KR19990022387A - 사람 시스타틴 e - Google Patents

Abstract

본 발명은 사람 CysE 폴리펩타이드 및 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA(RNA)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 재조합 기술에 의해 이러한 폴리펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 이러한 폴리펩타이드를 이용하여 골다공증, 종양 전이, 미생물 감염, 바이러스 감염, 패혈증성 쇼크, 염증, 망막 관주, 카리에스, 악액질 및 근위축증을 치료하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명에 따라 암호화 서열에서의 돌연변이체 및 숙주로부터 유도된 샘플에서 폴리펩타이드의 농도 변화를 검출하는 진단 방법이 제공된다.

Description

사람 시스타틴 E

본 발명은 새롭게 확인된 폴리뉴클레오타이드, 이러한 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드, 이러한 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 용도 및 이러한 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명의 폴리펩타이드는 사람 시스타틴 E로서 추정에 의해 해독되어 왔으며, 이하 때때로 CysE라 칭한다. 또한, 본 발명은 이러한 폴리펩타이드의 작용을 억제하는 방법에 관한 것이다.

시스테인 상과(上科)는 인체 조직 및 체액에 광범위하게 분포되어 있고, 카텝신 B, H, L 및 S 등의 시스테인 프로테아제와 치밀한 가역 착물을 형성하는 시스테인 프로테아제 억제제 군을 포함한다. 시스타틴류는 아마도 이들 단백질 분해 효소가 관여하는 정상 과정 또는 병리학적 과정의 조절에 연루된다. 따라서, 시스타틴은 단백질 및 펩타이드의 세포내 및 세포외 이화작용에 영향을 미칠 수 있고 (Barret, A.J. 및 Kirchke, H., Methods Enzymol., 80:535-561(1981)), 프로호르몬(Orlowski, M. Mol, Cell. Biochem, 52:49-74(1983)) 및 전효소(Taugner, R., 등, Histochemistry, 83:103-108(1985))의 단백질 분해 과정을 조절할 수 있고, 정상조직을 악성 세포(Sloane, B.F., Semin, Cancer Biol., 1:137-152(1990)) 또는 미생물(Bjorck, L., 등, Lature, 337:385-386(1989) 및 Bjorck, L. 등, L. Virol., 64:941-943(1990))에 의한 침투로부터 보호할 수 있고, 류마티스성 관절염(Mort, J.S., 등, Arthritis Rheum., 27:509-515(1984)) 및 화농성 기관지확장증(Buttle, D.J., 등, Scand. J. Clin. Lab. Invest., 50:509-516(1990))에 있어서 국부 염증의 진행을 조절할 수 있다.

시스타틴 상과는 각각 구조 조직 및 생물학적 분포가 다른 과의 것들과 상이한 구성원을 갖는 과 I, II 및 III(각각 스테핀, 시스타틴 및 키니노겐 과라고도 칭함)으로 세분되어 왔다(Barret, A.J., 등, Biochem. J., 236:312(1986)). 과 I 시스타틴 A 및 B는 디설파이드 브릿지가 없는 약 100개의 아미노산 잔기의 단일 폴리펩타이드 쇄로 구성된 작은 단백질이다. 과 II 시스타틴은 쇄 내부에 2개의 디설파이드 결합을 갖는 약 120개의 아미노산 잔기의 폴리펩타이드 쇄로 이루어져 있다. 마지막으로, 과 III 시스타틴인 키니노겐은 각각 과 II 시스타틴의 것과 동일한 위치에 2개의 디설파이드 브릿지를 갖는 3개의 과 II 시스타틴 유사 영역의 존재를 특징으로 하는 고도의 구조적 복잡성을 나타낸다(Muller-Esterl, W. 등, Transbiochem. Sci., 11:336-339(1986)). 과 I 및 과 II 시스타틴은 주로 세포내 및 분비액에 존재하는 반면(Abrahamson, M. 등., J. Biol, Chem., 261:11282-11289(1986)), 키니노겐은 혈장에 고도로 농축되어 있다(Adam, A., 등, Clin, Chem., 31:423-426(1985)).

시스타틴 C로 나타낸 최소한 1가지 유형의 II 시스타틴은 모든 조직에서 현되는 것으로 나타났다(Abrahamson, M., 등, Biochem. J., 268:287-294(1990)). 이와 대조적으로 S-타입 시스타틴은 타액 중에서 주로 발견된다(Abrahamson, M., 등, J. Biol, Chem., 261:11282-11289(1986)). 시스타틴 및 유도체 펩타이드는 환경에 직접적으로 노출된 상피 표면을 씻어내는 분비액 중의 그들의 존재와 일치하는 항세균성 활성 및 항비루스성 활성(Bjorck, 등 (1989, 1990))을 갖는다. 시스타틴은 면역 반응을 조절할 수도 있다. 이러한 현상은 마크로파지에 의해 시스테인 프로테아제 방출을 억제함으로써 직접적으로 발생할 수 있고(Bieth, J., Cysteine Proteinases and Their Inhibitors, V. Turk, ed. (Walter De Gruyter Company, New York) 제693-703(1986)), 또는 세포들의 화학 주성 반응 및 세포의 식균 작용-관련 호흡기 파열을 억제함으로써 간접적으로 발생할 수 있다(Leung-Tack, 등, Biol. Chem., 371:255-258(1990)). 이러한 테이터는 과 II 시스타틴이 상피에서 여러가지 보호 기능을 수행할 수 있음을 제안한다. 사람 타입 II 시스타틴 유전자 과는 최소한 7개의 구성원으로 이루어져 있다.

질병 유전성 시스타틴 C 아밀로이드 혈관증(HCCAA)은 시스타틴 C를 암호화한 유전자에서 Glu → Leu 돌연변이에 연관된다. 이는 뇌동맥에서 이러한 돌연변이체 시스타틴 C로 구성된 아밀로이드 원섬유의 침착을 유도하고, 치명적인 출혈을 유발하는 것으로 보인다(Ghiso, J. 등, PNAS. USA, 83:2974-2978(1986)).

본 발명의 폴리펩타이드는 시스타틴 C에 대한 아미노산 서열 상동성과 결과인 CysE로서 추정 해독되어 왔다. 이러한 해독은 아미노산 서열 상동성의 결과로서 이루어져 왔다.

본 발명의 일면에 따라, 새로운 성숙한 폴리펩타이드 뿐만 아니라 그의 생물학적으로 활성이고 진단학적으로 또는 치료학적으로 유용한 단편, 동족체 및 유도체가 제공된다. 본 발명의 폴리펩타이드는 인체에 기원한다.

본 발명의 다른 일면에 따라, mRNA, DNA, cDNA, 게놈 DNA를 포함하여 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 분리된 핵산 분자 뿐만 아니라 그의 동족체 및 생물학적으로 활성이고, 진단학적으로 또는 치료학적으로 유용한 단편이 제공된다.

본 발명의 또 다른 일면에 따라, 재조합 원핵 및(또는) 진핵 숙주 세포를 배양하는 단계, 상기 단백질의 발현 및 상기 단백질의 후속하는 회수를 촉진시키는 조건하에 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 사람 핵산 서열을 함유시키는 단계를 포함하는 재조합 기술에 의해 이러한 폴리펩타이드를 제조하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 일면에 따라, 치료 목적으로 예를 들면 카텝신을 억제시켜 골다공증, 종양 전이, 바이러스 복제, 염증, 화농성 기관지확장증을 예방하고, 망막을 보호하고, 백질뇌염을 예방하고, 카리에스를 감소시키고, 알레르기 반응을 치료하고, 악액질 및 근위축증을 치료하고, 유전분증을 예방하기 위해서 및 살균제로서 이러한 폴리펩타이드, 이러한 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 이용하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 일면에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 핵산 서열을 특이적으로 하이브리드화시키기에 충분한 길이의 핵산 분자를 포함하는 핵산 프로브가 제공된다.

본 발명의 또 다른 일면에 따라, 이러한 폴리펩타이드에 대한 항체가 제공된다.

본 발명의 또 다른 일면에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 핵산 서열에서 돌연 변이와 관련된 질병 또는 그 질병에 대한 민감성을 검출하기 위한 진단 분석물이 제공된다.

본 발명의 또 다른 일면에 따라 과학적 연구와 관련된 시험관내 목적상, 예를 들면 DNA의 합성 및 DNA 벡터의 제조의 목적상 이러한 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드를 이용하는 방법이 제공된다.

본 발명의 이들 일면 및 다른 일면은 본 명세서의 내용으로부터 당업계의 숙련자들에게 명백할 것이다.

하기 도면은 본 발명의 실시예를 예시하고, 특허 청구의 범위에 의해 포함된 바의 본 발명의 범위를 제한시키고자 하는 것이 아니다.

도 1 은 본 발명의 폴리펩타이드의 cDNA 및 상응하는 추정된 아미노산 서열을 나타낸다. 아미노산에 대한 표준 1문자 약자가 사용되었다. 서열화는 373 자동화된 DNA 시퀀서(Applied Biosystems, Inc.)를 사용하여 수행한다.

도 2 는 본 발명의 폴리펩타이드(맨 윗줄)와 사람 시스타틴 C(맨 아랫줄) 사이의 아미노산 서열의 상동성을 나타낸다.

본 발명의 일면에 따라, 도 1의 추정된 아미노산 서열을 갖는 성숙한 폴리펩타이드(서열 2) 또는 1995년 3월 20일자 ACTT 기탁 번호 제97103호로서 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩타이드를 암호화하는 단리된 핵산(폴리뉴클레오타이드)을 제공한다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 원시 배양 양막 세포로부터 유도된 cDNA 라이브러리에서 밝혀졌다. 이 폴리뉴클레오타이드는 시스타틴 II 상과의 구조적으로 관련된다. 이는 성숙한 단백질이 120개의 아미노산을 포함하도록 대략적으로 제 1의 28 아미노산 잔기가 추정되는 리더 서열인 경우의 148 아미노산 잔기의 단백질을 암호화한 개방된 리딩 프레임을 포함한다. 단백질은 147 아미노산 스트레치에 비해 33.566%의 상동성 및 53.846%의 유사성을 갖는 사람 시스타틴 C와 최고의 상동성을 나타낸다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 DNA가 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 DNA를 포함하는 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있다. DNA는 이본쇄 또는 일본쇄일 수 있고, 일본쇄는 암호화 쇄이거나 또는 암호화되지 않은 (안티-센스) 쇄일 수 있다. 성숙한 폴리뉴클레오타이드를 암호화한 암호화 서열은 도 1에 나타낸 암호화 서열(서열 1) 또는 기탁된 클론의 서열과 동일할 수 있거나, 또는 유전자 코드의 중복 또는 퇴화의 결과로서 암호화 서열이 도 1의 DNA(서열 1) 또는 기탁된 cDNA와 동일한 성숙한 폴리펩타이드를 암호화한 상이한 암호화 서열일 수 있다.

