KR19990065856A - 감자에서 인간의 인터루킨-2 단백질 생산방법과 인터루킨-2 형질전환체에 의한 감자의 성장촉진용도. - Google Patents

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Abstract

본 발명은 빠른 재분화 특성을 갖는 감자를 토대로 인간의 인터루킨-2 (interleukin-2) 단백질을 고등식물에서 발현시켜 인터루킨-2에 의존성이 있는 동물세포를 이용하여 감자에서 생산된 인터루킨-2의 활성을 이용한 감자의 성장촉진용도에 관한 발명으로,담배식물체에 의한 사람인터루킨-2의 제조방법보다는 비용이 적게 드는 감자를 이용하여 유용 단백질을 대량 생산할 수 있는 체계를 모색하고 유전자 운반체를 제작하여,인터루킨-2 유전자가 식물 특히 감자에서 어떤 효과를 갖는지 분석하고 산업적인 효용가치를 높이는 한편, 유전자 발현의 조절기구를 추적하고자 한다.이에 본발명은 벡터(Vector)pSSK-1을 이용하여 35S CaMV 프로모터(promoter)와 형질전환체의 선별을 위한 마커(marker)인 네오마이신 포스포트렌스퍼레이즈 II(neomycin phosphotransferase II, NPT II) 그리고 GUS(β-glucuronidase) 유전자를 내재하고 있는 pBI121 벡터(vector)를 조작하여 GUS(β-glucuronidase) 유전자 대신 인터루킨-2 유전자로 대치해,이를 식물 감염 균인 아그로박테리움(Agrobacterium)을 이용 본 발명에 의해 확립한 재분화 조건을 이용하여 다음 그림 1과 같이 감자에 인터루킨-2 유전자를 발현되도록 한 감자에서 인간의 인터루킨-2 단백질 생산방법과 인터루킨-2 형질전환체에 의한 감자의 성장촉진용도.

Description

감자에서 인간의 인터루킨-2 단백질 생산방법과 인터루킨-2 형질전환체에 의한 감자의 성장촉진용도.
본 발명은 인류의 4대 식량자원 중의 하나인 감자를 재료로 빠른 재분화를 토대로 인간의 인터루킨-2 (interleukin-2) 단백질을 고등식물에서 발현시켜 인터루킨-2 (interleukin-2)에 의존성이 있는 동물세포를 이용하여 감자에서 생산된 인터루킨-2 (interleukin-2)의 활성을 이용한 감자의 성장촉진방법에 관한 발명에 관한 것이다.지금까지 미생물에서만 생산되던 인간의 단백질은 미생물에서 생산하는 과정 중에 발생하는 전사수준에서의 차이에도 불구하고 고등 동물이나 식물에서 생산하기 힘들다는 단점과 많은 생산 비용으로 인해 무시되어 왔다.
이분야 관련 종래기술로는 국내 특허등록 제 070671호(사람인터루킨 2 단백질을 생산하는 담배식물체와 그의 제조방법)에 의한 발명은 사람 인터루킨-2 유전자가 포함되어 있는 재조합 유전자를 아그로박테리움 튜머페이션스에 이전시켜 이를 담배에 도입시켜 사람 인터루킨-2 단백질을 생산하는 담배식물체를 제조하는 방법과 제조된 담배식물체에 관한것으로서,종래의 유전자 도입에 의해 미생물체로부터 단백질을 생산하는 방법에서 미생물의 배양이 잘조성된 환경과 배지의 공급이 지속적으로 공급되어야 하는 문제점을 개선하기 위함으로, 고등식물의 형질전환용 유전자운반체인 pBKS-1에 사람 인터루킨-2 유전자를 삽입하여 재조합 유전자를 제조한후 이 재조합 유전자를 아그로박테리움 튜머페이션스에 이전시킨후,이를 선별배양하여 담배식물체에 도입함으로서 사람 인터루킨-2 단백질을 담배식물체로부터 제조함이 종래의 기술이고,기타 형질전환 식물체의 생산과 발달 및 분화에 따른 형질전환 기술이 여러 고등식물에서 이루어지고 있는데,유전자의 발현 조절 부위를 결정하는 벡터 (vector)의 프로모터 (promoter) 변환, 제한효소 및 DNA 재조합 기술의 응용, 그리고 Ti 플라스미드 (plasmid)를 이용한 바이너리 벡터 (binary vector)의 개발에 힘입어 식물체내로 외래 유전자를 도입시킬 수 있게 되었지만,과대한 생산비용이 문제로 지적되였다.
