KR19990077126A

KR19990077126A - 조영제

Info

Publication number: KR19990077126A
Application number: KR1019980705262A
Authority: KR
Inventors: 볼프강 군터; 케네쓰 켈라; 데니스 키요시 후지; 비네이 데사이; 크리스토퍼 블랙; 마샬 비버; 제니퍼 웰론스; 안느 키예르스티 팔비크; 안느 내베스타드; 죠지 나; 바바라 유안; 잭 스티븐스; 브라이언 위클리; 토르그림 엥겔; 미첼 가세크; 데이비드 리 라드; 재스비르 싱; 에드워드 리챠드 베이컨; 그레고리 린 맥인티어; 로버트 알란 스노우
Original assignee: 토브 아스 헬지; 니코메드 이메이징 에이에스
Priority date: 1996-01-10
Filing date: 1997-01-09
Publication date: 1999-10-25
Also published as: US6123920A; GB9600427D0

Abstract

본 발명은 혈액 체재를 연장하는데 사용되는 복합 나노입자들, 바람직하게는 산화 개열된 녹말 코팅과 임의로 관능화된 폴리알킬렌 옥사이드 코팅을 구비한 초상자성 철 산화물 코어 입자를 포함하는 입자들을 포함하는 MR 조영제에 관한 것이다.

Description

조영제

예를 들어 X-레이, 초음파 및 자기 공명(MR) 영상과 같은 진단 영상 양식에서, 상이한 조직 또는 기관간의, 또는 건강 조직과 손상된 조직간의 콘트라스트를 향상시키는 조영제를 사용하는 것은 잘 알려진 기술이다. 상이한 영상법에서는, 조영제에 의한 콘트라스트 향상의 방법이 다르다. 따라서, 예를 들어 양성자 자기공명(MR) 영상에서는 조영제는 일반적으로 영상을 발생시키는데 사용되는 MR 신호가 유래되는 영상핵(일반적으로 물 양성자)의 특징적인 이완시간(T₁및 T₂)을 조절함으로써 콘트라스트 향상효과를 낸다.

생물체에 주입되었을때, 상자성, 초상자성, 강자성 및 페리자성과 같은 자기 특성을 가지는 물질들은 조직의 물양성자의 T₁및 T₂(또는 T₂*)의 감소를 야기한다. 비록 T₂(또는 T₂*)의 감소 없이 T₁의 감소가 일어날 수 없지만, T₁의 부분적인 감소는 T₂(또는 T₂*)의 감소와 다르다. 만일 T₁에서의 부분적인 감소가 T₂(또는 T₂*)에서의 감소보다 크다면 MR 영상의 강도는 증가하며, 그 물질을 T₁또는 양성 조영제라고 한다. 만일 T₁에서의 부분적인 감소가 T₂(또는 T₂*)에서의 감소보다 작다면 MR 영상의 강도는 감소하며, 그 물질을 T₂또는 음성 조영제라고 한다.

초상자성, 페리자성 및 강자성 등의 자기특성을 가진 입자들을 지금부터 자기 입자들이라고 한다.

자기 물질들을 MR용 조영제로 사용하는 것에 관한 문헌에서의 최초의 제안은 1978년에 라우트부르(Lautebur)에 의한 망간염을 사용하는 것이었다. 특허문헌에서의 최초의 제안은 EP-A-71564호 (및 동일 US-A-4647447호)에서 쉐링(Schering)에 의한 란탄 이온 Gd(III)과 같은, 상자성 금속 이온의 킬레이트 착화합물을 사용하는 것이었다.

GdDTPA(쉐링, 상표명 MAGNEVIST), GdDTPA-BMA(니코메드사, 상표명 OMNISCAN) 및 GdHP-D03A(브라코, 상표명 PROHANCE)와 같은 초기의 상업적인 MR용 조영제는 모두 상자성 란탄 이온의 용해성 킬레이트 착화합물로서, 사용시 이들이 분포되어 있는 영역의 영상 강도를 향상시키는 양성 조영제였다.

계속하여, 입자로 이루어진 강자성, 페리자성 및 초상자성 조영제들이 음성 MR 조영제로 사용하기 위해 제조되었다. 지금부터는 자기 입자로 명명되는, 이러한 입자성 조영제의 경구용 제제(예를 들면 니코메드 이메징사의 제품 ABDOSCAN)는 위장내 경로의 영상화를 위하여 상업적으로 시판되어 왔다. 그러나 이러한 입자성 조영제의 비경구 투여 또한 이질적인 입자성 물질을 혈액으로부터 상대적으로 빨리 제거하는 간 및 지라와 같은 기관들의 영상화를 위해 널리 제안되어 왔다. 따라서, 예를 들어 이러한 조영제를 사용한 간 및 지라의 영상화는 US-A-4859210호에서 널리 제안되었다.

좀더 최근에는 예를 들면 US-A-5160725호 및 WO-94/21240호에서 필그림(Pilgrim)에 의해, 세망내피계에 의해 비경구로 투여된 자기 입자들의 혈액으로부터의 수집이 장애를 받게 되므로, 자기 입자 표면에 안정화제 물질을 화학적으로 결합시킴으로써 혈액 체재 시간을 연장시키는 것이 제안되었다.

이 방법에서 안정화제로 사용되는 물질의 예로는 올리고당 및 다당류와 같은 탄수화물, 폴리아미노산, 올리고 및 폴리뉴클레오티드 및 폴리알킬렌 옥사이드(폴록사머 및 폴록사민) 및 US-A-5160725호 및 WO-94/21240호에서 필그림, PCT/GB94/02907에서 니코메드, US-A-5464696에서 브라코 및 US-A-4904479에서 일럼(Illum)에 의해 제안된 다른 물질들이 있다.

이 방법에서 코팅된 자기 입자들은 혈액 수집제(즉, 맥관구조의 영상을 위해)로 사용될 수 있거나 또는 림프 노드 영상, 또는 이들은 바이오타게팅 제제와 결합하여 타게팅 조직 또는 기관을 영상화하는데 사용된다.

혈액 수집제로서 투여될 때, 혈액 양성자의 T₁의 부분적인 감소가 T₂(또는 T₂*)의 부분적인 감소보다 큰 자기 입자들이 발견되었고, 따라서 이러한 제제는 맥관구조에서 양성 MR 조영제로 사용될 수 있다.

비경구로 사용할 경우, 복합 입자들의 크기 및 크기 분포와 전체 입자 표면의 화학적 특성은 콘트라스트 발생 효능, 혈액 반감기 및 조영제의 생분포 및 생분해를 결정하는데 있어서 매우 중요하다. 이상적으로 자기 입자 크기 (즉, 자기 물질의 결정체 크기)는 단일 영역 크기 범위내 (입자들은 초상자성이라서 이력현상(hysteresis)을 보이지 않고 응집 경향이 감소할 정도로)이고 전체 입자 크기 분포는 좁아서 입자들이 균일한 생분포, 생제거 및 콘트라스트 효과를 가진다. 바람직하게는 자기입자들은, 예를 들어 혈액 반감기를 연장하거나 안정도를 증가시키거나 또는 종양부위와 같은 타게팅 부위에 우선적으로 분포되도록 하는 타게팅 벡터로서 작용함으로써, 입자의 생분포를 조절하는 물질의 표면 코팅을 갖추어야 한다.

자기 코어 물질의 평균 결정체 크기는 1 내지 50 nm, 바람직하게는 1 내지 20 nm, 특히 바람직하게는 2 내지 15 nm이고, 혈액 수집제로 사용하기 위해서는 어떤 코팅 물질을 포함하더라도 평균 입자 크기는 바람직하게는 30 nm 이하이어야 한다(입자 크기는 전자 현미경으로 측정할 수 있다). 이러한 크기들을 갖는 초상자성 결정체 또는 복합 입자를 제조하는 것은 그 자체로는 특히 문제될 것은 없다. 그러나, 원하는 크기 및 양호한 크기 분포를 갖고 부적당한 입자 응집물이 없는 입자들을 제조하는 것은 문제이고, 이 문제의 해결이 본 발명의 일면이다.

보통, 자기 결정체는 액상 침전물, 일반적으로 중합체 코팅제 용액 내에서 (예를 들어, US-A-4452773호에서 몰데이(Molday)에 의해 설명된 것과 같은 공침전 기술을 사용하여) 제조된다. 이 기술은 예를 들어 원심분리 또는 크로마토그래피에 의한 연속적인 크기 분류 단계를 필요로 하는 상대적 다분산 입자들의 발생을 초래한다. 예로서「Advanced Magnetics」의 AMI 227 제품을 생산하는 기술등이 있다.

이제 분지형(分枝形) 중합체를 함유하는 수성 매질내에서의 침전과, 계속하여 중합체를 개열하여 자기 입자 및 개열된 중합체 코팅을 포함하는 복합입자를 방출하는 것에 의해, 특별한 장점을 가지고 있는 자기 입자들이 제조됨이 밝혀졌다.

발명의 요약

따라서 본 발명의 일면은 친수성 분지형 유기 중합체를 함유하는 수성 매질내에서 자기입자, 바람직하게는 초상자성 입자들의 형성단계, 및 상기 중합체를 개열하여, 바람직하게는 대부분이 단일 자기 입자인 상기 복합 입자들을 방출하는 단계를 포함하는 복합 자기 입자의 제조과정을 제공한다.

본 발명은 초상자성(superparamagnetic) 입자로 된 조영제에 관한 것으로서, 특히 맥관구조의 자기 공명 영상에 사용하기 위한 조영제 및 그 제조방법에 관한 것이다.

도 1, 2 및 3은 본 발명에 따른 조영제의 투여 후에 토끼의 전/후 T₁가중 MR 영상을 도시한다.

본 발명의 방법에 따른 친수성 분지형 유기 중합체는 어떤 천연, 합성 또는 반합성 분지형 중합체라도 무방하며, 필요하다면 선형 친수성 중합체를 그래프팅하거나 가교결합함으로써 제조할 수 있다.

분지형 친수성 중합체가 광범위하게 가교결합된 중합체인 경우에는, 본 발명의 방법에 따른 중합체의 개열은 가교결합된 중합체 매트릭스의 붕괴를 초래한다. 따라서 자기 입자들의 상당한 분해를 초래하지 않는 조건하에서 가교결합이 화학적 또는 생화학적 개열을 용인할 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 따라서 에스테르 가교결합된 히드로겔 형성 중합체(예를 들어 선형 탄수화물(예, 덱스트란) 또는 폴리비닐알코올과 같은 수산기를 함유하는 중합체를 가교결합함으로써 형성된)이 이러한 가교결합 중합체로 특히 적합하다. 만일 필요하다면, 중합체를 적절히 치환하여 에스테르 개열율을 제어할 수 있다.

이러한 점에서 에스테르 개열은 암모니아나 알칼리 금속 수산화물과 같은 염기 처리를 거친다.

그럼에도 불구하고, 본 발명의 방법에서, 친수성 분지형 중합체는 특히 바람직하게는 천연, 합성 또는 반합성 탄수화물, 특히 수성겔을 형성하는 물질 및 더욱 바람직하기로는 예를 들어 글리코겐과 같은 다당류 또는 더욱 바람직하기로는 녹말이다. 만일 필요하다면, 본 발명의 방법에서는 적어도 하나는 분지형인 친수성 중합체들의 복합물을 사용한다. 중합체로 녹말을 사용하는 경우, 이는 천연 녹말 또는 예를 들어, 산처리, 효소 처리 또는 용해성 녹말과 같은 가공된 녹말이다. 천연녹말, 특히 옥수수, 감자, 쌀 또는 밀 녹말과 같은 식물성 녹말이 특히 바람직하다.

천연 녹말은 일반적으로 선형 아밀로오스 및 분지형 아밀로펙틴 다당류가 합쳐져 있다. 발명을 수행하기 위해서는, 아밀로오스 함량은 적당하여, 분산상에서 실질적으로 불용성인 미세결정질상으로의 거의 비가역적인 전환인, 퇴화(retrogradation)를 야기할 정도로 높지 않는 것이 바람직하다. 이러한 이유로 아밀로펙틴이 풍부한 감자 녹말을 사용하는 것이 옥수수 또는 밀 녹말보다 바람직하다.

본 발명에 따라 사용된 중합체 물질이 수성 매질에서 용해 및 열처리에 영향을 받는, 예를 들어, 입자상태에서 처음에는 팽창하였다가 부분적으로 용해하는 녹말과 같은 물질인 경우, 반응 매질의 열적 내력(thermal history)은 최종 제품의 특징에 영향을 미친다. 이러한 경우에, 점성과 매질의 구조를 더 잘 제어하는 열적 내력이 바람직하다. 따라서 특히 녹말의 경우 반응 매질을 제조하고,냉각한 후 재열하는 것이 바람직하며, 예를 들면 예를 들어, 60-95℃에서 수성 분산을 형성하고, 5-80℃(예를 들어 5-60℃)에서 냉각한후 45-80℃로 재열한다. 이런 방법으로, 침전 매질에 대한 바람직한 구조를 제조한다.

분지형 친수성 유기 중합체는 수성 메질 내에 분산된 침전 종자 부위를 제공하여 균일한 작은 침전 입자가 형성되게 한다. 겔라틴 또는 덱스트란과 같은 비분지형 친수성 유기체 또는 실리카겔과 같은 무기겔을 사용하는 것은 효율적이지 않다.

친수성 분지형 중합체는 바람직하게는 주위온도 또는 주위온도 근처, 예를 들어 0-60℃에서 침전 매질이 겔 형태가 되기에 충분한 농도로 존재한다. 사용된 농도는 또한 80℃ 이하의 온도에서 겔을 제조하기에 편리하다. 녹말의 경우, 1-200 g/L, 특히 2-150 g/L, 특히 20-100 g/L, 더 특히 40-90 g/L가 바람직하다.

