KR20000000265A - 콜레라 독소 ｂ 소단위로 표면 수식된 마이크로스피어 - Google Patents

Abstract

본 발명은 콜레라 독소 B 소단위체 (Cholera toxin B subunit, CTB)가 표면에 수식된 마이크로스피어 (microsphere)에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명에서는 마이크로스피어에 PEG 링커 (polyethylene glycol linker)를 접합하거나 접합하지 않은 형태에 CTB를 다시 접합함으로써 CTB-마이크로스피어 또는 CTB-PEG-마이크로스피어를 제조하고 이와 같이 제조된 마이크로스피어가 마우스 소장에서 흡수 효율이 탁월함을 확인한다. 따라서, 본 발명의 CTB가 접합된 마이크로스피어는 항원 등 생리활성 물질의 경구 투여용 제형으로서 유용하다.

Description

콜레라 독소 Ｂ 소단위로 표면 수식된 마이크로스피어{Surface modified microspheres with cholera toxin B subunit}

본 발명은 콜레라 독소 B 소단위체 (Cholera toxin B subunit, 이하 "CTB"로 약칭함)가 표면에 수식된 마이크로스피어 (microsphere)에 관한 것으로, 보다 상세하게는 폴리스티렌 (PS) 등의 마이크로스피어에 PEG (polyethylene glycol) 등의 링커 (linker)를 접합하거나 접합하지 않은 형태에 CTB를 다시 접합함으로써 제조된 CTB-마이크로스피어 또는 CTB-PEG-마이크로스피어; 그 제조 방법 및 용도에 관한 것이다.

경구 투여법은 약제와 백신 등의 의약품을 투여하는 방법 중 하나로서, 투여가 용이하고, 투여 시 수반되는 고통이 적으며, 숙련된 인력이 불필요하고, 비용 면에서 효율적이라는 점 등의 장점이 있어 가장 바람직한 투여법이다 (Fasano, Trends in Biotech., 16: 152-157, 1998). 그러나, 동물의 소장을 통해 흡수가 어려운 약품이 다수 존재하는 데다가, 단백질 및 펩타이드 제제를 경구 투여할 경우 위장에서 단백질 분해효소의 공격을 받고 산성화 조건에서 활성을 잃으므로 흡수 가능한 지점까지 전달될 수 없어 경구 투여가 불가능하다. 따라서, 단백질 제제가 위를 통과하고 장세포를 경유하여 전신 순환계 또는 표적 기관까지 전달될 수 있도록 만들어진 경구 단백질 제형의 개발이 요구되어 왔다.

마이크로스피어 형태의 단백질은 효소에 의한 분해나 산성 조건에서의 분해로부터 효율적으로 보호될 수 있음이 알려져 있을 뿐 아니라, 분자량이 큰 물질의 소장에서의 흡수 가능성을 향상시키기 위해서 상기 전달 시스템을 이용하는 것이 바람직함 또한 알려져 있다.

최근 점막 백신 (mucosal vaccine)의 하나인 경구 투여형 백신 (oral vaccine)에 관심이 집중되고 있다. 우리 신체 중 점막은 질병이 흔히 발생하는 장소이며, 소화기, 호흡기 및 비뇨생식기의 전염병을 일으키는 거의 모든 바이러스성, 세균성 및 기생성 병원체는 점막의 커다란 표면 지역 (400 m²)을 통해 침입하거나 감염된다 (Mestesky 등, J. Control. Release, 48: 243-257, 1997).

점막 관련 림프 조직 (mucosa-associated lymphoid tissue)은 주요한 항원 집합 장소임과 동시에 특이적인 작동체 세포 (effector cells) 및 기억 세포 (memory cells)의 주요한 생성 장소이기도 하다. 잘 알려진 점막 관련 림프 조직의 예로는 위장관 관련 림프 조직 (gut-associated lymphoid tissue, GALT), 기관지 관련 림프조직 (bronchus-associated lymphoid tissue, BALT)가 있다. 이중에서 GALT는 페이어 패치 (Peyer's patches; PP); 장간막 림프절 (mesenteric lymph nodes; MLN); 및 점막 고유층 (lamina propria)과 소장 상피에 걸쳐 분산되어 있는 수많은 림프세포로 구성된다. 페이어 패치는 항원 자극을 일으키는 장소로서, 돔 모양의 지역이 난포연합성 상피세포 (M 세포)로 덮혀 있다.

M 세포는 이웃한 흡수 장세포와 다음과 같이 구별된다: M 세포는 미세한 주름을 가진 작은 부정형 미세융모 (microvilli)를 보유하고 있고, 뮤신과 유사한 분자인 얇은 글라이코칼릭스 (glycocalyx)로 덮혀 있다. 반면, 흡수 장세포의 경우 그 정단 표면 (apical surface)이 딱딱하고 조밀한 미세융모에 의해 형성되어 있으며, 분산 억제벽과 미세소화환경을 제공하는 두꺼운 글라이코칼릭스로 덮혀 있다. M 세포의 정단 세포질에는 수많은 수송 소포 (transport vesicle)가 존재하며 측단 막은 함입되어 상피내 함입부 (intraepitherial pocket)를 형성한다 (도 1 참조). 상기 상피내 함입부는 고분자 물질, 미생물, 바이러스, 마이크로스피어 등의 엔도사이토시스 경로 및 수송 경로를 제공한다. 수송된 분자는 항원을 보유한 조세포 (antigen-presenting accessory cells) 및 림프 세포에 의해서 가공되어 숙주의 국소 면역반응을 자극하는데, 상기 국소 면역반응은 점막에서의 면역반응으로 M 세포를 통한 항원의 수송에 의존한다 (Wolf and Bye, Ann. Rev. Med., 35: 95-112, 1984; Meutra 등, Ann. Rev. Immunol., 14: 275-300, 1996). 따라서, M 세포를 통한 입자상 시스템의 트랜스사이토시스 (transcytosis) 경로는 경구 투여형 백신이 장으로 흡수될 수 있는 경로로 유용하다. 그러나 경구 백신으로 사용하기위하여서는 단백질, 폴리펩티드, 다당류등이 대부분인 항원을 불활성화되지 않도록 하여 소장의 흡수부위까지 전달하는 투여 방법이 요구된다.

경구 투여형 마이크로스피어의 운명을 결정하는 요소는 여러 가지가 있다. 먼저, 마이크로스피어의 크기는 소화관 내부의 페이어 패치 M 세포를 통한 흡수에 영향을 준다. 점유된 마이크로스피어의 분포 또한 마이크로스피어의 크기에 의존하며, 전신성 면역 및 점막성 면역의 유도는 경구 투여된 약품이 전달된 후 부수적으로 또는 선택적으로 일어날 수 있다. 작은 크기 (500 nm 이하)의 마이크로스피어는 큰 마이크로스피어에 비해 보다 효율적으로 흡수된다. 생분해성 및 생체친화성 폴리머인 폴리 DL-락티드-코-글리콜리드 (poly DL-lactide-co-glycolide, 이하 "PLGA"로 약칭함)는 인체를 대상으로 한 경구 투여에서 가장 흔히 사용되고 있다.

