KR100783204B1

KR100783204B1 - 누룩치 추출물을 포함하는 항비만 또는 항고지혈증 조성물

Info

Publication number: KR100783204B1
Application number: KR1020060038254A
Authority: KR
Inventors: 박희준; 정현주; 최종원; 김원배; 박광균
Original assignee: 상지대학교산학협력단
Priority date: 2006-04-27
Filing date: 2006-04-27
Publication date: 2007-12-06
Also published as: KR20070105717A

Abstract

본 발명은 누룩치 추출물, 이로부터 분획한 분획물을 유효성분으로 포함하는 항비만 또는 항고지혈증 조성물에 관한 것이다.

또한 본 발명은 누룩치의 추출물로부터 분리된 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)를 유효성분으로 포함하는 항비만 또는 항고지혈증 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 혈중 콜레스테롤과 트리글리세라이드를 감소시키므로 비만 및/또는 고지혈증의 치료 및 예방에 사용될 수 있다

누룩치, 누룩치 추출물, 부들레자사포닌 Ⅳ, 항비만, 항고지혈증

Description

누룩치 추출물을 포함하는 항비만 또는 항고지혈증 조성물{A composition for inhibiting obesity and hyperlipidemia}

도 1은 Poloxamer-407로 고지혈증이 유도된 랫트에서 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)의 Poloxamer-407 유도 고지혈 랫트에 대한 혈중 지질 억제 효과를 나타낸 그림이다.

도 2는 Triton WR-1339로 고지혈증이 유도된 랫트에서 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)의 혈중 지질 억제 효과를 나타낸 그림이다.

도 3은 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)의 30% 옥수수 기름 유도 고콜레스테롤 쥐에 대한 고지혈 억제 효과를 나타낸 그림이다.

도 4는 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)의 식이 유도성 고콜레스테롤 쥐에 대한 고지혈 억제 효과를 나타낸 그림이다.

도 5는 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)의 식이 유도성 고콜레스테롤 쥐에 대한 산화적 스트레스 억제 효과를 나타낸 그림이다.

본 발명은 누룩치 추출물을 포함하는 항비만 또는 항고지혈증 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 누룩치 추출물, 이로부터 얻어진 유기용매 분획물 또는 이로부터 분리된 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ, BSⅣ)를 유효성분으로 포함하는 항비만 또는 항고지혈증 조성물 및 이 조성물을 이용한 비만 또는 고지혈증의 억제 방법에 관한 것이다.

누룩치(Pleurospermum kamtschaticu )는 미나리과에 속하는 식물로서 한국, 일본, 사할린섬, 캄차카 반도, 시베리아에 분포한다. 누룩치의 뿌리와 어린 잎은 독성이 있으나 연한 잎자루는 산나물로 이용하고 있을 뿐 아니라 감기, 관절염, 동맥경화 및 임포텐스에 효과가 있다고 알려져 있어서 최근 이 식물에 대한 기호성이 높아지고 있다.

고지혈증이란 중성지방인 트리글리세라이드와 콜레스테롤 등의 지방대사가 제대로 이루어지지 않아 혈액 중에 지질이 많이 포함된 상태를 말한다. 혈액 중의 지질이라고 하면 흔히 콜레스테롤만을 떠올리기 쉽지만 중성지방이 높을 때에도 고지혈증을 일으킬 수 있다. 고지혈증은 그 자체가 병이라 할 수 없으나 순환기 질환의 중요한 위험요인으로 작용한다. 즉, 고지혈증은 아무런 병적 증상을 발생시키지 않지만 심각한 합병증을 유발할 수 있다. 고지혈증으로 인한 합병증의 대표적인 것은 동맥경화증이다. 동맥경화증은 심장에 산소와 영양분을 공급해주는 관상동맥에 발생하는 질환으로, 협심증, 심근경색증 및 돌연사의 원인이 되기도 한다. 이외에 도 동맥경화증은 외혈관에 발생하여 뇌졸증을 유발하기도 하는데 뇌졸증은 중성지방에 의한 것이다.

비만은 지방의 과다축적으로 특징지워지는 다양한 원인을 가진 심각한 만성 증후군이다. 또한 비만은 고지혈증, 당뇨병, 동맥 경화의 최대 위험 인자이며, 비만을 치료하여 이들 질병을 개선할 수 있다. 비만 치료는 보통 식사 요법을 기본으로 하지만 체중, 내장 지방량을 저하시키는 약제 또는 건강 식품의 병행이 요구되고 있다.

따라서, 체내의 트리글리세라이드 등의 중성지방이나 콜레스테롤류의 양을 줄일 수 있다면 이는 고지혈증 또는 비만을 억제할 수 있을 것이다.