도 1의 성숙한 폴리펩타이드(서열 2)에 대해 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드는 성숙한 폴리펩타이드에 대한 유일한 암호화 서열; 성숙한 폴리펩타이드 및 추가의 암호화 서열, 예를 들면 리더 서열 또는 전구 단백질 서열에 대한 암호화 서열; 성숙한 폴리펩타이드(및 임의의 추가 암호화 서열) 및 암호화되지 않은 서열, 예를 들면 인트론 또는 성숙한 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열의 암호화되지 않은 서열 5' 및 (또는) 3'을 포함할 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다.

따라서, 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드라는 용어는 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열만을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 뿐만 아니라 추가의 암호화 서열 및 (또는) 암호화되지 않은 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.

또한, 본 발명은 도 1의 추정된 아미노산 서열(서열 2)을 갖는 폴리펩타이드 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 단편, 동족체 및 유도체에 대해 암호화한 상기 여러가지 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 폴리뉴클레오타이드의 변이체는 폴리뉴클레오타이드의 자연적으로 발생하는 대립 유전성 변이체 또는 폴리뉴클레오타이드의 자연적으로 발생하지 않는 변이체일 수 있다.

따라서, 본 발명은 도 1에 나타낸 바와 동일한 성숙한 폴리펩타이드(서열 2) 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 동일한 성숙 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드 뿐만 아니라 그이 변이체가 도 1의 폴리펩타이드(서열 2) 또는 기탁된 클론의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 단편, 유도체 또는 동족체에 대해 암호화한 폴리뉴클레오타이드의 변이체를 포함한다. 이러한 뉴클레오타이드 변이체는 결실 변이체, 치환 변이체 및 추가 또는 부가 변이체를 포함한다.

상기한 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드는 도 1에 나타낸 암호화 서열(서열 1) 또는 기탁된 클론의 암호화 서열의 자연적으로 발생하는 대립 유전자 변이체인 암호화 서열을 가질 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 대립 유전자 변이체는 1개 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실 또는 부가될 수 있고, 암호화된 폴리펩타이드의 기능을 실질적으로 변경시키지 않는 폴리뉴클레오타이드 서열의 대체 형태이다.

본 발명은 성숙한 폴리펩타이드에 대한 암호화 서열이 숙주 세포로부터 폴리펩타이드의 발현 및 분비를 보조하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들면 세로포부터 폴리펩타이드의 수송을 조절하기 위한 분비 서열로서 작용하는 리더 서열과 동일한 리딩 프레임에 융합할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 역시 포함한다. 리더 서열을 갖는 폴리펩타이드는 프리 단백질이고, 폴리펩타이드의 성숙한 형태를 형성하기 위해 숙주 세포에 의해 절단되는 리더 서열을 가질 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 성숙한 단백질 + 추가의 5' 아미노산 잔기인 프로 단백질에 대해 암호화할 수도 있다. 프로서열을 갖는 성숙한 단백질이 프로 단백질이고, 단백질의 불활성 형태이다. 일단 프로서열이 분열되면, 활성인 단백질이 남겨진다.

따라서, 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 성숙한 단백질에 대해 또는 프로서열을 갖는 단백질에 대해 또는 프로서열 및 프리서열(리더 서열)를 모두 갖는 단백질에 대해 암호화할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리펩타이드의 정제를 허용하는 마커 서열에 대해 프레임 중에 융합된 암호화 서열을 가질 수도 있다. 마커 서열은 세균 숙주의 경우에 마커에 융합된 성숙한 폴리펩타이드의 정제를 위해 제공되는 pQE-9 벡터에 의해 공급된 헥사-히스티딘 택일 수 있거나, 또는 예를 들면, 마커 서열은 포유동물 숙주, 예를 들면 COS-7 세포가 사용될 때 헤마글루티닌(HA) 택일 수 있다. HA 택은 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프(epitop)에 대응한다(Wilson, I. 등, Cell, 37:767(1984)).

유전자라는 용어는 폴리펩타이드 쇄를 생산하는데 연루된 DNA의 세그먼트를 의미하고, 이는 암호화 영역에 선행하는 영역 및 후행하는 영역(리더 및 트레일러) 뿐만 아니라 개개의 암호화 세그먼트들(엑손) 사이에 개재되는 서열(인트론)을 포함한다.

전체 길이의 CysE 유전자의 단편은 전체 길이의 CysE 유전자를 분리시키기 위해서 및 CysE 유전자에 대한 고도의 서열 유사성 또는 유사한 생물학적 활성을 갖는 다른 유전자를 분리시키기 위한 cDNA 라이브러리에 대한 하이브리드화 프로브로서 사용될 수 있다. 이러한 유형의 프로브는 최소한 30개의 염기를 갖는 것이 바람직하고, 예를 들면 50개 이상의 염기를 함유할 수 있다. 이 프로브는 전체 길이 전사에 대응하는 cDNA 클론 및 조절 영역 및 프로모터 영역, 엑손 및 인트론을 포함하는 완전한 CysE 유전자를 함유하는 게놈 클론(들)을 해독하기 위해 사용될 수도 있다. 스크린의 예는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 합성하기 위해 공지된 DNA 서열을 사용함으로써 CysE 유전자의 암호화 영역을 분리시키는 것을 포함한다. 본 발명의 유전자 서열과 상보적인 서열을 갖는 표식된 올리고뉴클레오타이드는 라이브러리의 어떤 구성원에 프로브가 하이브리드화되는지를 위해 사람 cDNA, 게놈 DNA 또는 mRNA의 라이브러리를 스크린하는데 사용된다.

또한, 본 발명은 서열들 간의 상동성이 최소한 70%, 바람직하게는 최소한 90%, 보다 바람직하게는 최소한 95%인 경우 상기 서열에 혼성화되는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 발명은 특히 엄격한 조건하에 상기 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화되는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 본 명세서 사용된 엄격한 조건이라는 용어는 서열들의 상동성이 최소한 95%, 바람직하게는 최소한 97%인 경우에만 하이브리드화가 발생할 수 있음을 의미한다. 바람직한 양태에서 상기 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화된 폴리뉴클레오타이드는 도 1의 cDNA(서열 1) 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 성숙한 폴리펩타이드와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 실질적으로 보유하는 폴리펩타이드를 암호화한다.

대안으로, 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화되는 최소한 20개의 염기, 바람직하게는 30개의 염기, 보다 바람직하게는 최소한 50개의 염기를 가질 수 있고, 상기한 바와 같이 그에 대한 상동성을 갖고, 활성을 보유하거나 또는 보유하지 않을 수 있다. 예를 들면, 이러한 폴리뉴클레오타이드는 서열 1의 폴리뉴클레오타이드를 위한 프로브로서, 예를 들면 폴리뉴클레오타이드의 회수를 위한 프로브로서 또는 진단 프로브로서 또는 PCR 프로브로서 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 서열 2의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 대해 최소한 70%의 상동성, 바람직하게는 최소한 90% 및 보다 바람직하게는 최소한 95%의 상동성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 뿐만 아니라 그의 단편이 최소한 30개의 염기 및 바람직하게는 최소한 50개의 염기를 갖는 단편 및 그러한 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 관한 것이다.

본 명세서에 언급된 기탁물(들)은 특허 절차의 목적상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약하에 유지될 것이다. 이들 기탁물들은 당업계의 숙련자들에게 단지 편의상 제공되고, 기탁이 35 U.S.D. §112 하에 요구되는 것을 승인하지 않는다. 기탁된 물질에 함유된 폴리뉴클레오타이드이 서열 뿐만 아니라 그에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 본 명세서에 참고로 기재하며, 여기서 서열에 대한 임의의 설명과 모순되는 경우를 조절한다. 기탁된 물질을 제조, 사용 또는 판매하기 위해서는 인가서가 필요하고, 이로써 그러한 인가서는 승인받지 못한다.

또한, 본 발명은 도 1의 추론된 아미노산 서열(서열 2)을 갖거나 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 아미노산 서열을 갖는 CysE 폴리펩타이드 뿐만 아니라 그러한 폴리펩타이드의 단편, 동족체 및 유도체에 관한 것이다.

도 1의 폴리펩타이드(서열 2) 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 관하여 언급할 때 단편, 유도체, 및 동족체라는 용어는 그러한 폴리펩타이드와 동일한 생물학적 기능 또는 활성을 필연적으로 보유한 폴리펩타이드를 의미한다. 따라서, 동족체는 활성인 성숙한 폴리펩타이드를 제조하기 위해 프로 단백질 부분을 절단시킴으로써 활성화될 수 있는 프로 단백질을 포함한다.

본 발명의 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드, 천연 폴리펩타이드 또는 합성 폴리펩타이드일 수 있고, 바람직하게는 재조합 폴리펩타이드일 수 있다.

도 1의 폴리펩타이드(서열 2) 또는 기탁된 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 단편, 유도체 또는 동족체 (i) 1개 이상의 아미노산 잔기가 보존된 아미노산 잔기 또는 보존되지 않은 아미노산 잔기(바람직하게는 보존된 아미노산 잔기)로 치환된 것들 중의 하나이고, 이와 같이 치환된 아미노산 잔기는 유전자 코드로 암호화된 것이거나 또는 암호화되지 않을 수 있거나, 또는 (ii) 1개 이상의 아미노산 잔기가 치환기를 포함하는 것들 중의 하나이거나, 또는 (iii) 성숙한 폴리펩타이드가 폴리펩타이드의 반감기를 증가시키는 화합물(예를 들면, 폴리에틸렌 글리콜)과 같은 다른 화합물과 융합될 수 있는 것들 중의 하나이거나, 또는 (iv) 추가의 아미노산이 리더 또는 분비 서열 또는 성숙한 폴리펩타이드 또는 프로 단백질 서열의 정제를 위해 사용된 서열 등의 성숙한 폴리펩타이드에 융합된 것들 중의 하나일 수 있다. 이러한 단편, 유도체 및 동족체는 본 발명의 내용으로부터 당업자들이 알 수 있는 것들이다.

