 방법(McGowan, M.W. et al., Clin. Chem., 29, 538(1983))을 이용한 키트(AN 157S-K, Asan)를 사용하여 측정하였다. 즉, 효소시약(지단백 리파제 10,800 U, 글리세롤 키나제 5.4 U, 퍼옥시다제 135,000 U 및 L-α-글리세로포스포옥시다제 160 U)를 효소시약 용해액[N,N-비스(2-하이드록시에틸)-2-아미노메탄설폰산 0.427를 포함함] 72㎖에 빙냉상에서 가하여 용해시켜 효소시액을 제조하고, 이 효소시액 3.0㎖에 상기 식이성 고지혈증 래트의 혈청 20㎕를 가하고 37℃에서 10분 동안 반응시킨 후, 500㎚에서 흡광도를 측정하였다. 혈청을 포함하지 않는 반응액을 대조로하여, 검량선에 준해 중성지질의 함량을 ㎎/㎗로 나타내었다.

그 결과는 표 1과 같다.

식이성 고지혈증 래트의 혈청 인지질과 중성지질에 대한 계피 클로로포름 추출물 및 초두구 클로로포름 추출물의 영향

시험군	투여량(㎎/㎏)	인지질(㎎/㎗)	중성지질(㎎/㎗)
정상군	-	103.3 ± 4.79	75.4 ± 5.07^a,1)
대조군	-	107.6 ± 5.13	111.5 ± 4.65^b
계피 클로로포름 추출물 투여군	50	106.5 ± 5.89	109.4 ± 3.97^b
	100	105.7 ± 4.24	91.7 ± 3.42^c
	150	105.2 ± 5.28	90.5 ± 2.92^c
초두구 클로로포름 추출물 투여군	50	108.2 ± 6.66	98.6 ± 4.31^e
	100	107.8 ± 4.48	82.6 ± 3.98^f
	150	106.4 ± 5.51	81.9 ± 4.09^f
¹⁾평균 ± 표준편차를 나타낸다(n=8).^{a, b, c, e, f}던칸의 다중범위 시험(Duncan's multiple range test) 결과 서로 유의성이 없음을 나타낸다(p<0.05).

표 1에서 보듯이, 식이성 고지혈증이 유발된 대조군은 정상군에 비해 중성지질 함량이 현저하게 증가하고, 계피 클로로포름 추출물 투여군과 초두구 클로로포름 추출물 투여군은 추출물의 투여량이 증가함에 따라 중성지질 함량이 현저하게 감소하였다.

한편 인지질 함량은 정상군, 대조군, 계피 클로로포름 추출물 투여군 및 초두구 클로로포름 추출물 투여군 간에 차이점이 없는 것으로 나타나, 인지질 함량과 식이성 고지혈증은 무관한 것임을 알 수 있다.

(3) 혈청중 콜레스테롤 함량과 동맥경화지수에 미치는 영향

식이성 고지혈증이 유발된 래트에 계피 클로로포름 추출물 또는 초두구 클로로포름 추출물을 구강투여한 후 혈청중 총 콜레스테롤 함량, 고밀도 지질(HDL) 콜레스테롤 함량, 저밀도 지질(LDL) 콜레스테롤 함량, 초저밀도 지질(VLDL) 콜레스테롤 함량 및 동맥경화지수를 다음과 같이 측정하였다.

총 콜레스테롤 함량은 효소법에 의해 조제된 키트(AM 202-K, Asan)를 사용하여 측정하였다. 즉, 효소시약(콜레스테롤 에스터레이즈 20.5 U/ℓ, 콜레스테롤 옥시다제 10.7 U/ℓ, 수산화나트륨 1.81g/ℓ)을 효소시약 용해액(인산제1칼륨 13.1g/ℓ, 페놀 1.88g/ℓ) 120㎖에 용해한 후 혈청 20㎕ 시약 공시험구를 대조로 파장 500㎚에서 흡광도를 측정하였다. 표준 검량선에 준하여 혈중 함량은 ㎎/㎗로 표시하였다.