본 발명자들은 누룩치(Pleurospermum kamtschaticu)의 콜레스테롤 등 혈중 지질 억제 효과를 확인하기 위해 각종 고지혈 실험동물 모델에서 누룩치 추출물, 그의 유기용매 분획물이 유효한지를 시험하였으며, 활성 분획에서 얻은 주 물질 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ) 의 효능을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 누룩치의 유기용매 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 항비만 또는 항고지혈증 조성물을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 누룩치 추출물의 분획물로부터 분리한 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)를 포함하는 항비만 또는 항고지혈증 조성물을 제공함에 있다.

또한, 본 발명은 상기한 조성물을 투여하여 비만 또는 고지혈증을 억제하는 방법을 제공함을 목적으로 한다.

하나의 양태에서, 본 발명은 누룩치의 유기용매 추출물 또는 이로부터 얻어진 유기용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 항비만 또는 항고지혈증 조성물에 관한 것이다.

다른 양태에서, 본 발명은 누룩치의 유기용매 추출물로부터 단리한 하기 화학식 1로 표시되는 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)를 유효성분으로 포함하는 항비만 또는 항고지혈증 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서 “항비만”이란 비만을 억제하는 것을 의미한다. 비만이란 체중의 증가로 인해 건강에 부적절한 상태를 초래하는 것으로 에너지 섭취가 에너지 소비보다 많아 소비되지 않고 남은 과잉 에너지가 여러 가지 지질의 형태로 체지방으로 축적되거나 혈액 내에 지질의 함량이 높아진 상태를 말한다.

본 발명에 있어서, “항고지혈”이란 혈액 내 지질 함량을 낮추어 고지혈증을 억제하는 작용을 말한다. 고지혈증이란 혈장 콜레스테롤 또는 중성지방 수준의 증가를 의미한다. 그 원인은 콜레스테롤, 중성지방 등이 많이 함유된 고칼로리 음식의 과잉섭취 및 지단백의 생합성 증가 또는 분해 감소 그리고 혈장에서의 지단백 제거 속도의 지연과 같은 지단백 대사 이상에 의해 발생한다.

따라서 본 발명에 따른 조성물은 혈액내의 지질 함량을 저하시켜 비만과 고지혈증을 모두 억제할 수 있다.

본 발명에 의한 누룩치 추출물은 메탄올, 클로로포름, 부탄올 및 에틸아세테이트로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 유기용매를 추출용매로 사용하여 얻어질 수 있다. 본 발명에 따르면, 음건한 누룩치 식물재료를 작게 분쇄하고, 이것을 유기용매로 3회 이상 환류하여 추출한 후, 이 추출물을 여과하고 감압 농축하여 누룩치의 추출물을 얻는다. 상기에서 유기용매는 추출목적으로 사용되는 어떠한 유기용매도 사용가능하나, 바람직하게는 메탄올, 에탄올, 에틸아세테이트, 클로로포름 또는 이들의 혼합물 중에서 선택된다.

바람직하게는, 상기 누룩치의 유기용매 추출물을 각각 동결건조하여 고형의 추출물을 얻고, 고형의 추출물에 증류수를 가한 후 에틸아세테이트, 부탄올 또는 클로로포름으로 3회 나누어 분획하여 누룩치의 상기 유기용매 추출물로부터 각각의 분획물을 얻을 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기한 방법으로 단리된 유기용매 분획물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피와 ODS 컬럼 크로마토그래피를 실시하고 표준품 시료와 융점, 선광도 및 NMR 스펙트럼을 비교하여 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)를 단리한다.

본 발명의 방법으로 얻어진 누룩치의 유기용매 추출물, 이 추출물에서 얻어진 분획물, 이들 분획물로부터 단리된 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)는 Poloxamer-407, Triton WR-1339, 30% 옥수수 기름 투여, 고콜레스테롤 식이로 인한 혈중 지질함량을 인위적으로 높힌 고지혈증 유도 모델에서 혈중 지질의 함량 저하를 나타내었다.

Poloxamer-407은 계면활성제로서 고콜레스테롤 혈증이나 고지혈증 유도제로 사용된다. 그 기전은 HMG-CoA reductase 활성을 증진하며, 혈중 트리글리세라이드의 가수분해에 관여하는 효소인 리포프로틴 리파제를 강력하게 억제함으로써 고지혈증을 일으킨다. 이러한 Poloxamer-407의 특성은 고지혈증의 발생기전에 따른 그 억제제 탐색에 유리한 장점이 있다.

또한, Triton WR-1339는 세포의 리파제 활성을 억제하여 혈액내 트리글리세라이드와 LDL을 증가시키고 고분자량 Apo B, 유리상태 또는 에스테르 결합 상태의 콜레스테롤, 인지질, 지방산의 농도를 증가시키고, 또한 세포내 리파제 활성억제에도 관여하여 세포내 트리글리세라이드의 축적을 증가시키는 물질이다.

본 발명에서 상기한 Poloxamer-407과 Triton WR-1339는 지방 대사 문제로 인한 내인성 고지혈증에 대한 누룩치 추출물 및 분획물, 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)의 효과를 알아보기 위해 사용된 것이다.

