KR19990076910A - 뉴클레오타이드 동족체류 - Google Patents

Abstract

포스포네이트 뉴클레오타이드 동족체의 인 원자에 결합된 에스테르 결합기를 갖는다는 특징을 갖는 뉴클레오타이드 포스포네이트 에스테르가 제공된다. 이들의 동족체는 생체내에서 가수분해하여 상응하는 포스포네이트 뉴클레오타이드 동족체를 생산하는 에스테르 결합을 함유한다. 이들의 합성방법 및 합성 중간체 그리고 용도도 개시된다.

Description

뉴클레오타이드 동족체류

본 발명은 뉴클레오타이드 동족체 에스테르, 약리적으로 허용되는 그의 산부가염, 그의 제조방법 및 그들의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 뉴클레오타이드 동족체에 관련된 화합물은 미국특허 제 5,043,339호, 5,108,994호 및 5,166,198호; EP 206 459호, EP 253 412호, EP 269 947호; EP 270 885호; EP 319 228호; EP 398 231호; EP 404 296호; EP 465 297호; EP 468 119호; EP 468 866호; EP 479 640호; EP 481 214호; EP 494 370호; EP 531 597호; PCT/GB91/01171호; PCT/US92/01020호; PCT/US92/05208호; WO 91/19721호; Bronwson 외, Bioorg Medicinal Chem. Lett (1992) 2: 685-690; Bronson외, J. Med. Chem. (1989) 32:1458-1463; Bronson외, Nucleotide Analogs as Antiviral Agents, ACS Symposium Series 401, J.C. Martin, Ed., p. 72-87; American Chemical Society, Washington, DC (1989); Colla 외, J. Med. Chem (1983) 26: 602-604; Curley 외, Antiviral Res (1990) 14: 345-356; De Clercq 외, Nature (1986) 323: 464-467; Farrow 외, J. Med. Chem. (1990) 33: 1400-1406; Farquhar 외, J. Pharm. Sci. (1983) 72: 324-325; Freed 외, Biochem. Pharmacol (1989) 19: 3193-3198; Freeman 외, J. Med. Chem. (1992) (1992) 35: 192-3196; Gabrielsen, B. 외, Antiviral Res Suppl. I (1992) 17:149; Gumport 외, Proc. Natl. Acad. Sci (1971) 2559-2563; Juodka 외, Coll. Czech Chem Commun (1974) 39: 963-968; Kim 외, Bioorg. Medicinal Chem. Lett (1992) 2:367-370; Kim, 외, Tet Lett. (1992) 33:25-28; Kim 외, J. Med. Chem. (1990) 33:1207-1213; Kumar 외, J. Med. Chem (1990) 33:2368-2375; McGuigan 외, Antiviral Chem. Chemother (1993) 4:97-101; McGuigan 외, Antiviral Res (1991) 15: 255-263; Rosenberg 외, Coll. Czech Chem. Commun (1988) 53:2753-2777; Rosenberg 외, Coll Czech Chem Commun (1988) 52:2792-2800; Rosenberg 외, Coll Czech Chem Commun (1988) 52; 2801-2808; Starrett 외, Antiviral Res (1992) 19: 267-273; Yu 외, J. Med. Chem (1992) 35: 2958-2969; Wolff-Kugel 외, Tet. Lett. (1991) 32: 6341-6344.

포스페이트기 또는 포스포네이트를 갖는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 동족체의 특징은 생리적 pH에서 인 기 (phosphorus group)와 관련한 1 또는 2개의 음전하가 존재한다는 것이다. 연구자들은 포스페이트 또는 포스포네이트기와 같은 부분과 관련한 전하가, 장막을 통한 수동적 확산을 제한함으로써 경구에 의한 생체이용성을 일반적으로 제한시킨다고 믿고 있다 (Liebman 외, J. Biol. Chem., 19(55) 216:823-830; Roll 외, J. Biol. Chem. (1956) 220;439-444; Srivastava 외, Bioorg Chem. (1984) 12:118-129; Palu 외, Antiviral Res (1991) 16: 115-119; Sasty 외, Mol. Pharmacol (1992) 41:441-445). 연구자들은 종종 치료적인 혈청 또는 세포내 농도를 달성하기 위해 이 화합물들을 비경구 투여한다.

발명의 목적

본 발명은 다음 중 한가지 이상의 목적에 부합하는 한가지 이상의 화합물들을 제공한다.

본 발명의 주요 목적은 고리형 뉴클레오타이드 동족체의 포스포네이트 에스테르를 제공하는 것이다. 이 화합물들은 에스테르 부분 (ester moiety)을 갖지 않는 모(母) 뉴클레오타이드 동족체 (parent nucleotide analog)에 비해 개선된 약동학 및 약력학적 성질을 가질 수 있다. 이들 뉴클레오타이드 포스포네이트 에스테르 (nucleotide phosphonate ester; 이하 "NPEs"라 칭함)는 대개 인체 및 동물에 있어서 증가된 경구 생체이용성을 갖는다.

본 발명의 또 다른 목적은 에스테르 부분이 결여된 모 화합물에 비해 독성은 감소되고/또는 약효는 증가된 NPEs를 제공하는 것이다. 본 발명은 실질적으로 모 뉴클레오타이드 포스포네이트의 항바이러스 활성은 유지시키면서도 생체내에서 덜 독성적인 형태로 제공함으로써 모 뉴클레오타이드 포스포네이트의 치료적 활성창을 증가시켜주는 NPEs를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 NPEs 합성시 중간체 및 개선된 NPE 합성방법을 제공하는 데 있다.

발명의 요약

주요 구체예에서, 포스포네이트 인 원자에 가수분해가능한 에스테르 결합과 포스포네이트 부분을 함유하는 뉴클레오타이드 동족체가 본 발명의 목적이 된다. NPEs는 상응하는 뉴클레오타이드 포스포네이트로 생체내에서 가수분해되기 때문에 상응하는 뉴클레오타이드 포스포네이트의 전구체가 된다.

본 발명의 주요 구체예는 다음 화학식 1을 갖는 NPEs, 그의 염, 용매화합물 또는 라세미체이다:

식 중, B는 보호되거나 보호되지 않은 헤테로시클릭 염기;

R은 수소(H), 알킬, O-알킬, -CHO, -C(O)OR², -C(O)R², -C(O)N(R³)₂또는 -S(O)₂N(R³)₂;

각각의 R¹은 독립적으로 수소, 시아노(CN), 니트로(NO₂), 할로겐, 알킬, O-알킬, -C(O)OR³, -C(O)R³, -S(O)₂OH, -N(R³)₂, -CHO 또는 -OH;이고

각각의 R²와 R³는 독립적으로 수소, 알킬, 페닐, 알킬치환 페닐, -CH₂C₆H₅또는 -CH₂CH₂C₆H₅이다.

(^*)표가 붙은 원자들은 (R), (S), 또는 (RS) 배열이다.

본 발명의 구체예에는 입체화학적으로 인리치 (enrich)되거나 분할 (resolved) 또는 실질적으로 분할된 NPEs가 포함되며 탄소 또는 인 원자 비대칭 (chiral) 중심^*은 (R) 또는 (S) 에난티오머가 포함된다.

다른 구체예는 R이 -C(O)OR², R¹과 B는 상기 정의한 바와 같고, R²는 n-부틸 또는 탄소원자 5개 이상 갖는 알킬, 예컨대 탄소원자를 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 갖는 알킬기인 화합물이다.

다른 구체예에는 대상 환자에게 본 발명의 NPE의 항바이러스 유효 투여량을 경구 투여하는 것으로 되는 방법이 포함된다.

다른 구체예에는 인 원자의 비대칭 중심^*에서 입체화학적으로 인리치된 본 발명의 NPEs을 제조하는 방법이 포함된다.

본 발명의 NPEs 및 그의 중간체의 구체예에는 상응하는 염이 포함되며, 이들은 포스폰산 부분의 염기성 염, 염기의 산부가염, 이들의 쯔비터이온 형태, 이들의 비이온화 형태 및/또는 유기 또는 수성 용매화합물일 수 있다. 염들은 대개 약리적 또는 수의학적 목적에서 적절할 뿐만 아니라, 예컨대 NPE 합성과 같은 기타 목적에 유용한 염들도 여기에 포함된다. 약리적으로 허용가능한 이들 화합물의 비독성 염에는 알칼리 및 알칼리토 금속이온 또는 암모늄 및 4급 아미노이온과 같은 적절한 양이온과 포스폰산 기의 산 음이온 부분과의 결합에 의해 유도되는 것들이 포함될 수 있다. NPEs는 또한 퓨린, 특히 구아닌 또는 피리미딘 염기와 같은 퓨린의 염기 중심과의 반응으로부터 야기되는 특정의 유기 및 무기산의 산 부가염을 포함한다.

본 발명의 화합물들은 존재할 수 있는 부분입체이성질체 혼합물을 포함한다. 화학식 1의 화합물들은 대개 비대칭 탄소에서 S 배열로 존재하고, 비대칭 인에서 R, S, 또는 RS 배열로 존재할 것이다. 두가지 비대칭 중심 모두 본문에서^*로 표시된다. 부분입체이성질체 혼합물을 예컨대 HPLC와 같은 공지의 기술을 통해 개별적인 이성체로 분리할 수 있지만, 대부분의 경우, 본 발명의 화합물에서는, 부분입체특이적 반응 (대개 인 원자에서)을 통해/또는 소망하는 출발물질의 적절한 부분입체이성체를 이용함으로써 (대개 탄소 원자에서) 바람직한 광학 이성체를 합성할 수 있다.

NPE 구체예에는 방사능동소체 (³²P,³⁵S,¹⁴C,³H,¹²⁵I), 형광물질, 효소 (퍼옥시다제, 포스파타제등을 포함) 등과 같은 검색가능한 표지로 표지된 NPEs가 포함된다.

이러한 구체예는 또한 본 발명의 NPEs에 결합할 수 있는 항체를 발생시키는 면역원 및/또는 그들의 디히드록시 포스포네이트 가수분해 산물도 포함한다.

발명의 상세한 설명

본문에서, 알킬이라 함은 직쇄, 분지쇄 또는 고리형 포화탄화수소를 말하며 달리 특정하지 않는 한, 예컨대 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, t-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 3-에틸부틸, 시클로헥실, n-헵틸, n-옥틸, 2-에틸헥실, n-노닐, n-데실 등과 같은 모든 위치의 이성체를 포함한다. 화학식 1의 화합물의 범위를 정의할 때 사용되는 알킬이란 용어에는 약 1 - 20 탄소원자를 함유하는 알킬이 포함될 수 있으며, 일반적으로 약 2 - 16개 또는 약 2 - 12개의 탄소원자를 함유하는 알킬을 의미한다. 할로겐이라 함은 F(불소), Cl(염소), Br(브롬), 및 I(요오드)를 가리킨다.

실질적으로 분할된 것 (substantially resolved)이라 함은, 특정 비대칭 지점에서 인리치 (enrich)된 화합물을 의미한다. 예컨대 비대칭 인 원자에서 실질적으로 분할된 NPE와 같이 실질적으로 분할된 화합물은 대개 적어도 약 65% 또는 적어도 약 80% 또는 적어도 약 90%의 (R) 또는 (S) 이성체로 구성된다. 비대칭 탄소 원자에서 분할된 화학식 1의 NPE와 같은, 분할된 화합물이란, 그 화합물이 통상적인 측정범위의 검색 한계 내에서 비대칭 원자의 주어진 배열의 100%로서 존재함을 의미한다.

라세미체 (racemate) 또는 라세미 혼합물 (racemic mixture)이라 함은 주어진 화합물의 2개 이상의 광학 이성체를 함유하는 모든 혼합물을 의미하는 것이다. 예컨대,인 원자에서 또는 인 원자에 연결된 두 개의 위치 이성체 입체화학 이성체를 함유하는 화학식 1의 NPE 라세미체는 각각의 이성체를 정확히 50%씩 함유하거나 또는 특정 이성체를 50% 초과, 100% 미만의 양으로 함유할 수 있는 것이다.

화학식 1로 표시되는 NPEs 중 다음의 화합물들은 임의로 배제된다:

1. R과 모든 R¹이 함께 하나의 C_1-12O-알킬기와 3개의 수소원자가 아닌 것과 R과 모든 R¹이 함께 두 개의 C_1-12O-알킬과 2개의 수소원자가 아닌 것;

2. R과 R¹기가 수소일 때, 나머지 R과 모든 R¹이 함께 하나의 O-에틸기와 하나의 OH기가 아닌 것;

3. R이 수소일 때, 모든 R¹이 함께 하나의 시아노기와 두 개의 수소가 아닌 것과, R이 수소일 때, 모든 R¹이 함께 두 개의 시아노기와 하나의 수소가 아닌 것;

4. R이 수소일 때, 모든 R¹이 함께 세 개의 할로겐 원자가 아닌 것과 R이 수소일 때, 모든 R¹이 두 개의 할로겐 원자와 하나의 수소원자가 아닌 것과, R이 수소일 때, 모든 R¹이 하나의 할로겐 원자와 두 개의 수소원자가 아닌 것;

5. R과 모든 R¹이 함께 하나의 -C(O)O-C_1-4-알킬기와 세 개의 수소원자가 아닌 것;

6. R과 모든 R¹이 함께 두 개의 -C(O)O-C₂H₅기와 두 개의 수소원자가 아닌 것;

7. R과 나머지 R¹이 모두 수소일 때, 모든 R¹이 함께 하나 또는 두 개의 니트로기가 아닌 것;

8. R과 나머지 R¹이 모두 수소일 때, 모든 R¹이 함께 하나 또는 두 개의 히드록실기가 아닌 것;

9. R과 모든 R¹이 함께 하나의 C_1-6알킬기와 세 개의 수소원자가 아닌 것;

10. R과 모든 R¹이 함께 네 개의 수소원자가 아닌 것;

11. R이 수소원자일 때, 모든 R¹이 함께 -N(CH₃)₂와 두 개의 수소원자가 아닌 것;

12. R과 모든 R¹이 함께 하나의 -C(O)O-C₂H₅기, 하나의 히드록실기 및 두 개의 수소원자가 아닌 것.

상기 1 내지 12의 단서조항에 의해 화학식 1의 NPEs로부터 배제된 NPE 화합물들을 "배제된 NPEs"라 칭한다. 화학식 1의 NPEs의 한가지 구체예는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 부가적인 에틸 또는 에틸렌기를 갖기 때문에 배제된 NPEs와 구별되는 NPEs를 포함하는데, 즉, 배제된 NPEs에는 위에 열거된 예뿐만 아니라, 배제된 화합물의 여하한 위치에 삽입된 부가적인 메틸 또는 메틸렌기를 갖는 것들도 포함된다.

화학식 1의 NPEs는 임의로 모든 R¹이 수소인 것, 두 개의 R¹이 수소이고 하나의 R¹은 R¹의 정의에 따른 여하한 치환기인 것, 그리고 두 개 이상의 R¹이 수소 이외의 여하한 정의된 대로의 치환기인 것을 포함한다. 화학식 1의 NPEs는 임의로 두 개의 R¹이 수소이고 하나의 R¹은 수소 이외의 다른 정의에 따른 치환기인 것을 포함할 수도 있는데, 예컨대, 두 개의 R¹이 H이고 나머지 R¹은 -C(O)OR²(여기서 R²는 탄소원자를 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개 갖는 알킬이거나 또는 R²는 -C₆H₄-p-C(CH₃)₃인 것일 수 있다. 화학식 1의 화합물의 예에는 R이 -C(O)OR²인 (여기서 R²는 탄소원자 1 - 4개의 알킬이며 적어도 하나의 R¹은 수소 또는 메틸이 아님) 화합물이 포함된다. 화확식 1의 화합물에는 또한 R이 -C(O)OR²(여기서 R²는 탄소원자를 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 갖는 알킬이고 두 개의 R¹은 수소이며 나머지 R¹은 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록실 또는 -N(R³)₂이고, 여기서 R³는 같거나 다름)인 화합물이 포함된다. 화학식 1의 화합물에는 또한 R이 수소이고, 두 개의 R¹은 수소이며 나머지 R¹은 탄소원자를 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 갖는 알킬이거나 또는 나머지 R¹은 O-알킬, -C(O)OR³, -C(O)R³, -S(O)₂OH, -CHO, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록실 또는 -N(R³)₂(여기서 R³는 같거나 다름)인 화합물도 포함된다. 화학식 1의 화합물에는 또한 R이 수소이고 하나의 R¹은 수소이며 나머지 R¹은 각각 탄소원자 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개의 알킬이거나, 또는 나머지 R¹이 각각 O-알킬, -C(O)OR³, -C(O)R³, -S(O)₂OH, -CHO, 할로겐, 시아노, 니트로, 히드록실 또는 -N(R³)₂ (여기서 각각의 R³는 같거나 다름)인 화합물도 포함된다.

R이 알킬 또는 O-알킬인 경우 R의 예로는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 탄소원자를 갖는 알킬 또는 O-알킬이 포함된다. R이 알킬 또는 O-알킬이면 R에는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, t-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 3-에틸부틸, 시클로헥실, n-헵틸, 2-에틸펜틸, n-옥틸, 1-에틸헥실, 2-에틸헥실, 3-에틸헥실, n-노닐, n-데실 등이 포함되며 R이 R²를 포함하는 경우, 즉, R이 -C(O)R²또는 -C(O)R²인 경우, R²sms 알킬이며, R²는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 탄소원자를 갖는 알킬을 포함할 수 있다. R²는 1-12, 3-6, 3-10, 5-10, 6-12 또는 6-10개의 탄소원자를 갖는 알킬을 포함할 수 있다. R²에는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, t-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 3-에틸부틸, 시클로헥실, n-헵틸, 2-에틸펜틸, n-옥틸, 1-에틸헥실, 2-에틸헥실, 3-에틸헥실, n-노닐, n-데실 등이 포함된다.