PLGA 마이크로스피어의 크기에 의해, 마이크로스피어가 페이어 패치 및 기타 점막 관련 림프 조직 내로 흡수될 확률과 흡수 후 생물학적 운명이 결정된다고 알려져 있다 (Eldridge, J. Control Release, 11: 205-214, 1990; Mestecky 등, J. Control Release, 28: 131-141, 1994). 직경 약 10㎛ 이상의 PLGA 마이크로스피어는 페이어 패치로 전달될 수 없다고 알려져 있으며, 직경 약 5㎛ 내지 10㎛ 크기의 PLGA 마이크로스피어는 페이어 패치에 남아 있고 그보다 더 작은 것은 페이어 패치로부터 장간막 림프절, 비장 및 기타 심부 조직 (간장, 신장 등)으로 이동할 수 있음이 알려져 있다. 또한 0.05㎛ 내지 1㎛ 크기의 폴리스티렌 (PS) 마이크로스피어는 페이어 패치로부터 간장, 비장, 혈액 및 골수 조직으로 이동할 수 있으나, 3㎛ 폴리스티렌 마이크로스피어는 이동이 불가능함도 알려져 있다 (Jani 등, J. Pharm. Pharmacol., 41: 809-812, 1989). 상기 결과들은 경구 투여되는 마이크로스피어에 싸여 있는 항원이 유발하는 면역 반응의 유형이 마이크로스피어의 크기에 의해 결정된다는 사실을 암시한다. 페이어 패치에 남은 항원은 점막 면역 반응을 유도하고 페이어 패치에서 비장으로 이동한 항원은 전신 면역 반응과 분비형 (secretory) IgA의 분비를 유도한다.

마이크로스피어의 소수성 또한 페이어 패치로의 흡수에 영향을 준다. 폴리스티렌, 폴리(메틸 메타크릴레이트) 및 폴리(히드록시부티레이트)와 같이 상대적으로 소수성인 중합체는 쉽게 흡수된다. 예외적으로, 에틸 셀룰로즈의 경우 흡수 효율은 마이크로스피어 표면의 상대적 소수성에 관련된다고 밝혀져 있다. 10㎛ 이상의 마이크로스피어의 흡수를 결정하는 주요 요인은 중합체의 소수성이다. 친수성 계면활성제인 폴록사머™ (poloxamer™)로 코팅된 폴리스티렌 마이크로스피어는 소장에서 잘 흡수되지 않는데, 이는 코팅된 폴록사머가 소장에서 마이크로스피어의 흡수를 억제하기 때문인 것으로 보인다 (Florence, J. Control Release, 36: 39-46, 1995). 또한, 음전하로 하전된 카르복시화 폴리스티렌 마이크로스피어는 전기적으로 중성인 마이크로스피어보다 흡수가 잘 되지 않는다 (Jani, J. Pharm. Pharmacol., 41: 809-812, 1989).

마이크로스피어의 M 세포 결합은 세포와 마이크로스피어의 표면 특성에 의존한다. 따라서, 표면 수식 (surface modification)으로 마이크로스피어의 전달 효율을 향상시킬 수 있는 가능성이 제시되었다. 표면 수식을 이용한 접근 방법 중, M 세포에 대한 결합 특이성을 갖는 분자를 마이크로스피어에 접합시키는 방법이 있다. 이때에는 어떤 단백질로 마이크로스피어를 코팅하는지에 따라, M 세포로의 흡수 효율이 달라졌다. 스미스 등 (Smith 등, Exp. Physiol., 80: 735-743, 1995)에 의하면, 마이크로스피어에 코팅된 단백질의 M 세포 결합 특이성은 마우스 실험에서의 경우 bGH (우성장호르몬), bSA (우혈청알부민), hIgG (사람 면역글로불린 G) 순서로 증가하며, 마우스와 래트에서의 실험의 경우 bGH 보다 bGH 항체의 상기 결합 특이성이 더 높았다. 또한, M 세포 특이적 IgG 및 IgA는 마이크로스피어가 M 세포에 결합하여 들어가는 과정을 촉진할 수 있었다. 1㎛ 폴리스티렌 마이크로스피어에 토끼 M 세포에 대한 특이적 모노클로날 항체를 붙이면 토끼의 페이어 패치 내로의 흡수가 촉진된 반면, 비특이적인 모노클로날 항체를 붙일 경우 흡수가 촉진되지 않았다 (Pappo 등, Immunology, 73: 277-280, 1991; Ermak and Giannasca, Adv. Drug Del. Rev., 34: 261-283, 1998). 한편, 마이크로스피어의 표면에 렉틴 (lectin)을 결합시키면 림프 조직 뿐 아니라 흡수 세포 속으로의 마이크로스피어 흡수가 유도되지만, 소장 M 세포에 대한 결합 특성은 결합된 렉틴의 유형과 기원에 따라 상이하였다 (Clark 등, Cell Tissue Res., 282: 455-461, 1995; Jepson 등, J. Anat., 189: 507-516, 1996). 최근에 사용되는 M 세포 특이적 리간드로는, 예르시니아 (Yershinia) 속, 시겔라 (Shigella) 속, 살모넬라 (Salmonella) 속 등의 병원성 세균의 부착 분자인 인베이신 (invasin) 단백질이 있다 (Clark 등, Infec. Immun., 66: 1237-1243, 1998).

경구 투여되는 항원의 면역유발능을 강화하기 위한 전략으로서 콜레라 독소 (CT) 또는 콜레라 독소의 비독성 결합 B 소단위 (cholera toxin B subunit, 이하 "CTB"로 약칭함)를 상기 경구 투여되는 항원에 연결하는 방법이 있으며, 이는 점막 면역 보조제 (adjuvant of mucosal immunity)로 알려져 있다 (Czerkinsky, Infect. Immun., 57: 1072-1077, 1995). 또한, 독성이 없는 콜레라 독소 돌연변이체를 이용하더라도 점막 보조제 활성을 유지할 수 있었다 (Douce 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1644-1648, 1995). 한편, 항원을 포함하는 CTB-접합성 리포좀 (CTB-conjugated liposome)을 경구 투여하였을 때, 상기 리포좀이 전신성 면역 반응 뿐 아니라 점막성 면역 반응도 효과적으로 유도하였다는 사실이 알려져 있다 (Harokopakis 등, J. Immunol. Method, 185: 31-42, 1995; Harokopakis 등, Infect. Immunity, 66: 4299-4304, 1998). 이러한 CTB의 점막 면역반응 보조제로의 활성은 GM₁갱글리오사이드와의 특이적 결합에 의한 것으로 알려져있다.