그러나,본발명은 담배식물체에 의한 사람인터루킨-2의 제조방법보다는 비용이 적게 드는 감자를 이용하여 유용 단백질을 대량 생산할 수 있는 체계를 모색하고 유전자 운반체를 제작하여, 인터루킨-2 (interleukin-2) 유전자가 식물 특히 감자에서 어떤 효과를 갖는지 분석하고 산업적인 효용가치를 높이는 한편, 유전자 발현의 조절기구를 추적하는데 그 목적이 있다.
그러나 감자는 영양번식을 하는 관계로 바이러스 감염에 의한 수량의 감소 및 질적 저하와 유전적 변이가 심하여 품종 유지에 어려움이 크며, 새로운 형질을 개발하기 위하여 외래 유전자 도입 등 많은 연구가 이루어지고 있으나 아직까지는 형질 전환된 식물체에서의 분자생물학적, 생리, 생화학적인 역할을 분석하는데 체계적인 기구 확립이 이루어지지 않았다.
또한 고등식물의 유용인자 클로닝 (cloning)은 막대한 인력과 투자가 이루어진 가운데 전 세계적으로 시행되고 있고 DNA 조작에 의한 고등식물의 품종개량은 그 효과가 매우 크게 기대되는 기술로서, 그 주요부분이 유용인자 클로닝 (cloning)이다. 일단 유전자가 클로닝 (cloning) 되면 이를 이용하여 용도에 맞는 유전자 운반체 개발이 가능하며, 클론 (clone) 된 유전인자 조작에 의해 형질전환 식물체 생산이 가능하다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 강구하기 위해 수년간에 걸쳐 감자의 형태발생 및 분화에 따른 효소 활성 및 동위효소 (isozyme)의 양상변화에 관한 연구를 수행하여 많은 기초 자료를 확보하여, 현재 수미 (Sumi), 대지 (Daeji), 대서 (Atlentic), 조풍 등 여러 종의 재분화 기간을 1개월 내로 단축시켜 활용하고 있다. 따라서 본 발명에서 사용한 방법은 다음 실시예에 의해 나타난다.
[실시예]
(1) 인터루킨-2 (interleukin-2) 발현기작 분석을 위한 벡터 제작
이 방법은 pBI121 벡터에서 제한효소인 BamH I 과 Sac I 을 이용하여 GUS (β-glucuronidase) 유전자 (1.9 kb) 만을 제거한 후, BamH I 부위는 클레나우 절편 (klenow fragment)를 이용하여 엔드 필링 (end filling) 시키고, Sac I 부위는 멍빈 뉴클리에이즈 (mung bean nuclease)를 이용하여 양쪽 부위 모두를 평활 말단 (blunt end)으로 만들어 준다. 이를 T4 DNA 리가아제(ligase)를 이용하여 평활 말단 접합 (blunt end ligation) 을 유도하였다. 이렇게 유도된 평활 말단(blunt end) 부위의 효소부위 (enzyme site)는 BamH I 부위를 갖게 된다. 즉, 이 BamH I 부위에 인터루킨-2 (interleukin-2) 유전자를 삽입하였다.