본 발명의 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 바람직하게는 분리된 형태로 제공되고, 상동성을 위해 정제되는 것이 바람직하다.

분리된이라는 용어는 물질이 그의 원시 환경(예, 그것이 자연적으로 발생하는 경우 자연 환경)으로부터 제거되는 것을 의미한다. 예를 들면, 살아있는 동물에 존재하는 자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 분리되지 않지만, 자연계에 공존하는 일부 물질 또는 모든 물질로부터 분리되는 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 분리된다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 벡터의 일부일 수 있고(있거나) 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드는 조성물의 일부일 수 있으며, 그러한 벡터 또는 조성물이 자연 환경의 일부가 아닌 경우에 여전히 분리될 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 서열 2의 폴리펩타이드(특히 성숙한 폴리펩타이드) 뿐만 아니라 서열 2의 폴리펩타이드와 최소한 70%의 유사성(바람직하게는 최소한 70%의 상동성)을 갖고, 보다 바람직하게는 서열 2의 폴리펩타이드와 최소한 90%의 유사성(보다 바람직하게는 최소한 90%의 상동성)을 가지며, 특히 바람직하게는 서열 2의 폴리펩타이드와 최소한 95%의 유사성(특히 바람직하게는 최소한 95%의 상동성)을 갖고, 폴리펩타이드의 그러한 부분이 일반적으로 최소한 30개의 아미노산, 보다 바람직하게는 최소한 50개의 아미노산을 함유하는 폴리펩타이드 부분을 포함한다.

당업계에 알려진 바와 같이, 2개의 폴리펩타이드들 간의 유사성은 아미노산 서열 및 1개의 폴리펩타이드의 보존된 아미노산 치환체를 제 2 폴리펩타이드이 서열과 비교함으로써 측정된다.

본 발명의 폴리펩타이드의 단편 또는 부분들은 펩타이드 합성에 의해 상응하는 전체 길이의 폴리펩타이드를 제조하기 위해 사용될 수 있고; 따라서, 단편들은 전체 길이 폴리펩타이드를 제조하기 위한 중간체로서 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 단편 또는 일부는 본 발명의 전체 길이 폴리뉴클레오타이드를 합성하기 위해 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명이 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 본 발명의 벡터를 사용하여 유전자 공학에 의해 처리된 숙주 세포 및 제조합 기술에 의한 본 발명의 폴리펩타이드의 제조 방법에 관한 것이다.

숙주 세포들은 예를 들면 클로닝 벡터 또는 발현 벡터일 수 있는 본 발명의 벡터에 의해 유전 공학적으로 처리(형질도입 또는 형질전환 또는 형질감염)된다. 벡터는 예를 들면 플라스미드, 바이러스 입자, 파지 등일 수 있다. 처리된 숙주 세포는 프로모터를 활성화시키고, 형질전환체를 선별하거나 또는 CysE 유전자를 증식시키기에 적절하게 변형된 통상의 영양 배지 중에서 배양될 수 있다. 온도, pH 등의 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포와 함께 이미 사용된 것이고, 이는 통상의 기술을 가진 자들에게 명백할 것이다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 재조합 기술에 의해 폴리펩타이드를 제조하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들면 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드를 발현시키기 위한 여러 가지 발현 벡터들 중의 하나에 포함될 수 있다. 이러한 벡터들의 예로는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열, 예를 들면 SV40의 유도체; 세균성 플라스미드; 파지 DNA; 바쿨로바이러스; 효모 플라스미드; 플라스미드 및 파지 DNA, 바이러스성 DNA, 예를 들면 종두 바이러스, 아데노바이러스, 계두 바이러스 및 위광견병 바이러스의 조합으로부터 유도된 벡터를 들 수 있다. 그러나, 임의의 벡터가 숙주에서 복제될 수 있고, 생존할 수 있는 한 사용될 수 있다.

적절한 DNA 서열은 여러 가지 방법에 의해 벡터에 삽입될 수 있다. 일반적으로, DNA 서열은 당업계에 공지된 방법에 의해 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들)에 삽입된다. 이러한 방법 및 다른 방법들은 당업계의 숙련자들의 연구 범위에 속한다.

발현 벡터의 DNA 서열은 mRNA 합성에 직접적으로 관련된 적절한 발현 조절 서열(들)(프로모터)에 효과적으로 연결된다. 이러한 프로모터의 대표적인 예로써, LTR 또는 SV40 프로모터, 이. 콜라이 lac 또는 trp, 파지, λ P_L프로모터 및 원핵 세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스에서 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 기타 프로모터를 들 수 있다. 발현 벡터는 해독 개시 및 전사 터미네이터를 위한 리보솜 결합 부위를 역시 함유한다. 이 벡터는 발현을 증식시키기에 적절한 서열을 포함할 수도 있다.

또한, 발현 벡터는 형질전환된 숙주 세포의 선별을 위한 표현형 특징, 예를 들면 진핵 세포 배양을 위한 디하이드로폴레이트 환원 효소 또는 네오마이신 내성, 또는 이. 콜라이에서 테트라사이클린 또는 암피실린 내성을 제공하기 위해 1개 이상의 선별가능한 마커 유전자를 함유하는 것이 바람직하다.

상기한 바와 같이 적절한 DNA 서열을 함유하는 벡터 및 적절한 프로모터 또는 조절 서열을 사용하여 숙주가 단백질을 발현시키도록 적절한 숙주를 형질전환시킬 수 있다.

적절한 숙주의 대표적인 예로써, 세균 세포, 예를 들면 이. 콜라이, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium); 진균 세포, 예를 들면 효모; 곤충 세포, 예를 들면 드로소필라(Drosophila) S2 및 스포돕테라(Spodoptera) 9SF; 동물 세포, 예를 들면 CHO, COS 또는 Bowes 흑색종; 아데노바이러스; 식물 세포 등을 들 수 있다. 적절한 숙주의 선택은 본 발명의 내용으로부터 당업계의 숙련자들의 연구 범위에 속한다.

보다 바람직하게는, 본 발명은 상기한 바와 같은 1개 이상의 서열을 포함하는 재조합 작제물을 역시 포함한다. 이 작제물은 플라스미드 또는 바이러스성 벡터 등의 벡터를 본 발명의 서열이 삽입되어 있는 곳으로 순방향 또는 역방향으로 포함한다. 본 실시예의 바람직한 면에 있어서, 이 구조물은 예를 들면 서열에 효율적으로 연결된 프로모터를 포함하는 조절 서열을 포함한다. 많은 수의 적절한 벡터 및 프로모터가 당업계의 숙련자들에게 공지되어 있으며, 시판되고 있다. 하기 벡터들, 예를 들면 세균성; pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pd10, 파지스크립, psix174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A(Stratagen); ptrc 99a, pKK223-3, pKK233-3, pPR540, pRIT5(Pharmacia); 진핵세포성: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG(Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL(Pharmacia)이 제공된다. 그러나, 임의의 기타 플라스미드 또는 벡터는 이들이 숙주에서 복제 가능하고, 생존할 수 있는 한 사용될 수 있다.

프로모터 영역은 선별 가능한 마커를 갖는 CAT(클로람페니콜 트랜스퍼라제) 벡터 또는 다른 벡터를 사용하는 임의의 바람직한 유전자로부터 선택될 수 있다. 2개의 적절한 벡터들은 pKK232-8 및 pCM7이다. 특별한 명칭의 세균성 프로모터의 예로는 lacI, lacZ, T3, T7, gpt, λ Pr, P_L및 trp를 들 수 있다. 진핵 세포성 프로모터의 예로는 초기 CMV, HSV 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터 얻은 LTR 및 마우스 마탈로티오네인-I을 들 수 있다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 당업계의 통상의 기술을 가진 자들의 수준에서 용이하다.

다른 양태에서, 본 발명은 상기 작제물을 함유하는 숙주 세포에 관한 것이다. 숙주 세포는 포유 동물 세포 등의 고등 진핵 세포 또는 효모 세포 등의 하등 원핵 세포일 수 있거나, 또는 숙주 세포는 세균 세포 등의 진핵 세포일 수 있다. 숙주 세포에 작제물을 도입하는 것은 인산 칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 또는 전기 천공(Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology, (1986))에 의해 실행될 수 있다.

숙주 세포중의 작제물은 재조합 서열에 의해 암호화된 유전자 생성물을 생산하기 위해 종래의 방식으로 사용될 수 있다. 대안으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 종래의 펩타이드 합성기에 의해 생산할 수 있다.

성숙한 단백질은 적절한 프로모터의 조절하에 포유 동물 세포, 효모, 세균 또는 다른 세포에서 발현시킬 수 있다. 무세포 해독 시스템 역시 본 발명의 DNA 작제물로부터 유도된 RNA를 사용하여 이와 같은 단백질을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 원핵 세포 숙주 및 진핵 세포 숙주와 함께 사용하기 위한 발현 벡터 및 적절한 클로닝은 문헌[Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)]에 기재되어 있으며, 이를 참고 문헌으로 본 명세서에 기재한다.

고등 진핵 세포에 의해 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 DNA의 전사는 벡터에 인핸서 서열을 삽입함으로써 증가된다. 인핸서는 그의 전사를 증가시키기 위해 프로모터 상에 작용하는 통상 약 10 내지 300 bp의 DNA의 cis-작용 요소이다. 그 예로는 복제 기원 bp 100 내지 270의 측면 상의 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기원의 측면 상의 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 들 수 있다.

일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 기원 및 숙주 세포를 형질전환시키는 선별가능한 마커, 예를 들면 이. 콜라이의 암피실린 내성 유전자 및 에스. 세레비지아에 TRP1 유전자, 및 하부 구조 서열의 전사를 유도하기 위해 고도로 발현된 유전자로부터 유도된 프로모터를 포함할 것이다. 이러한 프로모터는 무엇보다도 3-포스포글리세레이트 키나제(PGK), α-인자, 산 포스파타제 또는 가열 쇼크 단백질과 같은 글리콜계 효소를 암호화한 오페론으로부터 유도될 수 있다. 이형의 구조 서열은 해독 개시 서열 및 종결 서열, 및 바람직하게는 해독된 단백질을 플라스미드 주변 공간 또는 세포의 배지로 직접적으로 분비할 수 있는 리더 서열을 갖는 적절한 위상으로 어셈블된다. 임의로, 이형의 서열은 바람직한 특성, 예를 들면 발현된 재조합 생성물의 안정화 또는 단순화된 정제를 부여하는 N-말단 해독 펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 암호화할 수 있다.