CTB는 GM₁갱글리오사이드 (ganglioside)에 특이적으로 결합할 수 있지만 뮤신 (mucin)에는 결합하지 못한다. CTB가 당지질 수용체에 결합하는 능력은 M 세포에 특이적인 것은 아닌데, 그 이유는 GM₁갱글리오사이드가 모든 소장 상피세포의 정단 세포막 (apical membrane)에 존재하기 때문이다. 그러나, 전술한 것처럼 M 세포의 표면은 형태학적으로 흡수 세포의 표면과 다르다. 따라서, CTB가 M 세포의 GM₁갱글리오사이드 결합할 확률이 흡수세포에서보다 높고, 또한 주변의 미세한 형태 차이에 의해서도 그 흡수효율이 변화될 수 있다.

본 발명자들은 설포-SMPB로 변형된 CTB를 마이크로스피어에 직접 수식하거나, 폴리에틸렌 글라이콜 (PEG) 링커를 사용하여 마이크로스피어에 수식하면, 경구 투여 시 소장 내의 흡수 효과가 뛰어나며 특히 페이어 패치로의 흡수가 뛰어나 효과적인 경구용 백신 등의 전달 시스템으로 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 CTB로 표면이 수식되어 경구 투여 시 소장 내 흡수 효율이 우수한 마이크로스피어를 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 경구 투여 시 소장의 페이어 패치 내부에 효율적으로 흡수되어 경구 투여용 백신의 재료로 유용하게 사용될 수 있는 마이크로스피어를 제공하는 것이다.

도 1은 M 세포 및 소장 흡수세포 (absorptive enterocytes)를 보여주고,

M: M 세포; A: 흡수장세포

도 2는 본 발명의 리간드가 접합된 PS 마이크로스피어 (ligand-conjugated polystyrene microsphere) 6종을 개략적으로 나타낸 것이고,

도 3은 카르복시화 PS 마이크로스피어에 t-Boc-NH-PEG-NH₂를 접합시키는 과정을 도식적으로 나타낸 것이고,

도 4는 설포-LC-SPDP를 이용하여 PEG-PS 마이크로스피어를 수식하는 과정을 도식적으로 나타낸 것이고,

도 5는 설포-SMPB를 이용하여 콜레라 독소 B 소단위 (CTB)를 변형하는 과정을 도식적으로 나타낸 것이고,

도 6은 TPH-PEG-PS 마이크로스피어와 CTB-MPB를 접합시키는 과정을 도식적으로 나타낸 것이고,

도 7은 FITC가 접합된 1 ㎛ 크기의 카르복시화 PS 마이크로스피어 대비 FITC 형광강도의 표준 곡선을 그린 그래프이고,

도 8은 FITC가 접합된 1 ㎛ 크기의 PS 마이크로스피어의 주사전자현미경 사진이고,

상단: TFA 처리 전의 카르복시화 PS 마이크로스피어;

하단: TFA 처리 후의 PEG-PS 마이크로스피어,

도 9a, 9b는 GM₁갱글리오사이드 (ganglioside)에 대한 CTB-MPB의 결합능에 미치는 CTB : 설포-SMPB의 몰비 및 반응 시간의 효과를 보여주는 그래프이고,

●: 몰비 1:10로 반응시킨 경우의 결합능;

▼: 몰비 1:50로 반응시킨 경우의 결합능;

■: 몰비 1:100로 반응시킨 경우의 결합능;

◆: 변형되지 않은 CTB의 결합능,

도 10은 설포-SMPB로 우혈청알부민 (BSA)를 변형시켜 제조한 BSA-MPB 및 변형되지 않은 BSA로 SDS-PAGE 분석을 수행한 결과를 나타내고,

레인 M: 분자량 마커;

레인 1: 변형되지 않은 BSA;

레인 2: 변형되지 않은 BSA 및 변형된 BSA-MPB의 혼합물;

레인 3: 변형된 BSA-MPB;

도 11은 설포-SMPB로 CTB를 변형시켜 제조한 CTB-MPB 및 변형되지 않은 CTB로 SDS-PAGE 분석을 수행한 결과를 나타내고,

레인 M: 분자량 마커;

레인 1: 변형되지 않은 CTB;

레인 2: 변형되지 않은 CTB 및 변형된 CTB-MPB (몰비 1:10)의 혼합물;

레인 3: 변형된 CTB-MPB (몰비 1:10);

레인 3: 변형된 CTB-MPB (몰비 1:50),

도 12는 본 발명의 리간드가 접합된 PS 마이크로스피어 6종에 대해 소장에서의 흡수량을 보여주는 그래프이다.

상단: 소장의 흡수세포 (absorptive cells)에서의 흡수량;

하단: 페이어 패치 (Peyer's patches)에서의 흡수량

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서는 CTB 또는 그 변이형이 표면에 수식된 마이크로스피어를 제공한다.

상기 "CTB (cholera toxin B subunit)"의 예로는 진뱅크 수탁번호 (GenBank accesion No.) BAA06289에 기재된 단백질을 들 수 있으며, 그 "변이형"이란 상기 CTB 단백질에 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입을 일으킨 단백질로서, GM₁갱글리오사이드 (ganglioside)에 대한 결합 활성을 야생형 대비 50% 이상 유지하는 단백질로 정의된다. 상기 CTB 및 그 변이형에 대해 기술하는 참고 문헌의 예는 Czerkinsky, Infect. Immun., 57: 1072-1077, 1995; Douce 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1644-1648, 1995; Harokopakis 등, J. Immunol. Method, 185: 31-42, 1995; Harokopakis 등, Infect. Immunity, 66: 4299-4304, 1998 등이 있다.

상기 "마이크로스피어"란, 수 마이크로미터의 직경을 갖는 구형 입자로서, 마이크로스피어 재질로는 전분 (starch), 덱스트란 (dextran), 풀루란 (puluran), 키토산 (chitosan), 알긴산 (alginate), 셀룰로오스 (cellulose), 젤라틴 (gelatin), 알부민 (albumin), 폴리비닐알코올 (poly vinyl alcohol), 폴리메틸메타크릴레이트 (polymethylmethacrylate), 폴리스티렌 (polystyrene), 폴리이미도카보네이트 (polyimidocarbonate), 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone), 폴리(DL-락타이드-코-글리콜라이드) (poly(DL-lactide-co-glycolide)), 폴리오르소에스테르 (polyorthoesters), 폴리언하이드라이드 (polyanhydride), 폴리포스파진 (polyphosphazene) 등을 이용할 수 있으나, 특히 전분 (starch), 덱스트란 (dextran), 풀루란 (pulluran), 키토산 (chitosan), 알긴산 (alginate), 셀룰로오스 (cellulose), 젤라틴 (gelatin), 알부민 (albumin), 폴리(DL-락타이드-코-글리콜라이드) (poly(DL-lactide-co-glycolide)), 폴리오르소에스테르 (polyorthoesters), 폴리언하이드라이드 (polyanhydride), 폴리포스파진 (polyphosphazene) 등의 생분해성 고분자를 사용하면 활성성분의 용출이 끝난 후 생체내에서 스스로 분해되어 소실될 수 있으므로 바람직하다. 본 발명의 실시예에서는 폴리스티렌 (PS) 마이크로스피어를 이용하였다.

