KR19990081422A

KR19990081422A - 대장균을 이용한 활성형 csbp-1의 대량 제조방법

Info

Publication number: KR19990081422A
Application number: KR1019980015360A
Authority: KR
Inventors: 박천길; 추승호; 윤혜성; 정현호
Original assignee: 성재갑; 주식회사 엘지화학
Priority date: 1998-04-29
Filing date: 1998-04-29
Publication date: 1999-11-15
Also published as: KR100378905B1

Abstract

본 발명은 고등동물 세포에 존재하는 대표적인 미토겐 활성 단백질 키네이즈 ( Mitogen-Activated Protein Kinase)의 하나인 CSBP-1( Cytokine-Suppressive Anti-inflammatory Drug-Binding Protein 1) 유전자를 포함하는 대장균 발현벡터 및 이를 이용한 대장균에서의 CSBP-1 의 대량 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 CSBP-1 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 대장균을 저온에서 배양하여 CSBP-1 을 대량으로 발현시킨 다음 친화 크로마토그라피 등으로 정제하여 활성화된 CSBP-1 을 고순도로 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

대장균을 이용한 활성형 ＣＳＢＰ-1 의 대량 제조방법

세포의 신호전달계는 여러 질병과의 연계성 및 생명현상의 유지를 위해 근본적으로 필요한 세포의 성장, 분화 등을 조절하며, 따라서 최근에 이에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 세포의 신호전달계중 특히 MAPK 신호전달 경로에는 세포가 성장인자(growth factor), 사이토카인 (Cytokine), 호르몬 및 기타 외부 환경 변화(Environmental Stress)에 반응하여 급격하게 발현되는 단백질군(family)으로서 조절(regulatory) 기능을 수행하는 쎄린/트레오닌 카이네이즈들이 포함된다. 이러한 MAPK 단백질은 연속적인 일단의 인산화과정(Phosphorylation cascade)을 통해서 세포외의 신호를 핵내부로 전달하는 기능을 수행한다 (Cano, E. and Mahadevan, L.C., 1995, Trends. Biochem. Sci. 20, 117-122 ; Lenormnd, P., 1995, J. Clin. Pathol. Mol. Pathol. 48, M292-M301 ; Cobb, M. H., 1995, J. Biol. Chem. 270, 14843-14846). 현재까지 ERK 단백질, SAPK 또는 JNK 단백질, 그리고 p38/CSBP 단백질로 이루어지는 3개의 MAPK 경로가 고등 세포에 존재하는 것으로 알려져 있으며, 이들은 특정의 카이네이즈들로 이루진 일단의 인산화과정을 포함한다. 이들중 ERK 인산화 과정은 주로 성장인자(growth factor)와 같은 마이토제닉 자극(Mitogenic stimuli)에 의해 활성화되는 반면, JNK 와 p38/CSBP 는 다양한 종류의 사이토카인(Cytokine)과 환경의 자극(environmental stress)에 의해 그 신호전달 경로가 활성화 되는 것으로 알려져 있다.

MAPK 단백질들은 MAPK 카이네이즈단백질( Mitogen Activated Protein Kinase Kinase)이라는 종류의 단백질들에 의해 트레오닌 잔기와 티로신 잔기가 인산화되어 활성화된다(Payne, M. et al. , 1991, EMBO J 10, 885-992 ; Ahn, N, G., 1992, Curr.Opin. Cell Biol. 4, 992-999). 이들 MAPK 단백질 중 특히 p38/CSBP 단백질은 사이토카인 생합성을 유도하는 해독(translation) 단계에 주요한 작용을 한다는 것이 밝혀짐으로인해 그동안 많은 관심의 대상이 되어왔다. 실제로, p38/CSBP 의 기능을 저해하는 저해제를 LPS-자극 단핵세포( LPS-induced monocytic cell)에 처리하여주면 세포의 염증 반응(inflammation)에 관여하는 사이토카인인 TNF-알파와 인터루킨 1 베타의 합성이 억제되는 것이 확인 되었다(Cuedna,A, et al ,1995, FEBS lett. 364, 229-233).