또한 외인성 고지혈을 유도하기 위해 30% 옥수수 기름 및 올리브 오일 등의 유지를 경구투여하거나 고콜레스테롤 식이 요법이 시도되었다. 이는 식사 등의 외부적 요인에 의한 에너지 과잉섭취로 인한 외인성 고지혈증 및 비만에 대한 누룩치 추출물 및 분획물, 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)의 효과를 알아보기 위한 실험이다.

상기한 방법으로 유도된 4가지의 고지혈, 고콜레스테롤 유도 실험군에 누룩치 유기용매 추출물, 이 추출물로부터 얻어진 분획물, 상기 분획물로부터 단리된 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ) 투여 전후의 트리글리세라이드, 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤의 변화량을 측정한 결과로부터 본 발명에 따른 조성물의 항비만 또는 항고지혈증 효과가 입증되었다.

또한 식이성 고지혈증 유발 쥐에 대해서는 지질과산화 억제 효과를 측정하기 위해 TBARS(유해산소잔존률), 히드록시 래디칼 함량 및SOD(superoxide dismutase)의 활성을 누룩치 유기용매 추출물, 추출물로부터 얻어진 분획물, 부탄올 분획물에서 단리한 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)의 투여 전후로 측정한다.

지질함량 저하 실험에서 누룩치의 메탄올 추출물이 효과를 보였으며, 유기 용매 분획물 중에서는 부탄올 분획물이 가장 우수한 효과를 나타내었다. 부탄올 분획물에서 분리한 사포닌인 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)는 경구투여로 전 실험군에서 지질함량을 낮추는 효과를 보임에 따라(도 1 내지 도 4) 이 성분이 비만 또는 고지혈 억제제로 작용할 수 있음을 실험적으로 확인하였다. 즉 본 발명자는 누룩치 추출물 및 이의 분획물, 이로부터 얻어진 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)는 식사 등으로 인한 외인성 고지혈 및 지방 대사 장애로 인한 내인성 고지혈에 대해 모두 효과가 있음을 밝혔다. 특히 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)가 30% 옥수수 기름 처리 고지혈증과 식이성 고지혈증에서 HDL-콜레스테롤은 증가시키고 LDL -콜레스테롤은 감소시킨 바, 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)가 동맥경화지수를 크게 감소시킴을 알 수 있다. 또한 에너지 과잉 섭취로 인해 증가된 중성지방 즉 트리글리세라이드의 함량 및 고콜레스테롤 식이로 인한 콜레스테롤의 함량을 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)가 낮춤으로써 비만치료에도 효과가 있음을 증명하였다.

식이성 고지혈의 경우, 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)의 투여는 혈장 TBARS, 히드록시 래디칼의 함량 감소 및 SOD(superoxide dismutase) 활성 증가를 일으켰는데, 이것은 지질과산화의 억제작용이 있음을 의미한다. 생체내 발생 활성 산소종으로부터 세포를 보호하기 위해 신체는 항산화제로 SOD, 글루타티올 퍼옥시다제(glutathione peroxidase), 카탈라제 등의 효소들과 비타민 C, 토코페롤, 설레늄, 요산, 설프하이드릴 화합물, 페놀, 환원성 플루타티올, 카로티노이드, 만니톨 등을 가지고 있다. 이러한 효소적 및 비효소적 항산화제들은 산화적 스트레스를 감소시키는 것으로 알려져 있다. 즉 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)가 이들 효소적 비효소적 항산화제들처럼 지질과산화를 방지하여 고콜레스테롤 식이로 인해 증가된 산화적 스트레스를 경감시킬 수 있으므로 외인성 고지혈을 억제할 수 있다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명은 누룩치의 유기용매 추출물, 상기 추출물로부터 얻어진 분획물, 이들 각각의 분획물로부터 단리된 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)를 포함하는 조성물로 비만 또는 고지혈을 억제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 조성물은 누룩치의 유기용매 추출물, 상기 추출물로부터 얻어진 분획물, 분획물로부터 단리된 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)를 유효성분으로 포함하는 경구투여용 제형, 예를 들면 트로치제(troches), 로젠지(lozenge), 수성 또는 유성 현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르(elixirs)로 제제화될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

정제 및 캡슐 등의 제형으로 제조하기 위하여, 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제와 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제, 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제 및 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유될 수 있다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 포함할 수 있다.

또한 본 발명에 의한 항비만, 항고지혈 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피부연고제, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주 사 방식에 의한다.

비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 이들 추출물 및 분획물 또는 상기 화학식 1의 화합물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알 단위의 투여형으로 제제할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에서 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

누룩치 추출물 및 분획물의 제조

강원도 태백시에서 채집한 누룩치 지상부를 음건하여 분쇄하고, 이 분쇄물 1.8 kg을 3회 환류하에 메탄올로 추출하였다. 이 추출물을 여과하고 감압농축한 후 동결건조하여 고형의 추출물 450 g을 얻었다. 약 430 g을 증류수 1L에 현탁시키고 3L의 클로로포름으로 3회 나누어 분획하였다. 같은 방법으로 에틸아세테이트, 부탄올로 연속하여 각각 용매의 분획물을 얻었다.

