KR19990008468A - 글리코폴리머의 합성 - Google Patents
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Abstract
네오글리코컨쥬게이트 및 이를 합성하기 위한 신규 중간체는, 유기 용매를 포함하는 배지에서 아트로박테르 프로토포르미아의 Endo-β-N-아세틸글루코사미니다아제(Endo-A)를 사용하여 합성한다. 상기 방법을 통하여, 고 만노스 글리코폴리머를 포함하는 신규 글리코컨쥬게이트를 합성할 수 있다.
Description
탄수화물은 세포-세포 인식(Wassarman, 1991; Patankar et al., 1993; 및 Lasky et al., 1992), 렉틴 결합(Lee, 1988; 및 Lee et al., 1991, Pure Appl. chem.), 바이러스성 감염(Glick et al., 1991; 및 Toogood et al., 1991)과 같은 중요한 생물학적 기능을 갖는다. 탄수화물의 작용을 연구하고자, 일반적으로 천연 자원으로부터 얻기 어려운, 구조가 밝혀진 매우 순수한 화합물이 필요하다. 그 결과, 지난 십여년간 네오글리코컨쥬게이트(모노 또는 올리고 당에 의해 유도된 단밸질, 지방 또는 기타 화합물)의 합성 및 구성에 대한 관심이 급속히 증대되었다(Lee, 1994). 네오글리코컨쥬게이트의 화학 합성이 크게 발전되었으나, 일반적으로 어려운 단계를 다수 거친다. 고-만노스형 올리고사카라이드의 합성은 효소법을 사용하여도 특히 어려운 것으로 판명되었다.
아트로박테르 프로토프르미아의 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제(Endo-A)는 가수분해 및 당 전이 반응(transglycosylation)을 하는 글리코시다아제이다. 이 효소는 당단백질 내에 있는 고-만노스형 및 혼성형 N-결합 당 사슬의 중심 GlcNAcβ1, 4GlcNAc 잔기에서 글리코사이드 결합을 파괴하고(Takegawa et al., 1989), 올리고사카라이드를 여러개의 모노- 및 디사카라이드로 바꾼다(Takegawa et al., 1991a, 1991b). (고 만노스형 화합물은, 2-아세틸글루코사민 잔기가 아스파라긴에 바로 인접하고, 나머지 사슬은 일반적으로 만노스만으로 구성되는 측쇄 화합물이며, 크실로오스 및 퍼코오스를 갖는 변형체가 다소 관찰되기도 한다. 복합형 화합물은 N-아세틸글루코사민, 갈락토오스 및 때때로 퍼코오스 및 시알산으로 구성된다. 혼성형 화합물은 두 가지가 혼성되는 것이다.)
당 전이 반응은 반응 용액에 아세톤, 디메틸 술폭시드(DMSO) 및N,N-디메틸 포름아미드(DMF)와 같은 유기 용매를 첨가함으로써 효율이 크게 증대될 수 있다. 예를 들면, Endo-A의 당 전이 활성을 공여체로 Man9-GlcNAc2Asn, 수용체로 GlcNAc를 사용하여 측정할 때, 수용성 배양액 안에서 당 전이 반응과 가수분해의 비율은 1:2 지만, 30% 아세톤을 첨가하는 경우에는 거의 끝까지 당 전이 반응만이 일어난다. 이러한 성질을 통하여, 효율과 순도가 매우 우수한 새로운 글리코사이드 및 네오글리코컨쥬게이트를 합성할 수 있다.
이러한 방법으로, 네오글리코컨쥬게이트의 몇가지 작용성 중간체를 합성하였다. 이 중 하나는 부속(pendant) Man9GlcNAc2사슬을 갖는 글리코폴리머로 전환되었다. 이렇게 생성된 글리코폴리머는, 모노머 올리고-사카라이드보다 간의 만노스-결합 단백질에 의한 결합을 매우 크게 억제한다.