상기 마이크로스피어의 크기는 약 0.5 내지 5 ㎛의 크기인 것이 바람직하며, 본 발명의 실시예에서는 1 ㎛ 크기를 주로 사용하였다. 마이크로스피어의 크기가 5 ㎛ 를 초과하면 장내에서 흡수가 되지 않는 것으로 알려져 있으며, 0.5 ㎛ 미만의 것은 세포 표면의 수용체로의 효과적인 접근이 어려우므로, 가장 적절한 표면 수식의 효과를 얻고 흡수가 용이한 마이크로스피어를 얻기 위해서는 5 ㎛ 크기의 마이크로스피어를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명이 제공하는 상기 마이크로스피어의 표면에 수식된 CTB는 마이크로스피어에 직접 접합될 수도 있으나 ("CTB-마이크로스피어"), PEG 링커 (polyethylene glycol linker)를 매개하여 마이크로스피어에 접합될 수도 있다 ("CTB-PEG-마이크로스피어"). 이와 같이 PEG 링커를 이용하는 경우 페이어 패치 (Peyer's patches)에의 접근가능성을 높임으로 우세적으로 흡수될 수 있으므로, 경구 투여용 백신 등의 재료로는 상기 CTB-PEG-마이크로스피어를 사용하는 것이 바람직하다. 도 2는 본 발명에서 제조된 6가지 상이한 리간드-접합성 1 ㎛ PS 마이크로스피어를 보여주고 있다.

상기 PEG 링커에 사용되는 PEG는 공지의 종류를 모두 사용할 수 있는데, 특히 바람직한 것으로는 분자량이 3,000-4,000 인 것이 바람직하며, 본 발명의 실시예에는 분자량 3400 크기의 PEG를 사용하였다. 장내 흡수 가능한 마이크로스피어의 크기와 비교하여 링커로 사용하는 PEG의 분자량이 너무 큰 경우 마이크로스피어의 표면 상태나 크기에 영향을 줄 수 있으며, 너무 작을 경우에는 말단에 결합된 CTB에 대한 스페이서 (spacer)로서의 작용성이 적으므로 3,000 내지 4,000의 분자량을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 실시예에서 사용된 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)은 양 말단에 두 개의 아미노기가 존재하는 것(H₂N-PEG-NH₂)으로, 특히 그 중 하나의 아미노기가 t-Boc 기로 보호되어 있는 형태의 PEG (t-Boc-NH-PEG-NH₂)를 사용하였다. 이와 같이 t-Boc 기를 이용하여 한쪽 아미노기를 보호하면, H₂N-PEG-NH₂를 사용할 때 발생할 수 있는 마이크로스피어 간의 접합을 억제할 수 있어 바람직하다.

또한 본 발명에서 CTB-PEG-PS 마이크로스피어를 제조하는 방법으로는, PEG을 마이크로스피어에 접합시키고 (도 3 참조); 설포-LC-SPDP와 PEG-PS 마이크로스피어를 반응시켜 TPH-PEG-PS 마이크로스피어를 제조하는 한편 (도 4 참조); 설포-SMPB를 이용하여 CTB를 변형시키고 (도 5 참조); 변형된 CTB와 상기 TPH-PEG-PS 마이크로스피어를 접합하여 (도 6 참조) CTB-PEG-PS 마이크로스피어를 제조하였다. 이때, 상기 CTB와 설포-SMPB의 반응에서 그 몰비는 약 1:10으로 하고 반응 시간은 약 2시간 이하로 하는 것이 바람직한데, 그 이유는 이와 같은 반응 조건에서 변형된 CTB가 GM₁갱글리오사이드에 대한 결합 활성에 있어서 가장 천연형 CTB와 유사하기 때문이다.

상기 마이크로스피어의 표면에는 FITC (fluoroscein isothiocyanate) 등과 같은 형광물질을 접합시킬 수 있다. 상기 형광물질은 마이크로스피어의 추적 등에 유용한데, 본 발명의 실시예 및 비교예에서 제조된 마이크로스피어에는 FITC를 접합하여 마이크로스피어의 흡수율 등을 조사하였다.

또한, 본 발명은 상기 마이크로스피어에 유효성분을 함유한 경구 투여용 제제 및 경구 투여용 백신을 제공한다.

상기 마이크로스피어는 소장의 흡수세포 (absorptive cells) 및 페이어 패치에 대한 흡수 효율에 있어 탁월하다 (도 12 및 표 2 참조). 따라서, 상기 마이크로스피어를 경구 투여형 백신, 경구 투여형 제제 등으로 사용할 수 있음이 명백하다.

상기 경구 투여형 백신 및 경구 투여형 제제의 유효 성분에 있어 제한은 없으나, 통상의 방법으로 경구 투여하면 쉽게 활성을 잃거나 분해되기 쉬운 물질, 또는 장에서의 흡수 효율이 좋지 않은 물질이 유효 성분으로 바람직하게 사용된다. 상기 물질을 본 발명에서는 "생리활성 물질"로 정의하기로 한다. 생리활성 물질의 예로는, 생체 주요 구성 요소인 단백질, 폴리펩타이드, 다당류, 지질, 핵산 등의 중합체 뿐만 아니라, 다양한 종류의 항원과 소장내의 흡수효율이 좋지 않은 단분자 물질이 있다. 여기에서 "항원"이란 통상의 백신에서 유효 성분으로 사용되는 물질로서, 인간 또는 동물에서 전신 면역반응 또는 국소 면역반응을 유발할 수 있는 물질을 말한다.

상기 생리활성 물질은 본 발명의 CTB가 접합된 마이크로스피어의 내부 또는 표면에 포함시켜서 경구 투여 시 소화 작용으로부터 보호될 수 있다. 또한, 상기 생리활성 물질은 한 종류 이상 병용하여 사용할 수 있다.

상기 경구 투여용 제제 또는 경구 투여용 백신의 유효량은 마이크로스피어에 포함된 생리활성 물질에 의존하여 결정된다.

또한, 본 발명은 CTB로 표면을 수식한 마이크로스피어를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 마이크로스피어 중 CTB를 직접 표면에 접합시킨 마이크로스피어는 하기 단계들에 의해 제조될 수 있다.

1) 마이크로스피어 표면에 존재하는 카르복시기의 활성화 단계; 및

2) 단계 1)의 활성화된 카르복시기에 CTB를 접합하는 단계.

또한, 상기 마이크로스피어 중 PEG를 통해 CTB를 표면에 접합시킨 마이크로스피어는 하기 단계들에 의해 제조될 수 있다.

1) PEG를 마이크로스피어에 접합시켜 PEG-마이크로스피어를 제조하는 단계;

2) 설포-LC-SPDP와 상기 단계 1)의 PEG-마이크로스피어를 접합시켜 TPH-PEG-마이크로스피어를 제조하는 단계;

3) 설포-SMPB를 이용하여 CTB를 변형시키는 단계; 및

4) 변형된 CTB와 상기 TPH-PEG-마이크로스피어를 접합하여 CTB-PEG-마이크로스피어를 제조하는 단계.