침전 매질이 수용성인 경우, 물 및 물과 섞일수 있는 알코올, 에테르 또는 케톤과 같은 공용매(co-solvent)의 복합물을 또한 포함한다.

상기한 바와 같이, 본 발명에 사용된 침전 매질은 겔로 불리는 물질의 콜로이드 상태인 것이 특히 바람직하다. 그러한 매질에서 중합체 겔 형성 물질은 수성 분산 매질에 의해 서로 관통되는 망을 형성한다. 이러한 겔은 일반적으로 단독의 수성 분산 매질보다 더 점성을 띠지만, 본 발명의 목적을 위해서 겔이 경질 또는 준경질 자기 지지 상태일 정도로 점성일 필요는 없다. 실제로 겔구조는 너무나 약해서 침전 매질이 단순이 자유 유동액인 것처럼 보일 수도 있다. 그러하 이경우, 매질의 겔 성질은 요변성, 즉 요동에 의한 매질 점성의 감소에 의해 쉽게 입증된다.

침전 매질이 상기에 기술한 분지형 중합체를 포함하여야 하는 반면, 이는 예를 들어 선형인 다른 겔 형성 중합체를 포함할 수도 있다. 이점에 있어서는, 사용하는 중합체의 적절한 예로는 단백질, 다당류, 단백다당류, 및 겔형성 계면 활성제, 예를 들어 F-127, F-108 및 F-68과 같은 플루론 계열 및 테트론 계열의 블록 공중합체 계면활성제가 있다. 이들 계면활성제는 본 발명의 방법에 유용한 높은 온도 및 pH를 띠는 수성 매질내에서 겔을 형성한다. 따라서, 예를 들어 겔 형태의 침전 매질은 겔 형성 선형 블록 공중합체 계면활성제와 아밀로펙틴과 같은 분지형 유기 중합체의 수성 분산을 사용하여 제조된다.

그러나 침전 매질의 겔 매트릭스는 중합체 성분들, 바람직하게는 적어도 분지형 중합체, 중 적어도 하나 이상을 화학적(또는 생화학적)으로 절단하여 자기 입자들을 방출할 수 있도록 하여야 한다. 이러한 이유로, 광범위하게 가교 결합된 중합체의 사용은 바람직하지 않다.

입자 침전은 경질 또는 준경질 겔 형태의 수성 매질에서도 예를 들어 염기로 겔을 투과함으로써 이루어지나, 가장 바람직한 침전은 물에 비해 현저히 증가한 점성을 보이기도 하고 보이지 않기도 하는, 가열되고, 요동(즉, 교반)된 수성 매질내에서 이루어진다. 특히 바람직한 침전은 부드럽게 교반하면서 40 내지 95℃의 온도에서 이루어진다.

수성 침전 매질의 요변 특성을 조정함으로써, 다양한 크기를 가지는 본 발명에 따른 복합 입자들을 제조할 수 있다.

본 발명에서 자기 입자 형성은 예를 들어, 비정형 물질 형성 과정 및 40-95℃, 바람직하게는 50-95℃의 높은 온도에서 자기 입자로의 전환 과정의 2단계 과정이다. 따라서 입자들의 자기 특성의 발달은 수분 내지 수시간 동안, 예를 들면 3시간 내에 조절될 수 있음이 밝혀졌다. 그러나, 실제로는 자기 특성의 발달은 실적으로는 2시간 이내에 완성되고 주요 자화는 20분 이내에 발달된다.

수성 매질내에서 형성되는 자기 입자들은 교반된 금속화합물을 포함하는 여하한 침전가능한 자기 금속산화물 또는 수산화물로서, 예를 들면 US-A-4827945 (그로만), EP-A-525189 (메이토 상요), EP-A-580878 (바스프) 및 PCT/GB94/02097 (니코메드) 또는 필그림(수프라)에서 논의된 화합물들이 있다. 이러한 점에서 아래 식들의 자기 철산화물 화합물에 대해 특별한 설명이 있다.

(M^IIO)_n(M^III ₂O₃)

여기서, mⁱⁱ및 mⁱⁱⁱ은 II 또는 III가 상태의 전이금속 또는 란탄 금속으로서, 적어도 하나는 Fe이고, n은 0 또는 양수인 자기 철산화물 화합물로 이루어진다. 또는 식

(M^IIO)_nFe₂O₃(M^III ₂O₃)_m

여기서, mⁱⁱⁱ은 Fe, Mg, Be, Mn, Zn, Co, Ba, Sr, 및 Cu와 같은 이가 금속이고, mⁱⁱⁱ은 Al, Yb, Y, Mn, Cr 또는 란탄과 같은 삼가 금속이고, n과 m은 각각 0 또는 양수이다.

바람직하게는 자기 입자들은 식(FeO)_nFe₂O₃(n은 0에서 1)이고 마게마이트(Y-FeO₃)와 마그네타이트(Fe₃O₄)로 대표되는 철산화물 또는 이러한 자기 철산화물들의 복합물이다.

다양한 철염들이 Fe^III및 Fe^II이온의 소스로서 사용되는데, 예를 들면, FeCl₂, FeCl₃, Fe^III시트레이트, Fe^II글루코네이트, FeSO₄, Fe₂(SO₄)₃, Fe^II옥살레이트, Fe(NO₃)₃, Fe^II아세틸락토네이트, Fe^II에틸디암모늄 설페이트, Fe^II푸마레이트, Fe^III포스페이트, Fe^III피로포스페이트, 암모늄 Fe^III시트레이트, 암모늄 Fe^II설페이트, 암모늄 Fe^III설페이트, 및 암모늄 Fe^II옥살레이트가 있다. Fe^II와 Fe^III이온의 비는 바람직하게는 1:5 내지 5:1이다.

일반적으로 염기, 바람직하게는 알카리 금속 수산화물(예를 들어, 수산화나트륨, 수산화 칼륨 또는 수산화리튬) 또는 수산화암모늄, 특히 바람직하게는 농축 수산화암모늄과 같은 수성 염기를 첨가함으로써, 침전 개시 문턱을 넘는 수성 매질의 pH를 맞추면서 침전이 개시된다. 첨가되는 염기의 pKb는 침전 개시 문턱을 넘는 수성 매질의 pH를 예를 들면 10 이상으로 하기에 충분하여야 한다.

염기는 금속 이온 및 중합체를 포함하는 수성매질에 첨가되는 것이 바람직하다. 또는, 염기와 중합체를 합하고 이어서 금속 이온을 첨가한다. 이러한 첨가는 높은 온도, 예를 들어 40 내지 95℃, 바람직하게는 50 내지 60℃에서 교반하면서 성분들의 수용액을 복합함으로써 간편하게 행한다.

침전 개시 이후에, 분지형 중합체에 의해 특정되는 금속 이온 또는 금속 수산화물의 비정형 상자성 영역내에 종자 자기 입자 결정체가 형성되어, 이들 비정형 영역은 충분히 형성된 자기 입자들로 전환한다. 따라서 입자형성은 수분 내지 수일, 예를 들어 1분 내지 24시간, 바람직하게는 20분 내지 10시간, 특히 1 내지 5시간의 선별된 기간동안 진행된다.

입자 형성이 특정화된 범위의 상한치, 예를 들어 90℃에서 이루어지는 경우에는, 매질은 이 온도에서 상대적으로 짧은 시간, 예를 들어 2시간정도만 유지한다.

만일 자기 입자를 형성하기 위해, 염기, 침전가능한 금속 이온 및 중합체가 낮은 온도에서 합해지고, 이어서 매질을 높은 온도로 가열한다면, 온도 상승률은 신중히 제어(예를 들면 10-100 ℃/시간)되어야 한다. 따라서 입자 형성동안 수성 매질의 온도는 제어되는 것이 바람직하며(예를 들어 시간에 대해 실질적으로 선형인 온도 상승), 예를 들면 2시간동안 복합 온도 55℃에서 최종 온도 90℃의 상승을 들수 있다.

입자 형성기간 후에는, 반응 매질의 pH를 예를 들어 6.0 내지 8.5로 중성화하는 것이 특히 바람직하다. 이는 겔을 형성한 후 중성이 될 때까지 세정하는 것으로서, 산(가능한 산으로는 예를 들면, 염산, 황산 및 질산) 또는 고체 이산화탄소로 매질을 중성화하거나 또는 만일 염기가 고증기압을 가진다면(예를 들어 만일 수산화암모늄이라면) 진공을 걸어 염기를 제거한다. 중성화된 매질은 즉시 더 가공할 수 있다.

이러한 중성화 단계로서의 세정은 매질이 겔을 형성하고 과도한 금속 염 및 염기를 제거하는 경우에 특히 유효하다. 세정은 바람직하게는 3 내지 15℃로 예비 냉각된 탈이온수로 이루어지고, pH가 대략 중성이 될 때까지 계속되는 것이 바람직하다.

겔을 단순히 초음파 처리하여 중합체로 코팅된 자기입자를 계속 방출하면서 중합체를 개열하지 않고 겔 매트릭스를 파열시키도록 할 수 있는 반면, 만일 중합체가 예를 들어 중합체의 분자구조를 파열함으로써 코팅된 입자를 방출하기 위해 개열된다면, 입자성 제품이 특히 좋은 특성을 가지고 있음이 밝혀졌다. 화학적 파열은 산화제 또는 염기와 같은 활성 화학매질을 사용하여 일어 날수도 있으나 또한 효소와 같은 생물학적 매질을 사용하여도 가능하다. 녹말과 같은 탄수화물 중합체의 경우 아밀라아제(예, α-아밀라아제)와 같은 효소를 사용하여 중합체를 간편하게 개열할 수 있다. 그러나, 산화제를 사용하여 중합체를 개열하는 것이 특히 바람직하다. 흔적 레벨에서의 산화제는 생물학적 내성을 가지거나, 그의 환원 제품이 유사하게 생물학적 내성을 가지며, 여기에는 할로겐 옥시애니온(예를 들어 알카리 금소 차아염소산염(차아염소산 나트륨 또는 차아염소산 칼슘)), 퍼아이오데이트(소디움 퍼아이오데이트와 같은), 퍼망가네이트(KMnO₄와 같은), 과산화물(과산화수소와 같은) 및 효소 산화제가 바람직하다. 예를 들어, 차아염소산이 산화제로 사용되는 경우 우레아의 첨가에 의해 어떠한 과량의 산화제도 연속적으로 불활성화된다. 산화제를 사용하여 중합체를 개열하는 경우, 여기에서 방출된 자기 입자는 음성의 표면전하를 가지고 입자 응집작용은 감소된다.

중합체 개열에 사용된 화학적 매질은 자기입자를 부식시키거나 또는 자기 특성을 손실하게 하여서는 안 되는 것이 바람직하다. 따라서 산성 매질을 사용하는 것은 일반적으로 바람직하기 않다.

중합체 개열이 일어나는 정도는 입자상의 코팅으로서 중합체의 잔류량을 더 적게 남기느냐 더 많게 남기느냐에 따라 변화될 수 있다. 또한 코팅이 일반적으로 바람직하며 그결과 복합 입자의 전체 크기는자기 입자 코어의 크기보다 더 크다. 선별된 개열 기술에 따라 입자의 코팅으로 남겨진 잔류물을 중합체, 또는 올리고머 또는 심지어 단량체일 수 있다.

중합체 개열 이후, 초음파 여과, 또는 다이아필트레이숀(diafiltration)와 같은 막 여과 기술을 사용하여 제품의 오염을 제거하는 것이 바람직하다.

결과적으로 전체 입자 크기는 일반적으로 1 내지 300 nm, 바람직하게는 4 내지 30 nm 및 특히 바람직하게는 8 내지 20 nm이다. 이 점에서 바람직한 중합체의 산화적 개열에서는 효소적 개열 과정에서보다 전체 입자 크기가 더 작게 되고, 양쪽 모두 겔 매트릭스를 단순히 초음파 처리하는 것보다는 입자크기가 더 작게 된다.

한 바람직한 구현예에서는, 전체 반응 시간을 줄이고, 활성화(work-up) 및 중간 생성물 취급을 피하고 코어 자기 입자에 가해지는 열을 줄일 수 있는 1단계 반응으로 복합 입자를 제조한다. 이 구현예에서는, 철(III) 및 철(II) 염(예, 염화물)을 녹말 수용액에 용해시킨 후 염기(예. 암모니아 수용액)를 첨가하여 철 산화물 임자를 침전시킨다. 70 내지 90℃에서 1 내지 3시간동안 반응시킨 후 과량의 염기를 감소시킨다(예를 들어 암모니아를 사용한 경우에는 진공 및/또는 질소를 고온의 반응 복합물에 급배출시킴으로써). 이어서 pH를 8.2 미만 또는 반응 복합물이 그 완충 능력을 상실할 때까지 감소시킨다. 이어서 복합물이 고온(예70-90℃)일 때 산화제(예, 차아염소산 나트륨)를 첨가하고 70 내지 90℃에서 만족할 만한 복합 입자의 크기에 도달할 때까지 산화시킨다. 복합 입자의 크기가 10 내지 20 nm경우는 반응 시간은 약 30 내지 120일이다. 0.47 테슬라 및 40℃에서 , 자기 포화 모멘트는 50 EMU/g FeOx 이상이고, r₁은 15 mM^-1.s^-1이고, r₂/r₁은 2.3 미만이다. 이어서 반응 복합물을 우레아로 제지하고 예를 들어 0.2 ㎛ 여과기를 통하여 여과한다. 녹말의 잔류물은 예를 들어 분자 컷오프가 20 내지 200 kD인 UF 막을 사용하여 다이아필트레이숀하여 제거한다.

"코어" 자기 입자는 바람직하게는 단일 영역 입자 크기를 가지며, 예를 들면 입자크기가 1 내지 50 nm, 특히 1 내지 20 nm, 특히 2 내지 15 nm, 가장 바람직하게는 4 내지 12 nm이다. 실제로, 본 발명에 따라 제조된 복합 입자에서, 코어 결정체는 보통 실질적으로 단일 크기로서, 주로 4 내지 12 nm이다.