본 발명은 글리코폴리머에 관한 것이며, 글리코폴리머를 합성하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 고(high)-만노스형 사슬을 포함하는 네오글리코컨쥬게이트를 생산하기 위하여 아트로박테르 프로토포르미아(Arthrobacter protophormiae)의 엔도-β-N-아세틸글루코사미니다아제를 사용하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 Endo-A 당 전이 반응 조건의 최적화이다. 30% 아세톤(A) 또는 다양한 농도의 아세톤(B)를 포함, 10mM 아세트산 암모늄 완충액(pH 6.0) 10μl에서 Man9GlcNAc2Asn(공여체) 11.6 nmol, GlcNAc-NAP(수용체) 4μmol 및 다양한 양의 효소(A) 또는 효소(B) 2.2mU 혼합물로 반응을 실시하여, 당 전이 반응의 효소(A) 및 아세톤 함량(B)의 최적 수준을 결정하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 15분동안 배양하고, 생성물을 HPAEC-PAD로 분석하였다. (○) : 기질; (◆) : 당 전이 반응 산물; (▲) : 가수분해 산물.
도 2는 Endo-A 당 전이 반응에 의한 Man9GlcNAc2-NAP의 합성이다. 이 반응은 35% 아세톤을 포함, 10mM 아세트산 암모늄 완충액(pH 6.0) 5ml 에서 Man9GlcNAc2Asn 5.75 μmol, GlcNAc-NAP 2mmol 및 효소 1.1U로 37℃에서 15분간 반응시켰다. 동결 건조 후, Man9GlcNAc2올리고사카라이드 0.7 nmol에 상당하는 시료를 분석용 HPAEC-PAD 시스템에 넣었다. NaOH 100mM 및 NaOAc 선형 농도구배 0 내지 10%로 20분동안 용리하였다. A: 당 전이 반응 산물, Man9GlcNAc2-NAP; B: 가수분해 산물, Man9GlcNAc; C: 잔류 기질, Man9GlcNAc2Asn.
도 3은 GlcNAc-NAP(A) 및 Man9GlcNAc2-NAP(B)의1H-NMR(300MHz) 분석이다. 시료 내에 있는 불안정한 수소는 측정하기 전에 D2O에 용해시킨 후 동결건조하는 순환 과정을 세 번 반복하여 중수소로 교환하였다. 내부 표준물로서 아세톤(2.225ppm)을 25℃에서 사용하여 D2O에서 분석하였다.
도 4는 Sephadex G-50에서 글리코폴리머를 겔 여과한 것이다. 시료(1ml)를 Sephadex G-50 칼럼(2.5 x 90cm) 상에 적용하고, 물로 용리하였다. 유량은 약 30ml/hr였고, 4ml 분획들을 수집하였다. 중성인 당을 페놀-H2SO4법으로 측정하고(점선, 480nm에서의 흡광도), GlcNAc는 220nm에서의 흡광도(실선)를 모니터하였다. a: 글리코폴리머로 결합된 분획을 나타낸다.
도 5는 글리코폴리머의1H-NMR(300MHz) 분석이다. 60℃, D2O 내에서 측정된 화학적 이동(shift)은 4.441ppm의 HDO 신호에 근거한다. *: 폴리머 기본 골격의 신호이다.
도 6은 Man9GlcNAc2당 사슬을 갖는 글리코폴리머이다.
도 7은 HPGFC로 글리코폴리머의 분자량을 결정한 것이다. HPGFC는 크기 배제 칼럼(7.5 x 600mm) 및 용리액으로서 0.3M NaCl을 포함하는 0.1M 인산염 완충액(pH 7.0)을 사용하여 유량 1.0ml/min로 실시하였다. 배출액은 220nm에서의 흡광도를 모니터하였다. ○: 글리코폴리머; ◇: 참조 화합물; 1: 블루 덱스트란(2,000,000); 2: B-아밀라아제(200,000); 3: 알코올 디히드로게나아제(150,000); 4: 알부민 소 혈청(66,000) 및 5: 탄소성 안히드라아제(29,000).
도 8은 글리코폴리머로 혈청- 및 간-MBP-CRDs에 의한 결합을 저해한 것이다. 프로그램 ALLFIT(De Lean et al., 1978)를 사용하여, 조정 곡선(fitted curves)을 얻었다. SBA 및 글리코폴리머의 농도는 Man9GlcNAc2를 기준으로 나타낸다. ■: SBA + 혈청 MBP-CRD; □: SBA + 간 MBP-CRD; ◆: 글리코폴리머 + 혈청 MBP-CRD; ◇: 글리코폴리머 + 간 MBP-CRD.