상기 단계 3)에서 CTB 대비 설포-SMPB의 몰비는 약 1:10으로 하고 반응 시간은 약 2시간 이하로 하는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> CTB-PS 마이크로스피어의 제조

FITC 카르복시화 PS 마이크로스피어에 단백질을 접합시키기 위해서 카르보디이미드 결합 방법 (carbodiimide coupling method)을 이용하였다.

구체적으로, 플루오로신 이소티오시안산염 (fluoroscein isothiocyanate; FITC)이 공유결합으로 연결된 단분산 카르복시화 PS 마이크로스피어 (monodisperse carboxylated polystyrene microsphere, 직경 1 ㎛)는 폴리사이언스사 (Polyscience Inc., 미국)로부터 현탁액 형태로 구입하였으며, PS 마이크로스피어의 특성은 표 1에 나타나 있다. 상기 FITC 카르복시화 PS 마이크로스피어를 2.7% (w/v) 포함하는 농축 현탁액 50 ㎕를 0.1 M MES ([morpholino]ethanesulfonic acid, pH 4.5) 용액에 세척하였다. FITC 카르복시화 PS 마이크로스피어의 카르복시기를 활성화시키기 위해 0.2 M EDC [1-Ethyl-1,3-(3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide; Pierce 화학, 미국] 100 ㎕를 가하고 pH 4.5, 상온에서 두 시간동안 반응시켰다. 이 반응액을 20,000g에서 30분 간 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 100 ㎍의 CTB (List Biological Inc., 미국)를 0.1 M MES 용액에 1 ㎎/㎖의 농도로 녹여 EDC로 활성화시킨 FITC PS 마이크로스피어에 가한 다음 상온에서 2 시간동안 서서히 교반하였다. 반응이 종결된 후, 상기 반응액을 20,000g에서 30분동안 원심분리하여 상등액과 분리하였다. 이와 같이 단백질이 직접 접합된 PS 마이크로스피어를 PBS (인산완충액; 0.20 g/ℓ KCl, 0.20 g/ℓ KH₂PO₄, 8.00 g/ℓ NaCl, Na₂HPO₄·12H₂0, pH 7.4)로 세척하여 반응하지 않은 단백질을 제거하였다.

g 당 마이크로스피어의 수	g 당 카르복시기의 수	마이크로스피어 당 카르복시기의 수
1.97×1012	3.31×1019±0.3×1019	1.82×107±0.17×107

<실시예 2> CTB-PEG-PS 마이크로스피어의 제조

(2-1) FITC 카르복시화 PS 마이크로스피어와 t-Boc-NH-PEG-NH₂링커의 접합 반응

FITC 카르복시화 PS 마이크로스피어와 분자량이 3400인 t-Boc-NH-PEG-NH₂링커 간의 접합을 수행하기 위해, 카르보디이미드 결합 방법을 사용하였다 (도 3 참조). FITC 카르복시화 PS 마이크로스피어를 EDC로 활성화시킨 다음, t-Boc-NH-PEG-NH₂링커와 직접 접합시켰다.

구체적으로, 2.7% (w/v) FITC 카르복시화 PS 마이크로스피어 현탁 농축액 50 ㎕를 0.1 M MES 용액 100 ㎕에 희석한 다음, 100 ㎕의 0.1 M MES 용액에 녹인 0.2 M EDC 및 t-Boc-NH-PEG-NH₂링커를 상기 희석된 현탁액에 가하고 상온에서 24시간동안 서서히 교반하였다. 이때, 부가한 t-Boc-NH-PEG-NH₂링커 대 상기 마이크로스피어의 카르복시기의 몰비는 3:100으로 하였다. 교반 후 상기 반응액을 20,000g에서 30분 간 원심분리하여 상등액을 취하고, PBS로 세척하여 FITC 및 PEG이 접합된 PS 마이크로스피어를 얻었다. 상기 마이크로스피어에 트리플루오로아세트산 (TFA, trifluoroaectic acid, Janssen Chemica)을 1시간동안 처리하여 t-Boc기를 제거하고 TFA는 진공 건조하여 제거하였다. 건조된 PEG-PS 마이크로스피어는 PBS 용액 (pH 7.4)로 세척하였다.

(2-2) PEG-PS 마이크로스피어와 설포-LC-SPDP의 접합 반응

티오프로피온아미도헥사노에이트 (TPH; thioproionamidohexanoate)-PEG-접합성 PS 마이크로스피어의 수식 과정이 도 4에 나타나 있다. 상기 과정에서는 FITC- PS 마이크로스피어에 접합된 PEG의 아민기가 설프히드릴기로 치환된다.

구체적으로, 상기 (2-1) 단계에서 제조된 PEG-PS 마이크로스피어를 PBS 200 ㎕에 현탁한 후, 10 mM 설포-LC-SPDP (sulfosuccininmidyl 6-[3'(2-pyridyl- dithio)-propionamido]hexanoate; Pierce 화학, 미국)를 50 ㎕ 가하고 상온에서 1 시간 동안 교반하였다. 이후 반응액을 20,000g에서 30분 원심분리하여 상등액을 제거한 다음, 설포-LC-SPDP와 반응시킨 PEG-PS 마이크로스피어를 세척하여 200 ㎕의 PBS에 현탁하였다. 이에 100 ㎕의 PBS에 녹인 25 mM DTT (Boehringer Mannheim, 독일)를 처리하고 1시간 동안 방치한 후, 20,000g에서 30분 간 원심분리하고 상등액을 버렸다. 마지막으로, DTT를 제거하기 위해 상기 DTT 처리된 마이크로스피어를 PBS로 세척하였다.

(2-3) 설포-SMPB를 이용한 단백질 변형

설포-LC-SPDP를 이용하여 상기에서 제조된 TPH-PEG-PS 마이크로스피어에 CTB (List Biological Inc., 미국) 단백질을 접합시키기 위해서, 상기 단백질을 설포-SMPB로 변형시켰다. 도 5는 콜레라 독소 B 소단위-4-(p-말레이미도페닐) 부티르산 [Cholera toxin B subunit-4-(p-maleimidophenyl) butyrate: CTB-MPB] 또는 비교예 2에서 제조되는 우혈청알부민-4-(p-말레이미도페닐) 부틸산 [Bovine serum albumin-4-(p-maleimidophenyl) butyrate: BSA-MPB]의 변형 과정을 나타낸다. CTB 또는 BSA의 아민기는 TPH-PEG-PS 마이크로스피어의 설프히드릴기에 반응하는 말레이미드기로 변형되었으며, 이 변형 반응은 수용성 아민반응성 시약인 설포-SMPB를 이용하여 수행하였다.