R¹과 R³가 알킬 또는 O-알킬인 경우에는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 이상의 탄소원자를 갖는 알킬이 포함될 수 있다. R¹또는 R³는 1-12, 3-6, 3-10, 5-10, 6-12, 6-10, 2-10, 3-10, 4-10, 2-6, 3-6 또는 4-6개의 탄소원자를 갖는 알킬을 포함한다. R이 -C(O))R²이고 R²가 1-4개의 탄소원자를 갖는 알킬이고, 하나 이상의 R¹이 알킬이면, R¹은 2-10, 3-10, 4-10, 2-6, 3-6 또는 4-6개의 탄소원자를 갖는 알킬일 수 있다. R¹이 알킬 또는 O-알킬이면, R¹은 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, t-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 3-에틸부틸, 시클로헥실, n-헵틸, 2-에틸펜틸, n-옥틸, 1-에틸헥실, 2-에틸헥실, 3-에틸헥실, n-노닐, n-데실 등일 수 있다. R³가 알킬이면, R³는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, t-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, n-헥실, 1-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 1-에틸부틸, 2-에틸부틸, 3-에틸부틸, 시클로헥실, n-헵틸, 2-에틸펜틸, n-옥틸, 1-에틸헥실, 2-에틸헥실, 3-에틸헥실, n-노닐, n-데실 등일 수 있다.

두 개의 R³가 하나의 치환기에 존재하면, 예컨대 -C(O)N(R³)₂또는 -N(R³)₂와 같은 경우에는, 각각의 R³는 같거나 다를 수 있다. 이러한 화합물의 예에는 하나의 R³는 수소이고 다른 R³는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소원자를 갖는 알킬기인 것이 포함된다. 이러한 화합물의 예에는 또한 두 개의 R³가 모두 같고 두가지 모두 수소 또는 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소원자를 갖는 알킬기인 것이 포함된다.

R²와 R³는 알킬치환 페닐을 포함하는데 여기에는 파라-알킬 치환 페닐이 포함되며 여기서 알킬기는 3, 4, 5, 또는 6개의 탄소원자를 갖는 알킬기이다. 이러한 알킬기에는 이소프로필, sec-부틸, t-부틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 2-에틸부틸 등이 포함된다.

화학식 1의 구체예에는 입체화학적으로 분할되거나 또는 탄소원자 비대칭 중심^*에서 (S) 또는 (R) 에난티오머로서 인리치된 NPEs가 포함된다. 화학식 1의 화합물의 구체예에는 입체화학적으로 분할되거나 또는 인 원자 비대칭 중심^*에서 (S) 또는 (R) 에난티오머로서 인리치된 NPEs가 포함된다. 인 원자 비대칭 중심^*에서 인리치된NPEs는 55% 내지 약 99.9%의 (S) 또는 (R) 에난티오머로 구성된다.

화학식 1의 NPEs는 다단계의 화학적 변경을 거쳐 생화학적 또는 효소적으로 비고리형 (acyclic) 뉴클레오타이드 포스포네이트 모 화합물을 형성하게 된다. 예컨대, cHPMPC (1-[((S)-2-히드록시-2-옥소-1,4,2-디옥사포스포리난-5-일)메틸]시토신; 시클릭 HPMPC; 이하 화학식 3으로 칭함)의 NPEs는 다음에 도시된 바와 같이 실질적으로 개환형태, 즉, (S)-HPMPC (이하의 화학식 4)로 먼저 전환된다. R^x는 화학식 2의 구조에서 화학식 1의 NPE 에스테르 부분 잔기를 나타낸다. 본 발명자들은 마지막 단계, 즉 화학식 3의 화합물에서 화학식 4의 화합물로의 전환이 세포내에서 이루어지는 것으로 믿는다.

R이 아미드인 화학식 1의 NPEs는 다음과 같이 합성할 수 있다.

이 반응은 용매나 에테르 (디에틸에테르 등) 또는 다른 용매 (N-메틸피롤리디논)를 사용하지 않고 수행할 수 있다. 이어서 후술하는 바와 같이, 화학식 B의 화합물을 cHPMPC 또는 다른 시클릭 HPMP 화합물과 커플링시킬 수 있다.

다음과 같이 설포닐 또는 설폰아미드를 포함하는 R을 포함하는 화학식 1의 NPEs를 합성할 수 있다.

또한 PCl₃또는 SOCl₂를 이용하여 화학식 C의 화합물을 화학식 D의 화합물로 전환시킬 수 있다. 다음에 설명된 바와 같이, 화학식 F 및 화학식 H의 화합물을 cHPMPC 또는 기타 시클릭 HPMP 화합물과 커플링시킬 수 있다.

다음과 같이 케토기를 갖는 R을 갖는 화학식 1의 NPEs를 합성할 수도 있다.

피리디늄 클로로크로메이트 (PCC)와 같은 적절한 시약을 이용하여 산화시킴으로써 화학식 J의 화합물을 화학식 K의 화합물로 전환시킨다. 이 반응은 디에틸 또는 디-n-프로필 에테르와 같은 적절한 에테르를 이용하여 수행한다. 또한 다음 반응에 의해 화학식 K의 화합물을 제조할 수도 있다.

후술하는 바와 같이 화학식 K의 화합물을 cHPMPC 또는 기타 시클릭 HPMP 화합물과 커플링시킬 수 있다. 화학식 K의 합성반응에는 필요한 경우 R²대신 R³를 이용할 수 있다.

본 발명의 화합물은 핵산, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오사이드 또는 그의 동족체에서 발견되는 자연발생적인 모든 헤테로시클을 포함한다. 이하에 B로 표시되는 바와 같은, 이러한 헤테로시클릭 염기 래디칼은 일반적으로 다음 화학식 a 내지 화학식 d로 표시되는 퓨린, 피리미딘 또는 그와 관련된 헤테로사이클들이다.

(식 중, R⁶는 NH₂, NHR⁷, NHR⁸, N=CHN(R⁷)₂또는 N=C(CH₃)N(R⁷)₂;

R⁷은 C_1-6알킬;

R⁸은 보호기;

각각의 R⁹은 각각 N 또는 CH;

R¹⁰은 OH, NH₂, NHR⁷또는 NHR⁸;

R¹¹은 H, NH₂, NHR⁷또는 NHR⁸;이며

R¹²는 NH 또는 CH₂임)

B에는 헤테로시클릭 염기의 보호된 형태와 보호되지 않은 형태가 모두 포함된다. 엑소시클릭 아민과 기타 치환기의 보호기는 공지이며 (T.W. Greene 외, 편, Protective Groups in Organic Synthesis (1991), Wiley, 2판), N-벤조일, 이소부티릴, 4,4'-디메톡시트리틸 (DMT) 등이 포함된다. 보호기는 당업자가 적절하게 선택할 수 있을 것이며 예컨대, 산성, 염기성, 산화, 환원 또는 기타 조건과 같이 보호기가 접할 수 있는 화학 및 불안정한 기의 특성에 좌우될 것이다.

일반적으로, B는 구아닐, 3-데아자구아닐, 1-데아자구아닐, 8-아자구아닐, 7-데아자구아닐, 아데닐, 3-데아자아데닐, 1-데아자아데닐, 8-아자아데닐, 7-데아자아데닐, 2,6-디아미노퓨리닐, 2-아미노퓨리닐, 6-클로로-2-아미노퓨리닐 및 6-티오-2-아미노퓨리닐 중에서 선택된 9-퓨리닐이거나, 또는 B는 시토시닐, 5-할로시토시닐, 6-아자시토시닐 및 5-메틸시토시닐과 같은 5-(C₁-C₃알킬)시토시닐 중에서 선택된 1-피리미디닐 잔기이다.

B가 시토신-1-일이고 두 개의 R¹이 수소인 화학식 1의 NPEs의 구체예의 설명을 이하에 제시한다. 표 1은 두 개의 R¹이 모두 수소인 화학식 1 화합물 구조에 결합된 특정 R 및 R¹치환기를 갖는 NPEs를 나타내는 것이다. A3, A4, A5, A6, A7 및 A8은 각각 탄소원자를 3, 4, 5, 6, 7 및 8개 갖는 알킬기를 의미한다. 이러한 표시에는 예컨대 직쇄, 분지쇄 및 고리형 이성체와 같은 이들 알킬기의 모든 위치 이성체가 포함된다.

표 1에서는 각각의 R 및 R¹치환기에 대해 번호를 붙여놓았다. R.R¹.X라는 약속은 개별적인 화학식 1의 화합물을 칭하며 수록된 R 또는 R¹구조에 할당된 번호는 그의 할당 구조를 나타낸다. 다음에 도시하는 화학식 1에서 R¹은 3, 4, 5 또는 6 위치로 표시되는 X 위치에서 방향족 고리에 결합한다. R과 R¹모두에서 예컨대 A5로 표시되는 동일한 두 개의 알킬기를 함유하는 화합물의 경우, 각각의 알킬기를 독립적으로 선택할 수 있다. 따라서, 4.19.5로 표시되는 화학식 1의 화합물은 다음 구조를 갖는다.

(식 중, B는 시토신-1-일이고 각각의 A4는 예컨대 n-부틸, sec-부틸, t-부틸 등과 같이 탄소원자를 4개 함유하는 알킬기이다) 22.15.6으로 표시되는 화합물은 다음 구조를 갖는다.

(식 중, B는 시토신 1-일임) 화합물의 예를 들면 다음과 같다:

부가적인 예시 화합물에는 염기가 시토신-1-일 대신 아데닌-9-일인 것을 제외하고 상기 나타낸 것과 동일한 화합물들이 포함된다. B가 아데닌-9-일인 화합물로서, 1.1.3으로 시작해서 54.44.6으로 끝나는 일련의 본 발명의 화합물들도 참조로 본문에 인코포레이션시켰다.

에스테르 가수분해가 요망되는 세포 내에서 발견될 것으로 예상되는 에스테라제 및/또는 카르복시펩티다제의 기질 특이성에 기초해서 NPE를 선택할 수 있다. 이러한 효소의 특이성이 알려져있지 않은 경우에는, 복수개의 뉴클레오타이드 포스포네이트 에스테르를 스크리닝함으로써 소망하는 기질 특이성을 결정할 수 있다. 이것은 유리 포스포네이트의 발생 또는 항바이러스 활성등의 분석으로부터 용이하게 결정할 수 있을 것이다. (i) 상부 소화관에서 가수분해되지 않거나 비교적 서서히 가수분해되는 화합물, (ii) 소화관과 세포 투과성인 화합물 및 (iii) 세포질 및/또는 전신 순환계에서 가수분해되는 화합물을 선택한다. 당업자는 표적 바이러스 감염에 민감한 기관으로부터 방출된 전구체를 동정하기 위해 특정 조직으로부터의 세포에 대해 스크리닝하는데, 예컨대 간의 경우에서와 같이, 간이 가수분해시키는 전구체 약물을 들 수 있다. 예컨대 CMV 또는 HIV와 같은 기타 감염은 감염 대상자가 모든 또는 대부분의 조직에서 실질적으로 동일한 속도 및 동일한 정도로 가수분해하는 전구체로 처리될 수 있으며, 어떠한 조직도 뉴클레오타이드 포스포네이트 에스테르를 심각한 정도로 우선적으로 가수분해시키지 않는다.

소장 루멘 (lumen) 안정성, 세포 투과, 간 균질물 안정성 및 혈장 안정성 분석을 비롯하여 기술분야에 잘 알려진 분석기술을 이용할 수 있다. 통상적으로 사용된 방법에 따라 특정의 활성 뉴클레오타이드 포스포네이트 에스테르의 생체이용 특성을 결정하기 위해 이러한 방법을 사용한다.

뉴클레오타이드 포스포네이트 에스테르의 가수분해 산물은 바이러스, 악성 세포 및/도는 기생 원생동물에 대해 활성을 갖는다. 예컨대, 9-(3-히드록시-2-포스포닐메톡시프로필 (HPMP)와 퓨린 (아데닌 (A), 구아닌 (G), 2,6-디아미노퓨린 (DAP), 2-모노아미노퓨린 (MAP), 하이포잔틴 (Hx) 및 피리미딘 (시토신(C), 우라실 (U), 티민 (T)을 이용하여 항바이러스 특성을 평가하였다. (S)-HPMPA, (S)-시클릭 HPMPA, (S)-HPMPC, (S)-HPMPG 및 (S)-HPMPDAP는 헤르페스 심플렉스 바이러스, 타입 1 또는 타입 2 (HSV-1 및 -2)에 대해 활성적이었다. (S)-HPMPA 및 (S)-시클릭 HPMPA는 바리셀라 조스터 바이러스 (VZV)에 대해 활성적이었다. (S)-HPMPC는 사람과 동물 모두에 있어서 인간의 시토메갈로바이러스 (HCMV)에 대해 활성적이었다. (S)-HPMPA 및 (S)-시클릭 HPMPA는 아데노바이러스와 백시니아 바이러스에 대해 활성을 나타내었다.

(S)-HPMPA는 HSV-1과 2, VZV, 헤르페스 심플렉스 바이러스의 티미딘 키나제 결핍 (TK^-) 변이주, HCMV, 포시드 (phocid) 헤르페스 바이러스 타입 1 (물개의 헤르페스 바이러스 BHV-1), 영장류의 헤르페스 바이러스 타입 1 (SHV-1), 또는 가성 광견병 바이러스 또는 Aujeszky 씨병 바이러스), 소과의 헤르페스 바이러스 타입 1 (소의 감염성 리노트라케이티스 바이러스, BHV-1), 말과의 헤르페스 바이러스 타입 1 (말의 유산 바이러스, EHV-1), 아프리카 돼지열 (ASF) 바이러스, 백시니아 바이러스; 및 사람의 아데노바이러스, 및 레트로바이러스, 예컨대 쥐의 육종 바이러스 (MSV)를 비롯한 광범위한 DNA 바이러스에 대해 강력하고 선택적인 활성을 갖는다. 또한 쥐와 토끼의 생체내에서, 전형적인 항헤르페스 약물에 대해 내성적인 TK^-변이주에 의해 야기되는 헤르페틱 각막염을 비롯한, 헤르페스 심플렉스 바이러스 타입 1에 의한 국부 및 전신 감염 모두에 대해 이들 화합물이 효과적임이 보고되어 있다 (DeClercq, E. 외, Antiviral Res (1987) 8:261-272; DeClercq, E.외, Nature 91986) 323:464-467; Gil-Fernandez, C.,외, Antiviral Res (1987) 7:151-160; Baba, M. 외, Antimicrob Agents Chemother (1987) 31:337-339).

연구자들은 또한 쥐의 종양 모델에서 그들의 항종양 활성에 대한 포스포닐메톡시알킬퓨린 동족체를 평가하기도 하였다. 이들은 HPMPA가 복강 P388 백혈병에 대해 활성적임을 발견하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 화합물은 미생물 감염 치료, 종양 치료 및 후술하는 기타 용도에 유용하다. 미생물 감염에는 바이러스, 기생충, 효모 및 곰팡이가 포함된다. 치료될 수 있는 바이러스 감염의 예로는 헤르페스 바이러스 (CMV, HSV 1, HSV 2, EBV, 바리셀라 조스터 바이러스, 소의 헤르페스바이러스 타입 1, 말의 헤르페스바이러스 타입 1), 파필로마바이러스 (HPV 타입 1-55), 플라비바이러스 (아프리카 돼지열 바이러스 및 일본 뇌염 바이러스를 포함), 토가바이러스 (베네주엘라 말 뇌척수염 바이러스), 인플루엔자 바이러스 (타입 A-C), 레트로바이러스 (HIV 1, HIV 2, HTLV I, HTLV II, SIV, HBV, FeLV, FIV, MoMSV), 아데노바이러스 (타입 1-8), 폭스바이러스 (백시니아 바이러스), 엔테로바이러스 (소아마비 바이러스 타입 1-3, 간염 A 바이러스), 위장염 바이러스 (Norwalk 바이러스, 로타바이러스), 한타바이러스 (Hantaan 바이러스), 파포바바이러스, 리노바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 타입 1-4, 광견병 바이러스 등을 비롯한 DNA 또는 RNA 바이러스에 의해 매개되는 감염을 들 수 있다.

효소 억제 분석, 조직배양 분석, 동물 모델 분석 및/또는 기타 허용되는 분석을 이용하여 항바이러스 (또는 기타 항미생물) 활성을 통상적으로 분석함으로써 각각의 뉴클레오타이드 동족체 및 뉴클레오타이드 포스포네이트 에스테르의 활성을 측정한다.

연구자들은 HPMPC와 같은 뉴클레오타이드 포스포네이트가 적어도 부분적으로는 디포스페이트로의 2단계에 걸친 효소-매개 전환에 이어, 디포스포릴화된 뉴클레오타이드 동족체가 핵산에 혼입됨으로써 항미생물 활성을 발휘한다고 믿는다. 디포스페이트의 핵산으로의 바이러스-매개 또는 미생물-매개 혼입은 바이러스 또는 기타 미생물의 DNA 또는 RNA 폴리머라제 (세균, 레트로바이러스 등)를 이용한다.