본 발명의 방법은 예를 들어 광자 상관 분광기로 측정한 결과, 적어도 90%의 강도 평균 입자 크기가 10 nm이내, 바람직하게는 5 nm 이내, 더욱 바람직하게는 2 nm이내의 충분히 작은 크기 분포를 가지는 복합 입자(즉, 개열된 중합체로 코팅된 자기 입자)를 가져서 이후에 크기 분류를 할 필요가 없다. 그러나, 입자들은 보통 상대적으로 큰 직경을 가지는 필터, 예를 들어 0.1 내지 0.2 ㎛ 필터로 여과하여, 큰 중합체 단편 또는 생물학적 혹은 복합 오염물을 제거한다(입자 크기는 전자 현미경으로 측정한다).

본 발명의 방법에 따라 제조된 복합 입자는 신규한 것으로서 본 발명의 다른 면을 구성한다. 이면에서 볼 때, 본 발명은 평균 전체 입자 크기가 4 내지 30 nm이고, 개열된 친수성 중합체 물질, 바람직하게는 산화 탄수화물 물질, 특히 개열된 녹말로 코팅된 초상자성 무기 코어 입자를 포함하는 복합 입자들, 바람직하기로는 전하를 띠는 입자들을 제공한다. 바람직하게는, 복합 입자의 대부분은 단일 초상자성 코어 입자를 포함한다.

다른 면에서 볼 때, 본 발명은 초상자성 금속 산화물 코어결정체와 유기 코팅을 포함하는 콘트라스트에 유효한 양의 복합입자들을 포함하는 조영제 조성물을 제공하는데, 여기서 상기 코어 결정체의 평균 직경은 2 내지 10 nm, 바람직하게는 4 내지 8 nm이고, 상기 입자는 평균 직경이 30 nm 이하, 바람직하게는 15 nm 이하이고, 상기 코팅은 산화적으로 개열된 녹말, 바람직하게는 메톡시 PEG 포스페이트와 같은 인산화물 말단 폴리에틸렌 글리콜도 함께 포함한다.

본 발명의 방법은 2개의 별개 단계로 이루어지는데, 첫째는, 예를 들어 자기 녹말 미세표면(MSMs)(예를 들어 Schroder WO89/03675호)를 제조하는데 사용된 통상적인 공침적 기술에 의해 복합입자를 제조하는 단계와 본 발명에 따른 복합 입자를 제조하기 위해 중합체를 연속적으로 개열하는 단계이다. 이방법으로 처리되는 복합 입자는 각 복합 입자내에 다수의 자기 결정체들을 함유하며, 중합체 개열 단계에서 코팅된 모노 결정체들을 방출한다. 이러한 과정은 본 발명의 다른 면을 구성한다.

특정 응용예에서, 모든 개열된 중합체 코팅을 자기 입자로부터 제거하여 이를 다른 표면 조절제로 대체하는 것이 바람직하다. 이 경우, 산화제(바람직하기로는 과산화수소와 같은 비이온성 산화제) 또는 개열된 중합체를 소화하는 효소(예;아밀라아제)가 사용될 수도 있다. 이온성 산화제의 사용은 덜 바람직한데 이는 정전기적 안정도를 감소시켜 입체적으로 덜 안정한 개열된 중합체 코팅이 제거되는 동안 자기 입자들이 응집될 수 있기 때문이다. 개열된 중합체가 제거되기 전에, 자기 입자에 결합하여 정전기정 안정도를 현탁액에 분배하는, 이인산 나트륨 또는 삼인산 나트륨과 같은 정전기적 안정화제와 같은 안정화제를 첨가하는 것이 바람직하다. pH는 중성 또는 약알카리성으로 유지(수산화 나트륨을 첨가하여)하는 것이 바람직한데, 이는 산성 pH가 인산염 안정화제에 양성자를 첨가하여 응집을 형성할 수 있기 때문이다. 녹말로 유도된 개열된 중합체로 코팅된 자기 입자(아래의 실시예에 의해 제조된)를 이인산 나트륨 및 과산화수소와 함께 50-60℃로 3 내지 24시간동안 배양한 결과 실질적으로 모든 잔류 녹말 유도 개열된 중합체 코팅을 제거하기에 충분함이 밝혀졌다. 결과 입자는 평균 입자 크기가 약 9 nm이고 주위온도의 현탁액내에서 증기 살균 조건에서 안정하였다.

이러한 정전기적으로 안정한 자기 입자의 안정한 현탁액은 신규한 것으로서 본 발명의 다른 면을 구성한다. 이면에서 볼 때 본 발명은 평균 전체 입자 크기가 4 내지 30 nm인 초상자성 무기 코어 입자의 수성 현탁액을 제공하는데, 상기 입자는 실질적으로 유기 코팅 물질이 없고 표면에 결합된 무기 정전기적 안정화제를 수반한다.

중합체 개열 및 방출된 입자들의 바람직한 세정 및 여과후에, 입자들은 2차 물질 코팅을 거치는데, 이는 보완 활성화 효과를 감소시킴으로써 생물학적 내성을 증가시키고, 혈댁 수집 잔류 시간을 증가시키고, 조직 타겟팅력을 제공하고, 쉐프(shelf) 안정도를 증가시키거나 또는 오토클레이브 내성을 향상시키기 위해서이다.

또는 2차 코팅 물질을 초기 단계, 즉 자기 입자 형성 전이나 자기입자 형성후 중합체 개열 전 단계에서 도입할 수도 있다.

특히 바람직하게는, 2차 코팅 물질은 천연 또는 합성 구조형의 다당류, 합성 폴리아미드 또는 PCT/GB94/02907에 기술된 생리학적으로 내성을 가지는 합성 중합체 또는 필그림 또는 일럼(수프라)에 의해 기술되는 안정화제 코팅이다. 특히 바람직하게는 2차 코팅 물질은 폴리알킬렌옥사이드(즉, 폴록소머, 폴록사민, 폴리에틸렌 글리콜등)이거나 헤파리노이드이고, 특히 바람직하게는 옥시산 작용기(예를 들어, 황, 탄소, 또는 인산 옥시산)와 같은 작용기를 수반하는 물질로서, 이로 인해 코팅 물질이 복합입자, 특히 코어 자기물질에 화학적으로 결합되거나 부착된다. 이러한 면에서 필그림에 의해 기술된 US-A-5160725 및 WO-94/21240에서 메톡시-PEG-포스페이트(MPP) 및 다른 폴리알킬렌옥사이드 물질에 대해 특별한 설명이 있다. 또한 MPP의 인산기 외에 다른 친철원소(siderophil)로 말단 관능화된 친수성 중합체를 사용함으로써 MPP의 장점이 밝혀 질수 있다. 이러산 기로는 살리실레이트가 있다. PEG는 4-아미노-살리실산 또는 5-아미노-살리실산(양쪽 모두 실질적으로 생물학적으로 무해함)을 결합함으로써 이것으로 관능화될 수 있다.

이외에 적당한 2차 코팅 제제는 피리딘 질소에 PEG와 같은 친수성 중합체를 수반하는 3-히드록시-4-피리디논이 있다. 1,2-디메틸-3-히드록시-4-피리디논과 같은 단순한 유사체는 예를 들어 과도한 적혈구 수혈을 받은 사람의 경우 인체에 과량의 철을 피하기 위해 임상적으로 사용된다. 이들 종은 Fe^III의 공지된 최대 결합상수, 즉 로그-베타(3) 35를 갖는다. 여기에 간편하게 적용할 수 있는 몇가지 합성 방법이 있다. 중합체(PEG)는 2-메틸-3,4-디히드록시피리딘의 질수의 알킬화에 의해 부착될 수 있다. PDG는 또한 2-메틸-3-히드록시피리딘의 알킬화 및 4-위치에서 결과물의산화에 의해 부착될 수 있다. PEG는 또한 1차 아미노기를 가지는 PEG를 3-히드록시-2-메틸-4-피론과 반응시킴으로써 부착될 수 있는데, 여기서 고리 산소원자를 질소로 대체하고 3-히드록시-4-피리디오논을 한번에 형성한다.

1-PEG-2-메틸-3-히드록시-4-피리디논

PEG 중합체를 철산화물 표면에 부착시키는 또다른 방법은 이들을 페레독신/페리옥사민으로 예시되는 박테리아 친철원소기 중 하나에 연결하는 것이다. 페리옥사민은 아실화 또는 알킬화에 의한 적절한 PEG 유도체를 부착시키는데 사용하는 아미노 말단 작용기를 가지고 있다.

2차 코팅 물질을 철산화물 표면에 부착시키는 또다른 방법은 철 결합기의 올리고머 또는 중합체, 예를 들어 MPP의 모노포스페이트 말고, 디포스페이트, 트리포스페이트 및 고중합체와 같은 포스페이트를 사용하는 것이다. 이러한 올리고 및 폴리포스페이트는 철산화물 표면에 매우 강하게 결합되는데, 이는 아마도 결합 부위가 많기 때문이며, 결합 반응은 단순하고 쉽게 수행된다. 따라서 예를 들어, 아래의 실시예세서 언급할 메톡시-PEG-포스페이트 대신에, 메톡시-PEG-디포스페이트 또는 메톡시-PEG-트리포스페이트를 사용할 수도 있다. 올리고 및 폴리포스페이트, 설페이트 및 술포네이트 또한 다른 벡터 또는 리포터기(아래에 설명할 것임)를 자기 입자에 결합시키는데 사용할 수 있다.

산화물 표면에 2차 코팅 물질 또는 다른 벡터 및 리포터기를 결합시키기 위하여 상기에 논의된 각종 포스페이트 결합기를 사용하는 것 대신에, 인산 결합기, 즉 메톡시-PEG-포스페이트를 사용할 수 있다. 이는 각종 장점을 제공하는데, 특히 MPP의 P-O-C 연결을 P-C 연결로 대체하는 것으로 인한 탈수 안정도의 증가, 산화물 표면에의 결합력 증가, 및 자기 결정체-연계기-벡터/리포터 콘쥬게이트를 제조할 때 연계기로 유용한 헤테로 이관능성 PEG-포스페이트를 더 잘 제조할 수 있게 하는 화학 안정도 증가가 있다.

따라서, 예를 들어 아래와 같은 헤테로이관능성 연계기는 자기 입자들을 단백질, 단백질 단편, 올리고펩티드 및 다른 펩티드 벡터에 연결하는데 잘 사용된다.

따라서 식 A 내지 E의 연계기는 반응성 티올 또는 아민기를 가지는 펩티드 성분에 연결되어 포스포네이트기를 통해 자기 입자에 연결된다.

PEG 또는 다른 벡터/리포터기를 자기 입자에 부착하는 다른 적절한 결합기로는 히드록사메이트, 카테콜, 아스코르베이트 및 디페리옥사민기와 같은 철이온에 대한 고결합성을 가지는 다른 기를 포함한다.

2차 코팅물질의 분자량은 특별히 임계적이지가 않으며 보통 0.1 내지 1000 kD의 범위내이나, 0.3 내지 20 kD, 특히 0.5 내지 10 kD, 특히 1 내지 5 kD가 바람직하며, 예를 들면 적어도 60개의 알킬렌 옥사이드 반복 단위를 가지는 폴리알킬렌 옥사이드 물질이 있다.

2차 코팅 물질의 무기 코어 입자에 대한 중량비는 바람직하게는 0.02 내지 25 g/g, 특히 0.4 내지 10 g/g 및 특히 0.5 내지 8 g/g이다.

본 발명의 방법에 따라 제조된 이중 코팅된 복합 입자의 한 장점은 입자 크기 또는 크기 분포의 현저한 감소 없이 오토클레이브 살균(즉, 121℃에서 15분간)할수 있다는 것이다. 이는 무균조건에서의 초기 처리과정을 거칠 필요가 없어 매우 경제적이라는 면에서 특히 중요하다.

2차 코팅 물질을 제공하는 것 이외에, 다른 후제조 조절과정이 본 발명의 복합입자의 제조에 행해질 수 있다. 따라서 특히 입자들은 잔류 탄수화물 코팅을 결합시키기 위해 관능성 제제로 처리되고, 바이오타게팅 부분(항체, 항체 단편, 펩티드 또는 인슐린과 같은 생물질등) 또는 리포터기(즉, X-레이, MR, 초음파, 광영상등에 의한 진단용 영상기기에 의해 감지되는 기들)는 통상적인 화학적 기술을 사용하여 코팅 물질에 연결될 수 있다. 또한 적절한 타게팅 벡터 또는 면역활성적인 기들은 WO-93/21597호에서 설명되어 있다.

보통, 자기입자와 이러한 바이오타게팅(벡터) 및 리포터간의 결합은 아래식으로 표현된다.

MP - X - L - V

여기서 MP는 자기 입자(임의로 상기에 기술된 개열된 중합체 코팅을 구비함); X는 입자의 표면에 결합할 수 있는 기(앵커)(예; 포스페이트, 올리고 또는 폴리포스페이트, 포스포네이트, 히드록사메이트 또는 상기에 논의된 다른 친철원소); L은 적어도 하나의 X기를 적어도 하나의 V기에 연결시키는 결합 또는 더 바람직하게는 연계 기(바람직하게는 분자량 1000 내지 10⁶의 유기쇄, 예를 들어 분자량 2 내지 50 kD의 PEG기) ; 및 V는 벡터 또는 리포터기 즉, 자기 입자의 생분포를 조절하거나(선별된 기관, 조직 또는 병리부위에 더 잘 분포되도록), 진단용 영상기술에 의해 감지할 수 있는 기(예를 들어, 킬레이트중금석이온, 중금속원자군, 상자성 금속 이온 또는 금속 방사성핵종, 또는 가스 미세포말 또는 포말 제조기, 비금속 방사성핵종, 수소 외의 비금속 비영 핵스핀 원자(예, F 원자), 비금속 중원자(예:I), 발색단, 형광단, 약 등)이다.