(2) 감자의 재분화 조건 확립
본 발명에서는 수년간의 감자에 대한 연구로 수미 (Sumi)를 비롯한 여러 종의 재분화 조건과 형질전환체에 관한 기술을 확보하여,감자의 줄기 절편을 1단계 (stage I) 배지 (0.5 g/L MES, 0.4 mg/L IAA, 2.24 mg/L BAP)에서 이틀간 전배양 (前培養)하고, 외래유전자를 도입시킨 식물 감염균인 아그로박테리움 튜모페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)와 감자의 줄기 절편을 10분 동안 공동배양 (共同培養, coculture) 하여 아그로박테리움 (Agrobacterium)을 감염시킨다. 아그로박테리움(Agrobacterium)으로 감염된 감자의 줄기 절편을 다시 1단계 (stage I) 배지로 옮겨서 3일간 암배양 (暗培養) 한 후, 2단계 (stage II, 50 mg/L kanamycin, 100 mg/L timentin) 배지로 옮겨 10일간 배양한다. 어린싹 (新草)를 유도하기 위해 3단계 (stage III, 2.24 mg/L BAP, 0.1 mg/L GA) 배지로 옮겨 배양 한다.
(3) 제놈 (Genomic) DNA분리
제놈 (Genomic) DNA의 분리는 셰어 (Shure) 등 (1986)의 방법을 변형하여 다음과 같이 수행하였다. 액체 질소를 이용하여 2 g 의 잎을 마쇄 (磨碎)한 후 6 ml의 우레아 (Urea) 추출액 (0.3 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 20 mM Na2EDTA pH 8.0, 1% sarcosyl, 7 M Urea)을 첨가하여 잘 섞어 상온에서 방치한다. 15분 후 원심분리 (5800 rpm/Beckman JA 20.1 rotor, 10 min, 4oC)하고 상증액에 1 ml의 4.4 M 암모니움 아세테이트 (ammonium acetate, pH 5.2)와 7 ml의 이소프로파놀 (isopropanol)을 첨가하여 DNA를 침전시키며, 원심분리하여 DNA 펠렛 (pellet)을 70% 에탄올 (ethanol)로 세척한 다음 TE 완충용액 (pH 8.0)에 녹인다.
(4) 써던 (Southern) 분석
형질전환을 유도한 감자로부터 게놈 (genomic) DNA를 분리하여 제한효소로 절단한 후 에티디움 브로마이드 (ethidium bromide)를 첨가한 아가로스 젤 (agarose gel)에서 전기영동 한 다음 젤 (gel)을 자외선에 5분간 노출시키고 변성과정을 거쳐 나이트란 (Nytran) 막에 전이시킨다. DNA가 전이된 막을 자외선 교차접합기 (UV crosslinker)에서 고정한 후, 대기 상태에서 건조시키고 전혼성화 (前混成化, prehybridization) 용액 (5X SSPE, 50% formamide, 2% blocking reagent, 0.1% N-laurylsarcosine, 0.02% SDS) 내에서 1 시간 동안 천천히 흔들어주며 반응시킨 다음 혼성화 (混成化, hybridization) 용액에서 하루 동안 반응시켜 0.1X SSPE로 세척하고 X-선 필름 (X-ray film)에 노출시켰다.
(5) RNA분리 및 인터루킨-2의 존재유무를 확인하기위한 노던 (Northern) 분석.
식물체를 마쇄하여 5배 (w/v)의 완충용액 (50% guanidine thiocyanate, 0.5% N-laurylsarcosine, 25mM EDTA, 0.1% β- mercaptoethanol)를 넣고 잘 섞은 다음 15분간 원심분리 (15000 rpm, 4℃)한다. 염화세슘 (Cesium chloride) 밀도구배 원심분리에 의하여 RNA를 정제하고 클로로포름/부탄올 (chloroform/butanol, 4:1)로 추출하여 DEPC (Diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수 (H2O)에 용해한 다음 50% 포름알데하이드 (formaldehyde)가 첨가된 아가로스 젤 (agarose gel) 전기영동을 하여 크기에 따라 분리한 후 나이트란 (Nytran) 막에 전이시킨다. RNA가 전이된 나이트란 (Nytran) 막의 처리과정, 전혼성화 (前混成化, prehybridization) 그리고 혼성화 (混成化, hybridization) 과정 등은 써던 (Southern) 분석의 방법과 동일하다.
(6)엘리샤(ELISA;enzyme-linked immunosorbent assay)를 이용한 단백질 생산확인.