실시예 2

Poloxamer-407 유도 고지혈증 쥐에 대한 실험

한국실험동물개발로부터 분양받아 동물사의 일정한 조건 (온도: 20± 2℃, 습도 : 40-60%, 명암: 12시간 light/dark cycle) 하에서 2주 가량 충분하게 적응시켜 사육한 체중 130 내지 150g의 Sprague-Dawley 계 웅성 흰 쥐를 사용하였고, 실험시간 24시간 전부터 물만주고 절식하였다. 이때 효소 활성의 하루 중 변동을 고려하여 실험동물을 일정시간(오전 10:00-12:00)에 치사시켰다.

흰 쥐에게 연속 2주동안 표 1에 기재된 바와 같이 매일 누룩치 메탄올 추출물, 부탄올 분획물, 클로로포름 분획물, 물 분획물과 Probucol을 1일 1회 투여하였다. 그런 다음, Poloxamer-407로 고지혈증을 유도하였다. 쥐는 Poloxamer-407 투여 24시간 후에 희생시켜 채혈하였다.

Poloxamer-407 투여 유발 고지혈 흰 쥐에 대한 효과 시료와Poloxamer-407 고지혈 유도제를 투여하지 않은 정상쥐는 혈청 트리글리세라이드와 총 콜레스테롤이 각각 93.6±10.7mg/㎗ 및 65.2±9.43mg/㎗를 나타낸 반면, Poloxamer-407을 투여한 흰 쥐는 각각 1306.04±150.2 mg/㎗ 및 793.7±86.5 mg/㎗의 측정치를 보여 매우 높은 고지혈 흰 쥐 모델이 제조되었다.

쥐의 혈청 중 트리글리세라이드와 콜레스테롤 및 HDL 콜레스테롤의 함량은 효소비색법에 의한 정량용 키트 시약(Asa Pharm. Co.)을 사용하여 측정하였고, LDL 콜레스테롤은 Friedwald의 다음과 같은 계산식에 의해 측정되었다.

LDL-콜레스테롤 = 총 콜레스테롤 - HDL-콜레스테롤 - (트리글리세라이드/5)

Poloxamer-407 유도 고지혈 흰 쥐에 대한 누룩치 추출물의 항고지혈 효과

처리	투여량 (mg/kg)	트리글리세라이드(mg/dl)	총 콜레스테롤(mg/dl)
Untreated		93.6 ±10.7^g	65.2 ±9.43^e
Poloxamer-407		1306.4±150.2^a	793.7±86.5^a,b
MeOH 추출물	100	1008.7±80.5^c,d,e	760.5±73.6^a,b
	200	943.2 ±71.8^e	690.6±53.5^b,c,d
CHCl₃ 분획물	100	1149.5±109.8^b,c	753.9±58.3^a,b,c
	200	1056.2±120.6^c,d,e	732.8±70.6^a,b,c,d
BuOH 분획물	100	983.2 ±54.2^de	720.3±35.9^a,b,c,d
	200	741.8 ±69.8^f	643.9±50.8^d,e
H₂O 분획물	100	1243.7±100.9^a,b	800.2±60.7^a
	200	1127.5±94.8^b,c,d	782.5±40.0^a,b,c
Probucol	20	1136.9±153.2^b,c,d	374.6±41.9^f

n=9, p<0.05

누룩치 메탄올 추출물, 클로로포름 분획, 부탄올 및 물 분획물을 2주간 100mg/kg과 200kg/mg 을 1일 1회 투여했을 때 혈청 트리글리세라이드 및 혈청 총 콜레스테롤의 함량 변화를 표 1에 나타내었다. 누룩치 추출물과 각각의 유기용매 분획물에서 혈청 콜레스테롤 저하효과가 고르게 나타났으며, 물 분획은 혈청 콜레스테롤 저하 효과에 관한 통계적 유의성이 인정되지 않았다. 부탄올 분획은 모든 투여군과 비교하여 큰 효과를 보였다.

실시예 3

Triton WR-1339로 고지혈증이 유도된 쥐에 대한 실험

Dominique(Dominique H, Paul H. and David NB(1991) Effect of the lipase inhibitors, Triton WR-1339 and tetrahydrolipstation on the synthesis and secretion of lipids by rat hepatocytes, FEBS Letters, 286, 186-188) 등의 방법에 준하여 실시되었다.

실시예 2에서와 동일하게 사육된 SD계 웅성 흰 쥐에게 표 2에 기재된 바와 같이 Triton WR-1339 투여 전 연속 2주 동안 매일 누룩치의 메탄올 추출물, 부탄올 분획물, 클로로포름 분획물, 물 분획물, Probucol이 1일 1회 투여되었다. Triton WR-1339 투여 24시간 전 부터 절식시킨 후 Triton WR-1339 200 mg/kg을 꼬리정맥에 주사하여 고지혈증을 유발시키고 18시간 후에 CO₂ 가스로 마취한 후 채혈하였다.