세균에 사용하기 유용한 발현 벡터는 기능성 프로모터에 의해 작동될 수 있는 리딩상으로 적절한 해독 개시 및 종결 시그날과 함께 목적하는 단백질을 암호화한 구조 DNA 서열을 삽입함으로써 작제된다. 이 벡터는 벡터를 유지하기 위한 복제 기원 및 1개 이상의 표현형 선별가능한 마커를 포함할 수 있고, 필요한 경우, 숙주내에 증식을 제공할 것이다. 형질전환을 위해 적절한 원핵 세포 숙주로는 이. 콜라이, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 및 슈도모나스, 스트렙토마이세스 및 스타필로코쿠스 종에 속하는 여러 종을 들 수 있지만, 다른 숙주가 선택에 따라 사용될 수도 있다.

비제한적인 대표적 예로써, 세균에 사용하기에 유용한 발현 벡터는 공지된 클로닝 벡터 pBR322(ATCC 37017)의 유전자 요소를 포함하는 시판중인 플라스미드로 부터 유도된 세균성 복제 기원 및 선별가능한 마커를 포함할 수 있다. 이러한 시판 벡터의예로는 pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) 및 GEM1(Promega Biotec, Madison, WI, USA)을 들 수 있다. 이들 pBR322 본쇄 부분은 적절한 프로모터 및 발현될 구조 서열과 조합된다.

적절한 숙주 균주가 형질전환되고, 숙주 균주가 적절한 세포 밀도로 성장한 후, 선택된 프로모터는 적절한 수단(예, 온도 이동 및 화학적 유도)에 의해 유도되고, 세포들은 추가의 기간 동안 배양된다.

세포들은 원심 분리에 의해 전형적으로 수거되고, 물리적 또는 화학적 수단에 의해 분쇄되고, 얻어진 조악한 추출물이 추가의 정제를 위해 유지된다.

단백질의 발현에 사용된 미생물 세포들은 동결 융해 사이클링, 초음파 분해, 기계적 분쇄, 또는 세포 분해제의 사용을 포함하는 임의의 편리한 방법에 의해 분쇄될 수 있다. 이러한 방법들은 당업게의 숙련자들에게 잘 알려져 있다.

여러 가지 포유 동물 세포 배양 시스템은 재조합 단백질을 발현시키기 위해 사용될 수도 있다. 포유 동물의 발현계의 예로는 문헌[Gluzman, Cell, 23:175(1981)]에 기재된 원숭이 신장 섬유아세포의 COS-7 세포주 및 양립할 수 있는 벡터, 예를 들면 C127, 3T3, CHO, HeLa 및 BHK 세포주를 발현시킬 수 있는 다른 세포주를 들 수 있다. 포유 동물 발현 벡터는 복제 기원; 적한 프로모터 및 인핸서 및 임의의 필요한 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 스플라이스 공여체 및 수용체 부위, 전사 종결 서열 및 5' 플랭킹 비전사 서열을 포함할 것이다. SV40 스플라이스로부터 유도된 DNA 서열 및 폴리아데닐화 부위는 요구되는 비전사 유전자 요소를 제공하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 황산 암모늄 또는 에탄올 침전법, 산 추출법, 음 이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용성 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 하이드록실애퍼타이트 크로마토그래피 및 렉틴 크로마토그래피 등의 방법에 의해 재조합 세포 배양액으로부터 회수 및 정제될 수 있다. 단백질 리폴딩 단계가 필요할 경우 성숙한 단백질의 원심 분리를 완료하는데 사용될 수 있다. 마지막으로, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 최종 정제 단계에 사용될 수 있다.

본 발명의 폴리펩타이드는 자연적으로 정제된 생성물 또는 화학적 합성 방법의 생성물일 수 있거나, 또는 원핵 세포 숙주 또는 진핵 세포 숙주(예 : 배양액 중의 세균, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유 동물 세포)로부터 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 재조합 생산 방법에 사용된 숙주 세포에 따라, 본 발명의 폴리펩타이드는 글리코실화될 수 있거나 또는 글리코실화되지 않을 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 초기 메티오닌 아미노산 잔기를 포함할 수도 있다.

본 발명의 CysE 폴리펩타이드는 사람 카텝신 효소를 억제하기 위해 사용될 수 있고, 생성된 병인은 이들 카텝신의 작용과 관련된다. 예를 들면, CysE는 골다공증, 베체트병, 과칼슘혈증, 골연화증, 알레르기성 피부병, 알레르기성 비염 및 알레르기성 자반병을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

카텝신이 종양의 전이에 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 생각되며, 따라서, CysE는 종양 전이를 방지하기 위해 사용될 수 있다.

CysE 폴리펩타이드는 특정 미생물제, 예를 들면 스트렙토코콕시의 생장을 중지시키고, 카리에스에 기인하는 산의 생산을 감소시킴으로써 치아의 카리에스를 감소시키는 살균제로서 사용될 수 있다.

CysE 폴리펩타이드는 바이러스에 의해 유발된 감염을 치료하기 위해, 예를 들면 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV)의 복제를 방지하기 위해 항바이러스제로서 사용될 수도 있다. CysE 폴리펩타이드는 시스테인 단백질 분해효소에 의한 공격으로부터 망막을 보호하기 위해 사용될 수도 있다.

본 발명의 CysE 폴리펩타이드는 시스테인 단백질 분해효소의 작용을 방지함으로써 악액질 및 근위축증을 치료하기 위해 사용될 수도 있다.

CysE 폴리펩타이드는 염증, 예를 들면 류머티스성 관절염과 연관된 염증을 변형시키고, 패혈증성 쇼크를 치료하기 위해 사용될 수도 있다. CysE 폴리펩타이드는 화농성 기관지확장증을 치료하기 위해 사용될 수도 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드는 사람 질병에 대한 치료제 또는 진단제를 발견하기 위한 연구 시약 및 물질로서 사용될 수 있다.

본 발명은 시스타틴 E 폴리펩타이드를 위한 수용기의 확인 방법을 제공한다. 이 수용체를 암호화한 유전자는 당업계의 숙련자들에게 공지된 많은 방법, 예를 들면 리간드 패닝 및 FACS 소팅에 의해 해독될 수 있다[참조 : Coligan, Current Protocols in Immun., 1(2), 5 (1991)]. 바람직하게는, 발현 클로닝은 폴리아데닐화된 RNA가 시스타틴 E 폴리펩타이드에 반응성인 세포로부터 제조되는 경우에 사용될 수 있고, 이러한 RNA로부터 생성된 cDNA 라이브러리는 푸울로 분할되어 시스타틴 E 폴리펩타이드에 반응성이 아닌 COS 세포 또는 다른 세포들을 형질감염시키기 위해 사용된다. 유리 슬라이드 상에서 생장한 형질감염된 세포들은 표지된 시스타틴 E 폴리펩타이드에 노출된다. 시스타틴 E 폴리펩타이드는 부위-특이적 단백질 카나제에 대한 인식 부위의 폐색 또는 요요드화를 포함하는 각종 수단에 의해 표지될 수 있다. 슬라이드들은 고정 및 항온처리한 후, 자동 방사선 사진 분석을 시행한다. 양성의 푸울이 해독되고, 서브-푸울이 제조되고, 반복적인 서브-푸울링 및 리스크리닝 방법을 사용함으로써 다시 형질감염되고, 결과적으로 추정되는 수용체를 암호화한 단일 클론을 생성한다. 수용체를 해독하는 다른 시도로서, 표지된 리간드는 세포막에 광친화적으로 연결되거나 또는 수용체 모듈을 발현시키는 제제를 추출할 수 있다. 가교 결합된 물질은 PAGE에 의해 분해되고, X-선 필름에 노출된다. 리간드-수용체를 함유하는 표지된 착물이 절단되고, 펩타이드 단편으로 분해되고, 단백질 마이크로서열화된다. 마이크로서열화로 얻어진 아미노산 서열은 추정되는 수용체를 암호화한 유전자를 해독하는 cDNA 라이브러리를 스크린하기 위한 세트의 변성 올리고뉴클레오타이드 프로브를 설계하는데 사용될 수 있다.

본 발명은 시스타틴 E 수용체에 결합되고, 그로부터 제 2 메신저 반응을 유도하는 것을 해독하기 위한 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. 예를 들면, 시스타틴 E 수용체를 발현하는 포유동물 세포 또는 막 제제는 스크리닝될 화합물의 존재하에 항온처리된다. 화합물과 수용체의 상호 작용에 따른 공지된 제 2 메신저 시스템의 반응이 측정되고, 시스타틴 E에 의해 유도된 제 2 메신저 반응과 비교된다. 이러한 제 2 메신저 시스템은 cAMP 구아닐레이트 사이클라제, 이온 채널 또는 포스포이노시티드 가수분해를 포함하지만, 이들로만 제한되지는 않는다.

본 발명의 폴리펩타이드 및 효능제 화합물은 시스테인 단백질 분해효소 활성을 억제하는 능력에 대해 분석될 수 있고, 그의 분석은 100M 인산나트륨 완충액 중의 기질로서 10 μM Z-Phe-Arg-NHMec에 의한 연속적인 속도 분석에 의해 파파인 및 사람 카텝신 B와 시스타틴 E 착물의 평형 해리 상수(K₁)를 측정하는 단계를 포함한다(Nicklin, M.J.H., Barrett, A.J., Biochem. J., 223:245-253(1984)). 이 완충액은 1mM 디티오트레이톨 및 2mM EDTA를 함유하고, 파파인 분석을 위해 pH6.5로 조정되고, 카텝신 B 분석을 위해 pH6.0으로 조정된다. 카텝신 B는 사용 전에 실온에서 분석 완충액 속에서 20분 동안 미리 항온처리된다. 분석에서 효소 농도는 0.05-0.25 nM이다. 카텝신 B 분석에서 시도된 가장 높은 시스타틴 E 농도는 100nM이었다. 유익한 억제를 제공하는, 즉 억제제의 첨가 후 1시간 내에 새로운 정상 상태 속도를 초래하는 억제제 농도는 파파인 분석에서 20-50 nM이다. 37℃에서 기질 가수분해는 퍼킨-엘머 Cetus LS50 형광측정기에서 360 및 460 nm의 여기 파장 및 방출 파장 각각에서 모니터한다. 이러한 분석시에 Z-Phe-Arg-NHMec의 가수분해를 위한 K_m값은 하기 수학식에 의해, 억제제의 기질 유도 해리에 대해 얻어진 명백한 K₁값을 보상하기 위해 사용된다:

[수학식 1]

K₁= K₁(1+[S]/K_m)

본 발명의 폴리펩타이드 및 효능제 화합물은 적절한 약제학적 담체와 조합하여 사용할 수 있다. 이러하 조성물은 치료 유효량의 폴리펩타이드 또는 효능제, 및 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함한다. 이러한 담체로는 염수, 완충 염수, 덱스트로스, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 그의 배합물을 들 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 제형은 투여 모드에 적합해야 한다.