엘리샤(ELISA) 실험은 제야슬란(Jeyaseelan)의 방법을 이용하여 수행되었으며 첫 번째 항체 (first antibody)는 PBST로 희석된 anti-mouse-anti-inter- leukin-2 이머노글로빈 G(IgG)를 마이크로타이터(microtiter)의 각 웰(well)에 분주한 후, 이차 항체(second antibody)로 알칼라인 포스테이트(Alkaline phos- photate;AP)-conjugated anti-rabbit IgG를 첨가 시켰다. 반응이 진행된 후 흡광도 405nm에서 단백질의 양을 측정하였다.
(7) 생체학적 활성 측정
생산된 인터루킨-2 (interleukin-2) 단백질이 생체에서 발현되는지 여부를 확인하기 위해서 인터루킨-2 (interleukin-2) 의존성 세포주인 CTLL-2를 실험에 이용하였다. CTLL-2 세포주는 인터루킨-2 (interleukin-2)가 생육배지에 적당량 첨가 되었을 때 자랄수 있다는 점을 이용하여 인터루킨-2 (interleukin-2) 형질전환체의 대조군과 인터루킨-2 (interleukin-2) 형질전환체의 단백질을 분리한 후 CTLL-2 세포주에 각각 넣은후 배양한다. 그후 인터루킨-2 (interleukin-2) 형질전환체의 단백질이 첨가된 세포주만 살고 있는 것을 확인하고 인터루킨-2 (interleukin-2) 형질전환체 단백질의 활성도를 측정한다.
(8) 인터루킨-2 (interleukin-2) 형질전환체의 생장 비교
인터루킨-2 (interleukin-2) 유전자의 효과를 검증하고자 인터루킨-2 (interleukin-2) 형질전환체, 대조군인 GUS(β-glucuronidase) 형질전환체 그리고 형질전환 시키지 않은 식물체의 생장을 비교하기 위해 각각 10개의 시료를 취하여 처음 15일간은 배양병에서 배양한 후 화분으로 옮겨 10일 간격으로 90일간 측정한 결과를 평균하였다.
이와 같은 본 발명 실시의 결과로 얻어진 인터루킨-2 (interleukin-2) 단백질은 의학용으로나 실험용 등으로 사용될 수 있으며, 싼 값으로 많은 양의 단백질을 생산하는데 기여할수 있을 것이다.
본 발명에 사용하기 위해 제작된 벡터 (Vector) pSSK-1을 이용하여 35S CaMV 프로모터 (promoter)와 형질전환체의 선별을 위한 마커 (marker)인 네오마이신 포스포트렌스퍼레이즈 II (neomycin phosphotransferase II, NPT II) 그리고 GUS (β-glucuronidase) 유전자를 내재하고 있는 pBI121 벡터 (vector)를 조작하여 GUS (β-glucuronidase) 유전자 대신 인터루킨-2 (interleukin-2) 유전자로 대치시킨다. 이를 식물 감염 균인 아그로박테리움 (Agrobacterium)을 이용하여 본 발명 실시예 에서와 같이 확립한 재분화 조건을 이용하여 다음 그림 1과 같이 감자에 인터루킨-2 (interleukin-2) 유전자를 발현됨을 알수 있었다.
[그림 1]
또한,셰어 (Shure) 등(1986)의 방법을 변형하여 게놈 (Genomic) DNA를 분리하여, 써던 (southern) 분석과 노던 (northern) 분석으로 형질전환 감자의 노던(northern)분석결과는 그림 2와 같이 인터루킨-2 (interleukin-2)가 발현되고 있음을 알수 있었다.
[그림 2]
한편,형질전환된 감자를 액체질소를 이용하여 분쇄한 후, 단백질을 분리하여 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 분석결과는 아래 그림 3과 같고 생체학적 분석은 표 1과 같이 나타남을 알수 있는바와 같이 형질전환 된 감자에서 많은 양의 인터루킨-2 (interleukin-2) 단백질 발현과 활성이 있는 것으로 나타났다.