이런 방법으로 광범위한 벡터와 리포터들이 자기 입자에 결합된다. 타게팅 벡터의 예로는 PEG(광범위한 혈액 수집 체재를 야기하는), t-PA, 스트렙토키나아제 및 우로키나아제로서 전체 단백질 또는 결합 영역을 가지는 선택된 단편, RGD를 포함하는 펩티드 및 유사한 혈소판 리셉터 결합 모티브; 및 아테롬성 동맥경화증 플라크 결합 펩티드(예, 아포리포단백질 B 단편 SP-4)가 있다. t-PA는 제넨테크사에서 판매한다. RGD 펩티드는 US-A-4589881, US-A-4661111, US-A-4614517 및US-A-5041380호와 같은 각종 특허 공보에 기술되어 있다. 사용되는 RGD 펩티드 로는 Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro-Ala-Ser-Ser-Ala-Tyr-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Lys-Lys-CoNH₂로서 Lys-Lys-CONH₂말단과 결합가능하다. 이는 고체 상태 펩티드 합성과 같은 표준 올리고펩티드 합성 기술에 의해 제조된다. (Tyr)-Arg-Ala-Leu-Lys-Val-Asp-Thr-Leu-Lys-Phe-Val-Thr-Gln-Ala-Glu-Ala-Lys-CONH₂((Tyr))은 요오드로 방사성 식별할 수 있게 첨가됨)의 형태인 SP-4는 Lys-CONH₂말단을 통해 결합하여 사용될 수 있다. 이것도 표준 기술에 의해 제조된다.

V가 킬레이트 금속인 경우, 연계제는 DTPA, EDTA, DO3A 잔류믈등과 같은 적절한 킬레이팅 부분을 포함한다. 이러한 기들은 진단용 조영제 분야에서는 잘 알려져 있고 관능도에 부착된 백본(backbone)(예CH₂OSCN)을 통하거나 금속 결합 기중의 하나(예; CH₂COOH)를 통해 결합된다.

금속 이온 자체는 영상 양식에 따라 선택되는데, 예를 들어 신티그램 조영법 경우에는 TMT에 의해 킬레이트된⁹⁰Y 또는 형광 영상의 경우에는 TMT 킬레이트된 유로퓸(Eu)이다.

X-레이 영상의 경우에는 요오드화된 유기포스페이트(또는 포스포네이트, 또는 올리고 혹은 폴리포스페이트)를 사용하는 것이 편리한데, 이는 이러한 화합물들이 자기 입자를 안정화시키면서 X-레이 조영제로 쓰이기 때문이다(입자들의 방사성용량을 증가시키기 때문).

적절한 요오드화된 유기포스페이트의 예로는

여기서 R¹및 R²는 임의로 그러나 바람직하게 히드록시화된 C_1-6알킬기이고, R³는 연계기로서 1 내지 6개의 탄소 원자 사슬을 제공한다.

X-L-V화합물은 자기입자에 부착되는 다수의 앵커 부위를 가져야한다. 따라서 바람직한 X-L-V 화합물은

또는,

여기서, L₁및 L₂는 연계기 L의 성분이고, p는 2이상, 즉, 2, 3, 4 또는 5이다. 따라서 예를 들어 1 내지 4개의 앵커기를 갖는 PEG 포함 구조는 다음과 같다.

V-(PEG)-OC-CH₂-N(CH₂X)CH₂(CH₂N(CH₂X)CH₂)_rCO(PEG)-V[X(CH₂)_S]-CH₂-Y-(PEG)-V

V-PEG-CONH-(CH₂)₅N(OH)CO(CH₂)₂CONH(CH₂)₅N(OH)CO-(CH₂)₂CONH(CH₂)₂N(OH)COCH₃

여기서 r은 1, 2 또는 3,

s는 1 내지 6,

Y는 CONH 또는 NHCO,

(PEG)는 폴리에틸렌글리콜 사슬 및

X는 CONHOH, -CONH-비스히드록시페닐 또는 -CO-O-비스히드록시페닐(인접탄소에 두 개의 히드록시기를 갖춘)이다.

리포터 또는 벡터가 이런 방법으로 결합하는 경우에는, 입자를 효율적으로 타게팅하는 충분한 벡터가 존재 및/또는 선별된 양식에 의해 입자를 감지하는 충분한 리포터가 존재하도록 입자당 개수 및 도즈(dose)당 개수를 명확하게 선택한다.

따라서 본 발명의 한 바람직한 구현예에서는 아래의 단계들을 포함한다: (ⅰ)가열된 수용액 내에서 녹말, 제1철염 및 제2철염 및 염기를 결합시키는 단계, (ⅱ) 임의로, 상기 용액을 15℃ 이하로 냉각시켜 겔을 형성하는 단계, (ⅲ) pH를 6.0 내지 8.5로 감소시키는 단계, 이 단계는 단계(ⅱ) 이전에 임의로 행한다, (ⅳ) 산화제, 예를 들어 할로겐 산화음이온 산화제로 처리하여 녹말을 개열하고 상기 입자를 방출하는 단계, (ⅴ) 방출된 입자들을 세정, 및 여과하는 단계, (ⅵ) 임의로, 방출된 입자를 관능성 폴리알킬렌 산화물 유도체와 반응시켜 상기 유도체를 상기 입자들에 결합시키는 단계; 및 (ⅶ) 임의로, 방출된 입자들을 오토클레이브 살균하는 단계를 포함한다.

단계 (ⅲ)은 예를 들어 감압하에서 단계(ⅱ) 이전에 과량의 물과 염기(예; 수산화암모늄)를 제거함으로써 이루어지거나 또는 단계(ⅳ) 이전에 산(예; 염산)을 첨가하여 과량의 염기를 조절함으로써 이루어진다.

개열된 친수성 중합체 코팅 및 무기 입자 표면에 혈액 수명 연장 친수성 중합체를 구비한 무기 코어 입자를 포함한 복합 입자는 두 개의 코팅중 하나만 구비한 입자의 경우보다 혈액 수명이 상당히 향상되었음이 밝혀졌다. 이는 개열된 중합체가 혈액 수명연장 중합체의 입자 표면 결합 부위를 가려서 무기입자로부터 혈액 수명 연장 중합체의 생체 내(in vivo) 개열을 연기시키는 결과 일어난다.

이러한 면에서 볼 때 본 발명은 그 표면에 친수성 혈액 수명 연장 중합체(바람직하게는 메톡시-PEG-포스포네이트, 특히 바람직하게는 말단 관능화된 선형 중합체 및 바람직하게는 분자량이 신장 문턱 분자량 이하로서 0.2 내 30 kD, 특히 1 내지 10 kD인 중합체와 같은, 관능화된 폴리알킬렌옥사이드)가 화학적 또는 물리적(바람직하게는 화학적)으로 결합된 무기 입자 코어(바람직하게는 금속 또는 복합 금속 옥사이드, 특히 초상자성 철산화물 입자)를 포함하고 친수성 유기 중합체 코팅, 예를 들어 개열된 분지형 탄수화물, 즉 산화녹말을 차폐하는 결합 부위가 구비된 주사가능한 복합 입자성 조영제를 제공한다.

이러한 입자들은 혈액 수집 제제 또는 상기에 기술한 바이오타게팅 벡터에 결합될 수 있다. 이들 입자들은 또한 임파관 조영법, 즉 아이브이 또는 피하 투여에 사용된다. 이들 입자들의 무기 코어는 초상자성 철 산화물이 바람직하지만, 만일 필요하다면 다른 금속 화합물, 즉 방사성 핵종이 삽입된 화합물, 또는 다른 치료용 또는 진단용으로 유효한 금속도 사용가능하다.

본 발명의 입자를 포함하는 초상자성 결정체의 이완도는 코어 및 코팅 입자의 크기 및 조성(또한 온도와 적용되는 자기장)에 따라 변한다. 0.5 테슬라에서 T₁이완도(r₁)는 5에서 200이고, T₂이완도(r₂)는 5에서 500이다(이완도는 (mMFe)^-1(sec)^-1). r₂/r₁비율은 0.47T 및 40℃에서 1 내지 100 이상, 예를 들어 1 내지 10, 바람직하게는 1.2 내지 3으로 변한다. 작은 단일 결정체 입자의 r₂/r₁비율은 낮으며 큰 입자 또는 다결정체 입자는 높은 비율을 보인다. 만일 입자들이 초상자성을 보인다면, 0 내지 약 1T 범위의 입자의 자화는 결정체 크기에 따라 달라지며, 큰 결정체는 큰 자화를 갖는다. 1T에서 자화는 약 20 내지 100이고, 바람직하게는 30 내지 90 emu/g 철산화물이다.

초상자성 입자들이 Fe^II및 Fe^III의 염기 침전에 의해 제조되는 경우, 0.47T 및 40℃에서의 r₂/r₁비율은 3 미만이다. 그 결과, T₁가중 영상에서는, 본 발명에 따라 제조된 입자들은 양성 조영제로서 효율적이다. 더욱이, 이러한 입자 현탁액의 자화곡선은 4T의 높은 자기장력에서도 입자들을 충분히 자화되지 않음을 보여준다. MR 영상 기기에서 통상적으로 사용되는 자기장력에서 입자들이 불충분하게 자화되는 것은 MR 영상에서 존재하는 대자율이 감소됨을 의미한다. 더욱이 본 발명의 입자들의 이완도는 통상적인 철산화물 입자와 같이 증가되는 전장력에 대해 급속히 감소되지 않는다.

통상적인 MR 영상에서는, 수년동안 주자기장력이 1 내지 1.5T인 높은 자기장 기기를 사용하려는 요구가 있어왔다. 그러나 낮은 자기장 기기의 사용이 증가하고, 몇몇 시판되는 영상기의 낮은 자기장(0.1 내지 0.3T)에 유용한 양성 MR 조영제에 대한 요구가 있어왔다. 이러한 요구는 마그네비스트(Magnevist)와 같은 통상적인 금속 킬레이트에 근거한 양성 MR 조영제보다 효능이 적어도 3배 이상인 본 발명의 입자의 요구를 충족하므로, 따라서 본 발명의 다른 면은 양성 조영제가 대상에 투여되고 상기 대상의 적어도 일부의 영상이 MR 영상 기기를 사용하여 나타나고, 이때 상기 기기는 0.3T 이하의 자기장을 가지는 주 자석을 가지고, 상기 양성 조영제는 생리학적으로 내성을 띠는 탄수화물 코팅을 가지는 자기 입자를 포함하고, 상기 입자는 상기 자기장에서, 바람직하게는 2T 이하, 특히 4T 이하의 자기장에서 불충분하게(즉, 이들의 최대 가능한 자화의 90% 이하가 자화됨) 자화되는 것이 특징인 향상된 자기 공명 영상 콘트라스트 방법을 제공한다.

다른 면에서 볼 때, 본 발명은 본 발명의 입자와 적어도 하나의 생리학적으로 수용할 수 있는 담체 또는 부형제, 예를 들어 주사용 물을 포함하는 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 현탁액, 유상액, 분말등의 어떤 약제형태라도 무방하며 수성 부형제(예를 들여 주사용 물) 및/또는 삼투압, pH, 점성 및 안정도를 조절하는 다른 성분을 포함할 수 있다. 이상적으로는, 상기 조성물은 현탁액이 혈액과 등장액이면서 등수소액인 현탁액이다. 예를 들어, 등장 현탁액은 염화나트륨, 글루코오스와 같은 저분자량의 당(덱스트로스), 락토오스, 말토오스, 또는 만니톨 또는 코팅 제제의 용해성 단편 및 이들의 복합물과 같은 염을 첨가하여 제조한다. 등수소성은 만일 pH를 조금만 조절해야 할 경우에는 염산과 같은 산 또는 수산화나트륨과 같은 염기를 첨가함으로써 이루어진다. 시트레이트, 아세테이트, 보레이트, 타르트레이트, 글루코네이트, 양성이온 및 트리스와 같은 버퍼 또한 사용된다. 입자 현탁액의 화학적 안정도는 아스코르브산 또는 소디움 피로설파이트와 같은 산화방지제로서 조절할 수 이다. 부형제 또한 조제의 물리적 안정도를 개선하기 위해 첨가할 수 있다. 비경구 현탁액에 가장 빈번히 사용되는 부형제로는 폴리소르베이트, 레시틴 또는 소르비탄 에스테르와 같은 계면활성제, 글리세롤, 프로필렌글리콜 및 폴리에틸렌글리콜(마크로골)과 같은 점성 조설제, 또는 안개점 조절제(cloud point modifiers), 바람직하게는 비이온성 제제가 있다(안개점 조절제는 비이온성 계면활성제 조성물이 응집물을 형성할 수 있는 상분리가 일어나는 온도를 변화시킨다).

본 발명의 조성물은 일반적으로 0.1 내지 250 mg Fe/ml, 바람직하게는 0.5 내지 100 mg Fe/ml, 특히 바람직하게는 1 내지 75 mg Fe/ml의 진단용 유효 금속 농도의 자기 금속 산화물을 포함한다.

본 발명은 또한 인간 또는 비인간, 바람직하게는 포유류의 몸체의 콘트라스트가 향상된 영상을 만드는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 상기 몸체에, 바람직하게는 비경구로 특히 바람직하게는 맥관구조로 본 발명에 따른 조영제의 현탁액을 투여하는 단계와 상기 조영제가 분포되어 있는 상기 몸의 적어도 일부의 영상을 MR 또는 자기측정(예를 들어 SQUID 감지기 또는 SQUID 감지기 어레이를 사용하여)에 의해 생성하는 단계를 포함한다.