이러한 사실이 밝혀지면서 세포의 염증 현상(inflammation)과 관련된 질병 치료의 대상으로서 p38/CSBP 활성억제제에 대한 연구가 진행되어 왔다 (Peter R. Young, Megan M. Mclaughlin et al., 1997, J. Biol. Chem. 272, 12116-12121 ; Jeffrey C. Boehm et al., 1996, J. Med.Chem. 39, 3929-3937). 반면, 이러한 개선된 억제제의 개발을 위한 p38/CSBP 의 결정구조 연구도 진행되고 있다(Keith P Wilsom et al., 1997, Chemistry & Biology 4, 423-431 ; Zhulun Wang, et al., 1997, PNAS 94, 2327-2332 ; S.Pav, White S Rogers et al., 1997, Protein Science, 6, 242-245). 특별히 스미스 클라인사가 개발하고 있는 것으로 알려진 피리돌-이미다졸 계열의 p38/CSBP 저해제인 SB 203580 은 사람의 질병을 대상으로 한 동물모델(animal model) 실험 결과 이 저해제가 류나티스, 골다공증, 패혈증과 염증과 관련된 질병에 대하여 탁월한 효과를 보여줌이 확인되었고, 일반적으로 사용되는 항면역반응 제제인 라파마이신(rapamycin)이 보여주는 과대한 면역체계의 억제 현상을 전혀 보이지 않는 것으로 확인되었다 (1997, Emerging pharmaceuticals). 이러한 결과는 p38/CSBP 의 활성억제제가 사람의 비정상적 또는 과도한 면역반응에 관련되어 나타나는 모든 질병에 대하여 아주 탁월한 치료제가 될 수 있슴을 보여준 것이다.

상기한 사실에 근거하여 현재 많은 연구자들이 p38/CSBP 의 억제제 개발을 위한 연구를 수행하고 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 연구는 단백질과 개발되어지는 합성물질의 3차구조의 정보를 이용하여 이루어지고 있다. 즉, 단백질과 합성된 저해제의 결합 결정구조(complex structure)를 확인하고 이 정보로부터 보다 개선된 저해제를 합성하는 연구 방법(Structure-based drug design)에 의해 이루어지고 있는 것이다.

따라서 저해제 개발을 위해서는 대량의 단백질이 필수적으로 필요하게 된다. 현재까지 밝혀져 있는 p38/CSBP 와 활성저해제의 결정구조를 확인하기 위한 연구도 유전자 재조합 기법을 이용한 p38/CSBP 의 생산에 기초하고 있다(Keith P Wilsom et al., 1997, Chemistry & Biology 4, 423-431 ; Zhulun Wang et al., 1997, PNAS 94, 2327-2332 ; S.Pav, White S Rogers et al., 1997, Protein Science 6, 242-245).

유전자 재조합 p38/CSBP 단백질의 제조에 관한 많은 보고가 있어 왔으며 이들 연구는 대장균, 효모 그리고 동물세포 등을 이용한 것이었다. 그러나 이들 연구의 보고들은 모두 재조합 단백질의 발현양과 활성에 대하여는 알려주는 바가 없었다(Han, J., Lee et al., 1994, Science 265, 808-811 ; Lee, J. C. et al., 1994, Nature 372, 739-746 ; Raingeaud, J. C, et al., 1995, J. Biol. Chem. 270, 7420-7426 ; Lin, A. et al., 1995, Science 268, 286-290). 또한, 최근에 발표된 구조연구에 사용된 단백질들은 곤충세포에서 발현된 것들로서 그 발현양에 많은 제한을 갖고 있는 것이었다(Keith P Wilsom et al., 1997, Chemistry & Biology 4, 423-431 ; Zhulun Wang et al., 1997, PNAS 94, 2327-2332 ; S. Pav, White S Rogers et al., 1997, Protein Science 6, 242-245). 이러한 문제점을 해결하고자 최근에 쉐링사(Schering-Plough)의 연구진은 GST-CSBP 의 융합 단백질의 제조와 정제법을 보고한 바 있다(Xiao-Yan Cai et al., 1997, Protein Exp. Puri. 10, 263-274). 그러나 이 방법 역시 곤충세포를 사용한 단점을 갖고 있으며 복잡한 정제 과정을 거쳐야 하는 문제점이 있다.