NPEs는 (1) 생약 또는 기타 제품 (단백질 또는 백신과 같은) 제조시 바이러스의 확산 또는 성장을 감소 제거시키기 위한 조직배양 시스템에서, (2) 임상 시료 (예컨대 혈액) 중에서의 바이러스의 확산 또는 성장을 제거 또는 감소시키기 위해, 그리고 (3) 단백질 생성을 간섭하지 않고, 조직배양에서 바이러스의 성장을 감소 또는 차단하기 위해 사용할 수 있다.

또한 NPEs를 이용하여 기생 원생동물의 감염을 치료할 수 있다. 원생동물 (protozoa)이라는 용어에는 Protozoa문의 Sarcomastigophora 아문과 Sporozoa 아문이 포함된다. 더욱 구체적으로, 본문에서 원생동물이라 함은 사람 또는 가축에 있어서 질병을 일으키기 때문에 인간에게 중요한 의미를 갖는 기생성 원생동물 속이 포함된다. 이러한 속은 대부분 Baker (1969)에 의한 분류에 따르면 Sarcomastigophora 아문의 Mastighphora 상강과 Sporozoa 아문의 Telosporea 강에 속하는 것들이다. 이러한 기생 원생동물의 전형적인 속에는 Histomonas, Pneumocystis, Trypanosoma, Giardia, Trichomonas, Eimeria, Isopora, Leishmania, Entamoeba, Toxoplasma 및 Plasmodium이 속한다. 기생 원생동물에는 Plasmodium falciparum, Plasmodium berghei, Plsmodium malariae, Plasmodium vivax, Leishmania braziliensis, Leishmania donovani, Trypanosoma cruzi, Trypanomosa brucei, Trypanosoma rhodesiense, Pneumocytis carinii, Entamoeba histolytica, Trichomonas vaginalis 등이 포함된다 (de Vvries, E.,외, Mol. Biochem. Parasitol (1991) 47:43-50). 본 발명의 NPEs 및/또는 그의 상응하는 뉴클레오타이드 동족체는 Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida albicans 및 기타 Candida 종 Cryptococcus 종, 예컨대, Cryptococcus neoformans, Blastomyces 종, 예컨대 Blastomyces dermatidis, Torulopsis 종, 예컨대 Torulopsis glabrata, Coccidiodes 종, 예컨대 Coccidioides immitis, Aspergillus 종 등과 같은 효모 또는 곰팡이 감염을 치료하는데 사용될 수도 있다.

본 발명의 화합물 및 그의 생리적으로 허용가능한 염 (이하 집합적으로 활성성분이라 칭함)은 경구, 직장, 코, 국소 (눈, 구강, 및 설하), 질 및 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 피내, 척추강내, 경막외를 비롯함)를 비롯한 적절한 경로를 통해 치료하고자 하는 상태에 대해 투여될 수 있다. 바람직한 투여경로는 예컨대 환자의 상태에 따라 달라질 수 있다.

활성성분을 단독으로 투여할 수 있지만, 약리적 배합물로서 투여하는 것이 바람직하다. 수의용도 및 인간에 대한 용도 모두에 있어서, 이러한 본 발명의 배합물 (formulation)은 상기 정의한 바와 같은 적어도 한가지 활성성분과 한가지 이상의 허용가능한 담체 및 임의로 기타 치료제 성분으로 이루어진다. 담체(들)은 배합물 중의 기타 성분들과 공존가능해야한다는 의미로 "허용가능"하여야 하며 환자에게 해를 끼쳐서는 안된다.

배합물은 경구, 직장, 코, 국소 (구강 및 설하 포함), 질, 또는 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 피내, 척추강내, 경막외) 투여에 적합한 것들을 포함한다. 약제학 분야에 잘 알려진 단위투여 형태로 배합물을 편리하게 제조할 수 있다. 이러한 방법에는 하나 이상의 보조 성분으로 구성된 담체와 활성성분을 한데 결합시키는 단계가 포함된다. 일반적으로, 활성성분을 액상 담체 또는 미세분쇄된 고상 담체 또는 두가지 모두와 함께 균질하고 세밀하게 잘 혼합한 다음, 필요에 따라 생성물을 성형시킴으로써 배하물을 제조할 수 있다.

활성성분 소정량을 함유하는 캡슐제, 카셰, 또는 정제와 같은 불연속적인 단위로서; 분말제 또는 과립제로서; 수용액 또는 비수용액 중 현탁액 또는 용액으로서; 또는 수중유 액상 유제 또는 유중수 액상 유제로서 경구 투여에 적합한 본 발명의 배합물을 제조할 수 있다. 또한, 환약, 연약 또는 페이스트로서 활성성분을 제조할 수도 있다.

임의로 한가지 이상의 보조성분을 압축 또는 성형하여 정제를 만들 수 있다. 활성성분을 임의로 결합제, 윤활제, 불활성 희석제, 방부제, 계면활성제 또는 확산제와 함께 혼합하여, 분말이나 과립제와 같은 자유유동형태로서 적절한 기계 중에서 압착함으로써, 압착 정제를 만들 수 있다. 성형된 정제는 불활성 액상 희석제로 습윤시킨 분쇄된 화합물의 혼합물을 적절한 기계로 성형시킴으로써 만들 수 있다. 정제를 임의로 코팅하거나 또는 정제에 눈금을 새켜서, 활성성분을 서서히 또는 조절된 속도로 방출시킬 수 있다.

눈이나 예컨대 입 및 피부와 같은 기타 외부 조직의 감염에 있어서는, 활성성분을 예컨대 0.075 내지 20% w/w (예컨대 0.6% w/w, 0.7% w/w 등과 같이 본 발명의 배합물을 0.1% 내지 20% 사이에서 0.1% w/w씩 증가시켜), 바람직하게는 0.2 내지 15% w/w, 가장 바람직하게는 0.5 내지 10% w/w의 범위로 함유하는 국부용 연고나 크림으로서 배합물을 적용할 수 있다. 파라핀 또는 물과 섞일 수 있는 연고 기제와 함께 활성성분을 연고 배합물로서 사요알 수 있다. 한편, 활성성분을 수중유 크림 기제와 함께 크림형태로 배합시킬 수도 있다.

소망되는 경우, 크림 기제의 수성상은 예컨대, 폴리히드릭 알코올, 즉 프로필렌글리콜, 부탄 1,3-디올, 만니톨, 소르비톨, 글리세롤 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG 400 포함) 및 그의 혼합물과 같이, 히드록실기를 두 개 이상 갖는 알코올을 30% w/w 이상 함유할 수 있다. 국부용 배합물은 바람직하게는 피부나 기타 감염 부위를 통해 활성성분이 잘 흡수 또는 침투되도록 도와주는 화합물을 함유하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 피부 침투 촉진제의 예로는 디메틸 설폭사이드 및 관련 동족체를 들 수 있다.

본 발명의 유제의 유성상은 공지 방식으로 공지 성분들을 함유할 수 있다. 이 유성상은 단지 유화제 (또는 에멀젼트로 알려져 있음)만을 함유할수도 있지만, 지방(fat)과 오일의 두가지 모두와 함께 또는 지방이나 오일과 함께 한가지 이상의 유화제를 함유하는 혼합물을 함유하는 것이 바람직하다. 또한, 오일과 지방을 모두 함유하는 것이 바람직하다. 안정화제(들) 존재여부와 무관하게 유화제(들)로부터 소위 유화 왁스를 만들고, 오일 및 지방과 함께 왁스로부터 소위 유화 연고를 만들며 이것은 크림 배합물의 오일상 분산상을 형성한다.

본 발명의 배합물에 사용하기에 적합한 유화제 및 유제 안정제에는 Tween^R60, Span^R80, 세토스테아릴 알코올, 벤질 알코올, 미리스틸 알코올, 글리세릴 모노-스테아레이트 및 소듐 라우릴 설페이트가 포함된다.

배합물에 적합한 오일 또는 지방의 선택은 소망되는 화장 특성을 얻을 수 있는가에 기초하는데, 이는, 약학적 유제 배합물에서 사용될 대부분의 오일 중에서의 활성 화합물의 용해도가 매우 낮기 때문이다. 따라서 크림은 기름지거나 얼룩이지지 않는 것이 좋고 튜브나 기타 용기로부터 새는 것이 방지되도록 적당한 점도를 갖는 씻어낼 수 있는 제품인 것이 바람직하다. 직쇄 또는 분지쇄, 일- 또는 이염기성 알킬 에스테르, 예컨대, 디-이소아디페이트, 이소세틸 스테아레이트, 코코넛 지방산의 프로필렌 글리콜 디에스테르, 이소프로필 미리스테이트, 데실 올리에이트, 이소프로필 팔미테이트, 부틸 스테아레이트, 2-에틸헥실 팔키테이트 또는 Crodamol CAP로 알려진 분지쇄 에스테르 혼합물을 사용할 수 있으며 마지막의 세가지가 바람직한 에스테르들이다. 이들은 요구되는 특성에 따라 단독으로 또는 배합하여 사용될 수 있다. 한편, 백색 연질 파라핀 및/또는 액상 파라핀 또는 기타 미네랄 오일과 같은 고융점 지질을 사용할 수도 있다.

눈에 국소 투여하는데 적합한 배합물은 또한, 예컨대 활성성분을 용해시키기 위한 수성 용매와 같은 적절한 담체 중에 용해 또는 현탁시켜 제공할 수 있다. 활성성분은 바람직하게는 약 0.5 내지 20% w/w, 바람직하게는 0.5 내지 10% w/w, 특히 약 1.5% w/w의 양으로 존재하는 것이 좋다.

구강 내로 경구투여하기에 적합한 배합물로는 수크로스나 아카시아 또는 트라가칸트와 같은 좋은 맛을 갖는 기제 중에 활성성분을 함유하는 로젠지제; 젤라틴과 글리세린 또는 수크로스와 아카시아와 같은 불활성 기제 중에 활성성분을 함유하는 파스틸제; 그리고 적절한 액상 담체 중에 활성성분을 함유하는 구강청정제를 들 수 있다.

직장 투여용 배합물은 예컨대 코코아 버터 또는 살리실레이트와 같은 적절한 기제로 된 좌약 형태로 제공될 수 있다.

담체로서 고체를 이용하는, 코에 투여하기에 적합한 배합물에는 입도가 20 내지 500 마이크론 (예컨대 30 마이크론, 35 마이트론 등처럼 5 마이크론 단위로 입도가 증가되는 식으로, 20 내지 500 마이크론 범위 내의 입도를 포함)인 조질의 분말제가 포함되는데, 이것은 분말이 든 용기를 코에 바짝 들이댄 채, 코로 재빨리 숨을 들이쉬는 방법으로 코 속을 통해 투입시킨다. 담체가 액상인 비내 투여용 스프레이 또는 비내점적제와 같은 적절한 배합물은 활성성분의 수용액 또는 유성용액을 포함한다. 에어로졸 투여에 적합한 배합물은 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있으며 뉴모시스티스 (pneumocystis) 폐렴을 치료하기 위한 펜타미딘과 같은 기타 치료제와 함께 투여할 수 있다.

질내 투여에 적합한 배합물은 활성성분에 더해 관련분야에 잘 알려진 담체를 함유하는, 페사리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포말제 또는 스프레이 배합물로서 제공될 수 있다.

비경구 투여에 적합한 배합물은 항산화제, 완충제, 정균제 및 비투여자의 혈액과 동등한 등장성을 부여하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균주사용액; 현탁제 및 농후제를 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 배합물은 예컨대 밀봉된 앰풀 및 바이알과 같은 단위 복용 (unit-dose) 또는 다중 복용 (multi-dose) 용기 중에 제공될 수 있으며, 예컨대 주사용수와 같은 멸균 액상담체를 첨가시켜 사용하기 직전까지 동결건조 상태로 저장할 수 있다. 즉석 주사용액과 현탁액은 상기 설명한 멸균 분말, 과립 및 정제로부터 제조할 수 있다. 바람직한 단위투여용 배합물은 상기한 바와 같이, 활성성분을 매일 투여용 또는 단위형 매일 서브-도즈 (sub-dose)형으로, 또는 적절한 그의 분획 형태로 함유하는 것들일 수 있다.

상술한 성분들에 더해 본 발명의 배합물은 문제의 배합물 형태와 관련하여 기술분야에 통상적으로 사용되는 다른 제제를 함유할 수 있다. 예컨대, 경구 투여에 적합한 배합물들은 맛을 내는 제제를 함유할 수 있다.

본 발명은 또한 한가지 이상의 상술한 활성성분과 함께 수의용 담체를 함유하는 수의용 조성물도 제공한다.

수의용 담체는 그 조성물을 투여할 목적에 유용한 물질로서, 수의학 분야에서 불활성 또는 허용가능하고 활성성분과 혼용가능한 고체, 액체 또는 기체상 물질일 수 있다. 이들 수의용 조성물은 경구, 비경구 또는 기타 바람직한 경로를 통해 투여될 수 있다.

본 발명의 화합물은 활성성분으로서 본 발명에 따른 화합물을 한가지 이상 함유하는 조절 방출형 제약 배합물을 제공하는데 사용될 수 있는데 ("조절 방출형 배합물 (controlled release formulations)", 이러한 조절 방출형 제약 배합물에서, 활성성분의 방출은 주어진 본 발명의 화합물의 독성 프로필이나 약동학적 프로필을 개선시키거나 또는 투여 빈도를 줄일 수 있도록 조절 또는 제어될 수 있다. 본 발명의 화합물을 한가지 이상 함유하는 불연속 단위로 된 경구 투여용 조절 방출형 배합물을 통상적인 방법으로 제조할 수 있다. 조절 방출형 배합물은 여러 가지 미생물 감염, 특히 Plasmodium, Pneumocystis, 헤르페스 바이러스 (CMV, HSV 1, HSV 2, VZV 등), 레트로바이러스, 아데노바이러스 등과 같은 미생물에 의해 야기되는 사람의 바이러스, 세균, 또는 기생성 원생동물에 의한 감염을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 조절 방출형 배합물은 HIV 감염 및 및 그와 관련된 증상, 예컨대 결핵, 말라리아, 뉴모시스티스 폐렴, CMV 망막염, AIDS, AIDS-관련 복합체 (ARC) 및 진행성 일반화된 임파절염 (PGL: progressive generalized lymphadenopathy), 및 다발성 골수염, 및 열대성 경련성 대성부전마비와 같은 AIDS-관련 신경증상을 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 조절 방출형 배합물로 치료가능한 기타 인간의 레트로바이러스 감염에는 인간의 T-세포 임파지향 바이러스 (HTLV)-I, -II, 및 -IV, HIV-1 및 HIV-2 감염을 들 수 있다.

본 발명은 따라서 상술한 인간 또는 수의 증상 및 미생물 감염의 치료 또는 예방에 사용되기 위한 약학적 조성물을 제공한다.

상술한 각 용도에 있어서 활성성분의(상기한 바와 같은) 필요량은 치료하고자 하는 질병의 위종도와 대상환자의 상태를 비롯한 여러 가지 인자에 의해 좌우될 것이며 궁극적으로는 치료에 참가하는 의사 또는 수의사의 재량에 따른 것이다. 그러나 일반적으로, 이들 각 용도에 있어서, 적절한 유효량은 매 투여시 체중 1 킬로그램당 0.1 내지 250 mg 범위, 즉 (2.5 mg/Kg/1회, 3.0 mg/kg/1회 등과 같이 0.5 mg/kg/1회씩 증가시키는 방식으로 0.1 mg/kg/1회 내지 250 mg/kg/1회 범위), 바람직하게는 1회 투여시 체중 1 킬로그램 당 0.5 내지 50 mg, 가장 바람직하게는 1회 투여시 체중 1 킬로그램 당 1 내지 15 mg; 최적 투여량은 1회 투여시 체중 1 킬로그램 당 약 3.0 mgdlek. (달리 언급하지 않는 한, 활성성분의 모든 중량은 화학식 I의 모화합물로서 산출된 것임; 그의 염의 경우에는 수치가 비례적으로 증가할 것임). 바람직한 투여방식은 1 내지 7일에 걸쳐 적절한 간격으로 1회 또는 2회 서브 투여 (sub-doses)하는 것이다. 매 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일에 한번씩 정해진 투여량을 투여하는 것이 바람직하다. 투여는 단위 투여형태로 행 할 수 있다. 바람직한 투여량을 1일 내지 7일의 기간에 걸쳐 적절한 간격을 두고 1, 2 또는 3회 서브-투여함으로써 제공할 수 있다. 이러한 서브-투여는 예컨대 단위 투여 형태 당 활성물질을 10 내지 1000 mg, 및/또는 100 내지 500 mg 함유하는 단위 투여 형태로 행할 수 있다. 배합물은 활성 화합물의 피크 혈장농도가 약 1 내지 약 100 μm, 바람직하게는 약 2 내지 50 μm, 가장 바람직하게는 약 3 내지 약 30 μm가 되도록 투여하는 것이 바람직하다.

cHPMPC의 에스테르를 인간에게 투여하는 방법이 미국특허출원 제 08/193,341호에 설명되어 있으며 본문에 이를 참고삽입하였다.

배합물 (1) 뉴클레오타이드 포스포네이트 에스테르는 일반적으로 (1) 그에 상응하는 비고리형 뉴클레오타이드 동족체보다 경구 생체이용성이 더 높고 (예컨대 HPMPC에 비해 cHPMPC가 더 높음)/또는 (2) 상응하는 비고리형 뉴클레오타이드 동족체와 비교할 때 동일 투여량에서 독성이 더 낮으며/또는 (3) 상응하는 비고리형 뉴클레오타이드 동족체와 비교할 때 동일한 투여량에서 효능이 더 크다.