본 발명은 유기 용매를 포함하는 반응 혼합물에서 Endo-A에 의하여 합성되는 네오글리코컨쥬게이트 및 네오글리코컨쥬게이트의 새로운 작용성 중간체를 제공한다.
또한, 본 발명은 순도가 매우 높은 합성 고 만노스형 및 혼성형 글리코폴리머를 제공한다.
본 발명은 또한 모노머 올리고사카라이드보다 간의 만노스 결합 단백질(MBP)을 더욱 저해하는, 부속 Man9GlcNAc2사슬을 갖는 글리코폴리머를 제공한다.
본 발명은 또한 네오글리코컨쥬게이트 및 이의 작용성 중간체의 합성 방법을 제공한다.
물질 및 방법
명세서에는 다음 약자가 사용된다.
Bn: 벤질; BSA: 소 혈청 알부민; CRD: 탄수화물 인식 도메인; DMF: N,N-디메틸 포름아미드; DMSO: 디메틸 술폭사이드; Endo-A: 아트로박테르 프로토포르미아의 엔도-β-N-아세틸-D-글루코사미니다아제; GlcNAc: N-아세틸-D-글루코사민;1H-NMR: 1H-핵자기공명 분광법; HPAEC-PAD: 펄스 전류계를 장착한 고성능 음이온 교환 크로마토그래피; HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피; HPGFC: 고성능 겔 여과 크로마토그래피; Man: 만노스; MBP: 만노스-결합 단백질; 4mU: 4-메틸움벨리페릴; NAP: 3-(N-아크릴로일아미노)-프로필; pNP: p-니트로페닐; SBA: 대두 응집소. 사용되는 단당류는 모두 D-형이다.
실험 방법
물질
Endo-A는 문헌[Takegawa et al.,(1989)]에 기재된 바와 같이 정제하였다. 소모성 프로나아제 소화 후, Sephadex G-50 상에 겔 여과 및 흑연화 탄소 칼럼(Fan et al., 1994)을 사용하여 HPLC 정제함으로써, 대두 응집소로부터 Man9GlcNAc2Asn을 제조하였다. 글리코아미다아제 A를 세이카가구사[Seikagaku America, Inc.(Rockville, MD)]로부터 입수하였다. GlcNAc는 Pfanstiehl Laboratories, Inc.(Waukegan, IL)로부터 구입하였다. 3-(N-아크릴로일아미노)-프로필 β-D-GlcNAc(GlcNAc-NAP) 및 GlcNAc-O-(CH2)3CH=CH2는 홋카이도 대학(Dr.Shin-Ichiro Nishimura)에서 얻었다. 이들은 문헌[Nishimura et al.,(1990) 및 Nishimura et al.,(1994a)]에 기재된 방법으로 합성할 수 있다. 벤질 β-GlcNAc, 4-메틸움벨리페릴 β-GlcNAc, p-니트로페닐 β-GlcNAc, GlcNAc-S-(CH2)6NH2, GlcNAc-O-CH2CH=CH2, GlcNAc-O(CH2)3NHCOCH=CH2, GlcNAc-S-CH2CN, GlcNAc-S-(CH2)3CH3, (GlcNAc-S-CH2CH2CH2)2및 GlcNAc-S-CH2CONHCH2CH(OMe)2를 문헌[Lee et al.,(1992)]에 기재된 대로 실험실에서 합성하였다. 콜롬비아 대학(Dr. Kurt Drickamer)으로부터 얻은 발현 플라스미드-생산 박테리아 종을 사용하여, 혈청 및 간으로부터 재조합 래트 MBP-CRDs를 문헌[Quesenberry 및 Drickamer(1992)]의 방법에 따라 발현시켜 정제하였다.