Triton WR-1339 유도 고지혈 흰 쥐에 대한 누룩치 추출물의 효과

처리	투여량(mg/kg)	트리글리세라이드 (mg/dl)	총 콜레스테롤(mg/dl)
Untreated		95.8 ±16.7^g	69.5 ±9.43^g
Triton WR-1339		749.3 ±29.7^a	200.7 ±86.5^a
MeOH 추출물	100	697.6 ±31.3^b,c	176.5 ±73.6^b,c,d,e
	200	645.5 ±23.9^d	158.9 ±53.5^c,d,e
CHCl₃ 분획물	100	738.6 ±30.5^a,b	187.8 ±60.7^a,b,c
	200	714.5 ±29.5^a,b,c	173.6 ±40.0^c,d,c
BuOH 분획물	100	673.3 ±20.2^c,d	169.2 ±35.9^c,d,c
	200	610.8 ±19.8^c	140.0 ±50.8^f
H₂O 분획물	100	720.5 ±30.7^a,b	196.5 ±58.3^a,b
	200	700.8 ±25.2^b,c	180.2 ±70.6^a,b,c
Probucol	30	701.8 ±50.3^a,b,c	96.7 ±17.2^b,c

n=9, p<0.05

Triton WR-1339로 고지혈증을 유도한 흰 쥐에서는 혈청 트리글리세라이드와 총 콜레스테롤 함량이 정상 쥐보다 현저히 높은 고콜레스테롤 혈증을 나타내었다. 표 2에 나타낸 실험결과는 Poloxamer-407로 유도한 실험에서와 같이 Triton WR-1339에 의해 고콜레스테롤 혈증이 유도되었음을 확인할 수 있다. 누룩치의 메탄올 추출물, 클로로포름 분획물, 부탄올 분획물을 2주간 100 mg/kg 및 200 mg/kg을 경구 투여한 흰 쥐의 혈청 콜레스테롤 및 트리글리세라이드 저하효과를 관찰 한 결과, 메탄올 추출물은 두 투여군에서 모두 효과를 나타내었으며 부탄올 분획물은 현저한 콜레스테롤 저하효과를 나타내었다.

실시예 4

30% 옥수수 기름으로 고지혈증이 유발된 흰 쥐에 대한 실험

Duhault(Duhault, J., Boulanger, M., Sicot, N. and Bouvier, F.(1976), A new type of hyperlipidemic agent comparative assay in rats, Atherosclerosis 23 : 63-72) 등의 방법에 준하여 실시되었고, 실험 용 쥐와 혈중 지질농도 측정은 실시예 2와 동일한 방법으로 실시되었다. 누룩치의 메탄올 추출물, 부탄올 분획물, Probucol을 2주간 경구투여하고 2시간 후에 옥수수 기름 3 g/kg을 경구 투여하였다. 옥수수 기름 투여 2시간 후에 CO₂ 가스로 마취시킨 후 복부 정중선을 따라 개복 후 대정맥에서 채혈하였다. 표 3에서 보이는 바와 같이 메탄올 추출물, 부탄올 분획물이 효과를 나타내었다.

30% 옥수수 기름 유도 고지혈 흰 쥐에 대한 누룩치 추출물의 항고지혈 효과

처리	투여량 (mg/kg)	트리글리세라이드 (mg/dl)	총콜레스테롤(mg/dl)	HDL콜레스테롤(mg/dl)	LDL콜레스테롤(mg/dl)
Untreated		105.7 ±9.452^f	72.8±7.43^a,	37.3±2.42^d	52.6±3.25^f
Controle		220.7 ±15.9^a	80.5±5.16^a	21.7±1.33^e	89.6±4.50^a
MeOH추출물	100	196.5 ±20.7^b,c	79.2±3.49^a,b	23.6±2.10^d,e	85.1±3.10^a
	200	173.2 ±9.55^c	74.6±4.36^a,b	26.8±1.16^c,d	73.8±2.47^b
BuOH분획물	100	182.8 ±10.8^b,c	77.2±6.11^a,b,	27.0±3.17^c,d	71.6±.49^b,c
	200	150.2 ±8.54^d,e	75.8±5.45^a,b	28.5±2.00^c,	68.4±1.54^c,d
Probucol	30	250.1 ± 20.5^d	70.3±8.21^b	26.4±2.52^c,d	55.2±4.11^e

n=9, p<0.05

실시예 5

식이 비만 고콜레스테롤 흰 쥐에 대한 누룩치 추출물의 항고지혈실험

고콜레스테롤 식이 유도 고지혈증을 유도하기 위해 예비실험을 실시하였다. 실험동물에 총 6주간 고콜레스테롤 식이를 먹이면서 혈중 지질을 측정한 결과 고지혈증을 확인하였다. 정상군에는 기본 식이를 6주간 먹이고, 다른 군에는 고콜레스테롤 식이를 6주간 먹여서 고콜레스테롤 흰 쥐를 유도하였다. 기본 식이와 고콜레스테롤 식이의 조성을 표 4에 기재하였다.