본 발명의 또다른 면에서는 또한 인간 또는 비인간, 바람직하게는 포유류의 몸에 있는 본 발명에 따른 조영제의 분포를 측정하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 상기 조영제를, 바람직하게는 비경구로 상기 몸에 투여하는 단계와 상기 조영제에 의해 상기 몸으로부터 발산되거나 조절되는 신호(예를 들어 방사능 활성 붕괴 발산, 자기장 일그러짐 또는 자기 공명 신호)를 감지하는 단계를 포함한다.

특히 바람직하게는, 본 발명의 방법은 특히 T₁-가중 MR 영상을 사용하여 맥관구조를 영상화하는 단계를 포함한다. 영상 발생은 간 또는 지라에 의한 여하한 입자 수집이 일어나기 이전에 이루어진다. 예를 들어 메톡시 PEG 포스포네이트인 혈액 수명 연장 중합체 코팅이 구비된 입자들의 경우, 영상은 정맥 투여 후 24시간 내, 바람직하게는 4시간 내, 더욱 바람직하게는 1시간 내에 발생된다. 본 방법의 다른 구현예에서는, 국소 투여 이후에 임파계의 T₂가중 영상이 발생하거나 또는 맥관구조내 투여 이후에 간 또는 지라에 대한 T₂가중 연구 또는 T₂가중 확산 연구가 이루어진다.

본 발명의 방법에서는, 사용되는 1회량은 사용되는 영상 양식에 콘트라스트 유효한 양이다. 일반적으로 이는 0.05 내지 30 mg Fe/kg 체중, 바람직하게는 0.1 내지 15 mg Fe/kg 및 특히 바람직하게는 0.25 내지 8 mg Fe/kg의 범위내이다.

본 발명은 또한 신규의 자기 결정체 물질의 인간 또는 비인간 몸에 투여하여진단하는 진단용 조영제 조성물의 제조용 용도를 제공한다.

조영제로 사용되는 외에도, 본 발명의 복합 입자는 이들의 자기 특성을 사용하여 국소 열처리 또는 과열 응용에 사용되어, 에너지는 생체내 실험을 통하여 입자에 전달되고 입자로부터 주위 조직으로의 에너지 손실은 약학 효과, 예를 들어 세포파괴 효과를 얻는데 사용하고 있다. 이는 입자가 이관능성 폴리알킬렌 옥사이드와 같은 이관능성 연계제를 통해 타게팅 벡터에 결합되는 경우 특히 중요하다.

유사하게 입자들은 철 치료법에 사용되며, 이 경우 코어 결정체의 자기 특성을 개발하는 것이 필요하며 이들은 개열된 중합체 코팅과 임의로 2차 코팅, 예를 들어 MPP이 구비된 상자성 철산화물이다.

종래기술에 따라 제조된 각종 철산화물 조제품은 혈관내로 투여될 때 부작용이 심각한 것으로 알려져 있다. 가장 잘 알려진 것으로는 혈압의 증가와 혈소판의 급격한 감소이다. 이러한 부작용은 보완체게의 활성화를 야기하는 입자들에 대한 생리학적 및 혈액적 반응이다. 통상적인 철산화물 입자, 예를 들어 자기 녹말 미세구(MSM)는 보완 체계를 강하게 활성화시키는 반면, 본 발명의 입자들은 통상적인 입자가 급성으로 두드러지고 일시적인 혈소판결핍증을 일으키는 반면에 순환하는 혈소판의 개수에 영향을 미치지 않거나 조금만 미친다.

본 발명의 입자들은, 2차 코팅 물질(예, MPP)이 있거나 없거나, 보완 체계 또는 혈압 및 혈소판 개수와 같은 보완 관련 변수에 영향을 미치지 않는다. 선별된 코팅 물질은 통상적인 입자들과 유하산 방법으로 보완 활성화를 야기시키지 않는 입자 표면을 가지고 있다.

입자들은 2차 코팅 물질, 즉 철산화물(FeOx) 표면에 화학적 또는 물리적으로 결합된 중합체(예를 들어 MPP)로 감싸여질 수 있다. 입자들은 그 표면적이 넓고 탄수화물 코팅층이 얇아서 MPP와 같은 말단이 관능화된 친수성 중합체가 코어 자기 입자의 표면에 결합되거나 부착될수 있기 때문에 부가적인 표면 조절 또는 코팅에 적절하다.

FeOx 입자들은 통상적인 철산화물 제제보다 낮은 자화도를 가지고 있고 자화도는 영상 자기장의 범위내에서는 충분히 포화되지 않는다. 이 특징은 고 자기장에서의 용인가능한 인공물의 출현을 감소시킨다.

입자들은 쥐의 혈액 반감기가 녹말 및 FeOx의 공침전에 의해 제조된 통상적인 MSM 입자들보다 훨씬 길다(2배 이상).

입자들의 혈액 운동성은 2차 코팅 물질을 첨가함으로써 더 조절할 수 있다. 따라서, MPP 코팅된 입자들, 즉 이중으로 코팅된 입자들은, MPP 코팅이 없거나 또는 부형제로서 메톡시-PEG(MeO-PEG) 코팅된 입자들(MeO-PEG는 부형제로 작용하며 FeOx 표면과 서로 반응하지 않는다)보다 쥐의 혈액 반감기가 훨씬 길다(2배 이상).

MPP 코팅된 입자들은 MPP로 코팅되었으나 1차 코팅인 개열된 중합체 코팅이 없는 나노 크기의 FeOx 입자들보다 쥐의 혈액 반감기가 훨씬 더 길다(2배 이상).

통상적인 다당류-FeOx 조제가 심각한 혈소판 결핍증을 일으키는 반면에 본발명의 단일 코팅 및 이중 코팅된 입자들 모두 혈액 효과는 나타나지 않았다.

더욱이 통상적인 녹말-FeOx (MSM) 입자들이 강한 보완 활성제임에 반해 본 발명의 단일 코팅 및 이중 코팅된 입자들은 인간 보완에 영향을 비치지 않았다.

본 발명의 단일 결정체 코어가 있는 입자는 응집되는 성향이 감소하여 본 발명의 조성물에 필요한 안정화제(예;덱스트란) 양을 감소시키고 따라서 독성 문제의 가능성을 감소시킨다.

저장 및 운반 문제를 최소화하기 위해, 본 발명에 따라 제조된 입자성 조영제는, 바람직하게는 무균 조건에서 스프레이 건조 또는 냉동건조하여 건조 분말의 형태로 제조한다. 건조 조영제는 본 발명의 다른 면을 형성한다.

여기에 언급된 각종 특허 공보는 본 발명의 일부로 한다.

본 발명은 이제 하기의 비제한적인 실시예에 의해 자세히 설명될 것이다.

<실시예 1>

겔 제조 단계는 녹말 용액 제조 및 55℃까지 가열 단계, 염화철을 녹말 용액에 첨가 단계, 수산화암모늄을 철/녹말 용액에 첨가 단계, 반응 복합물을 87-90℃까지 가열 단계 및 제품 냉각/겔 중화 단계로 이루어진다.

A. 녹말 용액의 제조

1. 용해성 감자 녹말 (CAS No. 9005-84-9) 50 그램을 끓는 탈이온수 850 그램에 부유시키고 복합한다.

2. 끓인후, 녹말 용액을 55℃의 수조로 즉각 옮긴다.

B. 철 및 수산화암모늄을 녹말에 첨가

1. FeCl₃·6H₂O 9.0 그램과 FeCl₂·4H₂O (Fe(III):Fe(II)=2:1 몰비) 3.3 그램을 전체 체적 50 mL의 탈이온수에 용해시킨다.

2. 녹말 용액을 일정온도 55℃까지 냉각시킨후, 철 용액을 녹말 용액에 붓고, 잘 복합한 후, 30%(농축)의 수산화암모늄 50 mL를 첨가한다.

3. 결과 용액을 89℃가 되도록 2시간 이상 가열한 후 89℃에서 50분 이상 유지시킨다.

4. 170분동안 수조를 가열한 후, a) 4℃에서 밤새 냉각시켜 겔을 만들거나, 또는 b) 주위온도까지 냉각한 후 산으로 중화시킨다(아래 참조).

C. 겔 세정 과정(겔은 산중화되지 않음)

pH가 8.5 미만이 될 때까지 맑아진 겔 현탁액에 차가운 탈이온수를 펌핑하여 겔을 세정한다.

D. 대체적 중화과정

복합물을 40℃ 미만으로 냉각한 후, 산으로 중화시킨다.

E. 차아염소산나트륨에 의한 겔 산화 개열

제조를 적절히 하기 위해 겔 1 그램당 차아염소산의 1회 분량 적정을 새로운 롯(lot)에 대해 실시할 수 있다. 광자 상관 분광기(photon correlation spectroscopy; PCS)를 이용하여 자기 입자의 크기 및 분산도를 측정하고 물 양성자 이완율로서 자기 입자의 제조량을 평가하였다.

a. 예를 들면, 12.5 mgs Fe/겔 5 gms 당 5% 차아염소산염 1.8 mLs. 사용가능한 염소의 농도 및 겔 5그램내의 Fe mgs에 차아염소산염의 체적을 맞춘다.

b. 겔의 무게를 재고, 차아염소산염을 첨가한 후 70℃의 수조에서 45분간 가열한다.

c. 가열후 8M의 우레아(0.8 ml/겔 5 그램)을 첨가한다. 우레아는 과량의 차아염소산염을 불활성화시킨다.

d. 막(분자량 한계 〈 100 kD)을 사용하여 모든 자유 Fe 및 CHO가 제거될 때까지 다이아필트이숀 한다.

F. 분석

이어서 샘플을 분석하였다. 이렇게 제조된 재료는 표 1에 설명된 특징을 가진다.

분석	결과	확대***
조성물
철(Fe)	6.4 mg/ml	90 mg/ml 이하
모스바우어 분광기	감마-Fe₂O₃의 나노결정체가 우세함
탄수화물(CHO)	3.6 mg/ml
CHO:Fe(무게비)	0.57	0.2-0.3
순도	(1.4 g/ml의 CsCl 밀도 구배에서 원심분리된 입자들의 상층액)	(겔 투과 크로마토그래피)
%자유 Fe	0%
%CHO 백분율	0%	2% 면적
크기(철 산화물 코어)
r₂/r₁예상치	9 nm	8 nm
NMRD*	8 nm	8 nm
LFI**	6.24±0.74 nm
자화 계산치	5.7-5.8 nm
크기(전체 입자)
광자 상관 분광기	11.5 nm	10-12 nm
침강 속도	42.6 스베드버그 단위
이완율(40℃ 및 0.47T)
r₁	16.34 (mM.sec)^-1	20-23 (mM.sec)^-1
r₂	28.04 (mM.sec)^-1	34-38 (mM.sec)^-1
r₂/r₁	1.72	1.6-1.7
4℃에서의 안정도++	〉6개월
포화 자화	60 emu/gm FeOx+++	80-90 emu/g Fe

+++ FeOx 1g은 Fe 약 70 중량%

* 핵 자기 이완 분산(Nuclear Magnetic Relaxation Dispersion)

** 격자 프린지 화상(Lattic Fringe Imaging)

*** 더 큰 규모로 제조된

++ 5분동안 12000 x g에서 원심분리한 침전물 5% 미만

% 면적=HPLC 흔적 하에 %총 면적

NMRD로, 2.35 Gauss - 1.2 Tesla 범위내에서 자기장력의 함수로 장기적 이완율(1/T₁)을 측정하였다. 예를들어, 코니그 등의 「NMR Spectroscopy of Cells and Organisms, Vol. II, page 75, 알. 케이. 굽타 (Ed), CRC Press, 1987」와 코니그등 「Progress in NMR Spectroscopy 22: 487-567 (1990)」를 참조한다.

<실시예 2>

감자 녹말을 옥수수 녹말로 대체하는 것을 제외하고는 실시예 1에 따라 자기 입자들을 제조하였다.

용해성의 감자 녹말 이외의 재료를 사용하려면 겔 형성 및 분해에 맞게 재료의 양을 조절하여야 한다.

<실시예 3>

감자 녹말을 쌀 녹말로 대체하는 것을 제외하고는 실시예 1에 따라 자기 입자들을 제조하였다.

<실시예 4>

차아염소산염 처리(단계 D)를 하지 않는 것을 제외하고는 실시예 1에 따라 자기 입자들을 제조하였다. 대신에, 겔 샘플(4, 8, 12 그램)을 인산염 완충 식염수로 희석하고, 알파-아밀라아제 효소 (EC 3.2.1.1) 100 μg(0.7-1.4의 활동도/μg)를 사용하여 주위온도에서 16시간동안 겔의 녹말을 효소 가수분해하였다. 방출된 입자들을 저속으로 원심분리하여 큰 응집물을 제거하고 0.45 μm 필터를 통해 여과하였다. 이 방법에 의해 전체 크기가 훨씬 크면서(10-110 nm) 철 산화물 코어의 크기는 6 nm인 입자들을 제조하였다.

<실시예 5>

차아염소산염 처리(단계 D)를 하지 않는 것을 제외하고는 실시예 1에 따라 자기 입자들을 제조하였다. 대신에, ¼ 인치 탐침이 달린 브란슨 음파파쇄기(Branson Sonifier)를 사용하여 겔 10 g을 음파파쇄하였다. 음파 파쇄는 15분간 연속적으로 이루어졌다. 저속으로 원심분리하여 큰 덩어리를 제거하고 0.45 μm 필터를 통해 여과한 후, 방출된 입자들은 전체 크기가 훨씬 크면서(30-800 nm) 철 산화물 코어의 크기는 실시예 4와 유사하였다.

<실시예 6>

실시예 1에서 제조된 입자들의 수성 현탁액에 메톡시 PEG 포스페이트 (MPP) (몰중량 5 kD)를 적당한 비율의 MPP 대 철산화물(FeOx)(보통 1-2 gms MPP/gm Fe)로 첨가하고, 37℃에서 계속 회전시키면서 15시간동안 배양한 후 사용할 때까지 4℃에서 보관하였다.