방법
효소 반응
30% 아세톤을 포함, 25mM 아세트산 암모늄 완충액(pH 6.0)에서, 총 체적이 20μl인 Man9GLcNAc2Asn 3 nmol, 수용체 4μmol 및 Endo-A 0.9mU의 혼합물로 당 전이 반응을 위한 전형적인 효소 반응을 실시하였다. (또한, DMSO 및 DMF와 같은 다른 유기 용매를, 통상적으로 실험에서 반응을 최적화하기 위하여 조정하는 농도로 사용할 수 있다.) 37℃에서 15분간 배양 후, 수조에서 3분동안 가열하여 반응을 종결하였다. 완충액을 진공 펌프를 사용하여 Speedvac으로 제거하였다. 반응 혼합물을 HPAEC-PAD 시스템을 사용하여 분석하였다(하기 참조).
고성능 음이온 교환 크로마토그래피(HPAEC)
반응 생성물의 분석을 위하여 펄스 전류계(PAD-II)를 장착한 Bio-LC(Dionex Corp., Sunnyvale, CA)를 포함하는 HPAEC 시스템을 사용하였다. 크로마토그래피 데이터를 AI-450 크로마토그래피 소프트웨어(Dionex)를 사용하여 분석하였다. Endo-A 반응 생성물을 유량 1.0ml/min인 100mM 수산화 나트륨으로 용리하는 Dionex CarboPac PA-I 칼럼(4x250mm)을 사용하여 30분동안 전개되는 30mM 내지 80mM의 나트륨 아세테이트 농도 구배로 분리하였다. 전개와 전개 사이에, 칼럼을 수산화 나트륨 100mM/아세트산 나트륨 200mM 용액으로 5분간 세척하고 15분동안 평형이 되도록 하였다. PAD 감도를 1K로 맞추었다. 글리코아미다아제 A로 Man9GlcNAc2AsnPhe 를 완전히 소화시키고 Endo-A로 Man9GlcNAc2Asn을 완전히 소화시켜 얻은 표준 물질과 비교함으로써, Man9GlcNAc 및 Man9GlcNAc2를 정량적으로 측정하였다. 출발 물질로부터의 잔류 기질 및 가수분해 산물을 제외하고 계산하여, N-아세틸-글루코사민 이외의 수용체를 사용하는 당 전이 반응 산물의 양을 추정하였다.
수용체로서 GlcNAc-NAP를 사용하는 Endo-A에 의한 당 전이 반응
아세톤 35%를 포함, 10 mM NH4OAc 완충액(pH 6.0) 5ml에서, Man9GlcNAc2Asn 5.8μmol, GlcNAc-NAP 2mmol 및 효소 1.1U를 포함하는 혼합물로 37℃에서 15분동안 배양하였다. 시료를 3분동안 비등 수조에 방치하여 반응을 종결한 후, 세파덱스 G-25 칼럼(2 x 140cm)에 적용하여 0.1M 아세트산으로 용리하였다. 229nm에서 배출액의 UV 흡광을 모니터하고, 중성 당을 페놀 황산법으로 측정하였다(McKelvy 및 Lee, 1969). 고분자 물질을 포함하는 분획을 결합하고 동결 건조하여 10.5mg의 백색 분말을 수득하였다.
고 만노스형 올리고사카라이드의 부속 사슬을 갖는 글리코폴리머의 제조 방법
겔 여과로부터 얻어진 백색 분말을 더이상 정제하지 않고 중합용 출발 물질로 사용하였다. 소량의 백색 분말(7.2mg, Man9GlcNAc2-NAP 약 3.25μmol)을 H2O 0.3ml에 용해시킨 후, 물 아스피레이터를 사용하여 30분동안 탈기하였다. 아크릴아미드(8.4mg, 118pmol), 과황산 암모늄(APS, 0.14μmol) 및N,N,N',N'-테트라메틸에틸렌디아민(TEMED, 6.6μmol)을 가하고, 상기 혼합물을 실온에서 3일동안 교반하였다. 그동안, 동량의 APS 및 TEMED를 2일간 매일 반응 혼합물에 가하였다. 상기 혼합물을 55℃에서 3시간동안 배양하여 반응을 최종 완결하였다. 반응 혼합물을 세파덱스 G-50 칼럼(2.5 x 90cm)에 적용하고 H2O로 용리하였다. 글리코폴리머를 함유하는 분획을 결합하고, 동결건조하여 백색 분말 5.3mg을 얻었다.