[그림 3]
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 분석사진그림
생체학적 분석 결과
Samples 3 H-thymidine incorporated (cpm)
Recombinant hIL-2 Potato transformant (1/1 concentration) Potato transformant (1/2 concentration) 8 U/ml 8.270 4 8.732 2 6.762 1 4.824 0.5 3.081 0.25 2.086 0.13 1.638 0.07 1.041 1:9 1.613 1:27 1.147 1:81 1.013 1:9 7.739 1:27 5.147 1:81 2.840
또 한편,인터루킨-2 (interleukin-2) 형질전환체와 GUS (β-glucuronidase) 형질전환체 그리고 형진전환 하지 않은 식물체(CON)의 생장을 비교한 결과 아래 그림 4의 인터루킨-2 형질전환체의 생장 효과비교와 그림 5의 인터루킨-2 형질전환체의 생장 효과 비교 그래프 그림 5와 같이 인터루킨-2 (interleukin-2) 형질전환체가 약 50%까지 생장이 증가하는 효과을 알수 있었다.
[그림 4]
인터루킨-2 (interleukin-2) 형질전환체의 생장 효과 비교
[그림 5]
인터루킨-2 (interleukin-2) 형질전환체의 생장 효과 비교 그래프
이와같이 효과를 갖는 본 발명 감자에서 인간의 인터루킨-2 (interleukin-2) 단백질 생산방법과 감자에서 생산된 인터루킨-2에 의한 감자의 성장촉진방법의 우수한 효과로는
첫째, 감자의 기내 줄기 증식법 개발로 유전적으로 동일한 개체를 적은 시간과 노력으로 증식시킬 수 있고,
둘째, 유용한 형질을 선발하여 우량 유전자형만을 고정(固定), 유지(維持), 증식(增殖)시켜 품종개량을 할 수 있고,
셋째, 식물의 유전자원을 변이의 발생 없이 오랫동안 보존할 수 있다.
넷째, 식물에서 인터루킨-2 (interleukin-2) 유전자의 효과를 관찰할 수 있으며,
다섯째, 고등식물인 감자에서 인간의 면역관련 물질인 인터루킨-2 (interleukin-2)를 발현시킬 수 있어 농업의 발전은 물론 산업화 그리고 의학에도 크게 이용 가능하리라 사료된다.
이에 본 발명이 산업상 미치는 효과로는
첫째, 유전공학 기법을 이용하여 감자 내로 외래 유전자를 도입함으로써 특이적 유전자 발현에 대한 연구와 분자 수준에서 이해가 가능해졌으며 이들의 발현조절 기작 규명에 대한 연구에도 큰 진보를 가져올 수 있게 되었다.
둘째, 고등식물의 생리, 생화학적인 기작과 구조유전자와의 관계를 알아보기 위한 방안으로 또한 유용유전자를 클로닝 (cloning) 하기 위하여 여러 가지 식물 형질전환 방법들이 개발되었다.
셋째, 고등식물에서 인터루킨-2 (interleukin-2) 유전자 발현과 생산을 위한 연구의 일환으로, 본 발명자가 그 동안 확립한 감자의 기내 재분화 체계를 토대로 감자의 형질전환을 유도하여 인터루킨-2 (interleukin-2) 단백질을 생산함과 동시에 배양조건의 다양화 및 생육속도 단축, 형질 전환된 변이 세포의 이용 등으로 생산 효율을 높이는데 성공하였으며, 유전공학 기법에 의하여 감자내 인터루킨-2 (interleukin-2) 유전자가 도입되어 형질 전환된 식물체에서 분자생물학적 분석과 유전적 안정성 검증하였다.
넷째, 인터루킨-2 (interleukin-2) 유전자(pSSK-1 벡터)를 감자에서 발현시키고 단백질 생산을 유도하였다. ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) 실험의 결과 형질전환체는 인터루킨-2 (interleukin-2) 단백질을 생산함을 알 수 있었고, 인터루킨-2 (interleukin-2) 의존성 동물세포인 CTLL-2를 이용하여 감자에서 생산한 인터루킨-2 (interleukin-2) 단백질이 어느정도 생체 활성이 있으며 실제 생산되는 양이 어느 정도인지 측정하였다.