만일 필요하다면 입자들을 121℃에서 15분간 오토클레이브 살균할 수도 있다.

유사하게 황산 콘드로이친(Chondroitin sulfate)을 사용하여 입자들을 코팅할 수 있다.

또는, MPP 코팅된 입자들을 75℃에서 12시간동안 배양하거나 또는 121℃에서 10-20분간 직접 오토클레이브할 수 있다.

<실시예 7>

MPP의 분자량을 달리 하고(1.1, 2.1, 5.0 및 10.0 kD) 코팅 비율을 달리 하여(0.02, 0.2, 0.4, 0.5, 0.8, 1.0, 1.2, 1.5, 1.6, 2, 2.5, 3, 4 및 8 g MPP/g FeOx) 실시예 6과 유사하게 MPP 코팅된 입자들을 제조하였다.

<실시예 8>

실시예 1, 6 및 7의 입자들에 대한 동물 시험 및 인간 혈장 시험 결과

MPP 코팅 밀도가 본 발명의 범위 내인 입자들에 대해 쥐 혈액 반감기(T_½)를 측정하였다. 실시예 1, 6 및 7의 제품 1 mg Fe/mL를 가진 샘플 100 μL를 쥐 꼬리의 정맥을 통해 쥐에게 투여하였다. 일정 시간 간격으로, 쥐를 안락사시키고, 쥐 2마리의 혈액 샘플을 수집하고 합쳐서 1/T₁을 측정하였다. 1/T₁수치로부터 반감기(T_½)를 계산하였다. 코팅되지 않은 입자 및 통상적인 MSM 입자들과 비교한 결과를 포함하여 표 2에 결과를 나타내었다.

gm MPP*/gm FeOx	T_½(분)
0	27.9
0.02	28.0 ± 3.2 #
0.2	31.9 ± 3.3
0.4	39.1 ± 14.1
0.8	28.5 ± 1.3
1.6	69.3 ± 27.7
2	48.9 ± 3.8
4	45.6 ± 3.0
8	62.0 ± 5.6
MSM	3.8

*: 분자량 5 kD

#: 평균 ± T_½곡선 의 선형성에 대한 측정된 표준 오차

MSM: 통상적인 공침전된 자기 녹말 입자들

표 2로부터 MPP 코팅에 의해 혈액의 반감기는 상당히 연장되었지만, 본 발명에 따른 코팅되지 않은 입자들이 통상적인 입자들보다 혈액 반감기가 훨씬 큰 것을 알 수 있다.

비연합 2차 코팅제를 MPP 대신에 사용한 결과 쥐의 혈액 반감기의 유의미한 증가는 없었다. 이는 코팅되지 않은 입자 및 MPP 코팅된 입자와 메톡시 PEG (몰중량 5 kD) 및 녹말 유도체 헤타스타치(상표명, Hetastarch)로 처리한 입자들에 대해 측정한 쥐 혈액 반감기의 비교에 의해 보여진다. MPP와 달리, 메톡시 PEG는 입자들과 화학적으로 결합되거나 또는 연합하지 않아서 단순히 부형제로 존재한다. 비교 결과를 표 3에 나타내었다.

2차 코팅제/부형제	T_½(분)
MPP 몰중량 5 kD, 8 g/g FeOx	62.0
MeO-PEG 몰중량 5000, 8 gms/gm FeOx	26.3
헤타스타치, 6% 용액	28.1
코팅 안함	27.9

MPP 코팅 입자들 및 비MPP 코팅 입자들을 테스트하여 쥐의 혈액 효과를 알아보았다.

수컷 쥐에게 내복용시키고 우측 경정맥 내에 삽입된 도뇨관을 통해 견본을 추출하였다. 복용 전 약 24시간, 및 복용후 약 3, 10 및 60분 및/또는 24시간에 혈액 샘플을 수집하였다. 측정한 혈액 변수는 백혈구 세포와 혈소판의 개수이었다.

덱스트란 마그네타이트 또는 MSM 입자들과 달리 본 발명의 MPP 코팅 및 비MPP 코팅 입자들에서는 일시적인 혈소판 감소증 발생은 관찰되지 않았다.

말단 보완물 복합체(terminal complement complex)의 활성화 정도를 측정하기 위해 MPP 코팅된 및 MPP 코팅되지 않은 입자들과 MSM을 인간 혈장에서 테스트하였다. MSM과는 달리, MPP 코팅된 및 MPP 코팅되지 않은 입자들은 활성화를 보이지 않았다.

<실시예 9>

실시예 6에 따라 제조된 MPP 코팅된 입자들을 1 mg Fe/kg 및 15분 후에 2 mg Fe/kg의 분량으로 토끼에게 투여하였다. 1.5T, 3DTOF, TR/TE 24/5.6, 플립(flip) 각도 60。에서 전/후 콘트라스트 T₁가중 MR 영상을 기록하여 도 1, 2 및 3에 나타내었다. 후-콘트라스트 영상 모두의 맥관구조의 향상이 뚜렷하였고, 고 투여량 및 고 전장에도 불과하고 도 3의 영상은 인공물에 대한 적응성 없는 조직 콘트라스트에 대한 고 혈관(high vessel)을 나타낸다.

<실시예 10>

후 복합 입자 형성 중합체 개열

(a) MSM의 합성

평균 분자량이 79 kD인 녹말 (3g, 렙프 글리코스(Reppe Glycose), 스웨덴)을 물 (10 mL)에 용해시켰다. 60℃의 온도에서 FeCl₃6H₂O (2.7g)과 FeCl₂4H₂O (4.5g)을 탄수화물 용액에 용해시킨 후, 초음파 처리를 하면서 60℃에서 복합물을 1.2 M NaOH (50 mL)에 침전시켰다. 초음파 처리를 10분 더 한 다음에 5분간 5000 rpm에서 원심분리하였다. 상층액을 수집하여 0.9%의 NaCl에서 희석하였다. 자화곡선에 의해 결과 녹말 입자들이 초상자성을 띠고 평균 수화동력 직경이 400 nm이었다.

(b) 차아염소산나트륨으로 MSM 처리

평균 입자 크기가 400 nm인 MSM 입자들 (15.5 mg Fe/mL, 1.70 mL)를 차아염소산나트륨(플루카(Fluka) # 71696, 13.8% 자유 염화물)에 첨가하였다. 용기를 밀봉하고 70℃에서 45분간 가열하였다. 반응 복합물을 냉각시키고, 8M 우레아 (0.17 mL)를 첨가하고 현탁액을 여과하였다 (0.2 μm). 입자를 3000 rpm의 마크로셉(Macrosep) 원심 농축기 (컷오프 100K)를 사용하여 물로 정제하였다. 첨가한 차아염소산나트륨의 양에 대한 함수로서의 입자의 크기를 아래의 표 4에 나타내었다.

차아염소산나트륨 처리 전후의 MSM 입자 크기

차아염소산 나트륨 양 (mL)	입자의 크기(평균, nm)
0	400
0.063	88
0.100	76
0.300	70
0.500	68
1.000	집합 1)

1) : 개열된 모든 녹말, 철산화물 결정체의 집합

<실시예 11 >

실시예 1 내지 7에 의한 제제화된 제품

표 5에는 실시예 1(조성물 A) 및 (1.2g MPP (2 kD)/g FeOx) (조성물 B)에 따라 제조되고, 투여를 위한 부형제(Tris (50 mM), 만니톨 (2.5%) 및 pH 6-8의 수산화나트륨)로 제제화된 입자들의 자세한 특징을 나타내었다.

분석	조성물 A	조성물 B
조성물
철(Fe)	30 mg/mL	30 mg/mL
탄수화물(CHO):Fe 비	0.8	1.2
MPP (2 kD)	0	60 mg/mL
순도	(겔 투과 크로마토그래피)	(겔 투과 크로마토그래피)
% 자유 탄수화물	10-12 면적%	10-12 면적%
크기(철산화물 코어)
r₂/r₁으로부터의 예상치	7 nm	7 nm
NMRD	7 nm	7 nm
크기 (전체 입자)
광 상관 분광기	9-11 nm	11-13 nm

이완도 (40℃, 0.47 테슬라)
r₁	19-20 (mM.sec)^-1	19-21 (mM.sec)^-1
r₂	30-32 (mM.sec)^-1	30-33 (mM.sec)^-1
r₂/r₁	1.5-1.6	1.5-1.6
포화 자화 0.45 테슬라	90-100 emu/gm Fe	90-100 emu/gm Fe

안정도	40℃에서 3달 이상	40℃에서 3달 이상

NMRD = 핵 자기 이완 분산

면적% = HPLC 흔적하에 총 면적%

<실시예 12>

(MPP 코팅 이전에 최상의 입자 제조방법)

(A) 상부에 역학적 교반기 및 환류기를 구비한 22 L들이 삼목 플라스크(three necked flask)내에서, 탈이온수를 95℃까지 가열한 후 용해성 감자 녹말 800g(시그마, No. S-2630)의 탈이온수 슬러리 1.6 L를 80-100 rpm로 교반하면서 첨가하였다. 약간 탁한 결과용액을 10분간 주위온도에서 교반한 다음 30분 이상의 시간동안 55℃로 냉각하였다. 염화철(III) 육수화물 144g과 염화철(II) 사수화물 52.8g의 탈이온수 수용액 1.2 L를 첨가하고, 3분 후에 28% 수산화암모늄 800 mL를 일부분에 첨가하였다. 교반 속도를 약 60 rpm으로 낮추고, 흑색의 반응 복합물을 92℃에서 15분간 교반한 수 60분 이상의 시간동안 92℃까지 점차 가열하였다. 3시간동안 온도를 92-94℃로 유지시키고 반응 전후의 대자율 변수로 반응의 진행도를 측정하였다. 진공 증류로 과량의 수산화암모늄을 제거하였다. 농축액을 약 20℃로 냉각하고 냉동시켜 겔을 형성하였다.

모두 합쳐, 감자 녹말 800 g을 사용하는 가장 큰 군으로 4개의 겔 군을 제조하였다.

겔의 제조

군	녹말 (g)	FeCl₃6H₂O (g)	FeCl₂4H₂O (g)	NH₄OH (mL)	반응 체적 (L)	겔 중량 (kg)	XRF*에 의한 Fe (g/kg)	M (emu/mg Fe)	M_sus(x^10-4emu/0e.㎤)
1	600	108	39.6	600	12	9.8	3.33	0.0932	0.69
2	600	108	39.6	600	12	9.8	3.35	0.0954	0.71
3	600	108	39.6	600	12	9.8	3.36	0.0924	0.69
4	800	144	39.6	800	12	13.7	3.30	0.0955	0.70

* XRF = X-레이 형광 분광기

(B) 겔을 냉수로 세정하여 철산화물 형성시 제조되는 염화암모늄 및 잔류 수산화암모늄을 제거하였다. 이러지 않으면, 이들 화합물들은 단계 C에서 녹말을 소화시키기 위해 사용된 차아염소산나트륨과 반응하게 되어, 차아염소산 단계에서 훨씬 더 많은 양의 차아염소산이 필요하게 된다.

겔 분해를 최소화하기 위해 5℃ 근처에서 보관되는 교반 반응기내에서 반복적인 물 부가/제거를 통해 겔 세정하였다. 약 2 체적의 차가운 탈이온수에서 겔을 교반하고(간단히 그리고 천천히) 이어서 (약 1시간동안) 정치시켰다. 매우 짙은 겔층으로부터 분리된 짙은 상층액 층을 흡입에 의해 제거하였다(층들의 시각적 관찰). 동량의 물을 첨가하고, 천천히 간단히 교반하고, 정치시킨 후 분리하는 과정을 도전율 0.5 mmho가 될 때까지 반복하였다. 겔을 세정하고 철을 약 80% 회수하는데 총 약 8 체적의 물이 필요하였다.

세정된 겔

군	부과된 중량 (kg)	총 물(L)	턴오버	최종 중량 (kg)	Fe (g)	Fe 회수 (%)	최초 도전율 (mmho)	최종 도전율 (mmho)
1	1.7	15	7	(원심분리된)	6.1	78	4.8	0.3
2	9.5	80	5	14.5	26.5	81	5.2	0.5
3	9.5	80	4	11.2	24.5	77	4.7	0.5
4	13.3	106	5	16.4	36.9	83	4.8	0.3

(C) 이 단계에서는 녹말 매트릭스의 산화에 의한 세정 겔의 입자 분산으로의 전환이 일어난다. 이는 겔을 차아염소산으로 처리함으로써 이루어졌다. 작은 척도(겔 50-100 g)의 산화실험을 거치고 이완도 (r₁, r₂및 r₂/r₁) 및 입자 크기를 측정함으로써 산화에 사용된 차아염소산의 양을 결정하였다.

세정된 겔을 45℃로 한 다음 12% 차아염소산나트륨 용액으로 처리하였다. 반응 복합물의 온도는 몇 도 떨어졌다(냉동 차아염소산을 첨가하였기 때문에). 반응 복합물의 온도를 약 45℃까지 증가시켰다. 반응을 30분 이상동안 55℃까지 가열하는데, 이 온도에서 발열 반응이 일어나서, 약 15분 이상동안 온도가 약 15℃ 정도 증가하는 것을 관찰하였다. 발열반응이 끝난 후에 반응을 70℃로 조절하고 45분간 유지하였다. RCI 열량계를 사용한 이 단계의 대략적인 평가(hazard evaluation)에 의하여 이 반응의 적당하면서 (15℃) 제어가능한 발열성이 확인되었다.

반응 복합물을 실온까지 냉각한 다음, 밀리포어(Millipore) 0.2 미크론의 명목적인 필터 카트리지를 통해 여과하였다. 겔 15 kg (Fe 34g)을 사용할 때 산화가 가장 컸으며 회수율도 측정가능한 정도였다.