이에 본 발명자들은 상기와 같은 CSBP 의 발현량과 정제의 문제를 해결하기 위하여 연구한 결과, CSBP-1 유전자를 포함하는 재조합 대장균 발현벡터를 제조하고 그에 의해 형질전환된 대장균을 저온에서 배양하여 p38/CSBP-1 을 대량으로 발현시킨 다음 아미노 말단에 융합된 6개의 히스티딘 아미노산 잔기를 이용하여 고수율로 1차 정제한 후, 융합 부위 절단, 젤 여과와 이온 교환 크로마토그라피 단계를 거쳐 정제하여 CSBP-1 이 그 활성을 유지한 상태로 제조됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 고등동물 세포에 존재하는 대표적인 MAPK 단백질의 하나인 CSBP-1 의 유전자를 포함하는 대장균 발현벡터 및 이를 이용한 대장균에서의 활성형 CSBP-1 의 대량 제조방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

도 1a 는 인간 CSBP-1 의 염기서열을 나타낸 것이고,

도 1b 는 인간 CSBP-1 의 아미노산 서열을 나타낸 것이고,

도 2 는 인간 CSBP-1 유전자를 대장균 발현벡터 pET15CSBP1 으로의 클로닝 과정을 나타낸 것이며,

도 3 은 인간 CSBP-1 유전자를 포함하는 발현벡터 pET15CSBP1 로 형질전환된 대장균을 배양하여 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동한 결과를 나타낸 것이며,

제 1 열 : 표준 단백질 시료 ; 제 2 열 : 대장균에서 발현된 CSBP-1;

도 4 는 본 발명의 정제 과정중 니켈 친화성 크로마토그라피 단계의 결과를전기영동한 것이며,

제 1 열 : 표준 단백질 시료 ; 제 2 열 : 컬럼에 투입되는 단백질 ;

제 3 열 : 용출된 단백질 ;

도 5 는 본 발명의 정제 과정중 젤 여과 크로마토그라피 단계의 결과를 전기영동한 것이며,

제 3 열 : 용출된 단백질;

도 6 은 본 발명의 정제 과정중 음이온 교환 크로마토그라피 단계의 결과를 전기영동한 것이며,

제 1 열 : 표준 단백질 시료 ; 제 2 열 : 용출된 단백질 ;

도 7 은 인간 트롬빈을 처리하여 아미노 말단의 6개 히스티딘 잔기를 제거하는 조건을 확인한 결과를 전기영동한 것이며,

제 1 열 : 표준단백질 시료 ;

제 2 열 - 제 7 열 : 37℃에 보관된 시료를 각각 5, 20, 40, 60, 90, 120분에 취한 것;

제 8 열 - 제 13 열 : 트롬빈과 반응된 시료를 각각 5, 20, 40, 60, 90, 120분에 취한 것 ;

도 8 은 정제된 CSBP-1 유전자 단백질의 인산화 활성을 확인한 결과이다.

제 1 열 : MBP 단백질만을 넣은 시료 ;

제 2 열 : ATF-2 단백질만을 넣은 시료 ;

제 3 열 : CSBP-1 와 MBP 단백질을 넣은 시료 ;

제 4 열 : CSBP-1 와 ATF-2 단백질을 넣은 시료 ;

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CSBP-1 의 유전자를 포함하는 대장균 발현벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환시킨 CSBP-1 을 생산하는 대장균 형질전환체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 대장균 형질전환체를 이용하여 활성형 CSBP-1 의 대량 제조방법을 제공한다.

구체적으로 상기 대장균 형질전환체를 저온 배양하여 CSBP-1 유전자가 대량으로 발현되게 한 다음 세포를 파쇄하고 융합된 히스티딘 잔기를 이용한 친화 크로마토그라피를 수행하여 1차 정제한 후 투석, 히스티딘 융합부위 절단, 여과 크로마토그라피 및 이온 교환 크로마토그라피 단계를 통하여 고순도로 정제하는 CSBP-1 의 제조방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 고등동물 세포에 존재하는 대표적인 MAPK 단백질의 하나인 CSBP-1 을 코드하는 유전자를 분리하기 위하여 인간 태아 뇌 세포를 이용한다.