구체적으로, 100 ㎍의 상기 단백질을 PBS (pH 7.0)에 1 ㎎/㎖의 농도로 녹여서 설포-SMPB (sulfosuccinyimidyl 4-[p-maleimidophenyl]butyrate; Pierce 화학, 미국)와 4℃에서 다양한 시간 (2시간, 4시간, 8시간 및 24시간)동안 반응시켰다. 이때, CTB 대 설포-SMPB의 몰비는 1:10, 1:50, 1:100으로 다양하게 조정하였다. 상기 반응액을 4℃, 14,000g에서 50분 간 원심분리하고, 아미콘 마이크로콘 (Amicon Microcon, 분자량 10,000)을 이용하여 반응하지 않은 설포-SMPB를 제거하였다.

(2-4) TPH-PEG-PS 마이크로스피어와 CTB-MPB의 접합

TPH-PEG-PS 마이크로스피어에 CTB-MPB를 접합시키기 위해, 상기 변형된 단백질을 TPH-PEG-PS 마이크로스피어 현탁액에 가하였다. 도 6은 이 반응을 개략적으로 나타낸 것이다.

구체적으로, 100 ㎍의 변형된 단백질을 반응성 설프히드릴기를 가진 TPH-PEG-PS 마이크로스피어에 가한 후 상온에서 30분 동안 서서히 교반하였다. 이후 반응액을 20,000g에서 30분 동안 원심분리한 후, 반응하지 않은 변형 단백질을 분리하고 PBS로 수차례 세척하였다.

<비교예 1> BSA-PS 마이크로스피어의 제조

모든 과정을 실시예 1과 동일하게 수행하되, 접합되는 단백질을 CTB 대신 BSA (Sigma, 미국)으로 하였다.

<비교예 2> BSA-PEG-PS 마이크로스피어의 제조

모든 과정을 실시예 2와 동일하게 수행하되, 접합되는 단백질을 CTB 대신 BSA (Sigma, 미국)으로 하였다.

<실험예 1> BSA-PS 마이크로스피어 및 CTB-PS 마이크로스피어의 형성률 결정

상기 실시예 1 및 비교예 1의 BSA-PS 마이크로스피어 및 CTB-PS 마이크로스피어의 제조 과정에서 단백질이 PS 마이크로스피어에 접합된 정도를 결정하기 위해, 브래드포드 분석을 통해 상등액에 존재하는 반응하지 않은 단백질을 정량하였다. 브래드포드 분석에 의한 단백질 정량은, 브래드포드 단백질 분석 키트(Bio-Rad Laboratories, 미국)를 사용하였으며, 단백질 용액을 2회 반복 분석하였다.

구체적으로, 표준 단백질을 PBS로 연속 희석하여 준비하고, 각 표준 단백질, 음성 대조군 및 시료 160 ㎕를 마이크로타이터 플레이트의 웰에 분주하고 40 ㎕의 염색 시약 농축액을 가한 후, 시료와 시약을 잘 혼합하여 상온에서 최소 5분간 반응시킨 다음 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices Corp, 미국)를 이용하여 595 nm에서 흡광도를 측정하였다.

상기와 같이 단백질 정량을 수행한 결과, BSA 접합의 경우 접합 반응 전의 BSA 중 약 40% 정도가 FITC 카르복시화 PS 마이크로스피어의 카르복시기와 반응하였음을 확인하였다 (10억 개의 마이크로스피어 당 약 15.75 ㎍ BSA). CTB 접합의 경우에는 접합 반응 전의 CTB 중 약 70%가 FITC 카르복시화 PS 마이크로스피어의 카르복시기와의 반응에 참여하였다 (10억 개의 마이크로스피어 당 약 27.65 ㎍ CTB). 상기 결과에 따르면, 마이크로스피어 표면에 존재하는 카르복시기의 약 1.57%가 CTB와 접합함을 알 수 있다.

<실험예 2> 주사전자현미경을 통한 PEG-PS 마이크로스피어 형태 관찰

실시예 (2-1)의 PEG-PS 마이크로스피어 제조 과정에서 TFA가 사용된 바 있다. TFA는 강산이며 FITC PEG-PS 마이크로스피어의 표면 형태를 변화시킬 가능성이 있다. 따라서 TFA를 처리한 상기 PEG-PS 마이크로스피어의 표면 형태를 확인하기 위해, 주사전사현미경 (SEM; S-2640N, Hitachi Ltd., 일본)을 이용하였다. 그 결과, 상기 마이크로스피어의 표면 형태는 TFA 처리에 의해 변화되지 않았다 (도 8 참조).

<실험예 3> GM₁갱글리오사이드에 대한 CTB-MPB의 결합 활성 결정

실시예 (2-3)에서의 CTB-MPB 형성 효과를 확인하기 위해, ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용하여 GM₁갱글리오사이드에 대한 CTB-MPB의 결합 활성을 조사하고 이를 변형되지 않은 CTB의 결합 활성과 비교하였다.

구체적으로, 중탄산 코팅 완충액 (40 mM Na₂CO₃, 60 mM NaHCO₃, pH 9.6)에 녹인 100 ㎕의 GM₁모노시알로갱글리오사이드 (1 ㎍/㎖; 시그마, 미국) 또는 BSA (1 ㎎/㎖)을 이용하여 폴리스티렌 마이크로타이터 플레이트 (Nunc, 덴마크)를 코팅한 후, 4℃에서 하루밤 동안 방치하고 0.05% 트윈 20을 포함하는 PBS (;PBST)로 코팅된 플레이트의 내용물을 6회 세척하였다. 초기 농도 1 ㎍/㎖인 시료들을 2배 단위로 연속 희석하여 상기 플레이트의 각 웰에 100 ㎕ 씩 분주하였다. 1시간 동안 상온에서 반응시킨 다음, 웰 속의 물질을 버리고 PBST로 6회 세척하였다. CTB-MPB의 비특이적 결합 가능성을 배제하기 위해, BSA가 코팅된 웰에서 CTB-MPB의 결합 활성을 측정하여 대조군으로 활용하였다. 과면역유도시킨 (hyperimmunized) 토끼의 혈청에서 얻은 토끼 항CTB 항체를 1000배 희석하되, 1% 탈지유를 포함하는 PBST에 희석하였다. 상기 희석된 항체 용액 100 ㎕를 각 웰에 분주한 다음, 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 플레이트를 PBST로 세척한 후, 1% 탈지유를 포함하는 PBST에 5000배 희석한 HRP (horseradish peroxidase)-접합성 염소 항토끼면역글로불린 (Organon Teknika Corp., 미국)을 웰 당 100 ㎕ 씩 분주하고 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후, 웰 속의 내용물을 버린 다음 PBST 세척을 6회 반복하였다. 상기 과정에서 처리한 시약의 표준 부피는 모두 100 ㎕이었다. OPD (1 ㎎/㎖, o-phenylenediamine dihydrochloride; Pierce 화학, 미국)을 포함하는 안정적인 퍼록시다제 기질 완충액 (PIERCE 화학, 미국)을 이용하여 발색 반응을 유도하였고, 발색 반응은 2 N 황산을 100 ㎕ 가함으로써 종결하였다. 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices Corp., 미국)을 이용하여 492 nm에서의 OD를 측정하였으며, 각 실험군은 2개씩 중복 분석하고 플레이트마다 음성 대조군 (blank)를 두 웰 씩 준비하여 OD를 측정하였다.