입자 분산

군	부과 중량(kg)	12% NaOCl (L)	우레아 냉각기 (g)	최종 체적(L)	Fe (g)	브룩크 해이븐(Brook haven)(nm)	r1 (mM.s)^-1	r2 (mM.s)^-1	r2/r1
1	3.0	0.63	20	3.5	5.5	11.1	13.37	23.1	1.68
2	6.5	1.83	42	8	11.8	11.8	14.5	24.8	1.68
3	10	2.25	112	12	22	12.4	14.9	25.0	1.68
4	15	3.00	80	18	34	12.7	21.0	36.2	1.71

(D) 이 단계에서는 차아염소산 산화 이후에 잔류 녹말, 자유 철 및 다른 반응물을 제거한다. 바람직한 결과를 얻기 위해 밀리포어, 예비척도 TM TFF 100K 재생 셀룰로오스막 카트리지 필터를 사용하였다. 입자들의 순도를 GPC에 의해 모니터하였다. 한외여과 후의 최종 산물의 순도는 97-99% (GPC)의 범위 내이었다.

최종 제품

군	부과 체적 (L)	필터 매개체	총 물 (L)	최종중량 (kg)	ICP에 의한 Fe (Ig)	Fe 회수 (%)
1	2	밀리포어 100k, 1ft²재생 셀룰로오스	25	670	2.2	67
2	6	밀리포어 100k, 6ft²재생 셀룰로오스	45	671	8.8	70
3	12	밀리포어 100k, 6ft²재생 셀룰로오스	60	980	13.7	73
4	18	밀리포어 100k, 6ft²재생 셀룰로오스	100	1674	27.7	82

4군의 최종 분석 자료를 표 10에 요약하였다.

(E) 계속적인 PEG 코팅

상기의 (A) 내지 (D) 단계에서 제조된 입자들은 만일 필요하다면 PEG 코팅할 수 있는데, 바람직하게는 분자량 2000 D의 메톡시 PEG 포스페이트 (MPP)로 1.2 g MPP/g FeOx의 코팅속도로 코팅한다.

이러한 PEG 코팅이 있건 없건, 이들 입자들은 투여를 위하여 50 mM 트리스 버퍼 및, 수산화나트륨으로 pH가 6-8로 맞추어진 2.5% 만니톨에 의해 제제화된다.

분석 결과

군	1	2	3	4
순도 (%, GPC)	97.2	98.1	99.0	99.2
철 (mg/ml, (ICP))	3.3	13.1	13.7	16.5
r2/r1	1.67	1.66	1.65	1.64
r1(mM.s)^-1	19.6	18.9	20.0	21.3
r2(mM.s)^-1	32.7	31.3	33.0	35.0
자화:(emu/mg Fe)	0.0762	0.0795	0.0801	0.0826
입자 크기 (nm, 브루크해이븐)	12	10	10	11
이동성(mV^-1s^-1x E08)	-3.02	-3.02	-3.04	-2.92
pH	4.1	4.0	4.0	4.0
탄소/철 비율	0.52	0.28	0.30	0.28
외양	비점성, 짙은 적색에서 갈색	비점성, 짙은 갈색	비점성, 짙은 갈색	비점성, 짙은 갈색

<실시예 13>

디에틸 2-(3,5-비스-아세틸아미노-2,4,6-트리이오도벤조일옥시)에틸포스포네이트의 제조

소디움 디아트리조에이트 (7.1g, 11.2 mmol)의 건조 디메틸포름아미드 (50 mL) 교반용액에 디에틸 2-브로모에틸포스포네이트 (3.02g, 12.3 mmol, 1.1 당량)의 디메틸 포름아미드 용액 (10 mL)을 첨가하였다. 12시간동안 교반한 후에, 용매를 진공 증발시키고, 포화 탄산나트륨 수용액 300 ml로 세정한 백색 고형물을 제조한 후 클로로포름-에탄올 (3 x 200 ml)의 2:1 복합물로 추출하였다. 유기 추출물을 건조시키고(MgSO₄) 여과시킨후 진공 증발시켜 백색 고형물의 형태인 제품 3.61g (41%)를 제조하였다. 아세토니트릴로 재결정하여 분석적으로 순수한 물질을 제조하였다: 녹는점 249-251℃; MH⁺(779).¹H-NMR (300 MHz) 스펙트럼은 타게팅 물질에 일치하였다.

C₁₇H₂₂I₃PN₂O₇계산치: C 26.24; H 2.85; I 48.93; N 3.60; 발견: C 26.26; H 2.70; I 49.05; N 3.50.

<실시예 14>

2-(3,5-비스-아세틸아미노-2,4,6-트리이오도벤조일옥시)에틸포스폰산의 제조

실온의 질소 분위기하에서 디에틸 2-(3,5-비스-아세틸아미노-2,4,6-트리이오도벤조일옥시)에틸포스포네이트 (3.1g, 3.98 mmol)의 건조 디클로로메탄 교반 현탁액 (40 mL)에 요오드화 트리메틸실란 1.5 mL (10.56 mmol, 2.65 당량)를 첨가하였다.

12-14시간동안 교반 후에, 점성 슬러리를 관찰하고, 그 후에 디클로로메탄 40 ml를 첨가한 후 6 시간동안 계속 교반하였다 이어서 물(4 ml)을 첨가하고 반응을 10분간 교반하였다. 이어서 메탄올 (40 ml)을 첨가하고 결과 적색 용액을 진공하에서 농축하여 황색 고형물의 형태로 타게팅 천연물질 3.42 g을 제조하였다. 생물질을 10% 메탄올-90% 물 용액 20 ml에 용해시키고 용액을 50 ml의 메탄올-물 용액으로 추출하면서, C₁₈이온 교환 칼럼을 통과시켰다. 여과액을 진공하에서 농축하여 백색 고형물(mp 〉220℃ (dec. ∼250℃); MH⁺(723))로서의 타게팅 포스폰산 0.48 g (14%)을 제조하였다.¹H-NMR (300 MHz) 스펙트럼은 타게팅 물질과 일치하였다.

C₁₃H₁₄I₃PN₂O₇계산치: C 21.63; H 1.95; I 52.73; N 3.88; P 4.29 발견: C 21.29; H 1.95; I 52.44; N 3.71; P 4.31.

실시예 14의 화합물은 이전의 실시예들에 따라 제조된 자기 입자를 코팅하는데 사용될 수 있다.

<실시예 15>

메톡시-PEG(2K)-포스포네이트의 합성

단계 1: 물에서 공비복합물을 제거하면서 수시간동안 톨루엔 108 ml에서 메톡시-PEG(2K)-OH (21.60g)을 환류시켰다. 염화 티온(7.88 mL)와 DMF (0.313 mL)의 복합물을 한방울씩 떨어뜨려 냉각된 용액을 처리한 후 가열하여 4시간동안 환류시켰다. 감압하에서 반응 복합물을 농축시키고 물 108 mL에서 잔류하는 옅은 황색의 고형물을 수집하여 에테르로 2번 세정하였다. 수용액을 클로로포름으로 2번 추출하고 결합된 추출물을 무수 황산마그네슘으로 건조시키고 농축하여 메톡시-PEG(2k)-Cl 19.90 g을 제조하였다.

단계 2: 메톡시-PEG(2k)-Cl (18.51g)과 아황산삼에탄 (185 mL)의 복합물을 4일동안 환류시켰다. 실온으로 냉각하여 침전물을 형성하고, 여과에 의해 침전물을 수집하여 에테르로 세정하고 진공 건조하여 메톡시-PEG(2k)-P(O)(OEt)₂18.16g을 제조하였다.¹H NMR(CDCl₃; 300 MHz): 4.10 ppm(m,-P(O)(OCH₂CH₃)₂); 3.65 ppm (s, (-CH₂CH₂O-)_n); 3.38 ppm (s, -OCH₃); 2.13 ppm (이중 피크 또는 삼중 피크, -CH₂CH₂P(O)(OCH₂CH₃)₂); 1.33 ppm (t, -P(O)(OCH₂CH₃)₂).

단계 3: 메톡시-PEG(2k)-P(O)(OEt)₂의 염화메틸렌 용액 100 mL을 브로모트리메틸실란 24.15g과 염화메틸렌 157 mL로 제조한 용액 28 mL로 한방울씩 처리하였다. 반응 복합물을 실온에서 16시간동안 교반한 다음, 농축하여 백색 고형물을 제조하였다. 백색 고형물을 메탄올 50mL로 2시간동안 처리한 후, 농축하여 백색 고형물 산물 4.57g을 제조하였다.¹H NMR(CDCl₃; 300 MHz): 8.20 ppm(br s,-P(O)(OH)₂); 3.65 ppm (s, (-CH₂CH₂O-)_n); 3.38 ppm (s, -OCH₃); 2.17 ppm (이중 피크 또는 삼중 피크, -CH₂CH₂P(O)(OCH₂CH₃)₂).

<실시예 16>

메톡시-PEG(2K)-포스포네이트/초상자성 철산화물 콘쥬게이트의 제조

실시예 12에 따른 메톡시-PEG(2K)-포스포네이트 (0.448g) 및 93.7 mg Fe/mL의 철산화물 현탁액 3.42 mL와 총 20 mL의 물과의 복합물을 37℃에서 20시간동안 배양하였다. 반응 복합물을 50 mL의 YM-30 막을 갖춘 아미콘(Amicon) 교반 셀에 놓고, 물에 대해 다이아필터한 다음, 0.2 ㎛의 나일론 필터를 통해 여과시켰다. ICP 분석에 의해 샘플이 13.3 mg Fe/ml(비결합 메톡시-PEG(2K)-포스포네이트 0.34 mg/ml 및 결합 메톡시-PEG(2K)-포스포네이트 1.42 mg/ml)을 함유하고 있음이 밝혀졌다.

<실시예 17>

메톡시-PEG(5K)-티올/초상자성 철산화물 콘쥬게이트의 제조

실시예 12에 따른 메톡시-PEG(5K)-티올 (0.438g)과 93.7 mg Fe/mL의 철산화물 현탁액 1.67 mL 및 물(10 mL)과의 복합물을 37℃에서 20시간동안 배양하였다. 반응 복합물을 50 mL의 YM-30 막을 갖춘 아미콘 교반 셀에 놓고, 물에 대해 다이아필터한 다음, 0.2 ㎛의 나일론 필터를 통해 여과시켰다. ICP 분석에 의해 샘플이 13.47 mg Fe/ml(비결합 메톡시-PEG(5K)-티올 0.23 mg/ml 및 결합 메톡시-PEG(5K)-티올 5.46 mg/ml)을 함유하고 있음이 밝혀졌다.

<실시예18>

MPP 코팅된 및 MPP 코팅되지 않은 철산화물 입자 현탁액의 제조

MPP 코팅되지 않은 경우:

배치 체적(batch volume) ∼70%의 주사용 물을 유리 또는 유리 테두리의 제조 수조에 첨가함으로써 시작한다. 계속 교반하면서, 만니톨을 첨가하여 용해시킨다. 만니톨의 최종 농도는 1 내지 5% w/v이고 보통 3.5% w/v이다. 계속 교반하면서 트로메타민을 첨가하여 용해시킨다. 트로메타민의 최종 농도는 10 내지 100 mM이고 보통 50 mM이다. 계속 교반하면서, 철산화물 벌크 현탁액(실시예 12에 따라 제조된)을 첨가한다. 철산화물의 최종 농도는 0.1 내지 10% w/v 철이고 보통 3%이다. 벌크 현탁액의 pH를 조사한다. 만일 필요하다면, 0.1 N NaOH 또는 0.1N 염산으로 pH를 8.1-8.3 (타겟팅 8.2)로 맞춘다. 계속 교반하면서, 주사용 물로 벌크 현탁액의 최종 체적이 100%가 되도록 맞춘다. 제조된 현탁액은 121℃에서 10 내지 50 F₀(보통 15 F₀) 동안 증기 살균한다. 최종 현탁액은 5 내지 8의 pH이며 보통은 7 내지 7.5이다.

MPP 코팅되지 않은 경우:

총 배치 체적(batch volume) ∼25%의 주사용 물을 적절한 주양의 제조 수조에 첨가함으로써 시작한다. 계속 교반하면서, 메톡시-폴리(에틸렌 글리콜)(2000) 포스페이트를 첨가하여 용해시킨다. 최종 MPP/Fe 비율은 0.1 내지 5이고 보통 1.5이다. 계속 교반하면서 트로메타민을 첨가하여 용해시킨다. 트로메타민의 최종 농도는 10 내지 100 mM이고 보통 50 mM이다. 계속 교반하면서, 만니톨을 첨가하여 용해시킨다. 철산화물의 최종 농도는 1 내지 5% w/v 철이고 보통 2.5%이다. 적절한 용기내에서 적절한 양의 철산화물 현탁액(실시예 12에 따라 제조된)의 무게를 잰다. 교반하면서, MPP, 만니톨 및 트로메타민을 철산화물 현탁액에 천천히 첨가한다. 철산화물의 최종 농도는 0.1 내지 10% w/v이고 보통 3%이다. 현탁액의 pH를 조사한다. 0.4 N NaOH로 pH를 8.4-9.0으로 맞춘다. 계속 교반하면서, 주사용 물로 벌크 현탁액의 최종 체적이 100%가 되도록 맞춘다. 제조된 현탁액은 121℃에서 10 내지 50 F₀(보통 15 F₀) 동안 증기 살균한다. 철산화물에 MPP 결합은 증기 살균동안 완성된다. 또는, 현탁액을 60 내지 95℃에서 2-4시간동안 배양하여 철산화물에 MPP 결합을 완성할 수도 있다. 최종 현탁액은 5 내지 8의 pH이며 보통은 7 내지 7.5이다.