고콜레스테롤 식이 4주째부터 누룩치 메탄올 추출물과 부탄올 분획물을 2주간 투여하고, 마지막 날에 8시간 절식한 후 CO₂ 가스로 희생시켜 복강대정맥으로부터 채혈하였다. 혈액은 마이크로원심분리기로 원심분리하여 혈청을 -70 ℃에 냉동 보관하였다.

정상식이와 고콜레스테롤 식이의 구성

성분	정상식이(%)	고콜레스테롤 식이(%)
카제인	20	20.0
DL-메타오닌	0.3	0.3
전분	15.0	15.0
수크로즈	50.0	48.5
섬유질	5.0	5.0
옥수수기름	5.0	5.0
AIN-mineral Mixture	3.5	3.5
AIN-vitamin mixture*	1.0	1.0
Choline Bitartate	0.2	0.2
콜레스터롤	-	1.0
콜린산 나트륨	-	0.5

식이 비만 고콜레스테롤 흰 쥐에 대한 누룩치 추출물의 항고지혈 효과

처리	투여양 (mg/kg)	트리글리세라이드(mg/dl)	총 콜레스테롤 (mg/dl)	HDL 콜레스테롤(mg/dl)	LDL콜레스테롤 (mg/dl)
Untreated		93.2 ±10.4^e	79.6 ±9.55^f	39.6 ±2.48^a	49.9 ±3.26^e
Controle		273.8±31.5^a	159.4±20.3^a	20.8 ±3.10^d	151.2±18.4^a
MeOH 추출물	100	251.3±20.7^a,b	143.7±11.6^a,b	22.4±1.18^c,d	139.2±20.0^a,b
	200	210.5±18.5^c,d	131.5±12.8^b,c	24.2±4.96^c,d	100.7±12.5^c
BuOH 분획물	100	234.7±19.3^b,c	140.2±9.53^a,b,	22.9±3.17^c,d	125.4±13.3^b,
	200	180.6±16.4^d	120.6±8.57^c,d	26.8±5.10^b,c	93.5 ±1.6^c,d,
Probucol	30	241.6±33.0^a,b,c,	85.7 ±8.12^f,	25.2±2.71^c,d,	69.3 ±13.6^e,f

n=9, p<0.05

상기 표 5에서 보이는 바와 같이, 누룩치의 메탄올 추출물과 부탄올 추출물이 혈청 콜레스테롤 저하효과가 있음을 알 수 있다.

실시예 6

식이비만 유도 고지혈 흰 쥐에 대한 누룩치 추출물의 히드록시 래디칼, TBARS, SOD 활성도

실시예 5의 방법으로 얻어진 혈청에 대해 TBARS, 히드록시 래디칼 및 SOD 활성도를 측정하였다.

SOD(Superoxide dismutase) 활성의 측정은 Oyanagui의 방법에 따라 정량하였다. 혈청 100㎕ 를 시험관에 넣고 여기에 증류수 500㎕ , 시약 A(3mM 하이드록실아민/3mM 하이포크산타) 200㎕ 및 시약 B[7.5mU/ml xanthine oxidase(XOD), 0.1mM EDTA-2Na] 200㎕를 넣고 잘 혼합한 다음, 37℃ 수조에서 30분간 정치하였다. 반응액에 시약 C(설파닐린산 300 mg/16.7% 아세트산 500㎖에 용해된N-1-나프틸 에틸렌디아민) 2.0㎖를 넣어 잘 혼합하여 실온에서 20분 동안 정치한 다음 550nm에서 흡광도를 측정하여 표준검량선에 준하여 혈청 중의 SOD(superoxide dismutase)의 활성도를 측정하였다.

혈청 중의 TBARS의 함량 측정은 혈청 중 지질 퍼옥시드의 함량을 측정하는데, Yagi 등의 방법에 따라, 혈청 20㎕에 1/12N H₂SO₄ 4㎖를 가하여 혼합하고 10% phosphotungstic acid 0.5㎖를 가하여 실온에서 5분간 방치한 후, 원심분리하여 침전물인 혈청단백질만 취해서 다시 1/12N H₂SO₄ 2.0㎖와 10% phosphotungstic acid 0.3㎖를 가하여 원심 분리하였다. 침전물만을 취하여 증류수 4.0㎖와 0.67% thiobarbituric acid와 아세트산을 1:1로 혼합한 용액을 1.0㎖를 가하고 95℃에서 60분간 반응시켜 실온에서 냉각 후 n-부탄올을 5.0㎖를 첨가하여 3000rpm에서 15분간 원심분리한 후 생성된 홍색의 n-부탄올을 취해 분광형광계를 사용하여(Ex:515nm, Em:553mn)흡광도를 측정하였다. 표준용액으로 테트라에톡시프로판(tetraethoxypropane) 0.5nmole을 같은 방법으로 반응시켜 흡광도를 측정하고 다음의 수학식2에 의해 혈청 리피드 퍼옥시드 함량을 산출하였다.