본 발명의 화합물은 상술한 감염 또는 증상의 치료 EH는 예방을 위해 기타 치료제와 병용될 수 있다. 이러한 추가적인 치료제의 예로는 바이러스, 기생충 또는 세균 감염이나 관련 증상의 치료나 예방 또는 종양이나 관련증상의 치료에 효과적인 제제를 들 수 있으며, 3'-아지도-3'-데옥시티미딘 (지도부딘, AZT), 2'-데옥시-3'-티아시티딘 (3TC), 2',3'-디데옥시-2',3'-디데히드로아데노신 (D4A), 2',3'-디데옥시-2',3'-디데히드로티미딘 (D4T), 카르보버 (카르보시클릭 2',3'-디데옥시-2',3'-디데히드로구아노신), 3'-아지도-2',3'-디데옥시우리딘, 5-플루오로티미딘, (E)-5-(2-브로모비닐)-2'-데옥시우리딘 (BVDU), 2-클로로데옥시아데노신, 2-데옥시코포르마이신, 5-플루오로우라실, 6-아자우리딘, 5-플루오로오로틴산, 메토트렉세이트, 트리아세틸우리딘, 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-1-β-아라비노실)-5-요오도시티딘 (FIAC), 테트라히드로-이미다조 (4,5,1-jk)-(1,4-벤조디아제핀-2(1H)-티온 (TIBO), 2'-노르시클릭 GMP, 6-메톡시퓨린 아라비노스 (아라-M), 6-메톡시퓨린 아라비노사이드 2'-O-발레레이트, 시토신 아라비노사이드 (아라-C), 2',3'-디데옥시뉴클레오사이드, 예컨대 2',3'-디데옥시시티딘 (ddC), 2',3'-디데옥시아데노신 (ddA) 및 2',3'-디데옥시이노신 (ddI), 비고리형 (acyclic) 뉴클레오사이드류, 예컨대 아사이클로버, 펜사이클로버, 팜사이클로버, 간사이클로버, HPMPC, PMEA, PMEG, PMPA, PMPDAP, FPMPA, HPMPA, HPMPDAP, (2R, 5R)-9[테트라히드로-5-(포스포노메톡시)-2-퓨라닐]아데닌, (2R,5R)-1-[테트라히드로-5-(포스포노메톡시)-2-퓨라닐]티민, 기타 항바이러스제, 예컨대 리바비린 (아데닌 아라비노사이드), 2-티오-6-아자우리딘, 투버시딘, 오린트리카르복실산, 3-데아자네오플라노신, 네오플라노신, 리만티딘, 아다만틴, 및 포스카르넷 (트리소듐 포스포노포르메이트), 항바이러스제, 예컨대 살균성 플루오로퀴놀론 (시프로플록사신, 퍼플록사신 등), 아미노글리코사이드 할균성 항생제 (스트렙토마이신, 겐타마이신, 아미카신 등) β-락타마제 억제제 (세팔로스포린, 페니실린 등), 기타 항바이러스제, 예컨대 테트라사이클린, 이소니아지드, 리팜핀, 세포페라존, 클라이트로마이신 및 아지트로마이신, 구충제 또는 항진균제, 예컨대, 펜타미딘 (1,5-비스(4'-아미노페녹시)펜탄), 9-데아자이노신, 설파메톡사졸, 설파디아진, 퀴나피라민, 퀴닌, 플루코나졸, 케토코나졸, 이트라코나졸, 암포테리신 B, 5-플루오로시토신, 클로트리마졸, 헥사데실포스포콜린 및 니스타틴, 신장배설 억제제, 예컨대 프로베니시드, 뉴클레오사이드 전달 억제제, 예컨대 디피리다몰, 딜라젭, 및 니트로벤질티오이노신, 면역조절제, 예컨대 FK506, 사이클로스포린 A, 티모신 α-1, 시토카인, 예컨대 TNF 및 TGF-β, 인터페론, 예컨대 IFN-α, IFN-β 및 IFN-γ, 인터류킨, 예컨대, 인터류킨 I, II, III, IV, V, VI, VII, VIII, X, XII, XIII 마크로파지/과립구 집락형성 촉진인자, 예컨대 GM-CSF, G-CSF, M-CSF, 시토카인 길항제, 예컨대 항-TNF 항체, 항-인터류킨 항체, 가용성 인터류킨 수용체, 단백질 키나제 C 저해제 등을 들 수 있다.

본 발명의 화합물, 또는 이들 화합물로부터 생체내에서 가수분해에 의해 생산되는 생물활성적인 물질들은 이들 화합물 또는 그의 가수분해 산물에 특이적으로 결합할 수 있는 항체를 만들기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 그를 위한 면역원 조성물은 그 화합물 또는 그의 가수분해 산물의 진단용 또는 정성 콘트롤 분석에 사용하기 위한 항체를 제조하는데 있어서 중간체로서 유용하다. 항체들은 여하한 간편한 균질 또는 이질적인 공정, 예컨대 형광극성화 면역분석, 형광 면역분석 (플루오레신 등과 같은 형광 표지를 사용함), 방사능면역분석, 효소 면역분석 (알칼라인 포스파타제, 포스래디쉬 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제, 우레아제 등과 같은 효소 지시약을 이용함) 및 혼탁계 저해 분석법 (WO92/22639에 기재됨: 본문에 참고삽입)등에 의한 화합물의 존재, 부재 또는 양을 측정하는데 유용하다. 이러한 분석법에는 대개 트레이서 (형광물질 또는 방사능 표지된 본 발명 화합물), 항체 및 그 화합물을 함유하는 분석하고자 하는 샘플을 필요하다.

본 발명의 면역원은 단백질이나 펩티드와 같은 면역원 물질과 함께 가수분해 산물 또는 전구체를 함유한다.면역원 물질에는 Freund' 보조제와 같은 보조제, 바이러스, 세균성, 효모, 식물 및 동물성 폴리펩티드, 특히 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소의 타이로글로불린 또는 대두 트립신 저해제와 같은 면역원 단백질 및 면역원성 다당류가 포함된다. 일반적으로, 전구체 가수분해 산물 구조를 갖는 화합물 또는 전구체는 다관능 (일반적으로 이관능) 가교제의 사용에 의해 면역원 폴리펩티드나 다당류에 공유결합된다. 합텐 면역원의 제조방법은 통상적인 방법으로서, 또는 합텐을 면역원 폴리펩티드에 콘쥬게이션시키는데 사용되는 방법이면 가교시킬 수 있는 전구체 또는 가수분해 산물 상의 관능기를 고려하여, 여하한 방법일 사용해도 좋다.

일반적으로 폴리펩티드는 알킬 또는 치환된 알킬 포스포네이트 부분의 어떤 부위보다는 화합물 또는 그의 가수분해 산물의 헤테로시클릭 염기 관능기 상의 부분에 콘쥬게이션된다. 일반적으로, 그 부위는 뉴클레오사이드 포스포네이트의 퓨린 또는 피리미딘 부분 상에 위치한 아미노기, 즉, 피리미딘 (예컨대 시토신 또는 우라실)의 제 5위치, 퓨린 (예컨대 아데노신 또는 구아닌)의 제 1 위치가 될 것이며, 또는 유리 히드록실기를 갖는 당 또는 당 동족체에 상응하는 고리 구조를 갖는 화합물의 경우, 유리 히드록실기 (대개 3' 또는 2' 위치)를 경유할 것이다. 한편, 전구체 화합물은 포스포네이트를 통해 가교된 전구체 화합물, 대개 폴리펩티드 자신에 의한 포스포네이트의 아미드와 또는 에스테르화 또는 폴리펩티드에 공유 결합된 가교 관능기에 의해, 포스페이트를 통해 가교된다.

콘쥬게이트는 통상적인 방식으로 제조된다. 예컨대, 히드록시석신이미드, 무수 석신산 또는 alkN=C=Nalk는 본 발명의 콘쥬게이트를 제조하는데 유용하다. 콘쥬게이트는 전구체, 그의 가수분해 산물 또는 두가지를 모두 함유한다. 일반적으로, 콘쥬게이트는 가수분해 산물, 즉 생물활성적인 약물을 함유할 것이다. 콘쥬게이트는 크로마토그래피 등을 이용하여 출발물질과 부산물질로부터 분리시킨 다음, 멸균여과시켜 저장을 위해 바이알에 담는다.

동물들은 일반적으로 1 mg 또는 1μg의 콘쥬게이트 (각각 토끼의 마우스의 경우)와 함께 3배 용량의 Freund' 완전 보조제와를 결합시킨다음 이 용액을 여러 부위에서 피내 주사함으로써 면역원성 콘쥬게이트 또는 그의 유도체에 대해 면역시킨다. 1개월 후 동물들을 여러 부위에서 피하 주사시킴으로써, Freund' 완전 보조제 (또는 기타 적절한 보조제) 중의 최초 콘쥬게이트 양의 1/5 내지 1/10로 부스트 (boost) 시킨다. 7일 내지 14일 후 동물들로부터 혈액을 채취하고 혈청을 목적하는 항체 역가에 대해 분석한다. 역가가 일정해질 때까지 동물들을 부스트시킨다. 바람직하게는, 전구체 또는 생성물이 상이한 단백질, 상이한 가교제 또는 두가지 모두에 결합된 콘쥬게이트로 동물들을 부스트시키는 것이 좋다. 임의로, 명반과 같은 응집제를 사용하여 면역 응답을 촉진시킨다.

면역화 후, 면역된 동물로부터 면역 임파구세포 (일반적으로 비장 세포 또는 임파절 조직으로부터의 임파구)를 회수함으로써 모노클로날 항체들을 제조하고 세포를 통상적인 방식, 예컨대 골수종세포와 융합시키거나 또는 Epstein-Barr 바이러스 형질전환 및 소망하는 항체를 발현하는 클론을 스크리닝 함으로써 세포를 불멸화시킨다. Kohler와 Milstein, Eur. J. Immunol. (1976) 6:511에 최초로 설명된 하이브리도마 기술은 많은 특정 항원에 대한 모노클로날 항체를 고농도를 분비하는 하이브리드 세포주를 생산하는데 광범위하게 적용되어 왔다.

한 종의 세포를 다른 것과 융합시키는 것이 가능하다. 그러나, 면역화된 항체를 생산하는 세포의 소스와 골수종의 소스는 동일종으로부터 유래하는 것이 바람직하다.

하이브리드 세포주는 생체외 배양체 중에서 유지시킨다. 본 발명의 세포주는 하이포잔틴-아미노프테린 티미딘 (HAT) 배지에서 선택 또는 유지시킨다. 그러나, 수립된 하이브리도마 세포주는 여러 가지 영양학적으로 적절한 배지에서 유지시킬 수 있다. 분비된 항체는 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등과 같은 통상적인 방법에 의해 배양체로부터 회수한다. 본문에서 설명된 항체들 역시 예컨대 에탄올 또는 폴리에틸렌 글리콜 침전 공정과 같이 수집된 혈장으로부터 면역글로불린을 정제하는데 사용되어 왔던 경우에서처럼 IgG 또는 IgM을 정제하기 위한 통상적인 방법에 의해 하이브리도마 세포 배양체로부터 회수한다. 정제된 항체를 멸균 여과한 다음 테스트 시료의 진단 분석에 사용하기 위한 효소 또는 스핀 라벨과 같은 검색가능한 마커와 임의로 콘쥬게이션시킨다.

본 발명의 항체들은 여하한 동물로부터 얻을 수 있지만, 본래는 쥐 또는 새앙쥐로부터 얻는다. 일단 소망하는 특이성과 친화성을 갖는 모노클로날 항체가 얻어지면, 이러한 항체들을 기타 통상적인 방식으로 변형시키는 것은 본 발명의 범위에 속한다. 예컨대, 동물 항체의 상보성 결정 영역과, 필요한 만큼의 프레임워크 대역이 교차-강 (클래스) 또는 교차-종의 키메릭 항체를 생산하기 위한 다른 종 또는 다른 강의 항체로 치환된다. 모노클로날 항체의 단편 또는 기타 아미노산 서열 변형물 역시 항체의 의미속에 포괄되는데 예컨대 이러한 용어는 Fab, Fab' 또는 (Fab')2 단편, 단일사슬 항체, 이중특이적 또는 다중 특이적 항체 등으로 사용된다.

본 발명의 항체들은 적절한 강 또는 이소타잎, 예컨대 IgG, IgM, IgA, IgD 또는 IgE로부터 유래된다. 이들은 보체결합 또는 ADCC에 참여하거나 또는 참여하지 않을 수 있다.

일반적으로, 면역원에 결합할 수 있는 하이브리도마를 요구되는 친화도를 갖는 전형적인 테스트 시료 (혈장, 혈청 등)에서 합텐 그 자신에 결합할 수 있는 능력에 대해 스크리닝 한다. 소망되는 친화도는 항체의 의도된 용도에 따라 달라질 것이지만, 통상적인 경쟁형 ELISA 또는 방사능면역분석 또는 통상적인 EMIT 면역분석에서 기능하는데 적합한 것이어야 한다.

본 발명의 항체는 전구체 또는 그의 가수분해 산물로부터 표지된 것과 함께 그러한 분석에 사용된다. 다른 한편, 항체를 표지시키기도 한다. 적절한 표지는 공지이며 여기에는 방사능 동소체, 효소, 안정한 유리 래디칼, 플루오로포어, 화학발광체 및 분석에 사용될 공유 콘주게이트를 제조하는데 사용된 기타 검색가능한 기들이 속한다. 표지를 리간드 아미노기, 또는 아미노산 측쇄 또는 폴리펩티드 말단에 결합시키기 위한 방법은 공지이며 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 기타 적절한 결합 방법들도 당업자에게 익히 알려져 있을 것이다.

항체와 표지된 리간드는 본 발명에서 치료 약물을 모니터링하거나 평가하기 위한 키트 또는 품질제어 공정을 위한 키트 내로 조립되어 통상적인 방식으로 사용된다.

cHPMPC와 기타 cHPMPC의 시클릭 동족체를 유리 히드록시 인산으로부터 여러 가지 방법으로 제조한다. 이러한 방법들에는 DMF 중에서의 DCC 처리, Vilsmeier' 시약 (ClCH=N(CH₃)₂Cl)과의 반응 또는 공지의 포스페이트 활성화방법이 포함된다. 상응하는 포스포네이트 뉴클레오타이드 동족체로부터 cHPMP를 제조하는 한가지 방법에서는, 포스포네이트를 (a) ClCH=N(CH₃)₂Cl로 처리하여 포스포닐클로리데이트를 얻고 (b) 임의로 이 포스포닐클로리데이트를 알코올 또는 아민과 같은 친핵체 (바람직하게는 예컨대 약 -20℃와 같은 저온에서)와 반응시켜 상술한 중간체들 중 하나를 생성시키는 것이다. 추가 단계에서는 (a) 또는 (b) 단계의 생성물을 각각 가수분해 또는 양성자분해 (일반적으로는 산 양성자분해)시켜 cHPMP ((a) 단계의 생성물 처리) 또는 그의 중간체 ((b) 단계의 생성물 처리)를 생산한다. Vilsmeier' 시약은 SOCl₂, PCl₅, POCl₃, COCl₂등을 DMF와 인 시투 반응시킴으로써 생산한다. 바람직하게는, (a) 단계의 생성물은 친핵체와의 반응에 앞서 반응 혼합물로부터 정제 또는 분리되지 않는 것이, 이 합성경로의 경제적 관점에서 유리하다. 화학식 Ia 및 Va의 화합물은 동일한 방법에 의해 예컨대 DMF 중 DCC 처리와 같이 동일한 방법에 의해 그의 비고리형 해당물로부터 쉽게 제조된다.

cHPMPs의 치환 및 비치환 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아릴알킬 및 헤테로아릴알킬 에스테르는 적절한 HPMP 화합물을 SOCl₂/DMF와 반응시킴으로써 활성화된 포스포닐클로라이드를 생산한 다음, 상응하는 친핵체 (예컨대, 알콕사이드, 페놀레이트, 아민 등)로 처리하여 보호된 중간체 포름아미딘을 생산하고 이를 표적 화합물 (반응식 1 참조)로 가수분해시킴으로써 제조한다. 다른 한편, 에스테르는 반응식 2에 도시된 바와 같이 제조할 수 있다. N-, O- 보호된 중간체 포스포네이트 디에스테르는 공지방법에 의해 세가지 구성 요소로부터 얻는다. 이어서 N- 및 O-보호기를 제거한 다음 포스포네이트 디에스테르 3을 NaH로 처리하여 고리화시킴으로써 표적 화합물 4를 얻는다. cHPMP 에스테르를 합성하기 위한 세 번째 방법은 알킬 할라이드, 토실레이트, 디아조알칸 등과 같은 통상적인 알킬화제 R¹⁵L (여기서 L은 이탈기임)을 사용하여 cHPMP를 알킬화시키는 것이다 (반응식 3 참조). 이 방법은 특히 cHPMP를 상응하는 아실옥시알킬할라이드로 처리함으로써 아실옥시알킬 에스테르를 제조하는데 유용하다.