상기와 같이 ELISA 분석을 수행한 결과, 설포-SMPB를 이용하여 CTB를 변형하면 GM₁갱글리오사이드에 대한 CTB의 결합 활성이 변화함을 확인하였다 (도 9 참조). 즉, 다양한 CTB 대 설포-SMPB의 몰비 조건에서 다양한 반응 시간동안 단백질 변형 반응을 수행하고 (실시예 (2-3) 참조), 각 경우에 대해 ELISA를 수행하였다. 그 결과, 1:10의 몰비로 2시간 동안 반응시켰을 때, CTB의 결합 활성이 거의 변화하지 않음을 확인할 수 있었다. 특히, 반응 시간은 결합 활성에 그다지 영향을 주지 못하였으나, 몰비는 큰 영향을 주었음을 확인할 수 있었다. 변형 정도가 이보다 더 심한 경우, 변형된 CTB의 결합 활성이 감소하였다.

<실험예 4> SDS-PAGE에 의한 BSA-MPB 및 CTB-MPB 단백질 분석

실시예 (2-3)에서 제조된 CTB-MPB 단백질 및 비교예 2에서 제조된 BSA-MPB 단백질의 변형 여부를 확인하기 위해, 상기 변형된 단백질을 매니아니스 등의 방법 (Maniatis 등, Molecular Cloning: A laboratory manual, second edition, 1989)에 의거하여 SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis)로 분석하였다.

도 10은 1:10의 BSA:설포-SMPB 몰비 조건에서 2시간 동안 반응시켜 생성된 BSA-MPB를 15% SDS-PAGE 분석한 결과이고, 도 11은 1:10의 CTB:설포-SMPB 몰비 조건에서 2시간 동안 반응시켜 생성된 CTB-MPB를 15% SDS-PAGE 분석한 결과이다. BSA 및 CTB 모두 변형 반응 전후의 단백질 밴드 모양이 상이하였으므로, BSA-MPB 및 CTB-MPB가 성공적으로 형성되었음을 확인할 수 있었다.

<실험예 5> BSA-PEG-PS 마이크로스피어 및 CTB-PEG-PS 마이크로스피어의 형성률 결정

비교예 2의 BSA-PEG-PS 마이크로스피어 및 실시예 (2-4)의 CTB-PEG-PS 마이크로스피어 제조 과정에서, TPH-PEG-PS 마이크로스피어에 단백질이 접합된 정도를 상기 반응하지 않은 단백질을 브래드포드 분석하여 결정하되, 상세한 방법은 상기 실험예 1에서의 분석 방법과 동일하게 수행하였다.

BSA-PEG-PS 마이크로스피어의 경우, 10억 개의 마이크로스피어 당 약 17.73 ㎍의 BSA-MPB가 접합 반응에 참여하였다. CTB-PEG-PS 마이크로스피어의 경우, 10억 개의 마이크로스피어 당 약 22.8 ㎍의 CTB-MPB가 성공적으로 접합하였다. 상기 결과에 따르면, 마이크로스피어 표면의 전체 카르복시기 중 약 1.3%가 CTB-MPB와 접합한 것이라 볼 수 있다.

<실험예 6> GM₁갱글리오사이드에 대한 CTB-PEG-PS 마이크로스피어의 결합능

실시예 2의 FITC가 접합된 CTB-PEG-PS 마이크로스피어가 GM₁갱글리오사이드에 결합할 수 있는지 확인하기 위해, 상기 실험예 3의 방법에 따라 ELISA를 수행하였다.

그 결과, 상기 CTB-PEG-PS 마이크로스피어 상의 CTB는 GM₁갱글리오사이드에 대한 결합능을 보유하고 있음을 확인하였다.

<실험예 7> 마이크로스피어의 생체내 흡수성

생후 14주 된 자성 Balb/c 마우스 (대한 실험 동물 센터, 대한민국)를 마이크로스피어 흡수 시험에 사용하였다. 각 마우스는 5마리 씩 6개 실험군으로 나누어 경구 투여 12시간 전에 단식시켰다. 도 2에 나타난 6가지 1 ㎛ FITC PS 마이크로스피어들을 약 10억 개 취하여 3% Na₂CO₃를 포함하는 PBS (pH 7.4)에 현탁시키고, 둔단형 침 (blunt-tipped feeding needle)을 이용하여 상기 현탁액을 200 ㎕ 씩 단회 경구 투여하였다. 경구 투여 3시간 후에 마우스를 마취용 에테르로 희생시킨 다음, 각 조직을 취하여 마이크로스피어 흡수율 분석에 사용하였다. 시료의 오염을 막기 위해, 소장을 절개하기 전에 장간 림프절 및 비장을 분리하였으며, 절개된 소장에서 페이어 패치 부위 및 소장 흡수세포를 분리하였다. 분리된 조직은 모두 PBS로 세척하여 흡수되지 않은 FITC PS 마이크로스피어를 제거한 다음, 조직의 중량을 측정하였다. 조직 시료에 조직용해액 (1% 트리톤 X-100, 1% KOH)을 3 ㎖ 가한 후 72시간동안 60℃에서 방치하여 조직을 용해해리시켰다. 용해된 시료는20,000g에서 1시간 동안 원심분리하여 상등액을 제거한 다음, 100 ㎕의 PBS를 가하여 침전물을 재현탁하였다. 흡수된 마이크로스피어의 수량은 형광물질 검출용 광학 필터가 장착된 형광현미경 (Nickon, 일본)을 이용하여 수동 측정하였다 (Ebel, Pharm. Res., 7: 848-851, 1990; Hodge 등, Dig. Dis. Sci., 40: 967-975).

상기 과정에서 각 1 ㎛ FITC PS 마이크로스피어가 10억 개씩 투여되도록 조정하기 위해 다중주파수상 형광측정기 (multifrequency phase fluorometer, Iss Inc., 미국)를 사용하였다. 연속 희석된 1 ㎛ FITC PS 마이크로스피어를 다이메틸포름아마이드 처리한 후, 추출된 FITC의 형광 강도는 형광 검출기를 이용하여 측정하되, 여기 파장 (excitation wavelength) 458 nm 및 방사 파장 (emission wavelength) 540 nm에서 형광을 측정하였다. 이와 같은 방법으로 1 ㎛ FITC PS 마이크로스피어의 숫자 대비 FITC 형광 강도에 대한 표준 곡선을 얻었다 (도 7 참조).

각 시료 조직에 흡수된 FITC PS 마이크로스피어의 평균 수량을 비교하기 위해, 스튜던츠 t-테스트 (unpaired, two-tailed Students' t-test)를 수행하였다. 이때, 결과치는 0.05 이하의 p값일 때 통계적으로 유의한 것으로 하였다.