본 발명은 본 발명의 약제학적 조성물 중의 1개 이상의 성분으로 충전된 1개 이상의 용기를 포함하는 약제학적 팩 또는 키트를 또한 제공한다. 이러한 용기(들)과 연관되어, 약제학적 제품 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 조절하는 정부 기관이 규정한 형태의 주의를 기울일 수 있으며, 그러한 주의는 인체투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 기관에 의한 승인을 반영한다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 효능제는 다른 치료 화합물과 결합되어 사용될 수 있다.

약제 조성물은 경구, 국소, 정맥내, 복막내, 근육내, 피하, 비강내 또는 경피 경로 등의 편리한 방식으로 투여될 수 있다. 약제 조성물은 특이적 증상의 치료 및(또는) 예방에 효과적인 양으로 투여된다. 일반적으로, 이들 조성물은 최소한 약 10μg/체중 kg의 양으로 투여되고, 대부분의 경우, 이들 조성물은 1일당 약 8mg/체중 kg을 초과하지 않는 양으로 투여될 것이다. 대부분의 경우, 투여량은 투여 경로, 증상 등을 고려하여 1일당 약 10μg/체중 kg 내지 약 1mg/체중 kg이다.

CysE 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드인 효능제 화합물은 생체내에 이러한 폴리펩타이드를 발현시킴으로써 본 발명에 따라 사용될 수도 있으며, 이는 종종 유전자 요법이라 칭한다.

따라서, 예를 들면 환자로부터 얻은 세포들은 생체외 폴리펩타이드를 암호화한 폴리뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA)로 처리될 수 있고, 이어서 처리된 세포들은 폴리펩타이드로 치료할 환자에게 제공되는 것이다. 이러한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 본 명세서의 내용으로부터 명백해진다. 예를 들면, 세포들은 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 RNA를 함유하는 레트로바이러스 플라스미드 벡터를 사용함으로써 처리될 수 있다.

마찬가지로, 세포들은 예를 들면 당업계에 공지된 방법에 의해 생체내에서 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 생체내에서 처리될 수 있다. 예를 들면, 패키지 세포는 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 RNA를 함유하는 레트로바이러스 플라스미드 벡터에 의해 형질도입됨으로써 패키지 세포는 목적하는 유전자를 함유하는 감염성 바이러스성 입자들을 생산한다. 이들 생산자 세포는 생체내 세포들의 처리 및 생체내 폴리펩타이드의 발현을 위해 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 방법에 의해 본 발명의 폴리펩타이드를 투여하는 이들 방법 및 다른 방법은 본 발명의 내용으로부터 당업계의 숙련자들에게 명백할 것이다.

상기 레트로바이러스 플라스미드 벡터가 유도될 수 있는 레트로바이러스는 몰로니 쥐의 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 레트로바이러스, 예를 들면 라우스 육종 바이러스, 하베이 육종 바이러스, 조류의 백혈증 바이러스, 깁본 원숭이의 백혈병 바이러스, 사람 면역 결핍 바이러스, 아데노바이러스, 척수 증식성 육종 바이러스, 및 포유동물 종양 바이러스를 들 수 있지만, 이들로만 제한되지는 않는다. 한가지 양태에서, 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 몰로니 쥐의 백혈병 바이러스로부터 유도된다.

벡터는 1개 이상의 프로모터를 포함한다. 사용될 수 있는 적절한 프로모터의 예로는 문헌[Miller et al., Biotechniques, vol. 7, No. 9, 980-990(1989)]에 기재된 레트로바이러스성 LTR; SV40 프로모터; 및 사람 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 또는 임의의 다른 프로모터(예 : 히스톤, po1 III, β-액틴 프로모터를 포함하지만, 이들로만 제한되지 않는 진핵 세포의 프로모터와 같은 세포 프로모터)를 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 다른 바이러스 프로모터의 예로는 아데노바이러스 프로모터, 티미딘 키나제(TK) 프로모터, 및 B19 파보바이러스 프로모터를 들 수 있으며, 이들로만 제한되지 않는다. 적절한 프로모터의 선택은 본 명세서에 포함된 내용으로부터 당업계의 숙련자들에게 명백할 것이다.

본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 핵사 서열은 적절한 프로모터의 조절하에 있다. 사용될 수 있는 적절한 프로모터의 예로는 아데노바이러스의 주요 후기 프로모터 등의 아데노바이러스 프로모터; 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 등의 이형 프로모터; 호흡기의 합포체 바이러스(RSV) 프로모터; MMT 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터 등의 유도가능한 프로모터; 가열 쇼크 프로모터; 알부민 프로모터; ApoAI 프로모터; 사람 글로빈 프로모터; 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나제 프로모터 등의 바이러스 티미딘 키나제 프로모터; 레트로바이러스성 LTR(상기 변형된 레트로바이러스 LTR를 포함함); β-액틴 프로모터; 및 사람 성장 호르몬 프로모터를 들 수 있으며, 이들로만 제한되지 않는다. 프로모터는 폴리펩타이드를 암호화한 유전자를 조절하는 천연 프로모터일 수도 있다.

레트로바이러스 플라스미드 벡터는 생산자 세포주를 형성하는 패키지 세포주를 형질도입하기 위해 사용된다. 형질감염될 수 있는 패키지 세포의 예로는 문헌[Miller, Human Gene Therapy, 제1권, 5-14페이지(1990)]에 기재된 바의 PE501, PA317, Ψ-2, Ψ-AM, PA12, T19-14X, VT-19-H2, ΨCRE, Ψ-CRIP, GP+E-86, GP+envAm12, 및 DAN 세포주를 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않고, 참고 문헌으로 본 명세서에 기재한다. 벡터는 당업계에 공지된 임의의 수단을 통해 패키지 세포를 형질도입할 수 있다. 그러한 수단으로는 전기 영동, 리포좀의 사용 및 CaPO4 침전법을 들 수 있지만, 이들로만 제한되지 않는다. 대안으로, 레트로바이러스 플라스미드 벡터는 리포좀내로 캡슐화될 수 있거나, 또는 지질에 결합된 후 숙주에게 투여될 수 있다.

생산자 세포주는 폴리펩타이드를 암호화한 핵산 서열(들)을 포함하는 감염성 레트로바이러스 벡터 입자들을 발생한다. 그러한 레트로바이러스 벡터 입자들은 진핵 세포들을 시험관내 또는 생체내 형질도입하기 위해 사용될 수 있다. 형질도입된 진핵 세포들은 폴리펩타이드를 암호화한 핵산 서열(들)을 발현시킬 것이다. 형질도입될 수 있는 진핵 세포들의 예로는 태아 간세포, 태아 종양 세포 뿐만 아니라, 조혈 간세포, 간담낭 세포, 섬유아세포, 근원세포, 케라티노사이트, 내피 세포, 및 기관지 상피 세포를 들 수 있으며, 이들로만 제한되지 않는다.

질병 유전성 시스타틴 C 아말로이드 맥관병은 치명적인 출혈을 유발하고, 알쯔하이머 증후군, 다운 증후군, 파킨슨 증후군, 치매와 연관될 수 있으며, 40세 이전에 사망에 이르게 할 수 있다.

따라서, 본 발명은 진단제로서 CysE 유전자를 사용하는 것에 관련된다. 성숙한 형태의 CysE 유전자의 검출은 CysE 유전자의 돌연변이로부터 초래되는 HCCAA와 유사한 질병을 진단할 수 있다.

사람 CysE 유전자에서 돌연변이를 포함하는 개체들은 여러가지 기술에 의해 DNA 수준에서 검출될 수 있다. 진단을 위한 핵산은 환자의 세포, 예를 들면 혈액, 소변, 타액, 조직 생검 및 검시 물질로부터 얻어질 수 있으며, 이들로만 제한되지 않는다. 게놈 DNA는 검출을 위해 직접적으로 사용될 수 있거나, 또는 분석 전에 PCR(Saiki 등, Nature, 324:163-166(1986))을 사용함으로써 효소적으로 증폭시킬 수 있다. RNA 또는 cDNA 역시 동일한 목적을 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, CysE를 암호화한 핵산에 상보적인 PCR/ 프라이머는 CysE 돌연변이를 해독하고 분석하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 결실 및 삽입은 정상적인 표현형에 비해 증폭된 생성물의 크기 변화에 의해 검출될 수 있다. 점 돌연변이는 증폭된 DNA를 방사선 표지된 CysE RNA 또는 대안으로 방사선표지된 CysE 안티센스 DNA 서열과 하이브리드화함으로써 확인할 수 있다. 완전히 일치된 서열은 RNase A 분해 또는 융 점차에 의해 일치되지 않은 이본쇄로부터 구별할 수 있다.

기준 유전자와 돌연변이된 유전자 간의 서열 차이는 직접적인 DNA 서열화 방법에 의해 드러날 수 있다. 또한, 클론된 DNA 세크먼트는 특이적 DNA 세그먼트를 검출하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다. 이러한 방법의 민감성은 PCR과 합해질 때 크게 증진된다. 예를 들면, 서열화 프라이머는 변형된 PCR에 의해 생성된 일본쇄 주형 분자 또는 이본쇄 PCR 생성물과 함게 사용된다. 서열 결정은 방사선 표지된 뉴클레오타이드를 사용하여 종래의 방법에 의해 또는 형광-택을 사용하여 자동 서열화 방법에 의해 수행된다.