실시예 12에 상세히 설명되어 있는 바와 같이, cHPMPs의 아실옥시알킬 에스테르를 제조하는 한가지 예시적인 방법에서는 DCC와 R¹⁶C(O)OCH₂Cl을 반응시키지만; 종전의 방법과 대조되는 바와 같이 DCC : R¹⁶C(O)OCH₂Cl, 시클릭 HPMP의 화학약론적 비율은 1-2:1-2:1이다. 반응물을 이렇게 낮은 비율로 사용함으로써 B의 고리밖 (exocyclic) 아미노기와의 부반응을 줄일 수 있고 그로 인해 수율이 크게 향상된다. R¹⁶은 H 또는 치환되지 않거나 또는 OH, O, N, 및 할로겐 중에서 독립적으로 선택된 치환기에 의해 치환될 수 있는 C_3-12알킬, 치환되지 않거나 또는 OH, O, N, 할로겐 중에서 독립적으로 선택된 치환기에 의해 치환될 수 있는 C_3-6아릴, 또는 치환되지 않거나 또는 OH, O, N 및 할로겐 중에서 독립적으로 선택된 치환기에 의해 치환될 수 있는 C_3-9아릴-알킬이다.

다음의 반응도는 HPMPC를 뉴클레오타이드 동족체로서 설명하고 있다. 그러나, 필요하에 따라 모든 고리밖 옥소 또는 아미노기가 보호된다면, 시토신 대신 어떠한 B도 사용될 수 있다. 또한, 반응식 1의 제 3 단계는 B가 고리밖 아민을 함유하지 않을 경우에는 생략된다.

시클릭 HPMP 에스테르의 합성을 위한 세 번째 방법은 반응식 3에 도시된 바와 같이 알킬 할라이드, 토실레이트, 디아조알칸등과 같은 일반적인 알킬화제 R¹⁵Lv를 이용하여 시클릭 HPMP 에스테르를 알킬화시키는 단계를 수반한다. 이 방법은 특히 시클릭 HPMP (cHPMP)를 상응하는 아실옥시알킬할라이드로 처리함으로써 아실옥시알킬 에스테르를 제조하는데 유용하다.

R¹⁵는 다음 기로 정의된다: H, 비치환 또는 OH, O, N, 및 할로겐 (F, Cl, Br, I) 중에서 독립적으로 선택된 치환기로 치환된 알킬 (예컨대 C_1-20 또는 C_4-12), 비치환 또는 알킬 (예컨대 C_1-8 또는 C_1-6), 알콕시 (예컨대 C_1-8 또는 C_1-6), 할로알킬 (예컨대 C_1-8 또는 C_1-6, 1 내지 3개의 할로겐 원자), 시아노, 니트로, OH, O, N 및 할로겐 중에서 독립적으로 선택된 치환기로 치환된 아릴, 또는 R¹⁵는 C_1-6알킬, C_1-6알콕시, C_1-6할로알킬 (1 내지 3개의 할로겐 원자), 시아노, 니트로, OH, O, N 및 할로겐 중에서 독립적으로 선택된 치환기에 의해 아릴 부분이 치환되거나 또는 치환되지 않은 C_4-20아릴-알킬이거나 또는 R¹⁵는 C_6-241-아실옥시-1-아릴-1-알킬 (예컨대, C_1-6아릴, C_1-4알킬)이거나 또는 R¹⁵는 C_3-241-아실옥시-2-알콕시-1-알킬 (C_1-8알킬)이거나, 또는 R¹⁵는 페닐, 2- 또는 3-피롤릴, 2- 또는 3-티에닐, 2- 또는 4-이미다졸릴, 2-, 4- 또는 5-옥사졸릴, 3- 또는 4-이속사졸릴, 2-, 4- 또는 5-티아졸릴, 3-, 4- 또는 5-이소티아졸릴, 3- 또는 4-피라졸릴, 2-, 3- 또는 4-피리디닐, 2-, 4- 또는 5-피리미디닐, 2-, 3- 또는 4-알콕시페닐 (2-, 3- 및 4-메톡시페닐 또는 2-, 3- 또는 4-에톡시페닐을 비롯한 C_1-12알킬), 2-, 3- 또는 4-할로페닐 (2-, 3- 및 4-플루오로페닐을 비롯), 2,3-, 2,4-, 2,5- 2,6-, 3,4- 또는 3,5-디할로페닐 (2,4-디플루오로페닐 및 2,4-디클로로페닐 포함), 2-, 3- 또는 4-할로알킬페닐 (1 내지 5개의 할로겐 원자, C_1-12할로겐 원자, C_1-12알킬, 예컨대 2-, 3-, 및 4-트리플루오로메틸페닐 및 2-, 3- 및 4-트리클로로메틸페닐), 2-, 3- 또는 4-시아노페닐, 알콕시카르보페닐 (2-, 3- 또는 4-n-부톡시카르보페닐, -C₆H₄-C(O)-OC₄H₉, 및 2-, 3- 또는 4-헥속시카르보페닐, -C₆H₄-C(O)-OC₆H₁₃, -C₆H₄-C(O)-OC₆H₁₁을 포함하는 C_1-12알킬) 또는 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- 또는 3,5-디에톡시카르보페닐, 1-, 2-, 3- 또는 4-피리디닐 (-C₅H₄N), 2-, 3- 또는 4-니트로페닐, 2-, 3- 또는 4-할로알킬벤질 (1 내지 5개의 할로겐 원자, C_1-12알킬, 예컨대 4-트리플루오로메틸벤질), 알킬살리실페닐 (C_1-4, C_3-10, 또는 C_6-12알킬, 2-, 3- 및 4-부틸살리실페닐을 포함), 2-, 3- 또는 4-아세틸페닐, 1,8-디히드록시나프틸 (-O-C₁₀H₆-OH 또는 -O-C₁₀H₆-O-), 2,2'-디히드록시비페닐 (-O-C₆H₄-C₆H₄-O-; 산소원자 두 개는 모두 인 원자에 결합된 것임), 알콕시 에틸 (-CH₂-CH₂-O-CH₃(메톡시에틸) 및 페녹시메틸을 비롯한 C_1-6알킬), 아릴옥시에틸 (C_5-10또는 C_6-9아릴 (페녹시에틸을 포함) 또는 OH, NH₂, 할로, C_1-4알킬 또는 OH 또는 1 내지 3 내지 3개의 할로 원자에 치환된 C_1-4알킬로 치환된 C_5-10또는 C_6-9아릴], -C₆H₄-CH₂-N(CH₃)₂, N-에틸모르폴리노

아다만토일 옥시메틸, 피발로일옥시(메톡히에틸)메틸

피발로일옥시메틸 (-CH₂-O-C(O)-C(CH₃)₃), 피발로일옥시(메톡시메틸)-메틸 (CH(CH₂OCH₃)-O-C(O)-C(CH₃)₃), 피발로일옥시이소부틸 (-CH(CH(CH₃)₂-O-C(O)-C(CH₃)₃) 이소부티릴옥시메틸 (-CH₂-O-C(O)-CH₂-CH(CH₃)₂), 시클로헥사노일옥시메틸 (-CH₂-O-C(O)-C₆H₁₁), 페닐 (-C₆H₅), 벤질 (-CH₂-C₆H₅), 이소프로필, t-부틸,

여기서 R^B는 OH, O, N 및 할로겐 (1 내지 5개의 할로겐 원자) 중에서 독립적으로 선택된 치환기에 의해 치환되거나 치환되지 않은 C_1-20알킬, OH, O, N 및 할로겐 (1 내지 5개의 할로겐 원자) 중에서 독립적으로 선택된 치환기에 의해 치환되거나 치환되지 않은 C_6-20아릴, 또는 OH, O, N 및 할로겐 (1 내지 5개의 할로겐 원자) 중에서 독립적으로 선택된 치환기에 의해 치환되거나 치환되지 않은 C_7-20아릴-알킬, (단, N(R^B)₂, CH₂C(O)N(R^B)₂, CH₂C(O)OR^B, CH₂OC(O)R^B, CH(R^B)OC(O)R^B및 CH₂C(R^B)CH₂OH의 화합물에서, 탄소원자의 총 수는 25개 미만임 (대개는 탄소원자가 약 4 내지 14개임) 또는 R¹⁵는 2,3-디히드로-6-히드록시인덴, 세사몰, 카테콜 모노에스테르, -CH₂-C(O)-N(R^C)₂(여기서 R^C는 같거나 다르고 R^C는 H, 또는 C_1-4또는 C_2-10알킬) -CH₂-S(O)(R^C), -CH₂S(O)₂(R^c), -CH₂-CH(OC(O)CH₂R^c _),CH₂(OC(O)CH₂R^C _),콜레스테릴, 5 또는 6개의 탄소를 갖는 단당류, 이당류, 또는 올리고당류 (3 내지 9개의 단당류 잔기), 에놀피루베이트 (HOOC-C(=CH₂)O), 글리세롤, α-D-β-디글리세라이드 (여기서 글리세라이드 지질을 구성하는 지방산은 대개 자연발생적인 포화 또는 불포화된 C_6-26, C_6-18또는 C_6-10지방산, 예컨대, 리놀레인, 라우린, 미리스틴, 팔미틴, 스테라인, 올레인, 팔미톨레인, 리놀레닌산등의 지방산임), 트리메톡시벤질, 트리에톡시벤질, 2-알킬 피리디닐 (C_1-4알킬),

3, 4 또는 5개의 할로겐 원자, 또는 할로겐, C_1-12알콕시 (메톡시, 에톡시, 프로필옥시, 부틸옥시, 2,3-, 2,4- 2,5- 2,6-, 3,4- 및 3,5-디메톡시 및 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- 및 3,5-디에톡시 치환 페닐을 포함), 시아노, 니트로, OH, C_1-12할로알킬 (1 내지 6개의 할로겐 원자), C_1-12알킬 (메틸 및 에틸 포함), C_2-12알케닐 또는 C_2-12알키닐 중에서 선택된 하나 이상의 원자 또는 치환기로 치환된 C_3-6아릴 (페닐, 2- 및 3-피롤릴, 2- 및 3-티에닐, 2- 및 4-이미다졸릴, 2-, 4- 및 5-옥사졸릴, 3- 및 4-이속사졸릴, 2-, 4- 및 5-티아졸릴, 3-, 4- 및 5-이소티아졸릴, 3- 및 4-피라졸릴, 2-, 3- 및 4-피리디닐 및 2-, 4- 및 5-피리미디닐을 포함); 또는 R¹⁵는 아릴 부분이 3 내지 5개의 할로겐 원자 또는 할로겐, C_1-12알콕시 (메톡시 및 에톡시 등), 시아노, 니트로, OH, C_1-12할로알킬 (1 내지 6개의 할로겐 원자, -CH₂-CCl₃등), C_1-12알킬 (메틸 및 에틸 등), C_2-12알케닐 또는 C_2-12알키닐 중에서 선택된 C_1-4알킬렌-C_3-6아릴 (벤질, -CH₂CH₂-C₆H₅, -CH₂-피롤릴, -CH₂-티에닐, -CH₂-이미다졸릴, -CH₂-옥사졸릴, -CH₂-이속사졸릴, -CH₂-티아졸릴, -CH₂-이소티아졸릴, -CH₂-피라졸릴, -CH₂-피리디닐 및 -CH₂피리미디닐 등)이다. 콜레스테릴, 당류 및 기타 부분을 반응성기에 결합시키는 방법은 잘 알려져 있다 (Hadfield Adv. Pharmacol. Chemother. (1984) 20:21; Gouyette Tet. Lett. (1989) 30:6019; Ksander J. Med. Chem. (1994) 37:1823).

다른 화합물들은 혼합된 아미데이트-에스테르 뉴클레오타이드 동족체 아미데이트의 합성시 중간체로서, 또는 몇몇 경우, 그 자체로 약물로서 사용된다. 기타 에스테르 화합물들은 (R¹⁵O)₂P(O)-Z¹-B (식 중, Z¹은 다음 구조식으로 정의된다);

식 중, C^#와 #은 (R), (S), 또는 (RS) 배열의 결합 치환기를 포함하며, 각각의 R¹⁵는 같거나 다르고 각각의 R¹⁵은 독립적으로 선택된다.

다음 표 2에 (OR¹⁵)₂P(O)-Z-B 구조를 갖는 화합물들의 예시적인 비스 에스테르 기를 수록하였다.

B

1. 아데닌-9-일

2. 구아닌-9-일

3. 시토신-1-일

4. 2,6-디아미노퓨린-9-일

5. 2-아미노퓨린-9-일

6. 6-메틸시토신-1-일

7. 5-플루오로시토신-1-일

* 한 개의 치환기로 치환된 페닐 및 벤질 화합물 (즉 R¹⁵는 1, 3, 5 등으로 매겨짐)에는 2-, 3- 및 4-치환된 화합물이 포함되며 두 개의 치환기로 치환된 페닐 화합물 (즉, R¹⁵는 2, 4, 6 등으로 매겨짐)에는 2,3-, 2,4-, 2,5-, 2,6-, 3,4- 및 3,5- 치환된 화합물이 포함된다.

** =P(O)-구조는 두 개의 결합이 OR¹⁵에 의해 점령되어 있음을 가리킨다

*** 7번과 8번 구조는 두 개의 OR¹⁵기 대신 도시된 바와 같이 결합된 하나의 OR¹⁵기를 갖는다.

표 2에 수록된 화합물들을 다음 식, R¹⁵.Z.B.에 따라, (OR¹⁵)₂(여기서 각각의 R¹⁵는 동일하다), Z 및 B 에 할당된 숫자로 이하에 표시한다. 화합물 표기는 표 1에서 사용된 것에 따른다. 예시적인 화합물에는 다음이 포함된다.

기술 분야에 알려진 예컨대 안정성 및/또는 생체이용성 분석 (예컨대, 낮은 pH/내장강 조건과 같은 수성 조건에서의 안정성 분석 또는 에스테라제를 함유하는 세포 추출물 존재하의 분석 또는 동물 모델을 이용한 생체이용성 분석)에 의해 특정 R¹⁵기의 존재 또는 부재 적합성을 결정한다.

본 발명에는 보호된 헤테로시클릭 염기를 포함하는 NPEs가 포함된다. 이 화합물들은 합성 중간체 및/또는 치료제 자체로서 유용하다. 보호된 헤테로시클릭 염기 화합물 구조, 이들 화합물의 이성체, 호변이성체 및 염들은 다음 화학식 5를 갖는다.

(식 중, B¹은 보호된 헤테로시클릭 염기임)

보호된 헤테로시클릭 염기 화합물을 합성하는데 사용되는 반응식의 일례를 다음에 나타내었다. 여기서는 cHPMPC가 사용되었다. 동종의 반응으로 아데닌과 같은 기타 염기를 포함하는 화합물이 생산될 것이다. B¹을 함유하는 화합물의 아릴 에스테르 및 포스포네이트 알킬을 다음 반응식에 따라 예컨대 HPMPC와 cHPMPC를 이용하여 제조한다.

식 중 R¹⁷은 C_1-10알킬이다. 시토신을 제외한 보호된 헤테로시클릭 염기, 예컨대 아데닌, 구아닌, 2,6-디아미노퓨린 또는 2-아미노퓨린을 함유하는 화합물을 합성하는데 이들 공정을 쉽게 적용할 수 있다. 같거나 다른 R¹⁵및/또는 R¹⁷의 예에는 페닐, 치환 페닐, -C₁₀H₁₅(식 중, C₁₀H₁₅는 아다만토일임), -CH₂-C₆H₅, -C₆H₅, -C(CH₃)₃, -CH(CH₃)₂, -CH₂CH₃, 메틸, 에틸, 부틸, t-부틸, 헵타닐, 노나닐, 운데카닐, 라우릴, 스테릴, 운데세닐 등이 포함된다. 아실 클로라이드를 염기에 결합된 고리밖 아민과 반응시킴으로써 아미드 결합을 간편하게 형성시킨다. R¹⁵이 유리 포스포네이트에 결합된 경우, 얻어진 에스테르는 인 원자에서 라세미체 혼합물 또는 단일의 이성체를 함유한다. 저온반응 조건 (약 -20℃ 미만, 예컨대 -20℃ 내지 약 -40℃ 또는 약 -40℃ 내지 약 -80℃)에서는 단일 이성체 생성물이 주로 생성되고, 이보다 높은 반응온도 (약 -20℃ 이상, 예컨대　약 -20℃ 내지 40℃)에서는 일반적으로 라세미체 혼합물이 생성된다. 라세미체 혼합물이 얻어지는 경우, 비록 혼합물을 예컨대 합성 중간체 또는 합성 미생물제제로서 사용 할 수 있지만, 분할함이 없이 예컨대 HPLC에 의해 이성체를 간편하게 분리할 수 있다. 클로리데이트와 페녹사이드와의 반응에 의해 -78℃에서 cHPMPC의 페닐 에스테르를 합성하자 인 원자에서 약 ≥90%의 하나의 이성체 (이성체 #1)와 ≤10%의 다른 이성체 (이성체 #2)와의 라세미체 혼합물이 얻어졌다. 이 라세미체 혼합물을 실온에서 10분 (약 10 내지 30분이 일반적으로 적합함)간 DMF 중 촉매량의 소듐 페녹사이드와 함께 인큐베이션시킴으로써 이성체 # 2 (≥90%)로 전환시켰다. cHPMP-B 또는 cHPMP-B¹(예컨대 cHPMPC 또는 cHPMPA)아릴옥시 또는 알콕시 에스테르의 한가지 이성체를 상응하는 아릴옥사이드 이온 또는 알콕사이드 이온의 촉매량을 이용하여 다른 이성체로 전환시키는 데 이 방법을 사용할 수 있다 (대개 약 90%의 이성체가 생산됨). 따라서, 55 내지 90%의 한가지 이성체를 함유하는 이성체 혼합물을 쉽게 제조할 수 있다.

cHPMPC 피발로일옥시메틸 에스테르 합성에 의해 인 원자에서 라세미체 혼합물이 생산된다. 이 혼합물을 HPLC에 의해 두 개의 이성체로 분리한 다음 이를 쥐의 내장 균질물 또는 쥐의 내장 세정물에 노출시켰다. 이성체 중 한가지는 균질물에서 인큐베이션된 후 cHPMPC로 전환된 반면 다른 이성체는 HPMPC 피발로일옥시메틸 모노에스테르로 전환되었다. 두가지 이성체 모두 내장 세정물에서 인큐베이션된 후에는 HPMPC 피발로일옥시메틸 모노에스테르로 전환되었다. 이러한 결과는 (1) 적어도 몇가지 경우에 있어서, 효소 활성은 어떤 인 이성체가 존재하는가에 따라 cHPMPC 에스테르의 대사적 경로에 상이한 영향을 미칠 수 있음과 (2) 화학적 활성 (즉 내장 세정물의 산도)이 효소활성과는 다른 방식으로 주어진 화합물의 대사경로에 영향을 미칠 수 있음을 암시하는 것이다.