구체적으로 인간 태아 뇌 조직으로부터 리보핵산(RNA)을 추출하여 cDNA를 합성하고 이를 주형으로 중합효소 연쇄반응 (Polymerase chain reaction, 이하 'PCR' 이라 약칭함)을 수행한다. 한편 CSBP-1 유전자에 대응하는 PCR용 시발체(서열 1, 서열 2 의 염기 서열을 갖는 올리고 뉴클레오타이드)를 합성하여 사용한다.

구체적으로 서열 1의 시발체는 제한효소 NdeI 인지 부위를 갖고 인간 CSBP-1 의 1번째 아미노산부터 8번째 아미노산을 코드하는 염기서열을 포함하고, 서열 2 의 시발체는 제한효소 XhoI 인지부위와 인간 CSBP-1 유전자의 종료코돈을 포함한다.

그 결과, 약 1050 염기쌍의 CSBP-1 유전자를 분리하였다.

상기 과정으로 얻은 CSBP-1 의 유전자를 T7 작동유전자를 포함하는 플라스미드 벡터 pET15 에 삽입하여 본 발명의 발현벡터 pET15CSBP1 을 제조한다.

본 발명의 발현벡터 pET15CSBP1 을 대장균 BL21(DE3) 균주에 형질전환시켜 그 대장균 형질전환체 BL21(DE3)/pET15CSBP1 을 1998년 4월 8일자로 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호:KCTC 0454BP).

또한 본 발명 고등동물 세포에 존재하는 대표적인 MAPK 단백질의 하나인 CSBP-1 의 제조방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명의 발현벡터 pET15CSBP1 을 대장균에 형질전환시켜 그 형질전환체를 이용하여 활성형 CSBP-1 을 대량으로 제조한다.

본 발명에서는 우선 상기 대장균 형질전환체를 35℃-40℃의 온도에서 충분히 배양한 다음 온도를 내려 약 20℃ 내외의 저온에서 배양하면서 이소프로필티오-β-D-갈락토사이드 (isopropylthio-β-D-galactoside , 이하 “IPTG ”이라 약칭함)를 첨가하여 T7 작동유전자로부터 CSBP-1 유전자의 발현을 유도한다. 이 때 35℃-40℃의 온도에서 대장균을 충분히 성장시킨 다음 저온에서 배양함으로써 대장균의 성장 및 분열은 느리게 일어나게 하고 단백질 생산은 증가되게 하는 것이다.

상기 과정으로 CSBP-1 유전자가 대량으로 발현되게한 다음 세포를 파쇄하여 조세포액을 얻고 원심분리하여 가용성 단백질만을 모은다. 상기 가용성 단백질을 포함하는 용액을 니켈 아가로즈 칼럼 등에 통과시킨 다음 수지에 흡착된 단백질을 용출시켜 CSBP-1 을 1차 정제한다. 본 발명의 벡터에 의하여 발현되는 단백질에는 그 아미노말단에 히스티딘 잔기가 융합되어 있어 친화 크로마토그라피를 이용하여 정제하는 것이다.

1차 정제 후 투석하고 인간 트롬빈과 반응시켜 히스티딘 융합부위를 절단한 다음 여과 크로마토그라피 및 이온 교환 크로마토그라피를 수행하여 CSBP-1 을 고순도로 정제한다.

본 발명에 의하여 제조된 CSBP-1 이 그 고유한 성질을 보유하고 있는 활성형 단백질인지 확인하기 위하여, MBP 와 ATF-2 단백질과 방사성 P을 포함한 ATP가 함유된 반응용액에 본 발명에서 제조된 CSBP-1 를 첨가하여 반응시킨 결과, MBP 와 ATF-2 단백질이 본 발명에서 제조된 CSBP-1 에 의하여 인산화되는 것을 확인하였다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다.

하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

<실시예 1> 인간 CSBP-1 유전자의 증폭.

(단계 1) 인간 태아 뇌로부터 cDNA 합성.