다섯째, 인터루킨-2 (interleukin-2) 형질전환체에서 식물 생장을 비교한 결과 대조군인 GUS 형질전환체보다 약 50%까지 증가시키는 결과를 얻게 되었다.

Claims (8)

  1. 인터루킨-2 (interleukin-2) 발현기작 분석을 위한 벡터 제작단계에 있어서,
    pBI121 벡터에서 제한효소인 BamH I 과 Sac I 을 이용감자에서 인간의 인터루킨-2 (interleukin-2) 단백질 생산방법하여 GUS (β-glucuronidase) 유전자 (1.9 kb) 만을 제거한 후, BamH I 부위는 클레나우 절편 (klenow fragment)를 이용하여 엔드 필링 (end filling) 시키고, Sac I 부위는 멍빈 뉴클리에이즈 (mung bean nuclease)를 이용하여 양쪽 부위 모두를 평활 말단 (blunt end)로 만들어 준후,이를 T4 DNA 리가아제 (ligase)를 이용하여 평활 말단 접합 (blunt end ligation) 해 유도된 평활 말단 (blunt end) 부위의 효소부위 (enzyme site)는 BamH I 부위를 갖게 한후,BamH I 부위에 인터루킨-2 (interleukin-2) 유전자를 삽입함을 특징으로하는 감자에서 인간의 인터루킨-2 단백질 생산방법.
  2. 감자의 재분화 조건 확립에 있어서,
    감자의 줄기 절편을 1단계 (stage I) 배지 (0.5 g/L MES, 0.4 mg/L IAA, 2.24 mg/L BAP)에서 이틀간 전배양 (前培養)하고, 외래유전자를 도입시킨 식물 감염균인 아그로박테리움 튜모페이션스 (Agrobacterium tumefaciens)와 감자의 줄기 절편을 10분 동안 공동배양 (共同培養, coculture) 하여 아그로박테리움 (Agro- bacterium)을 감염된 감자의 줄기 절편을 다시 1단계 (stage I) 배지로 옮겨서 3일간 암배양 (暗培養) 한 후, 2단계 (stage II, 50 mg/L kanamycin, 100 mg/L timentin) 배지로 옮겨 10일간 배양후,어린싹 (新草)를 유도하기 위해 3단계 (stage III, 2.24 mg/L BAP, 0.1 mg/L GA) 배지로 옮겨 배양함을 특징으로하는 감자에서 인간의 인터루킨-2 단백질 생산방법.
  3. 제놈 (Genomic) DNA분리에 있어서,
    액체 질소를 이용하여 2 g 의 잎을 마쇄 (磨碎)한 후 6 ml의 우레아 (Urea) 추출액 (0.3 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 20 mM Na2EDTA pH 8.0, 1% sarcosyl, 7 M Urea)을 첨가하여 잘 섞어 상온에서 15분 방치후 원심분리 (5800 rpm/Beckman JA 20.1 rotor, 10 min, 4℃)하고 상증액에 1 ml의 4.4 M 암모니움 아세테이트 (ammonium acetate, pH 5.2)와 7 ml의 이소프로파놀 (isopropanol)을 첨가하여 DNA를 침전시키며, 원심분리하여 DNA 펠렛 (pellet)을 70% 에탄올 (ethanol)로 세척한 다음 트리스이디티에이(TrisEDTA;TE) 완충용액 (pH 8.0)에 녹임을 특징으로 하는 감자에서 인간의 인터루킨-2 단백질 생산방법.