C(O)R¹⁷보호기를 함유하는 헤테로시클릭 염기를 제조하는 방법은 HPMPC와 cHPMPC를 이용하여 아실 클로라이드 (R¹⁷C(O)Cl)을 이용함으로써 예컨대 다음과 같이 수행한다.

식 중 Tr은 히드록시보호기 트리틸이다. 탈트리틸화 단계는 약 60℃에서 1 내지 2시간 동안 80% 아세트산과 같은 산 처리에 의해 수행된다. 유리 포스포네이트를 생산하기 위해 TMSBr과 같은 루이스산을 이용하여 R¹⁵부분을 제거한다.

B¹과 C_2-201-아실옥시-1-알킬 또는 C_4-201-아실옥시-1-알킬-1-아릴 에스테르기를 함유하는 포스포네이트 화합물은 다음과 같이 제조한다.

식 중, R¹⁸은 C_1-6알킬, C_1-6알콕시, C_1-6할로알킬 (1 내지 3개의 할로겐 원자), 시아노, 니트로, OH, O, NH 및 할로겐 중에서 독립적으로 선택된 치환기에 의해 치환되거나 치환되지 않은 C_1-20알킬 (에틸, 프로필, 이소프로필, t-부틸, 이소부틸 및 아다만토일 등), C_1-6알킬, C_1-6알콕시, C_1-6할로알킬 (1 내지 3개의 할로겐 원자), 시아노, 니트로, OH, O, NH 및 할로겐 중에서 독립적으로 선택된 치환기에 의해 치환되거나 치환되지 않은 C_3-10아릴 (페닐, 및 3- 또는 4- 피리딜 등)이다.

아민 보호기 =CR¹⁹N(R²⁰)₂(식 중, R¹⁹는 수소 또는 CH₃이고 R²⁰은 C_1-10알킬이며 두 개의 R²⁰은 모두 1-모르폴리노, 1-피페리딘 또는 1-피롤리딘임)을 고리밖 아민으로 혼입시켜 보호된 헤테로시클릭 염기 화합물을 다음과 같이 제조한다.

R²⁰알킬기의 예로는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 시클로프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸 및 시클로부틸을 들 수 있다. 일반적으로 R²⁰알킬기는 두가지 모두 같다. 반응은 문헌에 설명된 바와 같이 (Kerr외, J. Pharm. Sci. (1994) 83;582; Kerr 외, J. Med. Chem. (1992) 35:1996) 실온 (약 20 - 30℃)에서 건조 DMF 중에서 수행하거나, 또는 DMF 대신 CH₃CN 및 4Å 분자체를 사용할 수 있다. R¹⁹가 수소인 보호된 헤테로시클릭 염기는 중성 무수 조건 하에서 안정하며 일반적으로 산성 수성 조건 하에서는 불안정하다. R¹⁹가 메틸이면, 보호기는 수성의 산 또는 염기성 조건에서 보다 안정하다.

표 3에 고리형 부분 (보호된 헤테로시클릭 염기를 함유하는 cHPMPC 또는 cHPMPC 등) 또는 직쇄 부분 (보호된 헤테로시클릭 염기를 함유하는 HPMPC 또는 보호된 헤테로시클릭 염기를 함유하는 PMEA 또는 PMEA)의 두가지 모두의 인 원자에 혼입될 수 있는 에스테르 및 기타 부분을 나타내었다. 표 3의 에스테르 구조 1-5, 8-10 및 16, 17, 19-22는 뉴클레오타이드 동족체 (cHPMPC등) 상응하는 할라이드 (클로라이드 또는 아실 클로라이드 등)을 DMF (또는 아세토니트릴이나 N-메틸피롤리돈과 같은 다른 용매) 중에서, N,N-디시클로헥실-N-모르폴린 카르복사미딘 (도는 DBU, 트리에틸아민, CsCO₃, N,N-디메틸아닐린 등)과 반응시킴으로써 합성한다. 표 3의 에스테르 구조 4-6, 11, 12, 21, 및 23-26은 알코올 또는 알콕사이드 염 (또는 화합물 13, 14 및 15와 같은 경우 상응하는 아민)을 뉴클레오타이드 동족체 모노클로로포스포네이트 또는 디클로로포스포네이트 (cHPMPC 모노클로로포스포네이트 또는 PMEA 디클로로포스포네이트) 또는 기타 활성화된 포스포네이트와 반응시킴으로써 합성한다.

* - R^D는 C_4-6알킬과 같은 C_1-20알킬임.

** - 각각의 R^C는 같거나 다름 (메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 및 t-부틸 등)

모든 인용문헌을 본문에 명확히 표시하였다. 다음 실시예는 본 발명을 더욱 상세히 설명하기 위해 제시하는 것으로 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 포스포네이트 아미데이트 화합물의 합성.

화학식 Id의 구조를 갖는 화합물들을 표 6에 나타내었다 (비스(글리실 벤질 에스테르)PMEA (화합물 Ex 4), 비스 (알라닐 벤질 에스테르)PMEA (Ex 1), 비스(페닐알라닐 벤질 에스테르)PMEA (Ex5), 등. 화합물 Ex 1 - Ex 12는 다음 공정에 따라 합성하였다. 트리에틸아민 (0.3 mL; 22.2 mmol)을 함유하는 건조 피리딘 (6mL) 중에 PMEA (Z-B = -CH₂-O-CH₂-CH₂-B, 여기서 B는 아데닌-9-일임) (0.3 g; 1.1 mmol)과 아미노산 에스테르·HCl (2.2 mmol; Sigma)를 현탁시킨 다음 이 혼합물에 피리딘 (3mL) 중 2,2'-디피리딜 디설파이드 (3.3 mmol)과 트리페닐포스핀 (3.3 mmol)의 갓 제조한 혼합물을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고, 농축한 다음 메틸렌 클로라이드와 물 사이에서 분별시켰다. 유기용액을 MgSO₄를 이용하여 건조, 농축시킨 다음 실리카 겔 상에서 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

Ex14는 실온에서 PMEA (2.0mmol)가 첨가된 피리딘 (20 mL) 중 갓 제조한 트리페닐포스핀 (6.0 mmol)과 2,2'-디피리딜 디설파이드 (6.0 mmol)을 이용하여 합성하였다. 이 현탁액을 10분간 교반하고 에틸 사르코신 HCl (N-메틸글리신 HCl 에틸 에스테르; 1,2 g, 80 mmol)을 첨가하였다. 이 현탁액을 90℃로 가열시키고 24시간 교반하였다. 조질의 생성물을 회전증발에 의해 농축시킨 다음 실리카 플래쉬 크로마토그래피 (이동상 1% 메탄올 구배 20% 내지 메탄올 80% 메틸렌 클로라이드)에 의해 정제하였다.

화합물 Ex13은 PMEA와 페닐알라닌 N-에틸모르폴리노 에스테르를 이용하여 유사한 방식으로 합성하였다.

실시예 2: 항바이러스 활성

HSV-1 및/또는 HSV-2에 대한 화합물의 개별적인 활성을 시험하였다. HSV-2 (균주 414-92)는 다음의 분석 프로토콜에 EK라 MA 104 세포를 이용하여 시험하였다. 웰 당 10% 송아지 혈청을 함유하는 최소필수배지 (MEM) 200 μL를 이용하여 96-웰 플레이트에 웰 당 1 x 10⁴개의 MA 104 세포를 접종하고 37℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 화합물들을 MEM Earle's Salts 중에 혈청 없이 용해시켰다. 배지를 흡입에 의해 제거하고 혈청이 없는 100 μL MEM Earle's Salts를 웰에 첨가하였다. 화합물을 함유하는 웰들로부터 배지 50 μL를 화합물이 없는 웰들로 계대적으로 이동시킴으로써 3-배 희석된 화합물을 제조하였다. 37℃에서 15분간 플레이트를 인큐베이션시킨 다음 2% 송아지 태아 혈청을 함유한 MEM Earle's Salts 중 100 PFU/ 웰의 바이러스를 첨가하였다. 이어서 화합물을 함유하지 않는 바이러스 감염 콘트롤 웰 중의 세포의 약 90%가 사멸될 때까지 이 플레이트를 37℃에서 3일간 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 후, 배지를 흡입한 다음 웰을 멸균 PBS로 세척하였다. 이 웰에 5분에 걸쳐 20% 메탄올 중 0.5% 크리스탈 바이올렛 100 μL을 첨가하고 흡입한 다음 웰을 증류수로 2회 또는 3회 세정하였다. 이 웰에 0.01 N HCl을 200 μL 첨가하고 각 웰의 595 nm에서의 흡수도를 측정하였다. 표 6에 결과를 HSV-2에 의해 매개된 세포사멸을 50% 억제하는 농도 (μM), 즉 IC₅₀으로서 표시하였다. IC₅₀값은 21 μM의 PMEA의 IC₅₀값에 비해 2 μM 내지 > 100 μM 범위로 가변적이었다. 따라서, 몇몇 화합물은 PMEA 보다 HSV-1에 대해 더 활성적이었다. 이 화합물의 독성은 비감염 세포의 50%를 사멸시키는 농도, 즉 CC₅₀으로서 표시하였다.

화합물들을 VERO 세포 중 HSV-1의 KOS 균주에 대한 활성에 대해서도 시험하였다. 표 7에 결과를 HSV-2에 의해 매개된 세포사멸을 50% 저해하는 농도 (μM), 즉 EC₅₀으로서 표시하였다. EC₅₀은 138 μM의 PMEA에 대한 EC₅₀에 비해 2 μM 내지 >200 μM로 가변적이었다. 따라서, 몇몇 화합물은 PMEA 보다 HSV-2에 대해 더 활성적이었다.

화합물	HSV-1	HSV-2
	EC50	IC50	CC50
Ex 7	> 200	> 100	> 100
Ex 5	nt*	> 100	> 100
Ex 6	20	33	> 100
Ex 12	nt	20	80
Ex 11	> 200	> 100	> 100
Ex 10	> 200	> 100	> 100
Ex 9	63	63	> 100
Ex 8	3	9	20
Ex 4	nt	60	> 100
Ex 1	nt	20	> 100
Ex 3	nt	2	30
Ex 2	nt	3	20

* nt - 미측정.

실시예 3. PMEA, 모노페닐 에스테르, 모노 N-에틸모르폴리노페닐알라닐 포스포로아미데이트.

THF 중 NaOH를 이용하여 비스(페닐)PMEA를 PMEA의 모노페닐 에스테르로 선택적으로 가수분해시켰다. 반응 혼합물을 (1N HCl)로 중화시키고, 모노페닐 PMEA를 여과에 의해 분리하였다. 무수 모노페닐 PMEA와 피리딘 중 트리페닐포스핀과 2,2'-디피리딜 디설파이드와의 갓 제조한 1:1 혼합물 2 당량을 트리에틸아민과 피리딘 중 페닐알라닌 N-에틸-포르폴리노 에스테르 1 당량으로 농축시켜 표제 화합물을 얻었다. 표제 화합물을 감압 하에 용매를 증발시켜 회수하고 실리카 겔 크로마토그래피로 정제하였다.

실시예 4: PMEA 에스테르의 항바이러스 활성.

바이러스와 함께 인큐베이션시킨 후 100 μL XTT, 25 μM PMF를 함유하는 결핍 DME 중 1 mg/ml를 첨가함으로써 CPE를 측정한 것을 제외하고 상기한 바와 같이 MA 104 세포에 있어서 HSV II에 의한 세포변성 억제 효과에 대해 PMEA와 PMEA 에스테르를 시험하였다. 시험된 에스테르는 비스(POM)PMEA, 비스(페닐)PMEA, 모노페닐PMEA, 비스(3-디메틸아미노페닐)PMEA, 비스(3-메톡시페닐)PMEA, 비스(2-카르보에톡시페닐)PMEA, 비스(아다만토일 옥시메틸)PMEA, 비스(4-플루오로페닐)PMEA 및 비스(2-에톡시페닐)PMEA였다. 이들 화합물 모두 활성적인 것으로 평가되었는데, 이는 에스테르기가 제거됨으로써, 유리 PMEA가 바이러스 복제 및/또는 세포변성 효과를 억제할 수 있음을 가리키는 것이다. PMEA의 IC₅₀과 CC₅₀은 각각 19.3 μM 및 2000 μM였으며 비스(POM)PMEA의 IC₅₀과 CC₅₀은 각각 0.5 μM와 > 10 μM였다. 모노 및 비스 에스테르의 IC₅₀값은 1.1 내지 67.5 μM 범위였으며 CC₅₀값은 70 내지 500 μM 범위였다.

실시예 5: 뉴클레오타이드 동족체 아미데이트와 PMEA 에스테르의 경구 생체이용성.

시노몰로거스 (cynomologous) (또는 레서스 (rhesus)) 원숭이에게 뉴클레오타이드 동족체 아미데이트와 뉴클레오타이드 동족체를 경구, 피하 또는 근육내 하였을 경우 이들의 생체이용성을 시험하였다. 생체이용성은 방사능 표지된 (³H,¹⁴C 등) 화합물, 또는 아데닌을 갖는 화합물을 이용하여 문헌에 기재된 바와 같이 (Naesens외, Clin Chem. (1992) 38: 480-485; Russell 외, J. Chromatogr (Netherlands) (1991) 572-326) 약물을 투여한 후 상이한 시간대에서 혈장 또는 소변 중 PMEA 농도를 측정함으로써 결정하였다. 방사능 표지된 화합물은 상업적으로 구입하거나 (Moravek Biochemicals, Brea, CA) 또는³H 표지된 촉매적 수소교환과 같은 표준 공정에 의해 얻는다. 방사능 표지 화합물 약 20 - 50 μCi/Kg (대개 약 40 μCi/Kg)를 함유하는, 비스(2-에톡시페닐)PMEA, 비스(2-카르보에톡시페닐)PMEA, 비스(O-벤질페닐알라닐)PMEA, 비스(3,5-디메톡시페닐)PMEA, 비스(4-플루오로페닐)PMEA, 비스(아다만토일 옥시메틸)PMEA, 비스(페닐)PMEA, 비스(3-메톡시페닐)PMEA와 같은 화합물들 10 - 30 mg/kg (대개 15 내지 25 mg/kg)을 투여한 다음, 투여 후 몇몇 시간 대에서 (예컨대 투여한지 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4, 6, 12, 18, 24, 36, 48, 72, 96시간 시간 후)혈액샘플을 채취하고, 혈청의 단위 부피 (약 0.1 - 1.0 mL)당 존재하는 방사능 표지된 화합물의 양을 측정함으로써 이들의 경구투여에 의한 생체이용성을 시험한다. 시험된 화합물의 경구 생체이용성은 2 - 80% (또는 2% 내지 80% 범위에서 1%만큼 증가됨), 바람직하게는 10 - 80%, 더욱 바람직하게느는 15 - 80%이다. 이러한 유형의 분석법에 의한 비스(POM)PMEAA의 경구 생체이용성은 원숭이에 있어서 일반적으로 약 25%이고 PMEA는 약 2 - 4%인 반면(Balzarini외, Animal Models in AIDS (1990) p. 131-138, Schellekens, H. 외 (ed), Elsevier Science Publications, Amsterdam), 뉴클레오타이드 동족체 아미데이트와 뉴클레오타이드 동족체 (모노- 및 디에스테르 등)는 약 5%, 10%, 15%, 30%, 40%, 50%, 60% 또는 80%의 경구 생체이용성을 갖는다.

약 200 μL의 혈장을 섬광 계수 칵테일 (Scinti-Safe 플러스 LSC 칵테일)과 혼합한 다음 섬광 계수기를 이용하여 계수함으로써 혈장 중 총 방사능을 측정하였다 (대개 약 5 - 30분). 약 350 μL의 혈장을 이용하여, 혈청 중 단백질을 변성시키고 (예컨대 아세토니트릴 중 약 700 μL 0.1% 트리플루오로아세트산을 이용함), 얻어진 시료를 감압 하에 건조시킨 다음, 샘플을 적절한 완충액 (예컨대 pH 6.0 HPLC 분석을 위해, 10mM 테트라부틸 암모늄 하이드로겐 포스페이트 (TBAHP)와 함께 25 mM 칼륨 포스페이트 완충액 중 2% 아세토니트릴 약 100 μL를 이용함) 중에 현탁시키고, 샘플을 원심분리하여 상등액을 시판하는 컬럼 상 (The Separation Group, Hesperia, CA; Vydac C 18, 5 μm, 250 x 4.6 mm 컬럼, 주입 용량 약 50 μL, 유속 약 1.0 mL/분, 약 35℃에서 2분간 완충액을 이용한 다음 이어서 10 mM TBAHP와 함께 25 mM 인산칼륨 완충액 중 약 65% 아세토니트릴로 선형 구배시킴)에서 역상 HPLC에 의해 별도의 방사능 표지된 화합물을 분석하는데 사용하였다. 방사능 표지 검색은 시팜하는 섬광 계수 시스템 또는 방사능 유속 검색 시스템과 같은 수단을 이용하여 수행하였다 (Packard, Meridian, CT).