DNA 서열차에 대한 유전자 시험은 변성제의 존재하 또는 부재하에 겔 중에서 DNA 단편의 전기영동 이동성의 변화를 검출함으로써 달성될 수 있다. 적은 서열 연결 및 삽입은 고해상도 겔 전기영동에 의해 가시화될 수 있다. 다른 서열의 DNA 단편은 상이한 DNA 단편의 이동성이 이들의 특정 융점 또는 부분적 융점에 따라 겔 속에서 지연된다는 점에서 포름아미드 구배 겔을 변성시키는 것에 대하여 구별될 수 있다(Myers 등, Science, 230:1242(1985) 참조).

특정 위치에서 서열 변화는 뉴클레아제 보호 분석, 예를 들면 RNase 및 S1 보호 또는 화학적 절단 방법에 의해 나타날 수도 있다(예 : Cotton 등, PNAS, USA, 85:4397-4401(1985)).

따라서, 특정 DNA 서열의 검출은 하이브리드화, RNase 보호, 화학적 절단, 직접적인 DNA 서열화 또는 제한 효소(예 : 제한 단편 길이의 다형성(RFL))의 사용 및 게놈 DNA의 써던 플로팅 등의 방법에 의해 달성될 수 있다.

종래의 겔-전기영동 및 DNA 서열화 외에, 돌연변이는 그대로의 분석에 의해 검출될 수도 있다.

본 발명의 서열은 염색체 해독에 유용할 수도 있다. 서열은 인간 개개인의 염색체 상의 특정 위치에 대해 특이적으로 표적화될 수 있고, 그와 하이브리드화될 수 있다. 더욱이, 현재 염색체 상의 특정 위치를 해독할 필요성이 있다. 실제 서열 데이터(반복적인 다형성)에 기초한 몇몇 염색체 표시 시약은 염색체의 위치를 표시하기 위해 현재 이용되고 있다. 본 발명에 따라 염색체에 대한 DNA의 매핑은 그들의 서열을 질병과 연관된 유전자의 상관시키는 중요한 첫 번째 단계이다.

간단히 말하자면, 서열들은 cDNA로부터 PCR 프라이머(바람직하게는 12-15bp)를 제조함으로써 염색체로 매핑할 수 있다. 유전자의 3' 비해독 영역의 컴퓨터 분석은 게놈 DNA에서 1개 이상의 엑손에 미치지 않는 프라이머들을 신속하게 선별하는데 사용되고, 따라서 증폭 과정이 복잡해진다. 이어서, 이들 프라이머는 인간 개개인의 염색체를 함유하는 체세포 하이브리드를 PCR 스크리닝하기 위해 사용된다. 프라이머에 상응하는 사람 유전자를 함유하는 하이브리드만이 증폭된 단편을 생산할 것이다.

체세포 하이브리드 PCR 매핑은 특정 염색체에 특정 DNA를 할당하기 위한 신속한 방법이다. 동일한 올리고뉴클레오타이드 프라이머와 함께 본 발명을 이용함으로써, 유사한 방식으로 큰 게놈 클론의 풀 또는 특정 염색체로부터 단편의 패널에 의해 부편재화가 달성될 수 있다. 그의 염색체에 대해 매핑하는데 마찬가지로 사용될 수 있는 다른 매핑 전략은 생체내 하이브리드화, 표지된 유동-분리된 염색체에 의한 예비스크리닝, 염색체 특이적-cDNA 라이브러리를 작제하기 위해 하이브리드화에 의한 예비 선별을 포함한다.

중기 염색체 스프레드에 대한 cDNA 클론의 형광 특정부 하이브리드화(FISH)는 1단계로 정확한 염색체의 위치를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술은 최소한 50 또는 60개의 염기를 갖는 cDNA와 함께 사용될 수 있다. 이러한 기술을 검토하려면 문헌[Verma 등, Human Chromosomes : a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)]을 참조하기 바란다.

일단 서열이 정확한 염색체 위치로 매핑되는 경우, 염색체에 대한 서열의 물리적 위치는 유전자 맵 데이터와 상관 관계일 수 있다. 그러한 데이터는 예를 들면 문헌[참조 : V. Mckusick, Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Medical Libray로부터 직접 입수할 수 있음)]에서 발견된다. 유전자와 동일한 염색체 영역으로 매핑된 질병 사이의 관계는 연결 분석(물리적으로 인접한 유전자들의 공동상속)을 통해 해독된다.

다음으로, 감염된 개개인과 감염되지 않은 개개인 사이의 cDNA 또는 게놈 서열의 차이를 측정할 필요가 있다. 돌연변이가 임의의 정상적인 개개인에서가 아니라 일부 또는 모든 감염된 개개인에게 관찰되는 경우, 돌연변이는 질병 유발제가 되기 쉽다.

물리적 매핑 및 유전자 매핑 기술의 현재의 분석에 따라, 질병과 연관된 염색체 영역으로 정확하게 편재된 cDNA 50 내지 500개의 잠재적 발병 유전자중의 하나일 수 있다(이는 1 중기 매핑 분석 및 20kb당 1개의 유전자로 추정됨).

폴리펩타이드, 이들의 단편 또는 그의 유도체 또는 동족체 또는 이들을 발현시킨 세포들은 그에 대한 항체를 생산하기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 이들 항체는 예를 들면 폴리클로날 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 본 발명은 키메라, 일본쇄, 및 사람화된 항체 뿐만 아니라 Fab 단편 또는 Fab 발현 라이브러리의 생성물을 포함한다. 당업계에 공지된 여러가지 방법들은 그러한 항체 및 단편을 제조하기 위해 사용된다.

본 발명의 서열에 상응하는 폴리펩타이드에 대해 생성된 항체는 폴리펩타이드를 동물에 직접적으로 주사함으로써, 또는 폴리펩타이드를 동물, 바람직하게는 인간이 아닌 동물에 투여함으로써 얻을 수 있다. 이렇게 수득된 항체는 폴리펩타이드 자체에 결합할 것이다. 이러한 방식으로, 폴리펩타이드의 단편만을 암호화한 서열도 전체 천연 폴리펩타이드에 결합한 항체를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 항체들은 폴리펩타이드를 발현시키는 조직으로부터 폴리펩타이드를 분리시키기 위해 사용될 수 있다.

모노클로날 항체를 제조하기 위해, 연속적인 세포주 배양에 의해 제조된 항체를 제공하는 임의의 기술이 사용될 수 있다. 그 예로는 하이브리도마 기술(Koholer 및 Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), 트리오마 기술, 사람 B-세포 하이브리도마 기술(Kozbor 등, 1983, Immunology Today 4:72) 및 사람 모노클로날 항체를 생산하는 EBV-하이브리도마 기술(Cole 등, 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy Alan R. Liss, Inc., 77-96페이지)을 들 수 있다.

일본쇄 항체를 제조하기 위해 기재된 기술(미국 특허 제4,946,778호)는 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드 생성물에 대한 일본쇄 항체를 제조하기에 적합할 수 있다. 또한, 유전자 이식된 마우스는 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드 생성물에 대해 사람화된 항체를 발현시키기 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 하기 실시예를 참조하여 보다 상세히 기재할 것이다; 그러나, 본 발명은 그러한 예들로만 제한되지 않음을 이해해야 한다. 달리 지적하지 않는 한, 모두 부 및 양은 중량 단위이다.

하기 실시예의 이해를 돕기 위해, 특히 자주 사용되는 방법 및(또는) 용어를 기재한다.

플라스미드라는 용어는 소문자 p가 선행하고(또는) 대문자 및(또는) 숫자가 뒤따르는 것으로 정의된다. 본 명세서에서 출발 플라스미드는 비제한적인 근거로 공공연히 입수할 수 있도록 시판중이거나 또는 공개된 방법에 따라 입수가능한 플라스미드로부터 작제될 수 있다. 또한, 기재된 것들과 동등한 플라스미들이 당업계에 공지되어 있으며, 통상의 기술을 가진 자들에게 명백할 것이다.

DNA의 분해는 DNA의 특정 서열에서만 작용하는 제한 효소를 사용한 DNA의 촉매적 절단을 의미한다. 본 발명에 사용된 여러가지 제한 효소는 시판중이며, 이들의 반응 조건, 보조 인자 및 기타 요건은 당업계의 통상의 기술을 가진 자들에게 알려진 바와 같이 사용된다. 분석의 목적상, 전형적으로 플라스미드 또는 DNA 단편 1μg이 약 20 μ1의 완충용액 중의 약 2 단위의 효소와 함께 사용된다. 플라스미드를 작제하기 위해 DNA 단편을 분리시키려는 목적상, 전형적으로 5 내지 50 μg의 DNA가 보다 큰 용적중의 20 내지 250 단위의 효소로 분해된다. 특정 제한 효소를 위한 적절한 완충액 및 기질의 양은 제조자가 명시한다. 37℃에서 약 1시간의 항온처리 시간이 통상적으로 사용되지만, 공급자의 지시에 따라 변화할 수 있는다. 분해 후, 반응물을 목적하는 단편을 분리시키기 위해 폴리아크릴아미드 겔 상에서 직접 전기영동된다.

절단된 단편의 크기 분리는 문헌[Goeddel, D. 등, Nucleic Acids Res., 8:4057(1980)]에 기재된 8% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 수행된다.

올리고뉴클레오타이드는 화학적으로 합성될 수 있는 일본쇄 폴리데옥시뉴클레오타이드 또는 이본쇄 상보성 폴리데옥시뉴클레오타이드 모두를 의미한다. 이러한 합성 올리고뉴클레오타이드는 5' 인산염을 갖지 않고, 따라서 키나제의 존재하에 ATP와 함께 인산염을 부가하지 않으며 다른 올리고뉴클레오타이드에 연결되지 않을 것이다. 합성 올리고뉴클레오타이드는 탈인산화되지 않은 단편에 연결될 것이다.

연결이라는 용어는 2개의 이본쇄 핵산 단편들 사이에 포스포디에스테르 결합을 형성하는 방법을 의미한다(Maniatis, F. 등, Id., 제146페이지). 달리 지적하지 않는 한, 연결은 대략 등몰량의 DNA 단편 0.5 μg당 T4 DNA 리가제 10 단위로 공지된 완충액 및 조건을 사용함으로써 수행될 수 있다.

달리 언급하지 않는 한, 형질전환은 문헌[Graham, F. and Van der Eb, A., Virology, 52:456-457(1973)]에 기재된 바와 같이 수행된다.