도 12는 경구 투여 후 소화관 각 부분에서 흡수된 6가지 마이크로스피어의 수량을 나타낸 것이다. 또한, 하기 표 2는 조직 1 ㎎ 당 흡수된 마이크로스피어의 수량을 나타낸 것이다. 마이크로스피어 6종 모두 소화관 내의 페이어 패치 및 흡수세포로 어느 정도 흡수되었다. 그러나, 페이어 패치 및 흡수세포 양자에서 CTB-PS 마이크로스피어 및 CTB-PEG-PS 마이크로스피어 등 2종의 마이크로스피어가 특히 더 잘 흡수되었음을 확인하였다. 흡수세포 내로의 마이크로스피어 흡수 정도를 페이어 패치로의 흡수 정도와 비교하였을 때, CTB 접합 자체는 페이어 패치 내로의 특이적 흡수를 촉진하지 않았다.

페이어 패치에서 CTB-PEG-PS 마이크로스피어는 다른 리간드 접합성 마이크로스피어보다 훨씬 더 잘 흡수되었다. 특히, CTB-PEG-PS 마이크로스피어의 평균 흡수량은 CTB-PS 마이크로스피어의 두 배를 초과하였다. Frey 등 (J. Exp. Med., 184: 1045-1059, 1995)에 따르면, 1 ㎛ 비이온성 PS 마이크로스피어에 CTB를 코팅하더라도 코팅되지 않은 PS 마이크로스피어에 비해 페이어 패치에서의 흡수율이 증가하지 않는다고 하였다. 본 발명에 따르면 PEG 링커의 존재 때문에 CTB-PEG-PS 마이크로스피어 상의 CTB가 M 세포의 정단 세포막에 존재하는 GM₁갱글리오사이드에 접근하기 용이해졌다고 볼 수 있다.

한편, 장간막 림프절 및 비장에서는 경구 투여 3시간 후 6종의 마이크로스피어 모두 검출되지 않았다.

조직	흡수된 마이크로스피어의 수량
	카르복시화 PS	BSA-PS	CTB-PS	PEG-PS	BSA-PEG-PS	CTB-PEG-PS
페이어 패치	21.4±3.2	14.6±6.1	58.8±27.1	21.0±9.9	19.7±4.6	105.5±52.1
흡수세포	125.7±11.2	126.9±42.7	201.8±142.2	86.4±51.4	9.8±5.4	155.0±90.1
장간막 림프절	미검출	미검출	미검출	미검출	미검출	미검출
비장	미검출	미검출	미검출	미검출	미검출	미검출

본 발명의 CTB가 접합된 마이크로스피어는 마우스 소장의 페이어 패치 및 흡수세포에 효과적으로 흡수되며, 특히 PEG 링커를 경유하여 CTB가 접합된 마이크로스피어는 페이어 패치에서 보다 효과적으로 흡수된다. 따라서, 본 발명의 CTB가 접합된 마이크로스피어 또는 PEG 링커를 사용한 마이크로스피어는 항원 등 다양한 생리활성 물질의 경구 투여용 제형으로서 유용하다.

Claims (13)

1. 콜레라 독소 B 소단위체 (Cholera toxin B subunit: CTB) 또는 그 변이형이 표면에 수식된 마이크로스피어 (microsphere).
2. 제 1항에 있어서, 콜레라 독소 B 소단위체는 PEG 링커 (polyethylene glycol linker)을 통해 마이크로스피어에 연결되어 있는 것을 특징으로 하는 마이크로스피어.
3. 제 2항에 있어서, PEG 링커는 분자량이 약 3,000 내지 4,000 인 것을 특징으로 하는 마이크로스피어.
4. 제 1항에 있어서, 상기 마이크로스피어는 그 내부 또는 표면에 한 종 이상의 생리활성 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로스피어.
5. 제 4항에 있어서, 상기 생리활성 물질은 단백질, 폴리펩타이드, 다당류, 지질 및 핵산, 항원, 단분자성 물질로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 물질인 것을 특징으로 하는 마이크로스피어.
6. 제 1항에 있어서, 상기 마이크로스피어는 그 내부 또는 표면에 한 종 이상의 불활성화된 바이러스, 약화된 바이러스, 재조합 또는 합성 폴리펩타이드, 햅텐 (haptens), 세균성 항원 또는 이뮤노젠 (immunogen)을 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로스피어.
7. 제 1항에 있어서, 상기 마이크로스피어는 약 0.5 내지 5 ㎛의 크기인 것을 특징으로 하는 마이크로스피어.
8. 제 1항에 있어서, 상기 마이크로스피어는 전분 (starch), 덱스트란 (dextran), 풀루란 (puluran), 키토산 (chitosan), 알긴산 (alginate), 셀룰로오스 (cellulose), 젤라틴 (gelatin), 알부민 (albumin), 폴리비닐알코올 (poly vinyl alcohol), 폴리메틸메타크릴레이트 (polymethylmethacrylate), 폴리스티렌 (polystyrene), 폴리이미도카보네이트 (polyimidocarbonate), 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone), 폴리(DL-락타이드-코-글리콜라이드) (poly(DL-lactide-co-glycolide)), 폴리오르소에스테르 (polyorthoesters), 폴리언하이드라이드 (polyanhydride) 또는 폴리포스파진 (polyphosphazene) 의 재질로 된 것을 특징으로 하는 마이크로스피어.
9. 제 1항의 마이크로스피어를 제형으로 하여 제 5항의 생리활성물질을 유효성분으로 하는 경구 투여용 제제.
10. 제 6항의 마이크로스피어를 포함하는 경구 투여용 백신.
11. 1) 마이크로스피어 표면에 존재하는 카르복시기를 EDC [1-Ethyl-1,3- (3-dimethyl-aminopropyl) carbodiimide]로 활성화하는 단계; 및

    2) 단계 1)의 활성화된 카르복시기에 CTB를 접합하는 단계

    를 포함하는 제 1항의 마이크로스피어를 제조하는 방법.
12. 1) PEG를 마이크로스피어에 접합시켜 PEG-마이크로스피어를 제조하는 단계;

    2) 설포-LC-SPDP와 상기 단계 1)의 PEG-마이크로스피어를 접합시켜 TPH-PEG-마이크로스피어를 제조하는 단계;

    3) 설포-SMPB를 이용하여 CTB를 변형시키는 단계; 및

    4) 변형된 CTB와 상기 TPH-PEG-마이크로스피어를 접합하여 CTB-PEG-마이크로스피어를 제조하는 단계

    를 포함하는 제 2항의 마이크로스피어를 제조하는 방법.
13. 제 12항에 있어서, 상기 단계 3)에서 CTB 대비 설포-SMPB의 몰비는 약 1:10으로 하고 반응 시간은 약 2시간 이하로 하는 것을 특징으로 하는 제 2항의 마이크로스피어의 제조 방법.