인간 태아 뇌로부터 RNA 추출을 콜로진스키등의 방법(Cholozynski, P. et al., 1987, Anal. Biochem. 162, 156)에 따라 다음과 같이 수행하였다. 1g의 인간 태아 뇌 조직에 3ml 의 RNA추출액 [4M 구아니디니움 티오시아네이트(Guanidinium thiocyanate), 25mM 소듐 시트레이트(Sodium Citrate), pH 7.0, 0.5% 사코실(Sarcosyl), 0.1M 2-머캅토에탄올(Mercaptoethanol)]을 가하고 진탕시켜 세포막을 파괴시킨 다음 2.4ml 의 2M 나트륨아세테이트 (pH4.0), 2.4ml 의 페놀, 4.8 ml의 클로로포름-이소아밀알콜(49:1, v/v)을 가하여 잘 혼합하여 12,000g, 15분간, 4℃에서 원심분리한후 상층의 수용액을 동일 부피의 이소프로판올이 있는 새용기에 옮기고 -20℃에서 약 1시간 방치한 다음 12,000g, 4℃에서 20분간 원심분리하여 RNA 침전물을 얻었다. 이 침전물을 75% 에탄올로 세척한뒤 진공 건조시키고 100ul의 TE 완충액(10mM 트리스-HCl, pH7.5, 1mM EDTA)에 용존시켰다. cDNA단선을 합성하기 위해 위에서 얻은 RNA용액 10ul를 취하여 2ul의 0.1M 메틸머큐리(CH₃HgOH)를 가한다음 상온에서 10분간 방치하여 RNA의 2차 구조를 풀어준 후 2ul의 1M 2-머캅토에탄올을 가하여 5분간 반응시켰다. 여기에 5ul의 10배 농축 역전사 효소 반응 용액 [500mM 트리스-HCl,pH8.3, 750mM KCl, 30mM MgCl₂, 10mM 디티오트레이톨(Dithiothreitol)], 2.5ul의 10mM dNTP혼합액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP가 각각 10mM), 24ul의 다이에틸피로카보네이트 (DEPC, Diethylpyrocarbonate)가 처리된 증류수, 1.0ul의 RNase 억제제(RNasin,1U/uL, Promega, U.S.A.), 1ul의 올리고(dT)_12-18시발체(oligo(dT)_12-18primer, GibcoBRL, U.S.A. )를 가한 다음 상온에서 10분간 방치시켜 RNA주형과 시발체가 잘 붙게 한 다음 2.5ul의 역전사 효소(18U/ul, Superscript RNase H- Reverse transcriptase, BRL, U.S.A.)를 가하여 37℃에서 1시간 반응시켜 cDNA 가닥을 합성하였다.

(단계2) 시발체의 합성.

인간 CSBP-1 유전자를 중합효소 연쇄반응을 이용해 상기 단계 1에서 얻은 cDNA로부터 얻기 위해, 다음과 같은 시발체들을 핵산합성기 (DNA Synthesizer 394, Applied Biosystems Inc., U.S.A.) 를 이용하여 합성하였다.

서열 1의 시발체 BNCSBP1 는 제한 효소 Nde I 인지 부위를 갖고 인간 CSBP-1 의 1번째 아미노산 부터 8번째 아미노산을 코딩하는 염기서열을 갖도록 고안되었고, 서열 2의 시발체 CSBP1XhoI 는 제한효소 XhoI 인지 부위와 인간 CSBP-1 유전자의 종료코돈을 갖는다.

(단계3) 인간 CSBP-1 유전자의 분리.

인간 CSBP-1 유전자를 증폭하기 위해 다음과 같이 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 반응튜브 1에 상기 단계 2에서 얻은 2㎍의 서열 1의 시발체 BNCSBP1, 2㎍의 서열 2의 시발체 CSBP1XhoI 을 넣은 다음 상기 단계 1에서 얻은 인간 태아 뇌세포 cDNA 1ng을 주형으로 넣고 10㎕의 10배 중합완충용액(500mM KCl, 100mM 트리스-HCl, pH 9.0, 1% 트리톤 X-100, 2.5mM MgCl₂), 10㎕의 2mM dNTP(각 2mM dGTP, 2mM dATP, 2mM dCTP, 2mM dTTP), 2.5단위체 Taq 중합효소와 증류수를 각각 가하여 총 부피를 100㎕로 한 후 95℃에서 1분(변성단계), 55℃에서 40초(담금단계), 72℃에서 2분(중합단계)의 조건으로 PCR 을 40회 실시하였다. 상기에서 얻은 PCR 산물을 7% 아크릴아마이드 젤에서 분리한 결과 약 1050 염기쌍의 핵산이 증폭되었음을 확인하였고 7% 아크릴아마이드 젤에서 분리, 정제하였다(이하 상기 핵산 단편을 '단편 CSBP1' 이라 칭한다).