혈장 중 PMEA의 형광 검색은 상기한 바와 같은 HPLC 구배에 의해(2 내지 65% 아세토니트릴) 검색기 (모델 F2000, Spectra Physics, San Jose, CA)를 이용하여 형광 방출 (420nm, 약 236 nm에서 여기됨)에 의해 수행하였다. 분석용 시료는 혈장 (200 μL)로부터, TFA (아세토니트릴 중 0.1% 400 μL)를 이용한 단백질 침전, 건조시킨 후 200 μL 반응 완충액 (0.34%, 클로로아세트알데히드, 100 mM 소듐 아세테이트, pH 4.5) 중, 95℃에서 40분 동안 아데닌을 N6-에탄오아데닌으로 전환시킨 다음 50 μL을 잉요하여 HPLC 분석함으로써 제조한다.

실시예 6: 비스(아다만토일 옥시메틸)PMEA 에스테르:

DBU (1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데-7-센; 1.53g, 10 mmol)를 DMF (25 mL) 중 PMEA (1.365 g, 5 mmol) 현탁액에 첨가하였다. DMF (25 mL) 중 아다만토일 옥시메틸 클로라이드 (5.72 g, 25 mmol)를 반응 혼합물에 첨가하고 이를 실온에서 4시간 교반한 다음 진공하에 휘발물질을 제거하였다. 용매 제거 후 얻어진 조질의 생성물을 실리카 겔 컬럼상에 로딩시킨 다음 3% MeOH/CH₂Cl₂로 세정하여 비극석 불순물을 제거하였다. 8% MeOH/CH₂Cl₂중에서 1 g (30%)의 비스(아다만토일 옥시메틸)PMEA 에스테르를 용리시켰다. (CH₂O)_n/ZnCl₂를 이용하여 1-아다만탄카르보닐 클로라이드 (Aldrich NO. 11,772-2)를 전환시킴으로써 아다만토일 옥시메틸 클로라이드를 얻었다 (Bodor 외, J. Med. Chem. (1980) 23: 474-480 참조).

실시예 7: 비스(페닐)PMEA 및 비스(2-에톡시페닐)PMEA 에스테르:

PMEA (2.0 g, 7.3 mmol), 아세토니트릴 (20 mL), 티오닐 클로라이드 (20mL) 및 N,N-디메틸포름아미드 (2 방울)을 N₂분위기 하에서 자석 교반기, 냉각수 응축기가 구비된 250 mL 용량의 가지 하나 달린 둥근바닥 플라스크에 첨가하였다. 이 플라스크를 85℃의 유조에 침지시켜 얻어진 현탁액을 2시간 동안 교반하였다. 얻어진 용액을 건조상태로 농축시키고 아세토니트릴 (50mL)을 첨가하여 조질의 클로리데이트를 재용해시켰다.

기계 교반장치가 구비된 별도의 250 mL 들이 가지달린 둥근바닥 플라스크에 N₂분위기 하에서 페놀 (3.25g, 35 mmol), 테트라히드로퓨란 (80mL) 및 소듐 하이드라이드 (1.4 g, 34 mmol, 미네랄 오일 중 60% (w/w) 분산액)을 첨가하였다. 30 분 교반한 후, 드라이아이스-아세톤 배쓰를 이용하여 용액을 -78℃로 냉각시켰다. 이어서 전단계로부터의 아세토니트릴를 내부 온도가 -76℃가 넘지 않는 속도로 하여 적가하였다. 첨가완료 후, 얻어진 현탁액을 포화 수성 NaHCO₃(100mL)에 붓고 메틸렌 클로라이드 (3 x 150 mL)로 추출하였다. 결합 유기층을 H₂O (100 mL), 염수 (100 mL)로 세정하고 무수 Na₂SO₄로 건조시켰다. 회전 증발에 의해 농축시켜 황색 고체를 얻었다. 재결정 (에틸 아세테이트/헥산)에 의해 정제시켜 순수한 비스(페닐)PMEA (1.64 g, 53%)를 얻었다. 페놀 대신 2-에톡시페놀을 마찬가지로 이용하여 비스(2-에톡시페닐)PMEA를 36%의 수율로 얻었다.

실시예 8: (R)-9-(2-디-2-에톡시페닐포스포닐메톡시프로필)아데닌.

피리딘 (75 mL) 중 2-에톡시페놀(45mmol, 6.22 g)의 용액에 (R)-9-(2-포스포닐메톡시프로필 아데닌 (PMPA, 15 mmol, 4.3 g)을 첨가하여 백색 현탁액으로 만들었다. 피리딘 (75 mL) 중 2,2'-디피리딜 디설파이드 (45 mmol, 9.91 g)과 트리페닐 포스핀 (45 mmol, 11.81 g)의 별도 용액을 상기 백색 용액에 22℃에서 한번에 첨가하였다. 이어서, 트리에틸아민 (30 mmol, 4.18 mL)을 전체 용액에 한번에 첨가하고 이를 75℃에서 21시간 (TLC:10% MeOH/EtOAc) 동안 교반하였다. 어두운 호박색의 슬러리를 톨루엔 (100 mL)과 함께 증발시켰다. 이어서 이것을 디클로로메탄 (200 mL)에 용해시키고 물 (200 mL)로 2회 추출하였다. 유기상을 건조 (NaSO₄)시키고, 여과 및 농축 (진공)하여 갈색 시럽 (25.4 g)으로 만들었다. 이 시럽을 플래쉬 크로마토그래피:1-5% MeOH/EtOAc에 의해 정제하여 불순물을 용리시킨 다음 6-12% MeOH/EtOAc (표제 화합물이 10-11%에서 용리됨)로 처리하였다. 소망되는 분획을 농축시켜 갈색 고체 1.04 g을 얻었다. 이어서 이 고체를 재결정 (EtOAc)시켜 표제 화합물 (780 mg, 12% 수율)을 황갈색 고체로서 얻었다. HNMR (CDCl₃)δ1.25 (d, J=7.5Hz, 3H, CH₃), δ1.46 (m, 6H(OCH₂CH₃)₂), 4H (OCH₂CH₃)₂), δ3.9 (m, 2H, O-CH₂P), δ4.04 (m, 1H, H-2'), δ4.09, 4.39 (m, 2H, H-1'), 7.24 (m, 8H, (C₆H₄)₂), 7.92 (S, 1H, (C₈-H), 8.19 (S, 1H, C₂-H).

실시예 9: cHPMPU.

주변 온도에서 N,N-디메틸포름아미드 (1.25 mL) 중 디소듐 HPMPU (131 mg, 0.404 mmol) 현탁액에 티오닐 클로라이드 (60 mL, 0.812 mmol, 2.02 eq)를 적가함으로써 cHPMPU를 합성하였다. 얻어진 담황색 용액을 주변 온도에서 20분간 교반한 다음 농축건조 (진공, 45℃)시켰다. H₂O (2mL)를 첨가하고 얻어진 용액을 진공농축시켰다. 메탄올 (4mL)를 첨가하고 얻어진 용액을 농축건조시켜 조질의 생성물을 담황색 고체로서 얻었다. 실리카 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 (이동상: 30% 메탄올: 70% CH₂Cl₂구배 내지 50% 메탄올; 50% CH₂Cl₂) 백색 무정형 고체로서 69^의 수율로 순수한 cHPMPU를 얻었다.¹H NMR (300 MHz, D₂O) d7.62 d (1H, J=7.1Hz, CH=CH), 5.82d (1H, J=7.8Hz, CH=CH), 4.30-3.71 m(7H, CH₂CH(OCH₂P)CH₂OH), NH 및 OH는 D₂O중 관찰되지 않음.¹³C NMR (75 MHz, D₂O) d, 169.6 s (4-C), 155.1 s (2-C), 150.4s (6-C), 103.2 s(5-C), 76.71 d (JP,C=3.6Hz, 2'-CH₂), 72.30 d (JP,C=6.2Hz, 3'-CH₂), 67.90 d (JP,C=142.0Hz, P-CH₂), 50.71s (1'-C)³¹P NMR (121 MHz, D₂O) d 9.23s.

실시예 10: cHPMPC 에틸 에스테르.

DMF 중 디에틸 HPMPC (1.1 g)의 교반 용액에 NaH (115 mg)를 첨가하였다. 15분 후, 반응 혼합물을 아세트산 (1 eq.)으로 급냉시켰다. 용매를 감압하에 제거하였다. 조질의 혼합물을 CH₂Cl₂와 물에 용해시켰다. 유기층을 NaCl용액으로 세정하고 얻어진 조질의 물질을 실리카 겔 컬럼 (CH₂Cl₂중 5%-10% MeOH로 용리) 상에서 정제시켜 고리형 에틸 HPMPC (950 mg)를 부분입체이성질체 혼합물 (약 70%)로서 얻었다.

실시예 11: cHPMPC 에스테르.

DMF 중 HPMPC (2.79g)의 교반 현탁액에 티오닐클로라이드 (2.1 mL)를 무수 조건 하에서 적가하고 혼합물을 1시간 교반하였다. 다른 플라스크에서 소듐 아릴옥사이드 (적절한 아릴 치환기 이용함)를 상응하는 페놀 (8.9g)과 NaH(1.8g)을 이용하여 1:1 DMF/THF (50ml) 중에 합성하였다. 이 용액을 -78℃로 냉각시키고 클로리데이트 용액을 무수 조건 하에서 적가하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 아세트산 (5 eq)으로 급냉시키고 용매를 진공하에 증발시켰다. 조질의 혼합물을 물과 CH₂Cl₂사이에서 분별시켰다. 유기층을 농축시키고 잔사를 실리카 겔 컬럼 (CH₂Cl₂중 5%-10% MeOH를 이용하여 용리시킴) 상에서 정제시켜 고리형 아릴 화합물을 단일의 부분입체이성체로서 약 60%의 수율로 얻었다. 이 방법은 모든 치환 또는 비치환 R¹⁵기에 대해, 특히 반응이 일어나는 것이 바람직하지 않은 아미노기를 제외한 불안정한 기를 통상적으로 보호하는데 사용할 수 있다 (아미노기는 DMF와의 반응에 의해 보호되며 아세트산과 알칸올 처리에 의해 탈보호된다). 이 방법은 실제로 입체화학적으로 순수한 생성물을 생성시키고, 높은 수율과 쉬운 합성법을 제공한다는 장점이 있다.

실시예 12: cHPMPC 에스테르

고리형 HPMPC (1 mmol)의 교반 현탁액에 N,N'-디시클로헥실-4-모르폴린카르복사미딘 (2mmol)을 첨가한 다음 상응하는 아실옥시메틸 클로라이드 (1.5 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 3일간 교반시키고 DMF를 감압 하에 증발시켰다. 조질의 생성물을 실리카 겔 컬럼 (메틸렌 클로라이드 중 5% 메탄올로 용리시킴) 상에서 정제하여 순수한 고리형 HPMPC 유도체 (약 30% 수율)를 얻었다.

고리형 HPMPC (1 mmol), N,N'-디시클로헥실-4-모르폴린-카르복사미딘 (1.1 mmol)을 이용한 다음 상응하는 아실옥시메틸 클로라이드 (1.2 mmol)을 사용하여 반응시킴으로써 최종 생성물을 보다 높은 수율로 얻었다. 출발물질로서 N⁴-벤조일 cHPMPC를 사용하여 유사한 방식으로 N⁴-벤조일 cHPMPC 피발로일옥시메틸 에스테르를 합성하였다.

실시예 13: cHPMPC 에스테르:

표 3의 화합물 구조 6, 7, 11, 12, 13, 23, 24, 25 및 26에 상응하는 에스테르 구조를 위해 실시예 11에 설명된 바대로 적절한 반응물을 이용하여 cHPMPC 에스테르를 합성하였다. 표 3의 화합물 구조 8, 9, 10, 16 및 17에 상응하는 에스테르 부분을 위해 실시예 12에 설명된 바와 같이 적절한 반응물을 이용하여 cHPMPC 에스테르를 합성하였다. 화합물 구조 6, 8, 9, 11, 24, 25 및 26의 cHPMPC 에스테르의 융점 데이터는 다음과 같았다: cHPMPC 3-피리딜 에스테르 (#6)-268-273℃ (분해); cHPMPC N-에틸모르폴리노 에스테르 (#7)-241℃； cHPMPC-CH₂-O-C(O)-C₆H₅(#8)-198-201℃； cHPMPC #9 오르토 에스테르-176℃； cHPMPC#11 에스테르-100-250℃ (분해); cHPMPC 페닐 에스테르 (#12);190℃； cHPMPC #24 에스테르-218-225℃ (왁스상 액체);cHPMPC #25 에스테르-171℃； cHPMPC #26 에스테르-181℃.

실시예 14: 9-[2,3-디데옥시-2,3-디데히드로-4-포스포노메톡시-β-D-에리쓰로퓨라노실]아데닌 에스테르.

아세토니트릴 중 요오드(2 당량)과 구조식 (R¹⁵O)₂P(O)-CH₂-OH (식 중, R¹⁵는 이소프로필, 페닐 또는 2-에톡시페닐)의 화합물 및 다음 화합물을 이용하여

(식 중, B는 아데닌이었음)

부가-제거 반응에 의해 다음의 3-요오도포스포네이트디에스테르를 생산하고

이어서 이를 제거하여 메탄올 또는 테트라히드로퓨란과 같은 무수 유기용매 중, 실온에서 12시간 동안 DBU 또는 소듐 메톡사이드 5 당량과의 반응에 의해 상응하는 화학식 V의 화합물을 생산하였다.

구조식 (R¹⁵O)₂P(O)-CH₂-OH (식 중, R¹⁵는 페닐 또는 2-에톡시페닐임)의 화합물은 PCl₃1당량과 t-부탄올 1 당량을 55℃에서 반응시켜 (R¹⁵O)₂P(O)H를 경유하여 얻었다 (미국특허 3,329,742). 이어서 (R¹⁵O)₂P(O)H를 1당량의 비스(트리메틸실릴)-트리플루오로아세트아미드를 이용하여 실릴화시키고 얻어진 (R¹⁵O)₂P(OTMS)를 진공하에 건조시켰다. 이어서 (R¹⁵O)₂P(OTMS)를 70℃에서 12시간 동안 티타늄 이소프로폭사이드 (또는 티타늄 테트라클로라이드와 같은 다른 류이스산을 사용할 수도 있음)를 촉매량만큼 함유하는 파라포름알데히드 중에서 반응시킴으로써 (R¹⁵)₂P(O)-CH₂-OH로 전환시켰다. 에톡시페닐 생성물을 결정화에 의해 분리하였다. 비스-페닐 생성물은 실리카 게0f 크로마토그래피에 의해 분리하였다.

실시예 15: N⁴-벤조일 cHPMPC.

출발물질로서 히드록실기에서 트리틸화된 N⁴-벤조일 HPMPC 디에틸 에스테르를 사용하여 표제 화합물을 합성하였다. 출발물질을 아세트산을 이용하여 탈트리틸화시킨 다음 TMSBr을 이용하여 N⁴-벤조일 HPMPC로 전호나시켰다. 얻어진 화합물을 피리딘 중에서 모르폴린과 DCC를 이용하여 N⁴-벤조일 cHPMPC로 전호나시켰다. 표제 화합물을 조직배양 중 HCMV에 대한 활성에 대해 테스트하자 (NHDF 세포주), HPMPC 0.4 μM에 비해 22 μM의 IC₅₀을 나타내어 활성적인 것으로 나타났다.

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) δ8.02 (H₆, 1H, d, 7.2Hz), 7.97 (방향족, 2H, d, 7.2Hz), 7.62 (방향족, 1H, t, 7.2Hz0, 7.5 (방향족, 2H, t, 7.2Hz), 7.26 (H₅, 1H, d, 7.2Hz), 4.28 (1H, t, 14.7Hz), 4.15 (1H, t, 10.8Hz,), 4.0 (m, 3H), 3.84 (1H, m), 2.49 (1H, d, 14.1Hz);³¹P-NHR (121 MHz, CDCl₃)δ 10.07. 융점 243-246℃.

실시예 16: cHPMPC 에스테르.

세가지 방법 중 한가지에 의해 화학식 1의 NPE 에스테르를 합성하였다. 첫 번째 방법, "방법 A"으로, CH₃CN (250 mL) 중 Vilsmeier 시약 (7.7g, 0.060 mol)의 교반 현탁액에 HPMPC (6.74g, 0.024mol)를 첨가하고 반응 혼합물을 세시간 동안 계속 교반하였다. 이어서 DMF 또는 DMF-테트라히드로퓨란 (THV) 1:1 (v/v 혼합물) 중 화학식 6의 소듐 살리실레이트 (0.120 mol; NaH와 상응하는 살리실레이트로부터 갓 제조됨)를 클로리데이트 반응 혼합물에 한번에 첨가하였다.