혈청 TBARS = (샘플의 흡광도/표준용액의 흡광도)×25(nmole/㎖ 혈청)

히드록시 래디칼의 측정은 Kobatake 등의 방법에 따라 혈청 34.8㎕에 0.54M NaCl, 0.1M 칼슘 포스페이트 완충액(pH7.4), 10mM NaN₃, 7 mM 데옥시리보스, 5 mM 황상 암묘늄 제 1철(ferrous ammonium sulfate) 및 증류수로 333.3㎕가 되도록 첨가하고 교반기에서 잘 혼합하여 37℃에서 15분간 정치하였다. 혈청 67㎕를 취하고 여기에 8.1% 소듐 도데실 설페이트 75㎕, 20% 아세트산 500㎕ 및 증류수 25㎕를 넣어 혼합한 다음, 여기에 다시 1.2% thiobarbituric acid 333㎕를 가하여 항온 수조에서 30분간 가열하였다. 실온에서 냉각한 다음 700G에서 5분간 원심분리하여 얻은 상층액을 파장 532nm에서 흡광도를 측정하여 표준검량선에 의하여 히드록시 래디칼(nmole/mg protein)을 정량하였다.

식이 비만 유도 고콜레스테롤 흰 쥐에 대한 누룩치 추출물의 혈액내 TBARS, 히드록시 래디칼 및 SOD 활성에 대한 효과

처리	투여량 (mg/kg)	TBARS (MDA nmole/ml)	히드록시래디칼 (nmole/mg protein)	SOD (U/mL)
Untreated		7.2 ±1.20^d	2.51 ±0.97^c	3.96 ±0.20^a
Control		12.43±2.59^a	6.48 ±1.19^a	2.00 ±0.40^a
MeOH 추출물	100	12.0 ±1.46^a,b	6.23 ±1.10^a	2.38 ±0.37^c,d
	200	10.6 ±1.30^a,b,c	5.33 ±0.80^a,b	2.65 ±0.25^c
BuOH 분획물	100	11.8 ±1.28^a,b	6.04 ±0.99^a	2.56 ±0.4^c
	200	9.4 ±1.59^b,c,d	4.92 ±0.76^a,b	2.78 ±0.23^b,c
Probucol	30	7.5 ±2.11^d	3.56 ±0.97^c,d	3.56 ±0.48^a,b

n=9, p<0.05

표 6에서 볼 수 있는 바와 같이, 누룩치의 메탄올 추출물, 부탄올 분획물이 효과가 있음을 알 수 있다.

실시예 7

부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ) 의 단리

실시예 1에서 얻어진 부탄올 분획물을 실리카 겔 크로마토그래피 및 ODS 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)를 단리하였고, 이를 표준품 시료와 융점, 선광도 및 NMR 스펙트럼을 비교하여 동일함을 확인하였다.

부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ): 무정형의 고체, [α]_D ²⁵+54.2 (c=0.99, MeOH), FAB-MS (positive) : m/z 965.6 [M + Na]⁺, ¹H-NMR (pyridine -d₅) 과 ¹³C-NMR(pyridine-d₅,125.5MHz) 의 측정치가 문헌과 일치하였다.

실시예 8

부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)의 항비만, 항고질혈증 억제 효과

부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)를 실시예 2 내지 실시예 5에 따른 Poloxamer-407 유도 고지혈 흰 쥐, Triton WR-1339 유도 고지혈 흰 쥐, 30% 옥수수 기름 투여 고지혈 흰 쥐, 식이성 비만 유도 고콜레스테롤 흰 쥐 각각에 20mg/kg과 30mg/kg씩 경구투여하였다. 그리고 각각의 실험군에 대해 혈중 지질의 농도를 측정하고 식이 비만 유도 고콜레스테롤 흰 쥐에 대해서는 TBARS, 히드록시 래디칼, SOD의 활성을 추가로 측정하였다. 그 결과를 도 1 내지 도 5에 나타내었다.

Poloxamer-407 유도 흰 쥐에 대한 부들레자사포닌 Ⅳ (buddlejasaponin Ⅳ)의 투여결과는 도 1에 나타내었다. 이 경우 트리글리세라이드는 46.4%(20 mg/kg 투여군), 54.3%(30mg/kg 투여군)의 감소율을 보였고 총 콜레스테롤은 15.6%(20 mg/kg 투여군), 33.4%(30 mg/kg 투여군)의 감소율을 보였다 (도 1).