혈청중 HDL 콜레스테롤 함량은 나카야마 등의 효소법(Nakayama, N.A. et al., Clin. Chem., 24, 1504(1978))을 이용한 키트(AM 203-K, Asan)를 사용하여, 상기 고지혈증 래트의 혈청 20㎕에 침강시약(0.1% 덱스트란 설페이트, 0.1M 염화마그네슘) 0.2㎖를 가하고 잘 혼합한 후 실온에서 10분간 방치한 다음 3,000rpm에서 10분동안 원심분리하였다. 상층액 0.1㎖를 효소시액 3.0㎖(콜레스테롤 에스터레이즈 20.5 kU/ℓ, 콜레스테롤 옥시다제 10.7lU/ℓ, 수산화나트륨 1.81g/ℓ를 인산이수소칼륨 13.5g/ℓ, 페놀 1.88g/ℓ가 포함된 완충액 150㎖에 용해한 것)과 잘 혼합하고 37℃에서 5분 동안 반응시킨 후 500㎚에서 흡광도를 측정하였다. 혈청을 포함하지 않는 반응액을 대조로하여, 검량선에 준해 중성지질의 함량을 ㎎/㎗로 나타내었다.

혈청중 LDL 콜레스테롤과 VLDL 콜레스테롤의 함량은, 프라이드왈드 등의 방법(Fridewald, W.T. et al., Clin. Chem., 18, 499(1979))에 따라 각각 하기 수학식 1과 2에 의해 결정하였으며, 동맥경화지수는 하기 수학식 3에 따라 결정하였다.

VLDL콜레스테롤 양=[총콜레스테롤양-(HDL콜레스테롤양+LDL콜레스테롤양)]

그 결과는 하기 표 2와 같다.

혈청중 콜레스테롤 함량과 동맥경화지수에 대한 계피 클로로포름 추출물 및 초두구 클로로포름 추출물의 영향

시험군	투여량 (㎎/㎏)	콜레스테롤 (㎎/㎗)	동맥경화지수
시험군	투여량 (㎎/㎏)	총 콜레스테롤	동맥경화지수	HLD	LDL과 VLDL
정상군	-	69.8±2.11^a,1)	35.4±2.09^a	41.7±3.46^a	0.98±0.06^a
대조군	-	110.6±3.40^b	30.1±2.53^b	68.9±13.5^b	2.69±0.20^b
계피 클로로포름 추출물 투여군	50	108.7±2.69^b	29.4±2.43^b	68.2±2.66^b	2.72±0.22^b
	100	108.6±2.40^b	29.9±2.16^b	54.6±2.40^c	2.32±0.20^c
	150	93.1±3.58^c	33.4±1.82^a	48.2±2.54^d	1.73±0.07^d,e
초두구 클로로포름 추출물 투여군	50	109.2±3.68^b	29.7±1.62^b	67.2±3.45^b	2.69±0.18^b
	100	97.5±2.12^b	33.9±2.03^a	51.1±2.59^c,d	1.84±0.06^d
	150	87.6±2.57^c	34.8±2.50^a	47.6±2.11^d	1.53±0.11^e
¹⁾평균±표준편차를 나타낸다(n=8).^{a, b, c, e, f}던칸 다중범위 시험(Duncan's multiple range test) 결과 서로 유의성이 없음을 나타낸다(p<0.05).

표 2에서 보듯이, 150㎎/㎏의 계피 클로로포름 추출물 투여군, 100 및 150㎎/㎏의 초두구 추출물 투여군은 식이성 고지혈증이 감소되는 경향을 나타내었다.

본 발명의 추출물은 소장에서 식이 콜레스테롤의 분해 및 흡수를 매개하는 pCEH의 활성을 저해함으로써, 식이 콜레스테롤의 체내 흡수를 막아 동맥경화증의 예방 및 치료에 유용하다.

Claims

활성성분으로서 유효량의 계피 추출물 또는 초두구 추출물, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 동맥경화증의 예방 및 치료용 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 계피 추출물 및 초두구 추출물이 각각 계피 및 초두구의 에탄올 추출물을 클로로포름으로 추출하여 제조된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 계피 추출물 및 초두구 추출물이 각각 계피 및 초두구의 에탄올 추출물을 클로로포름으로 추출한 후 남은 물층을 에틸아세테이트로 추출하여 제조된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 계피 추출물 및 초두구 추출물이 각각 계피 및 초두구의 에탄올 추출물을 클로로포름으로 추출한 후 남은 물층을 에틸아세테이트로 추출하고 남은 물층을 부탄올로 추출하여 제조된 것임을 특징으로 하는 조성물.