2시간 후, 고체를 여과하였다. 고체를 100 mL CH3CN으로 세정하고 100 mL CH2Cl2로 세정하였다. 결합된 여액을 감압하에 농축시켰다. 조질의 잔사를 50 mL CH2Cl2에 용해시키고 이를 50mL의 디에틸 에테르에 교반하면서 서서히 첨가하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고 1H NMR과 31P NMR에 의해 동정하자 cHPMPC 살리실레이트 에스테르 (~ 50-60%), 즉 화학식 1의 화합물 (모든 R은 수소이고 R은 수소가 아님)의 약 90%의 적도형 이성체와 약 10%의 축방향 이성체인 것으로 동정되었다.

본 발명자들은 다음과 같이 적도형 이성체를 축방향 이성체로 전환시켰다. 본 발명자들은 1:1 (v/v) DMF-THF 용매 화합물 30mL에 cHPMPC 살리실레이트 에스테르 (적도형 이성체, 3.3g, 6.7 mmol)를 용해시켰다. 이어서, DMF 25 mL(또는 DMF-THF 1:1 혼합물 25 ml) 중 상응하는 소듐 살리실레이트 7.25 mmol을 cHPMPC 살리실레이트 에스테르 용액에 첨가하였다. 얻어진 용액을 실온에서 16시간 동안 교반한 다음 3.8 mL의 빙초산을 첨가하였다. 혼합물을 1시간 교반한 다음 용매를 진공 하에 제거하고 조질의 잔사를 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하자 NMR에 의해 주로 축방향 이성체 (인 원자에서 적도형 이성체 약 10%와 축방향 이성체 약 90%)가 얻어졌음이 확인되었다.

화학식 1의 NPEs를 "방법 B"에 의해 다음과 같이 합성하였다. CH₃CN (40 mL)와 DMF (2.8 mL) 중 빙냉시킨 HPMPC 현탁액 (4g, 14.3mmol)에 옥살릴 클로라이드 (3.1 mL, 0.0357 mol)를 서서히 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 데우고 3시간 동안 교반하였다. 화학식 6의 소듐 살리실레이트 (100 mmol; DMF 또는 DMF-THF 혼합물 중 상응하는 살리실산 에스테르와 NaH로부터 갓 제조됨)를 상기 반응 혼합물에 첨가하고 밤새 실온에서 교반하였다. 빙초산 (7.2 mL)을 반응 혼합물에 첨가하고 이어서 1시간 동안 계속 교반하였다. 다음 감압 하에서 반응 혼합물을 농축하였다. 조질의 잔사를 헥산 또는 디에틸 에테르 또는 헥산-디에틸 에테르 혼합물에 20분간 현탁시켰다. 고체를 여과에 의해 수집하고 디옥산:1N HCl (80mL:20mL)에 용해시켰다. 혼합물을 실온에서 2시간 교반하고 용매를 감압하에 제거하였다. 조질의 잔사를 CH₂Cl₂300 mL에 용해시키고 200 mL 물로 2회 세정하였다. 유백색의 유기층을 건조시키고 회전 증발기로 농축시켰다. 조질의 생성물은 약 6:4 축대 (축형 인원자) (axia(axphosphorus atom)의 혼합물이었다. 이 물질을 방법 A에 설명된 바와 같이 이성화시켜 인 원자에서 약 9:1 이성체 비율을 얻었다 (축방향 이성체가 우세한 이성체로 얻어짐).

화학식 1의 NPEs를 "방법 C"에 의해 다음과 같이 합성하였다. CH₃CN (150 mL)과 DMF (6.9 mL) 중 빙냉시킨 HPMPC 현탁액 (10 g, 35.7 mmol)에 옥살릴 클로라이드 (7.75 mL, 89.3 mmol)을 서서히 첨가하였다. 실온으로 반응 혼합물을 데우고 3시간 동안 교반하였다. 화학식 6의 소듐 살리실레이트 (178.6 mmol; THF 또는 DMF 또는 DMF-THF 혼합물 중 상응하는 살리실산 에스테르와 NaH로부터 갓 제조됨)를 상기 반응 혼합물에 30분에 걸쳐 서서히 첨가하고 혼합물을 실온에서 3시간 교반한 다음 용매를 감압하에 제거하였다. 조질의 잔사를 300 mL CH₂Cl₂에 용해시키고 100 mL의 물로 2회 세척하였다. 유기층을 건조시키고 회전 증발기 상에서 농축시켰다. 조질의 생성물을 실리카 겔 크로마토그래피로 처리하여 화학식 1의 cHPMPC의 살리실레이트 에스테르를 인 원자에서 약 9:1의 이성체로서 얻었다 (적도형 이성체가 우세한 이성체임).

다음 화학식 1의 cHPMPC 화합물을 합성하였다 - 모든 R¹은 수소였고 R은 다음에 표시한 바와 같음. (eq)라는 표시는 인 원자에서 적도형 이성체가 축방향 이성체에 비해 약 9:1의 비율로 우세하게 존재하였음을 가리키며 (ax)라 함은 인 원자에서 축방향 이성체가 적도형 이성체에 비해 약 9"1의 비율로 우세하게 존재하였음을 가리키는 것이다.

표시된 화학식 1의 화합물 (모든 R¹은 수소였음)에 대해 다음과 같이 NMR 데이터를 얻었다.

실시예 17: cHPMPC와 cHPMPC 에스테르의 경구 생체이용성.

이 연구에 의해 Beagle종 개에 있어서 cHPMPC와 cHPMPC 에스테르의 경구 생체이용성을 시험하였다. 이 실험에 의해 정맥내 투여 후 cHPMPC에 의해 얻어진 AUC에 대한 cHPMPC 에스테르 또는 cHPMPC 경구 투여 후 혈장 농도 시간 곡선 하의 면적인 AUC를 비교함으로써 개에 있어서 cHPMPC와 cHPMPC 에스테르의 생체이용성을 측정하였다.

이 연구에서는 0.9 NaCl 중 고리형 HPMPC 10 mg/ml를 함유하는 경구투여용 cHPMPC 수용액을 사용하였다. 투여량은 1.0 mL/kg (10mg/kg)이었다. cHPMPC 에스테르 (10mg/kg 용액)의 제조방법은 다음과 같다.

이 실험에서는 다 자란 수컷 비이글종 개를 이용하였다. 투약 12- 18시간 전과 투약 후 6시간가지 개를 굶겼다. 굶은 개의 평균 위장 pH는 인간의 위의 산도보다 대략 1 pH 단위가 더 높았다. 이 연구에는 위장의 pH를 조정하기 위해 펜타가스트린으로 미리 처리된 개를 사용하였다 (J. Dressman, Pharm. Res., (1986) 3:1223-131). 펜타가스트린 처리에 의해 위의 pH가 공복시의 인간의 위장의 pH와 일치되는 정도로 낮아진다 (R. P. Happe 외, Research in Vet. Sci. 33:232-239). 이 연구는 펩타블론 (펜타가스트린, 0.25 mg/mL) (Ayerst Laboratories, Inc. Philadelphia, PA)을 이용하였다. 인간의 위의 pH 값과 유사하게 만들기 위해 투약 하기 20분 전 펜타가스트린 (6μg/kg)을 1회 근육내 주사하였다. 개에게 물을 자유롭게 먹게 하였다.

각각의 배합물을 1회 투여하였다. 이 연구에서는 각 동물에 대해 각 배합물을 개별적인 바이알로 제공하였다. 경구용 용액을 위관 영양법에 의해 투여한 다음 10 mL 물로 2회 세정하였다. 시료 채집 기간 동안 동물을 의식있는 상태로 유지시켰다.

각 동물로부터 헤파린처리한 튜브내로 직접 인후부 정맥을 통해 혈액시료 (4.0 mL)를 채혈하였다. 혈액을 2000 rpm에서 10분간 원심분리하여 혈액을 즉시 처리하였다. 혈장 샘플을 동결시키고 분석할 때까지 ≤-20℃에서 유지시켰다. 수집한 정상적인 개의 혈장을 표준 시료로서 사용하였다.

역상 HPLC 및 형광 시토신 염기 3, N⁴-에테노 유도체의 형광 검색 (Excitation 305 nm Emission 370 nm)을 이용하여, 테스트된 에스테르와 cHPMPC의 혈장 농도를 측정하였다. HPLC 분석의 내부기준으로 시토신 5'-모노포스페이트 (5'-CMP) (Sigma, Cat.# C-1006)을 사용하였다. 혈장 (100 μL)을 400 μL의 단백질 침전 용액 (5'-CMP를 함유하는 800 mL의 아세토니트릴, 물 190 mL, 빙초산 10mL)과 혼합하고 이 용액을 20,000 g에서 5분간 원심분리시켰다. 상등액을 다른 튜브에 옮기고 아세토니트릴 중 0.25 g/mL로 페나실 브로마이드 (Fluka) 100 μL와 혼합하여 65℃에서 40분간 인큐베이션시킴으로써 시토신 에테노 유도체를 생산하였다. 이어서 튜브를 얼음에 넣어 반응물을 급냉시켰다. 다음 시료를 감압하에 ≤2.5 시간 동안 증발건조시켰다. 잔사를 100 μL의 재조성 용액 (물 중 6 mM 도데실트리에틸 암모늄 포스페이트 (Bodman), 30 mM 인산)에 용해시키고 0.45 μM 여과 장치 (Z-spin)을 통해 여과시켰다. 여액을 자동샘플채취기 바이알 (Chromacol)로 이동시켜 HPLC 분석하였다.

HPLC 시스템은 모델 P4000 (Thermo Separations, San Jose, CA) 용매 전달계와 Model AS3000 자동주입기 (ThermoSeparations) 및 모델 F-1080 형광검색기 (Hitachi)로 이루어졌다. Peak Pro 데이터 획득 시스템 (Beckman, Palo Alto, CA)으로 연구에 따른 데이터를 수득 및 저장하였다. 컬럼은 45℃에서 작동하는 Intersil ODS-2, 4.6 x 150 mm, 5 μM HPLC 컬럼이었다. 이동상으로부터 30% 아세토니트릴 중 pH 2.85, 30 mM 인산, 6 mM 도데실트리에틸암모늄 포스페이트 (Bodman)을 탈기시켰다. 유속은 2.0 mL/분이었으며 주입 용량은 20 μL였다. 모든 용액과 HPLC 분석을 위한 표준물로서 HPLC 등급의 물을 사용하였다.

cHPMPC 측정의 경우와 동일한 방식으로 다음의 화학식 1의 화합물에 대해 경구 생체이용성을 시험하였다. 테스트된 에스테르는 인 원자에서 약 90:10 (w/w) 라세미체 혼합물로 구성되었으며, 모든 화합물에 있어서, 동일한 이성체가 우세하였다.

화합물 #7의 R기는 시클로헥실이고 화합물 #8의 R기는 페네틸이었다. cHPMPC 화합물을 전달하는데 사용된 배합물은 다음으로 이루어졌다: 배합물 #1 0.9% NaCl, #2 PEG 400, #3 20% PEG 400 및 80% 수성 구연산 완충액 (50mM, pH 2.2). 화합물들은 cHPMPC로서 경구 생체이용가능하였다: 화합물 #1 22.5% ± 11.0; 화합물 #2, 18.5±5.8; 화합물 #3, 46.3±9.0; 화합물 #4, 30.5±4.8; 화합물 #5, 34.4±4.8; 화합물 #6, 27.8±6.2; 화합물 #7, 22.7±4.4; 화합물 #8, 12.0±2.6 내지 1.4±1.2 (뒤의 값은 cHPMPC로부터 나온 값임).

Claims (33)

1. 다음 화학식 1을 갖는 화합물 및 그의 라세미체, 염 및 용매화합물.

   화학식 1

   식 중, B는 보호되거나 보호되지 않은 헤테로시클릭 염기;

   R은 수소(H), 알킬, O-알킬, -CHO, -CH₂CH₂C₆H₅, -C(O)OR², -C(O)R², -C(O)N(R³)₂또는 -S(O)₂N(R³)₂;

   각각의 R¹은 독립적으로 수소, 시아노(CN), 니트로(NO₂), 할로겐, 알킬, O-알킬, -C(O)OR³, -C(O)R³, -S(O)₂OH, -N(R³)₂, -CHO 또는 -OH;이고

   각각의 R²와 R³는 독립적으로 수소, 알킬, 페닐, 알킬치환 페닐, -CH₂C₆H₅또는 -CH₂CH₂C₆H₅임

   (단, R과 R¹을 함유하는 고리가 페닐, 1-4개의 할로겐 원자로 치환된 페닐, 하나 또는 두 개의 CN, NO₂, OH, C_1-12알킬 또는 C_1-12O-알킬기로 치환된 페닐, 두 개의 -C(O)O-C₂H₅기로 치환된 페닐, 하나의 -N(CH₃)₂또는 -C(O)O-C_1-4알킬기로 치환된 페닐, 또는 하나의 -C(O)O-C₂H₅또는 -O-C₂H₅기와 하나의 OH기로 치환된 페닐인 화합물들은 본 청구항에서 제외됨)
2. 제 1항에 있어서, B가 다음 화학식 a, b, c, 또는 d로 이루어진 것이 특징인 화합물.

   (식 중, R⁶는 NH₂, NHR⁷, NHR⁸, N=CHN(R⁷)₂또는 N=C(CH₃)N(R⁷)₂;

   R⁷은 C_1-6알킬;

   R⁸은 보호기;

   각각의 R⁹은 각각 N 또는 CH;

   R¹⁰은 OH, NH₂, NHR⁷또는 NHR⁸;

   R¹¹은 H, NH₂, NHR⁷또는 NHR⁸;이며

   R¹²는 NH 또는 CH₂임).
3. 제 2항에 있어서, R이 -C(O)-OR²이고, R¹은 수소이며, B는 시토신-1-일, 5-플루오로시토신-1-일, 6-아자시토신-1-일, 5-메틸시토신-1-일, 아데닌-9-일, 구아닌-9-일 또는 2,6-디아미노퓨린-9-일인 화합물.
4. 제 3항에 있어서, R²가 5 내지 12개의 탄소원자를 갖는 것이 특징인 화합물.
5. 제 3항에 있어서, R²가 6 내지 10개의 탄소원자를 갖는 것이 특징인 화합물.
6. 제 4항에 있어서, R²가 5개의 탄소원자를 갖는 것이 특징인 화합물.
7. 제 6항에 있어서, R²가 n-펜틸인 화합물.
8. 제 7항에 있어서, B가 시토신-1-일인 화합물.
9. 제 4항에 있어서, R²가 6개의 탄소를 갖는 것이 특징인 화합물.
10. 제 9항에 있어서, R²가 n-헥실인 화합물.
11. 제 10항에 있어서, B가 시토신-1-일인 화합물.
12. 제 4항에 있어서, R²가 7개의 탄소원자를 갖는 것이 특징인 화합물.
13. 제 12항에 있어서, R²가 n-헵틸인 화합물.
14. 제 13항에 있어서, R²가 시토신-1-일인 화합물.
15. 제 4항에 있어서, R²가 8개의 탄소원자를 갖는 것이 특징인 화합물.
16. 제 15항에 있어서, R²가 n-옥틸, 시클로옥틸, 또는 -CH₂CH(CH₂CH₃) CH₂CH₂CH₂CH₃인 화합물.
17. 제 16항에 있어서, B가 시토신-1-일인 화합물.
18. 제 4항에 있어서, R²가 9개의 탄소를 갖는 것이 특징인 화합물.
19. 제 18항에 있어서, R²가 n-노닐인 화합물.
20. 제 19항에 있어서, B가 시토신-1-일인 화합물.
21. 제 4항에 있어서, R²가 10개의 탄소원자를 갖는 것이 특징인 화합물.
22. 제 21항에 있어서, R²가 n-데실인 화합물.
23. 제 22항에 있어서, B가 시토신-1-일인 화합물.
24. 제 1항에 있어서, R²가 탄소원자를 6개 이상 함유하는 것이 특징인 화합물.
25. 다음 화학식으로 표시되는 화합물, 그의 라세미체, 염 및 용매화합물.

    (식 중, B는 시토신-1-일임).
26. 제 1항에 있어서, 탄소 또는 인 원자의 비대칭 중심^*이 (R또는 (S) 에난티오머로서 입체화학적으로 분할 또는 인리치(enrich)된 것이 특징인 화합물.
27. 제 1항에 있어서, 탄소 원자 비대칭 중심^*이 (S) 에난티오머로서 입체화학적으로 분할된 것이 특징인 화합물.
28. 제 1항에 있어서, 인 원자 비대칭 중심^*이 (R) 또는 (S) 에난티오머로서 입체화학적으로 분할된 것이 특징인 화합물.
29. 제 26항에 있어서, 인 원자 비대칭 중심^*에서 55% 내지 100%의 (R) 에난티오머로 이루어진 것이 특징인 화합물.
30. 제 26항에 있어서, 인 원자 비대칭 중심 *에서 55% 내지 100%의 (S) 에난티오머로 이루어진 것이 특징인 화합물.
31. 제 1항의 화합물의 항바이러스 유효량을 대상자에게 경구투여하는 것으로 되는 방법.
32. 제 27항의 화합물의 항바이러스 유효량을 대상자에게 경구투여하는 것으로 되는 방법.
33. 제 30항의 화합물의 항바이러스 유효량을 대상자에게 경구투여하는 것으로 되는 방법.