Triton WR-1339로 고지혈증이 유도 된 흰 쥐에 대한 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)의 투여결과는 도 2에 나타내었다. 이 경우 트리글리세라이드는 17.1%(20 mg/kg 투여군), 31.8%(30 mg/kg 투여군)의 감소율을 보였고, 총 콜레스테롤은 32.7%(20 mg/kg 투여군), 60.4%(30 mg/kg 투여군)의 감소율을 나타내었다 (도 2).

30% 옥수수 기름 처리 쥐 및 고콜레스테롤 식이 쥐는 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤, HDL-콜레스테롤 양이 감소되었다. (도 3과 도 4).

30% 옥수수 기름 처리했을 때 트리글리세라이드의 큰 증가가 관찰되었으며, 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤에는 그 영향이 낮게 관찰되었다. 이 경우에 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)를 투여하여 트리글리세라이드 함량을 49.8%(20 mg/kg 투여군), 72.3%(30 mg/kg 투여군)로 감소시켜 높은 감소율을 보였으며, 총콜레스테롤은 40.8%(20 mg/kg 투여군), 139.0%(30 mg/kg 투여군)의 감소율을, HDL-콜레스테롤은 52.6%(20 mg/kg 투여군), 72.7%(30 mg/kg 투여군)의 증가율을 보였다. LDL-콜레스테롤은 64.6%(20 mg/kg), 77.6%(30 mg/kg)의 감소율을 보였다 (도 3).

식이성 고지혈 유도 흰 쥐의 경우에 정상쥐에 비해 혈청 트리글리세라이드, 총 콜레스테롤, LDL-콜레스테롤이 매우 크게 증가하였으며, HDL-콜레스테롤은 크게 감소하였다 (도 4). 부들레자사포닌 Ⅳ의 투여에서는 혈청 트리글리세라이드가 49.8%(20 mg/kg 투여군), 72.3%(30 mg/kg 투여군)의 감소율을, 혈청 총 콜레스테롤이 62.8%(20 mg/kg 투여군). 86.7%(30 mg/kg 투여군)의 감소율을, LDL-콜레스테롤이 59.6%(20 mg/kg 투여군), 73.1%(30 mg/kg 투여군)의 감소율을 나타낸 반면, 혈청 HDL-콜레스테롤이 36.2%(20 mg/kg 투여군), 59.0%(30 mg/kg 투여군)의 증가하였다 (도 4).

한편 식이성 고지혈 흰 쥐에서 산화적 스트레스에 대한 효과를 측정하기 위한 TBARS, 히드록시 래디칼 함량 및 SOD 활성을 측정한 결과, 혈청 TBARS 와 히드록시 래디칼은 감소하고 SOD 활성은 크게 증가하였다 (도 5). 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)를 투여하였을 때 혈청 TBARS가 25.0%(20 mg/kg 투여군), 50%(30 mg/kg 투여군)의 감소율, 히드록시 래디칼이 32.0%(20 mg/kg 투여군), 54.9%(30 mg/kg 투여군)의 감소율을 보였으며 SOD 활성은 40.8%(20 mg/kg 투여군), 61.7%(30 mg/kg 투여군)의 증가율을 보임으로써 체내 산화적 스트레스가 크게 감소되었음을 알수 있다 (도 5).

본 발명에 따른 누룩치 메탄올 추출물, 이의 유기용매 분획물 및 이로부터 단리한 부들레자사포닌 Ⅳ(buddlejasaponin Ⅳ)는 LDL-콜레스테롤, 트리글리세라이드, TBARS(유해산소잔류물), 히드록시 래디칼을 감소시키고, SOD(superoxide dismutase)의 활성을 증가시킨다.

본 발명에 따른 누룩치 추출물은 상기한 작용 효과를 이용하여 트리글리세라이드 및/또는 콜레스테롤의 함량을 낮출 수 있는 물질로써 항고지혈증 또는 항비만 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명에 의한 누룩치 추출물은 고지혈증과 비만을 효과적으로 억제하여 고지혈증과 비만으로 유발되는 합병증의 예방 및 치료에 적용될 수 있다.

Claims

누룩치의 유기용매 추출물을 유효성분으로 포함하는 항비만 또는 항고지혈증 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 유기용매는 메탄올, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올로 구성되는 군에서 선택된 1이상의 유기용매인 것인 항비만 또는 항고지혈증 조성물.
삭제
제 1항에 있어서, 상기 누룩치의 유기용매 추출물은 누룩치의 메탄올 추출물을 부탄올로 더 추출하여 얻은 누룩치의 부탄올 분획물인 것을 특징으로 하는 항비만 또는 항고지혈증 조성물.
부들레자사포닌 Ⅳ를 유효성분으로 포함하는 항비만 또는 항고지혈증 조성 물.
삭제
제 5항에 있어서, 상기 부들레자사포닌 Ⅳ는 누룩치로부터 추출·분리하여 얻은 것임을 특징으로 하는 항비만 또는 항고지혈증 조성물.