  4. 써던 (Southern) 분석에 있어서,
    형질전환을 유도한 감자로부터 게놈 (genomic) DNA를 분리하여 제한효소로 절단한 후 에티디움 브로마이드 (ethidium bromide)를 첨가한 아가로스 젤 (agarose gel)에서 전기영동 한 다음 젤 (gel)을 자외선에 5분간 노출시키고 변성과정을 거쳐 나이트란 (Nytran) 막에 전이시켜,DNA가 전이된 막을 자외선 교차접합기 (UV crosslinker)에서 고정한 후, 대기 상태에서 건조시키고 전혼성화 (前混成化, prehybridization) 용액 (5X SSPE, 50% formamide, 2% blocking reagent, 0.1% N-laurylsarcosine, 0.02% SDS) 내에서 1 시간 동안 천천히 흔들어 반응시킨 다음 혼성화 (混成化, hybridization) 용액에서 하루 동안 반응시켜 0.1X SSPE로 세척하고 X-선 필름 (X-ray film)에 노출시킴을 특징으로 하는 감자에서 인간의 인터루킨-2 단백질 생산방법.
  5. RNA분리 및 인터루킨-2의 존재유무를 확인하기위한 노던 (Northern) 분석에 있어서,
    식물체를 마쇄하여 5배 (w/v)의 완충용액 (50% guanidine thiocyanate, 0.5% N-laurylsarcosine, 25mM EDTA, 0.1% β- mercaptoethanol)를 넣고 잘 섞은 다음 15분간 원심분리 (15000 rpm, 4℃)한다. 염화세슘 (Cesium chloride) 밀도구배 원심분리에 의하여 RNA를 정제하고 클로로포름/부탄올 (chloroform/butanol, 4:1)로 추출하여 DEPC (Diethyl pyrocarbonate) 처리된 증류수 (H2O)에 용해한 다음 50% 포름알데하이드 (formaldehyde)가 첨가된 아가로스 젤 (agarose gel) 전기영동을 하여 크기에 따라 분리한 후 나이트란 (Nytran) 막에 전이시켜,RNA가 전이된 나이트란 (Nytran) 막의 처리과정, 전혼성화 (前混成化, prehybridization) 그리고 혼성화 (混成化, hybridization) 과정 등은 써던 (Southern) 분석의 방법과 동일하게 함을 특징으로 하는 감자에서 인간의 인터루킨-2 단백질 생산방법.
  6. 엘리샤(ELISA;enzyme-linked immunosorbent assay) 를 이용한 단백질 생산확인에 있어서,
    엘리샤(ELISA) 실험은 제야슬란(Jeyaseelan)의 방법을 이용하여 수행되었으며 첫 번째 항체 (first antibody)는 PBST로 희석된 anti-mouse-anti-inter- leukin-2 이머노글로빈 G(IgG)를 마이크로타이터(microtiter)의 각 웰(well)에 분주한 후, 이차 항체(second antibody)로 알칼라인 포스테이트(Alkaline phos- photate;AP)-conjugated anti-rabbit IgG를 첨가 시켰다. 반응이 진행된 후 흡광도 405nm에서 단백질의 양을 측정함을 특징으로 하는 감자에서 인간의 인터루킨-2 단백질 생산방법.
  7. 생체학적 활성 측정에 있어서,
    생산된 인터루킨-2 (interleukin-2) 단백질이 생체에서 발현되는지 여부를 확인하기 위해서 인터루킨-2 (interleukin-2) 의존성 세포주인 CTLL-2를 실험에 이용하여,CTLL-2 세포주는 인터루킨-2 (interleukin-2)가 생육배지에 적당량 첨가 되었을 때 자랄수 있다는 점을 이용해,인터루킨-2 (interleukin-2) 형질전환체의 대조군과 인터루킨-2 (interleukin-2) 형질전환체의 단백질을 분리한 후 CTLL-2 세포주에 각각 넣은후 배양한후후 인터루킨-2 (interleukin-2) 형질전환체의 단백질이 첨가된 세포주만 살고 있는 것을 확인하고 인터루킨-2 (interleukin-2) 형질전환체 단백질의 활성도를 측정함을 특징으로 하는 감자에서 인간의 인터루킨-2 단백질 생산방법.
  8. 제 1 항 내지 제 2 항을 따르는 방법으로 발현된 인터루킨-2 형질전환체에 의한 감자의 성장촉진용도.
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