<실시예 2> CSBP-1 유전자를 포함하는 대장균 발현벡터의 제조.

플라스미드 pET15 (Novagen) 2ug 을 제한효소 Nde I과 Xho I으로 NEB 완충용액 2(50mM NaCl, 10mM 트리스-HCl, 10mM MgCl₂, 1mM 디티오트레이톨, pH 7.9)의 조건으로 완전 절단한 다음 1% 아가로스젤로 전기영동 분리하여 5.7Kb 핵산 절편을 얻었다(이하 상기 단편을 '단편 pET15-N/X' 이라 칭한다).

한편 상기 실시예 1의 단계 3에서 얻은 단편 CSBP1 2ug을 제한효소 XhoI으로 NEB 완충용액 2(50mM NaCl, 10mM 트리스-HCl, 10mM MgCl₂, 1mM 디티오트레이톨, pH 7.9)의 조건으로 완전 절단한 다음 제한효소 NdeI으로 부분절단하여 7% 아크릴아마이드 젤로 전기영동 분리하여 약 1050 염기쌍의 핵산 절편을 얻었다(이하 상기 단편을 '단편 CSBP1N/X' 이라 칭한다).

접합반응 튜브에 상기에서 얻은 100ng 의 단편 CSBP1N/X, 100ng의 단편pET15-N/X 을 넣은 다음, 2㎕의 10배 접합반응용액[50mM 트리스-HCl(pH 7.8), 10mM MgCl₂, 10mM 디티오트레이톨, 1mM ATP, 25㎍/ml 소혈청 알부민(bovine serum albumin)], 10 단위체의 T4 DNA 리가아제와 총 부피가 20㎕가 되도록 증류수를 가한다음 16℃에서 12시간 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 대장균 HB101(ATCC 33694)에 형질전환시켜 CSBP1 유전자를 포함한 대장균 발현벡터 pET15CSBP1 을 얻었다.

CSBP-1 유전자의 염기서열 확인은 pET15CSBP1 을 포함하고 있는 대장균으로부터 대량으로 플라스미드를 추출한후 자동화된 DNA 시퀀서(DNA SEQUENCER 377 , Applied Biosystems Inc., U.S.A.)를 이용하여 수행하였다.

선별된 플라스미드 pET15CSBP1 을 발현 숙주인 대장균 BL21(DE3) 균주(Novagen Inc., Madison WI53711, U.S.A.)에 형질전환시켰다.

<실시예 3> 대장균에서 CSBP-1 유전자의 발현.

상기 실시예 2에서 얻은 재조합 대장균 세포를 50ug/ml 의 엠피실린(Ampicillin) 이 함유된 액체 루리아 (Luria)배지 (6% 박토 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨)에서 12시간 동안 진탕배양한 다음, 이중 3ml을 300ml의 M9 배지 (40mM K₂HPO₄, 22mM KH₂PO₄, 8,3mM NaCl, 18.7mM NH₄Cl, 1% 포도당, 0.1mM MgSO_4,0.1mM CaCl2 2% 카사미노산, 10ug/ml Vit. B1, 40ug/ml 엠피실린)로 옮겨서 37℃에서 약 4시간동안 진탕 배양하여 박테리아의 흡광도가 650nm 의 파장에서 약 0.3 정도가 될 때 최종농도 0.4mM IPTG 가 되도록 IPTG를 첨가하였다. IPTG를 첨가한지 약 4 시간 후에 세포 배양액의 흡광도를 측정한 다음 원심분리기(Beckman J2-21, JA14 rotor)를 이용하여 6000 rpm에서 25분간 원심분리하여 박테리아 세포 침전물을 수거하였다. 수거한 세포 침전물을 램리의 방법(Laemmli, 1970, Nature 227, 680)에 따라 SDS 의 존재하에 12 % 폴리아크릴 아마이드 젤에서 전기영동하여 발현을 확인한 결과 CSBP-1 이 대량으로 발현되었음을 알 수 있었다(도 3 참조).