<실시예 19>

네이키드(naked) 철산화물의 나노결정체(nanocrystal)의 제조

(a) 안정화제를 첨가하지 않고 철산화물로부터 녹말 유도 중합체 코팅의 제거

실시예 12에 따라 제조된 철산화물 현탁액으로부터 출발한, 중합체 없는 철산화물 나노결정체의 안정한 현탁액이 어떤 대체 안정제 없이 제조될 수 있는가에 대한 테스트를 행하였다. 철산화물 현탁액 분획(aliquots) 0.5 ml를 30% 과산화수소 0.5 ml에 첨가하였다. 계속 교반하면서 샘플을 55℃에서 배양하고 pH를 측정하기 위해 pH 전극을 사용하였다. 산화 과정이 진행됨에 따라, 샘플 pH는 아래쪽으로 내려갔다. 1N의 수산화나트륨을 첨가하여 6.5-7.5 범위로 샘플 pH를 유지하였다. 3시간의 배양내에 샘플은 응집되는데 이는, 철산화물 입자 현탁액은 그 중합체 코팅이 일단 벗겨지면, 불안정하고 큰 응집물을 형성한다는 것을 가리킨다.

(b) 일인산염으로 시험

네이키드 철산화물 나노결정체 (nions)를 안정시키는 표면 조절제로서의 효율을 시험하기 위해, 철산화물 현탁액 0.5 ml를 각종 농도의 삼나트륨 인산염과 복합하는 시험을 행하였다. 이어서 각 샘플에 과산화수소 0.5 ml를 첨가하였다. 샘플을 55℃에서 배양하여 녹말 유도 중합체 코팅(SDPC)을 산화하였다.

<표>

샘플 #	[Na₂HPO₄](mM)
0	0
1	1.7
2	8.3
3	16.6
4	33.3
5	50
6	66.7
7	83.3
8	166
9	250
10	333

55℃에서 5시간 배양한 후에 모든 샘플은 응집물이 형성되는데, 이는 일인산염이 네이키드 페론(naked ferron)에 대한 표면 조절제 및 안정제로서 만족스럽지 못함을 나타낸다.

(c) 표면 조절제 및 안정제로서의 이인산염

피로인산 사나트륨을 사용하고 일인산염에서 사용한 것과 유사한 방법으로 철산화물 입자들의 표면 조절제로서의 이인산염(피로인산염으로도 알려져 있음)의 효율을 연구하였다. 샘플을 55℃에서 배양하여 녹말 유도 중합체 코팅(SDPC)을 산화시켰다. 55℃에서 5시간동안 배양한 후에, 샘플 2-7은 현탁상태로 남아있었다. 이들의 평균 입자 크기를 측정하여 아래의 표에 나타내었다.

<표>

샘플#	[Na₄P₂O₇] (mM)0	평균 입자 크기(nm)
0	0	*
1	2.5	11.6
2	6.3	9.5
3	12.5	9.3
4	18.8	9.7
5	25.1	9.1
6	25.1	9.6
7	62.7	9.7
8	125.4	*
9	188.1	*
10	250.7	*

* 샘플이 응집하였음.

입자 크기가 작은 것은 녹말 유도 코팅 물질이 제거됨을 나타낸다. 이 자료는 약 2 내지 60 mM의 농도 범위 내에서 이인산염이 네이키드 철산화물 결정체에 대해 만족스런 표면 조절제와 안정제임을 나타낸다.

(d) 표면 조절제 및 안정제로서 삼인산염

안정제로서의 삼수화물을 테스트하기 위한 연구를 행하였다. 시그마사의 오나트륨 삼인산염 육수화물을 사용하였다. 철산화물 현탁액 3.75 ml에 나트륨 삼인산염 5.25 mM, 물 3.75 ml 및 30% 과산화수소 7.5 ml를 첨가하였다. 복합물을 60℃에서 3시간동안 배양하였다. 현탁액은 응집현상을 보이지 않았고, 입자 크기는 9 nm이었다. 다시, 작은 평균 입자크기는 녹말 유도 물질 코팅이 제거되었음을 반영한다. 이 자료는 삼인산염이 네이키드 철산화물 결정체에 대해 만족스런 표면 조절제와 안정제임을 나타낸다.

(e) 표면 조절제 및 안정제로서 사인산염

사인산염을 테스트하기 위해 유사한 연구를 행하였다. 시그마사의 육암모늄사다인산염(Hexammonium tetrapolyphosphate salt)을 사용하였다. 결과를 하기 표에 요약하였다.

샘플 #	[P₄O₁₃] (nM)	평균 입자 크기 (nm)
0	0	*
1	2.5	27.3
2	5	9.5
3	10	10.1
4	20	9.3

* 샘플이 응집하였음.

다시, 배양후 샘플 2-4의 입자 크기가 작은 것은 녹말 유도 코팅 물질이 제거되었음을 반영한다. 이 자료는 사인산염이 네이키드 철산화물 결정체에 대해 만족스런 표면 조절제 및 안정제임을 나타낸다.

네이키드 철 산화물 나노결정체의 특징 부여

피로인산 나트륨을 사용하여 네이키드 철산화물 나노 결정체(nions)를 제조하였다. 산화과정이 끝나고, 현탁앨을 물에 대하여 다이아필터하여 녹말 조각 및 잔류 과산화수소를 제거하였다. 결과현탁액을 아래에 요약된 몇가지 분석 기술을 사용하여 특징을 밝혀냈다.

(a) GPC: 겔 투과 크로마토그래피(GPC)는 네이키드 철산화물 나노입자들(NIONS)은 녹말 유도 중합체의 흔적을 남기지 않는 날카로운 피크를 보인다는 것을 나타낸다.

(b) 전체 유기탄소: 두개의 분리된 니온 제품의 분석 결과 유기탄소의 총량은 겨우 기저선 정도로서, 이는 실질적으로 중합체 코팅이 완전하게 제거되었음을 나타낸다.

샘플 TOC (ppb) Fe 농도

물 블랭크(blank) 159 -

니온 156 2.6 μg/ml

샘플 TOC (ppb) Fe 농도

물 블랭크(blank) 144 -

니온 211 30 μg/ml

실시예 12 4060 18 μg/ml

(c) 모세관 전기영동: 니온 분석 결과 전기영동 활동도가 -3.4 x 10^-4㎠v^-1s^-1로서 이는 실시예 12의 제품(-3.0 x 10^-4㎠v^-1s^-1)보다 약간 더 음성적이다. 이는 다인산염에 의해서 입자에 첨가된 음성 정전기 전하에 일치한다.

(d) 이완도 및 자기 포화: 자기 이완도를 측정하였다. r₁과 r₂는 각각 22.5 및 34.4 mM^-1s^-1이므로 r₂/r₁의 값은 1.53이었다. 이들 수치는 실시예 12의 산물과 일반적으로 많이 유사하다.

(e) 증기 살균동안의 안정성: 니온 현탁액을 121℃에서 20분동안 증기 살균한 결과 입자 크기에서 뚜렷한 차이를 보이지 않았다.

Claims

(ⅰ) 수성 매질을 함유하는 친수성 분지형(分枝形) 유기 중합체내에서 자기 입자를 형성하는 단계; 및

(ⅱ) 상기 중합체를 개열(開裂, cleaving)하여 복합 입자를 방출하는 단계를 포함하는 복합 자기 입자의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 매질이 겔인 방법.
제2항에 있어서, 상기 겔이 음이온 부위를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 자기 입자가 철산화물 입자인 방법.
제1항에 있어서, 상기 자기 입자가 초상자성(超常磁性)인 방법.
제1항에 있어서, 상기 분지형 중합체가 녹말인 방법.
제1항에 있어서, 상기 중합체가 산화 개열되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 중합체의 개열이 상기 중합체 매트릭스내에 다수의 상기 자기입자들을 포함하는 입자들을 처리함으로써 이루어지는 방법.
제1항에 있어서, 상기 복합 입자가 친수성 혈액-체재-연장 중합체 코팅(a coating of a hydrophilic blood-residence-prolong polymer)에 부착되는 처리를 더 거치는 방법.
제9항에 있어서, 상기 친수성 혈액-체재-연장 중합체가 단계 (ⅱ)전에 상기 매질내에 존재하는 방법.
제9항 또는 10항에 있어서, 상기 혈액-체재-연장 중합체가 관능성 폴리알킬렌 산화물인 방법.
제1항에 있어서, 상기 수성 매질이 선형 중합체를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 중합체가 자기 입자-중합체 복합 입자의 형성 이후에 개열되는 방법.
제1항에 있어서,

(ⅰ) 가열된 수용액에서 녹말, 제1철염 및 제2철염, 및 염기를 결합시키는 단계;

(ⅱ) 임의로, 상기 용액을 15℃ 이하로 냉각시켜 겔을 형성시키 단계;

(ⅲ) pH를 6.0 내지 8.5로 감소시키는 단계(이 단계는 임의로 단계 (ⅱ) 이전에 수행할 수 있음);

(ⅳ) 산화제로 처리하여 녹말을 개열하여 상기 입자들을 방출하는 단계;

(ⅴ) 방출된 입자들을 세정 및 여과하는 단계;

(ⅵ) 임의로, 방출된 입자들을 관능성 폴리알킬렌 산화물 유도체와 반응시켜 상기 유도체를 상기 입자들에 부착시키는 단계; 및

(ⅶ) 임의로, 방출된 입자들을 오토클레이브 살균하는 단계를 더 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 이렇게 방출된 대부분의 상기 복합 입자들이 단일 자기 입자를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (ⅱ)의 개열은 제2 개열 단계가 실질적으로 모든 상기 중합체를 자기입자들로부터 제거하는 두 단계로 수행되는 방법으로서, 상기 제2 개열단계는 자기 입자에 결합되는 안정화제의 존재하에서 또는 안정화제 첨가 이후에 이루어지는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (ⅰ) 및 (ⅱ)가 동일한 반응기에서 이루어지는 방법.
전체 입자 직경의 중간치(mean)가 4 내지 30 nm이고, 개열된 친수성 중합체 코팅 물질과 초상자성 무기 코어 입자들을 포함하는 복합 입자들.
제18항에 있어서, 상기 코팅 재료는 산화되 탄수화물인 복합 입자들.
제18항 또는 19항에 있어서, 상기 코팅 재료는 개열된 녹말인 복합 입자들.
제18항에 있어서, 친수성 혈액-체재-연장 중합체 코팅을 더 포함하는 복합 입자들.
입자들이 유기 코팅 물질을 실질적으로 포함하지 않고 표면에 결합된 무기 정전기 안정화제를 수반하는 전체 입자 직경의 중간치가 4 내지 30 nm인 초상자성 무기 코어 입자들의 수성 현탁액.
제22항에 있어서, 상기 안정화제는 올리고- 또는 폴리-포스페이트인 현탁액.
제18항에 있어서, 코어 입자 표면에 다수의 철 이온 결합기 또는 조절기에 부착된 올리고- 또는 폴리-포스페이트기 또는 포스포네이트기를 통해 결합되는 생분포 조절기(biodistribution modifier)가 결합된 초상자성 무기 코어 입자들을 포함하는 전체 입자 직경의 중간치가 4 내지 30 nm인 복합 입자들.
제24항에 있어서, 상기 생분포 조절기는 폴리알킬렌옥사이드기를 포함하는 복합 입자들.
제24항 또는 25항에 있어서, 개열된 친수성 중합체 코팅 물질을 더 포함하는 복합 입자들.
제18항 내지 26항중 어느 한 항에 있어서, 코어 입자 표면에 진단용 영상 양식에서 감지가능한 리포터(reporter) 부분이 부착되어 있는 복합 입자들.
제27항에 있어서, 코어 입자 표면에 요오드화된 유기포스페이트가 부착된 복합 입자들.
화학적 또는 물리적으로 그 표면에 결합된 친수성-혈액-체재-연장 중합체를 가지는 무기 입자를 포함하고 친수성 유기 중합체 코팅을 차폐하는 결합 부위를 구비하는 복합 입자성 주사용 제제.
제29항에 있어서 상기 차폐되는 중합체 코팅은 개열된 분지형 탄수화물인 제제.
제29항 또는 30항에 있어서, 상기 친수성-혈액-체재-연장 중합체가 관능성 폴리알킬렌옥사이드인 제제.
제1항 내지 31항중 어느 한항의 또는 어느 한항에 따라 제조된 입자 및 적어도 하나의 생리학적으로 수용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 진단용 조성물.
초상자성 금속 산화물 코어 결정체 및 유기 코팅을 포함하고, 상기 코어 결정체의 중간 직경은 2 내지 10 nm이고, 상기 입자는 중간 직경이 30 nm 이하이고 상기 코팅은 산화 개열 녹말을 포함하는 복합 입자들을 콘트라스트 유효량 포함하는 조영제 조성물.
제33항에 있어서, 상기 코팅은 다관능성 폴리알킬렌옥사이드를 더 포함하는 조성물.
제33항 및 34항에 있어서, 상기 코어 결정체는 중간 직경이 4 내지 8 nm 이고 상기 입자의 중간 직경은 15 nm 이하인 조성물.
제32항 내지 35항중 어느 한 항에 따른 조성물을 몸체에 투여하는 단계와, 상기 조영제가 분포되어 있는 상기 몸체의 최소 부위의 영상을 생성하는 단계를 포함하는, 인간 또는 비인간의 몸체의 콘트라스트가 향상된 화상 생성 방법.
제32항 내지 35항중 어느 한 항에 따른 조성물을 몸체에 투여하는 단계와, 상기 몸체로부터 발산되거나 상기 입자에 의해 조절되는 신호를 감지하는 단계를 포함하는 인간 또는 비인간 내의 조영제 분산 측정 방법.
인간 또는 비인간 몸체에 투여하여 진단하는데 사용하기 위한 진단용 조영제 조성물을 제조하기 위한 제1항 내지 31항중 어느 한 항의 또는 어느 한 항에 따라 제조되는 복합 자기 입자의 용도.