[실시예 1]

[가용성 CysE의 세균 발현 및 정제]

CysE, ATCC # 97103을 암호화한 DNA 서열은 처리된 CysE 단백질의 5' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머(시그날 페타이드 서열 제외) 및 CysE 유전자에 대한 벡터 서열 3'를 사용함으로써 초기에 증폭된다. CysE에 상응하는 추가의 뉴클레오타이드는 5' 및 3' 서열 각각에 부가된다. 5' 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 5' CGCCCATGGCGGCCGCAGGAG 3'(서열 3)을 갖고, 처리된 단백질의 추정된 말단 아미노산으로부터 출발하는 CysE 암호화 서열이 후속하는 Ncol 제한 효소 부위를 함유한다. 3' 서열 5' CGCAAGCTTTCACATCTGCAAAAAGTTGGC 3'(서열 4)는 HindIII 부위에 대한 상보성 서열을 함유하고, CysE 암호화 서열이 후속한다. 제한 효소 부위는 세균 발현 벡터 pQE-9(Qiagen, Inc. Chatsworth, CA, 91311) 상의 제한 효소 부위에 상응한다. pQE-9는 항생제 내성(Amp), 세균 복제 기원(ori), IPTG-조절가능한 프로모터 작동인자(P/O), 리보솜 결합 부위(RBS(, 6-His 택 및 제한 효소 부위를 암호화한다. 이어서, pQE-9는 NcoI 및 HindIII에 의해 분해된다. 증폭된 서열은 pQE-9에 연결되고, 히스티딘 택 및 RBS를 암호화한 서열에 프레임내에서 삽입되었다. 연결 혼합물은 문헌[Sambrook, J. 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Clod Spring Laboratory Press, (1989)]에 기재된 방법에 의해 이. 콜라이 균주 M15/rep 4(Qiagen, Inc.)를 형질전환시키기 위해 사용되었다. M15/rep4는 플라스미드 pREP4의 복수 카피를 함유하고, lacI 리프레서를 발현시키고, 카나마이신 내성(Kan^r)을 부여한다. 형질전환체는 LB 플레이트 상에서 성장하는 그들의 능력에 의해 해독되며, 암피실린/카나마이신 내성 콜로니가 선별된다. 플라스미드 DNA가 제한 분석에 의해 분리되고 확인되었다. 목적하는 작제물을 함유하는 클론은 Amp (100 μg/ml) 및 Kan (25 μg/ml) 모두로 보충된 LB 배지의 액체 배양액 중에서 밤새(O/N) 성장시킨다. O/N 배양액은 1:100 내지 1:250의 비율로 대량의 배양액을 접종시키는데 사용된다. 세포들은 0.4 내지 0.6의 광학 밀도 600(O.D.⁶⁰⁰)으로 성장시킨다. IPTG (이소프로필-B-D-티오갈락토 피라노사이드)가 1 mM의 최종 농도로 부가되었다. IPTG는 lacI 리프레서를 불활성시키고, 증가된 유전자 발현을 유도하는 P/O를 제거시킴으로써 유도된다. 세포들은 추가로 3 내지 4 시간 동안 성장시킨다. 이어서, 세포들은 원심분리에 의해 수거된다. 세포 펠릿은 카오트로픽제 6몰 구아니딘 HCl에 용해시킨다. 분류 후, 용해된 CysE를 6-His 태그를 함유하는 단백질에 의해 치밀하게 결합시키는 조건하에 니켈-킬레이트 컬럼 상에서 크로마토그래피에 의해 용액으로부터 정제시킨다(Hochuli, E. 등, J. Chromatography 411:177-184(1984)). CysE는 pH 5.0의 6몰 구아니딘 HCl 중의 칼럼으로부터 용출시키고, 원형 재현의 목적상 3몰 구아니딘 HCl, 100mM 인산 나트륨, 10 밀리몰 글루타티온(환원됨) 및 2 밀리몰 글루타티온(산화됨)으로 조절된다. 이 용액에서 12시간 동안 항온처리시킨 후, 단백질을 10밀리몰 인산 나트륨으로 투석한다.

[실시예 2]

[바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하는 CysE의 클로닝 및 발현]

전체 길이 CysE 단백질을 암호화한 DNA 서열(ATCC# 97103)을 유전자의 5' 및 3' 서열에 상응하는 PCR 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 증폭시킨다.

5' 프라이머는 서열 5' CGCGGATCCGCCATCATGGCGCGTTCGACCTC 3' (서열 5)를 갖고, 진핵 세포(Kozak, M., J. Mol. Biol., 196:947-950(1987))에서 해독의 개시에 효율적인 시그날이 후속하는 BamHI 제한 효소 부위(굵게 표시) 및 CysE 유전자의 18개 뉴클레오타이드를 함유한다(ATG 해독의 개시 코돈을 밑줄이 그어졌다).

3' 프라이머는 서열 5' CGCGGATCCTCACATCTGCAAAAAGTTGGCTT 3'(서열 6)을 갖고, 제한 엔도뉴클레아제 BamHI 및 CysE 유전자의 3'-비해독 서열에 대해 상보적인 뉴클레오타이드에 대한 절단 부위를 함유한다. 증폭된 서열은 시판중인 키드를 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리시켰다(Geneclean, BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). 이어서, 단편은 엔도뉴클레아제 BamHI를 사용하여 분해시키고, 1% 아가로스 겔 상에서 다시 정제시킨다. 이러한 단편은 P2로 지정된다.

벡터 PA2(아래 논의하는 바와 같이, pVL941의 변형)는 바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 CysE 단배질의 발현을 위해 사용한다(참조 : Summers, M.D. 및 Smith, G.E. 1987, A manual of methods for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas Agricultural Experimental Station Bulletin No. 1555). 이러한 발현 벡터는 오토그라파 캘리포니아 핵 폴리헤드로시스 바이러스(AcMNPV)의 강한 폴리헤드린 프로모터를 함유하소, 제한 엔도뉴클레아제 BamHI에 대한 인식 부위가 후속한다. 원숭이 바이러스 (SV)40의 폴리아데닐화 부위는 효율적인 폴리아데닐화를 위해 사용된다. 재조합 바이러스의 용이한 선별을 위해, 이. 콜라이로부터 β-갈락토시다제 유전자가 폴리헤드론 유전자의 폴리아데닐화 시그날에 의해 후속하는 폴리헤드린 프로모터와 동일한 배향으로 삽입된다. 폴리헤드린 서열은 동시-형질감염된 야생형 바이러스 DNA의 세포 매개된 상동성 재조합을 위해 바이러스의 서열에 의해 양쪽 측면에서 플랭킹된다. pRG1 pAc373, pVL941 및 pAcIM1 등의 다른 많은 바쿨로바이러스 벡터들이 pA2 대신에 사용될 수 있다(Luckow, V.A. 및 Summers, M.D., Virology, 170:31-39).

플라스미드는 제한 효소 BamHI에 의해 분해시킨 후 당업계에 공지된 방법에 의해 송아지 장의 포스파타제를 사용하여 탈인산화시킨다. 이어서, DNA는 시판중인 키트를 사용하여 1% 아가로스 겔로부터 분리시켰다(Geneclean BIO 101 Inc., La Jolla, Ca.). 이러한 벡터 DNA는 V2로 지정된다.

단편 F2 및 탈인산화된 플라스미드 V2 는 T4 DNA 리가제에 의해 연결시킨다. 이어서, 이. 콜라이의 HB101 세포는 형질전환시키고, 효소 BamHI를 사용하여 CysE 유전자에 의해 플라스미드(pBacCysE)를 함유하는 세균을 확인한다. 클로닝된 단편의 서열을 DNA 서열화에 의해 확인한다.

프라스미드 pBacCysE 5μg을 지질감염 방법을 사용하여 시판중인 선형 바쿨로바이러스(BaculoGold^TMbaculovirus DNA, pharmingen, San Diego, CA.)와 동시-형질감염시켰다(Felgner 등, Proc. Natl. Aced. Sci. USA, 84:7413-7417 (1987)).

BaculoGold^TM바이러스 DNA 1μg 및 플라스미드 pBacCysE 5μg을 무혈청 그레이스 배지 50μl를 함유하는 미세역가 플레이트의 멸균 웰에서 혼합한다(Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). 지질감염 10μl + 그레이스 배지 90 μl를 첨가한 후, 혼합하고 실온에서 15분 동안 항온처리시킨다. 이어서, 형질감염 혼합물을 형청 없는 그레이스 배지 1ml와 함께 35mm 조직 배양 플레이트에 파종한 Sf9 곤충 세포(ATTCC CRL 1711)에 적가한다. 이어서, 이 플레이트를 27℃에서 5시간 동안 항온처리시킨다. 5시간 후, 형질감염 용액을 플레이트로부터 제거하고, 10% 테아 송아지 혈청이 보충된 그레이스 곤충 배지 1ml를 첨가한다. 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣고, 4일 동안 27℃에서 배양을 계속한다.

4일 후 상청액을 수집하고, Summers 및 Smith가 기재한 바와 유사하게 플라크 분석을 수행한다. 변형으로서, 청색으로 염색된 플라크를 용이하게 분리시킬 수 있는 Blue Gal(Life Technologies Inc., Gaithersburg)과 함께 아가로스 겔을 사용한다. (플라크 분석에 대한 상세한 설명은 곤충 세포 배양을 위한 사용자 안내서 및 Life Technologies Inc.에 의해 배포된 바쿨로바이러스, Gaithersburg, 제9-10페이지에서 발견할 수 있다).

멸균 희석한지 4일 후, 바이러스를 세포에 부가하고, 청색으로 염색된 플라크를 에펜도르프 피펫의 팁으로 골라냈다. 이어서, 재조합 바이러스를 함유하는 아가를 그레이스 배지 200μl를 함유하는 에펜도르프 시험관에 다시 현탁시킨다. 아가를 간단한 원심분리에 의해 제거되고, 재조합 바쿨로바이러스를 함유하는 상청액을 35mm 접시에 파종한 Sf9 세포를 감염시키기 위해 사용한다. 4일 후 이들 배양 접시의 상청액을 수집한 후 4℃에서 저장한다.