<실시예 4> CSBP-1 의 제조.

(단계 1) 세포 배양.

상기 실시예 3에서의 형질전환된 대장균 세포를 12시간 37℃에서 배양한 후, 그 배양액 10 ml를 1리터의 상기 실시예 3 과 동일한 루리아 배지에 넣어준후 배양하였다. 37℃에서 약 2시간 동안 진탕배양하여 박테리아의 흡광도가 650nm 의 파장에서 약 1.0 정도가 될때 진탕 배양기의 온도를 20℃로 내려 저온에서 배양한다. 30분후 최종농도 0.4mM IPTG 가 되도록 IPTG를 첨가하였다. IPTG를 첨가한지 약 4 시간 후에 원심분리기(Beckman J2-21, JA14 rotor)를 이용하여 5000 rpm 에서 10분간 원심 분리하여 박테리아 세포 침전물을 수거하였다

(단계 2) 세포 파쇄 및 불용성 단백질의 제거.

2리터 배양에서 얻어진, 유전자 재조합 CSBP-1 이 발현된 대장균 세포 침전물에 약 100ml의 완충용액 1(5mM 이미다졸, 1M NaCl, 20mM 트리스, pH 8.0)을 가하여 현탁시킨 후, 얼음 중탕안에서 초음파 분쇄기(Ultrasonic homogenizer 4710 : Cole- Parmer, U.S.A.)로 50%의 출력과 50%의 효율 싸이클(duty-cycle)에서 약 2분간 초음파 처리하여 세포를 파쇄하였다. 이렇게 하여 얻은 세포 균질액을 고속 원심 분리기(Beckman J2-21M, Rotor JA - 14)로 10000rpm에서 30분간 원심분리하여 상층액인 가용성 단백질을 얻었다.

(단계 3) 니켈 친화성 크로마토그라피.

상기 단계 2의 용액에 같은 부피의 완충용액 1을 가한 후, 완충용액 1로 평형화한 니켈 아가로즈 컬럼(His Bind metal chelation resin, Novagen, U.S.A.)에 넣은 후 분당 2ml의 속도로 통과시켰다. 이어서 50ml의 완충용액 1을 컬럼에 흘려 수지에 흡착되지 않은 단백질을 제거하였다. 그 다음, 0.0 내지 1.0M 선형 농도 구배의 이미다졸 (Imidazole)을 포함하는 400ml의 완충용액 1을 가하여 수지에 흡착되어 있던 단백질들을 분당 2ml의 속도로 용출시켜 각 10ml의 분획들을 수집하였다. 수집된 분획들을 15% SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기 영동하여 CSBP-1 을 포함하는 특정 분획들만을 별도로 수집하여 취합하였다. 이 단계의 시료들을 도 4에 나타내었다.

(단계 4) 투석.

상기 단계 3에서 취합된 단백질 용액을 투석막 (Spectrum Co, U.S.A., MW Cut-off: 12000 )에 넣은 후, 4 리터의 완충용액 2( 25mM 트리스, 1mM EDTA, pH 8.0) 에서 투석하여 주었다.

(단계 5) 히스티딘 잔기의 제거.

상기 단계 4에서 투석이 완료된 단백질 용액에 1/100 되는 양의 사람 트롬빈을 넣은 후 , 37℃에서 10분간 반응시킨후, 1mM 되게 PMSF 를 넣어주어 반응을 종결시켰다. 이렇게 해서 아미노 말단에 있는 6개의 히스티딘 잔기를 제거하여 주었다.

(단계 6) 젤 여과 크로마토그라피.

상기 단계 5에서 수거한 시료를 한외여과기 (Amicon Co, U.S.A., MW Cut-off: 10000) 에 넣어 단백질의 농도가 15mg/ml 이상이 되게 농축하여 주었다. 농축된 단백질 시료를 수퍼덱스-200 FPLC 컬럼( Superdex-200, FPLC, Pharmacia, Sweden)에서 0.5ml/min의 속도로 젤 여과하여 1분당 1개의 분획으로 수거한 후 SDS-PAGE를 수행하여 고순도의 MAPK 단백질을 수거하였다. 이 때의 용출 결과를 도 5에 나타내었다.

(단계 7) 음이온 교환 크로마토그라피.