Sf9 세포를 10% 가열-불활성화된 FBS로 보충한 그레이스 배지에서 성장시킨다. 세포들은 2의 감염 중복도(MOI)에서 재조합 바쿨로바이러스 V-CysE로 감염시킨다. 6시간 후, 배지를 제거하고, 메티오닌 및 시스테인이 없는 SF900 II로 대체한다(Life Technologies Inc., Gaithersbur). 42시간 후, 5μCi³⁵S-메티오닌 및 5μCi³⁵S-시스테인(Amersham)을 첨가한다. 세포들을 16시간 동안 추가로 항온처리한 후, 원심 분리에 의해 수집하고, 표지된 단백질을 SDS-PAGE 및 자동 방사선 사진술에 의해 가시화한다.

[실시예 3]

[COS 세포에서 재조합 CysE의 발현]

플라스미스 CysE HA의 발현은 1) SV40 복제 기원, 2) 암피실린 내성 유전자, 3) 이. 콜라이 복제 기원, 4) 폴리링커 영역, SV40 인트론 및 폴리아데닐화 부위가 후속하는 CMV 프로모터를 함유하는 벡터 pcDNAI/Amp(Invitrogen)로부터 유도된다. 그의 3' 말단으로 프레임 중에 융합된 HA 택 및 전체 CysE 전구체를 암호화한 DNA 단편을 벡터의 폴리링커 영역에 클로닝시키고, 그에 따라 재조합 단백질의 발현은 CMV 프로모터하에 지시된다. HA 택은 이미 기재된 바와 같이 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응한다(I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A Cherenson, M. Connolly 및 R. Lerner, 1984, Cell 37:767, (1984)). 표적 단백질의 대한 HA 택의 융합은 HA 에피소드를 인식하는 항체에 의해 재조합 단백질의 용이한 검출을 가능케한다.

플라스미드 작제 전략은 다음과 같이 기재한다:

CysE, ATCC # 97103을 암호화한 DNA 서열은 2개의 프라이머를 사용하여 클론된 원시 EST 상에서 PCR에 의해 작제하였고: 즉, 5' 프라이머 5' GCGCGGATCCACCATGGCGCGTTCG 3'(서열 7)는 BamHI 부위에 이어 개시 코돈으로부터 출발하는 CysE 암호화 서열의 12개 뉴클레오타이드를 함유하고; 3' 서열 5' GCGCTCTAGATCAAGCGTAGTCTGGGAGCTCGTATGGGTACATCTGCACAAA 3'(서열 8)는 XbaI 부위, 해독 정지 코돈, HA 택 및 CysE 암호화 서열의 뉴클레오타이드에 대한 상보성 서열을 함유한다. 따라서, PCR 생성물은 프레임내에서 융합된 HA 택, HA 택에 이어서 해독 종결 코돈이 후속하는 BamHI 부위, CysE 암호화 서열 및 XbaI 부위를 함유한다. PCR 증폭된 DNA 단편 및 벡터, pcDNAI/Amp는 BamHI 및 XbaI 제한 효소를 사용하여 분해시키고 연결시킨다. 연결 혼합물을 이. 콜라이 균주 SURE (Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037)로 형질전환시킨다. 대략 10조각을 각각의 플라스크에 넣었다. 형질전환된 배양액을 암피실린 배지 플레이트 상에서 평판 배양시키고, 내성 콜로니를 선별한다. 플라스미드 DNA를 형질전환체로부터 분리시키고 정확한 단편의 존재를 제한 분석에 의해 조사한다. 재조합 CysE의 발현을 위해, COS 세포들을 DEAE-DEXTRAN 방법에 의해 발현 벡터에 형질감염시켰다(J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). CysE HA 단백질의 발현은 방사선 표지법 및 면역침전법에 의해 검출한다(E Harlow, D. Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). 세포들을 형질감염 2일 후,³⁵S-시스테인에 의해 8시간 동안 표지시킨다. 이어서, 배양 배지를 수집하고, 세포들을 세정제 [RIPA 완충액(150mM NaCl, 1% NP-40, 0.1% SDS, 1% NP-40, 0.5% DOC, 50mM Tris, pH7.5)]으로 용해시킨다(Wilson, I, 등, Id. 37:767(1984)). 모든 세포 용해질 및 배양 배지는 HA 특이적 모노클로날 항체를 사용하여 침전시킨다. 침전된 단백질은 15% SDIS-PAGE 겔 상에서 분석한다.

[실시예 4]

[유전자 요법을 통한 발현]

섬유아세포를 피부 생검에 의해 피검자로부터 얻었다. 얻어진 조직을 조직-배양 배지에 넣고, 작은 조각들로 분리시킨다. 작은 덩어리의 조직을 조직 배양 플라스크의 습윤 표면 위에 놓고, 위 아래를 뒤집고, 완전히 밀폐시키고 밤새 실온에 두었다. 실온에서 24시간 후, 플라스크를 뒤집고, 조직 덩어리를 플라스크 바닥에 고정시키고, 신선한 배지(예, 10% FBS, 페니실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 Ham's F12 배지)를 첨가한다. 이어서, 이를 약 1주일 동안 37℃에서 항온처리한다. 이때, 신선한 배지를 첨가하고, 순차로 몇일마다 변화시킨다. 추가로 2주 배양시킨 후, 섬유아세포 단일층이 나타났다. 단일층은 트립신화되고, 보다 큰 플라스크로 정량한다.

몰로니(Moloney) 쥐의 육종 바이러스의 긴 말단 반복서열에 의해 플랭킹된 pMV-7(Kirschmeier, P.T. 등, DNA, 7:219-25(1988))은 EcoRI 및 HindIII으로 분해시키고, 순차로 송아지 장의 포스타파제로 처리한다. 선형 벡터를 아가로스 겔 상에서 분별시키고, 유리 비드를 사용하여 정제시킨다.

본 발명의 폴리펩타이드를 암호화한 cDNA는 5' 및 3' 말단 서열 각각에 상응하는 PCR 프라이머를 사용하여 증식시킨다. 5' 프라이머는 EcoRI부위를 함유하고, 3' 프라이머는 HindIII 부위를 함유한다. 등량의 모로니 쥐의 육종 바이러스 선형 본쇄 및 EcoRI 및 HindIII 단편을 T4 DNA 리가아제의 존재하에 함께 첨가한다. 수득된 혼합물은 2개의 단편을 연결시키기에 적절한 조건하에 유지시킨다. 연결 혼합물은 세균 HB101을 형질전환시키기 위해 사용하였으며, 이어서 벡터가 적절히 삽입된 목적하는 유전자를 갖는 것을 확인할 목적으로 카나마이신을 함유하는 아가 상에서 평판 배양시킨다.

양성 pA317 또는 GP+am12 패키지 세포를 10% 송아지 혈처(CS), 페니실린 및 스트렙토마이신을 갖는 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM) 중에서 융합 밀도까지 조직배양시킨다. 이어서, 유전자를 함유하는 MSV 벡터를 배지에 첨가하고, 패키지 세포를 벡터에 의해 형질도입시킨다. 패키지 세포는 유전자를 함유하는 감염성 바이러스 입자들을 생산한다(패키지 세포는 이하 생산자 세포라 칭한다).

신선한 배지를 형질도입된 생산자 세포에 첨가하고, 연속하여 배지는 융합된 생산자 세포의 세포의 10cm 플레이트로부터 수집한다. 감염성 바이러스 입자들을 함유하는 소모된 배지는 분리된 생산자 세포를 제거하기 위해 소공(millipore)을 통해 여과시키고, 이어서 이 배지는 섬유아세포를 감염시키는데 사용되었다. 배지는 섬유아세포의 부융합 플레이트로부터 제거하고, 신속히 대체시킨다.

Claims (20)

1. 내용없음
2. 내용없음
3. 내용없음
4. 내용없음
5. 내용없음
6. 제 1 항에 있어서, 도 1에 나타낸 뉴클레오타이드 1 내지 뉴클레오타이드 576의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
7. 제 1 항에 있어서, 도 1에 나타낸 뉴클레오타이드 14 내지 뉴클레오타이드 459의 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
8. 제 2 항의 DNA를 함유하는 벡터.
9. 제 10 항의 벡터에 의해 유전공학적으로 처리된 숙주 세포.
10. 제 11 항의 숙주 세포로부터 상기 DNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드를 발현시키는 단계를 포함하는 폴리펩타이드의 제조 방법.
11. 제 10 항의 벡터에 의해 세포를 유전공학적으로 처리하는 단계를 포함하는, 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 세포의 제조 방법.
12. (i) 도 1의 추정된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 및 이의 단편, 동족체 및 유도체; 및 (ii) ATCC 기탁번호 제97103호의 cDNA에 의해 암호화된 폴리펩타이드 및 상기 폴리펩타이드의 단편, 동족체 및 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 구성원을 포함하는 폴리펩타이드.
13. 제 12 항의 폴리펩타이드에 대한 수용체를 활성화시키는 화합물.
14. 제 12 항의 폴리펩타이드에 대한 수용체를 억제시키는 화합물.
15. 치료학적 유효량의 제 12 항의 폴리펩타이드를 CysE를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 환자의 치료 방법.
16. 제 15 항에 있어서, 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 환자에게 제공하여 생체내에서 상기 폴리펩타이드를 발현시킴으로써 치료학적 유효량의 폴리펩타이드가 투여되는 방법.
17. 치료학적 유효량의 제 14 항의 화합물을 CysE 폴리펩타이드의 억제를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 상기 환자의 치료 방법.
18. 제 12 항의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열에서 돌연변이를 검출하는 단계를 포함하는 상기 폴리펩타이드의 저발현과 관련된 질병 또는 이에 대한 감수성의 진단 방법.
19. 숙주로부터 유도된 샘플 중에서 제 12 항의 폴리펩타이드의 존재를 분석하는 단계를 포함하는 진단 방법.
20. 스크리닝될 화합물이 제 12 항의 폴리펩타이드에 대한 수용체와 결합하여 검출가능한 시그날을 제공할 수 있는 제 2 성분과 연합되어 있는 상기 수용체를 표면 상에 발현시키는 세포를 수용체와의 결합을 허용하는 조건하에 스크리닝될 화합물과 접촉시키는 단계; 및

    화합물과 수용체의 상호작용에 의해 발생된 시그날의 존재를 검출함으로써 화합물이 수용체에 결합하고 그 수용체를 활성화시키는지의 여부를 측정하는 단계를 포함하는, 상기 폴리펩타이드에 대한 수용체에 결합하고 이 수용체를 활성화시키는 화합물의 동정 방법.