상기의 단계 6에서 취합된 단백질 시료를 완충용액 2에서 투석하여준 후 모노-Q 음이온 교환수지를 이용하여 FPLC 장치를 사용하여 정제하였으며 그 결과를 전기영동하였다(도 6 참조)

이로써 대량의 CSBP-1 이 고순도로 정제되어짐을 확인할 수 있었다.

<실시예 5> 트롬빈에 의한 히스티딘 융합부위 절단조건 확인.

CSBP-1 의 아미노말단에 위치하는 6개의 히스티딘 부위의 절단조건을 확인하기 위하여, CSBP-1 과 트롬빈을 1/100 이 되게 섞어준후, 37℃ 물 중탕에서 반응시킨 후, 각각 5분, 20분, 40분, 60분, 90분, 120분에 시료를 취하여 전기영동하여 그 절단정도를 확인하였다. 또한 CSBP-1 만을 37℃ 물 중탕에서 보관한 후, 같은 시간에 시료를 취하여 온도에 의해 절단된 정도를 전기영동하여 확인하였다(도 7 참조). 그 결과 주어진 반응조건에서 20분 이내에 아미노말단의 융합 부위가 완전히 제거됨을 확인할 수 있었다.

<실시예 6> 인산화 측정.

정제된 CSBP-1 의 활성을 이 단백질에 의해 인산화되는 MBP 와 ATF-2단백질의 인산화를 통해 알아보았다. 정제된 CSBP-1 20 ng에 MBP 와 ATF-2 단백질을 각각 100 ng 넣어준 후 γ-32 P을 갖고 있는 ATP (Amersham 사, 미국)를 2 μl씩을 넣어주었다, 전체 부피가 30 μl가 되게 반응완충용액 (30mM HEPES, pH 8.0, 1mM DTT, 1mM 벤자미딘, 10 mM MgCl₂)을 넣어주었다. 37℃에서 30분간 방치한 후 얼음그릇에 넣어 반응을 종결시켰다. 각 시료에 동량의 전기영동용 시료용액을 넣어준 후, 12% 아크릴아미드젤에서 전기영동하였다. 전기영동 후, 젤을 건조기에서 건조 시킨 다음 방사선용 필름에서 감광하여 발색시켰다(도 8 참조). 그 결과 정제된 CSBP-1 이 인산화의 고유 성질을 갖고 있슴을 확인할 수 있었다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 방법에 의하여 CSBP-1 을 제조하면

대장균을 숙주세포로 이용하여 발현량을 높일 수 있고 또한 CSBP-1을 생산하는 대장균을 충분히 성장시킨 다음 유전자 발현을 유도하며 저온에서 배양함으로써 그 발현량을 극대화시킬 수 있으며 친화크로바토그라피 등을 이용함으로써 고순도로 정제할 수 있다. 또한 본 발명의 방법을 이용하면 활성형의 CSBP-1 을 간단하게 제조할 수 있다.

〔서열목록〕

서열번호 : 1

서열의 길이 : 36

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

〔서열목록〕

서열번호 : 2

서열의 길이 : 34

서열의 형 : 핵산

쇄의 수 : 1본쇄

형태 : 직쇄상

서열의 종류 : 기타 핵산 (올리고 뉴클레오타이드)

Claims

인간 CSBP-1(Cytokine-Suppressive Anti-inflammatory Drug-Binding Protein 1) 유전자를 포함하는 대장균 발현벡터 pET15CSBP1.
제 1 항의 발현벡터로 형질전환시킨 대장균 형질전환체 BL21(DE3)/pET15CSBP1(수탁번호: KCTC 0454BP).
발현벡터 pET15CSBP1FMF를 대장균에 형질전환시킨 후 이를 배양하고 파쇄하여 조세포액을 얻은 다음 원심분리하여 가용성 단백질을 분리한 후 친화크로마토그라피를 수행하고 아미노말단의 히스티딘 잔기를 제거하여 정제하는 것을 특징으로 하는 활성형 CSBP-1 의 제조방법.
제 3 항에 있어서, 상기 형질전환체를 35℃∼40℃에서 충분히 성장시킨 후 저온에서 배양하여 CSBP-1 의 발현량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 활성형 CSBP-1 의 제조방법.