HPGFC를 통한 글리코폴리머의 분자량 측정
크기 배제 칼럼[TSK-Gel G2000SW, 7.5 x 600mm, TosoHaas, ND 및 UV 검출기(Model V4, ISCO)]을 장착한 Gilson HPLC 시스템으로 HPGFC를 실시하였다. 용리액은 0.3M NaCl을 함유하는 0.1M 인산염 완충액(pH 7.0)을 사용하였으며, 배출액을 220nm로 모니터하였다. 분자량 측정을 위한 표준 화합물은 i) 블루 덱스트란(분자량 = 2,000,000); ii) β-아밀라아제(분자량 = 200,000); iii) 알콜 디히드로게나아제(분자량 = 150,000); iv) 소 혈청 알부민(분자량 = 66,000); v) 카본 안히드라아제(분자량 = 29,000)을 사용하였다.
글리코폴리머의 MBP 결합
문헌[Quesenberry 및 Drickamer(1992)]에 기재된 바와 같이 고체-상 결합에 대한 연구는 몇가지 변형체를 사용하여 실질적으로 실시되었다. 모든 단계는 4℃에서 실시하였다. 간략히 하면, CRD(50μl)를 각각의 폴리스티렌 웰(Dynatech의 Immulon 4 Removawell Strips, Fisher Scientific 사제) 상에 도포하였다. 밤새 배양한 후, 1.25M NaCl/25mM CaCl2/25mM Tris(pH 7.8) 중의 1% BSA 블러킹 용액을 가하고 2시간동안 반응시켰다. 상기 Tris 완충액 중의 0.5% BSA에 결합 및 저해를 위한 리간드 및 저해제가 있었다. 사용되는 참조 리간드는125I-[만노스30-BSA](약 2000 cpm/μg)이고, 콜로라민 T 방법[Choloramine T method(Lee et al., 1991, J.Biol.Chem)]으로 방사성 표지하였다. 약 500cpm/웰 참조 리간드를 다양한 농도에서 저해제가 있는 경우 또는 없는 경우에 20시간동안 배양하였다. 이어서, 웰 함유물을 옮겨 세척하고, 패커드 미나시 감마 카운터(Packard Minaxi gamma counter)를 사용하여 수를 세었다. 수를 바탕값(background, CRD로 도포되지 않은 블러킹된 웰에 남아있는 수)에 대하여 보정하고, 상기 데이터를 ALLFIT 프로그램(De Lean et al., 1978)을 사용하여 분석하여, 곡선 피팅 식(logistic equation for curve fitting)으로 I50값(50% 저해를 위하여 필요한 실험 리간드 농도)을 결정하였다.
1
H 핵자기 공명 분광학
300 MHz NMR 스펙트럼을 Bruker AMX 300 분광계를 사용하여 기록하고, Bruker AM-600 분광계로 600MHz NMR을 측정하였다. 화학적 이동(chemical shifts)은 내부 표준물인 아세톤(δ=2.225ppm)을 기준한 것이다. 시료를 D2O에 용해시키고 동결건조하는 것을 3회 반복한 후, 측정 직전에 상기 잔류물을 고순도 D2O(99.96% D) 0.5ml에 용해시켰다. 25℃에서 300MHz 데이터를 기록하고, 60℃에서 600MHz 데이터를 기록하였다.
결 과
Endo-A에 의한 물-혼화성 알콜로의 당 전이 반응
공여체로서 Man9GlcNAc2Asn을 사용하여, Endo-A에 의한 다양한 물-혼화성 알콜로의 당 전이 반응을 실험하였다. 3nmol Man9GlcNAc2Asn(공여체) 및 3mU 효소를 함유하고, 30% 알콜(v/v)을 포함하고 있는 25mM 아세트산 암모늄 완충액(pH 6.0) 20μl 중에서 37℃, 10분동안 표 1의 반응을 실시하였다. 참조 화합물로서 Man9GlcNAc 및 Man9GlcNAc2를 사용하여, 반응물을 HPAEC로 측정하였다.
| 알콜(30% v/v) | 가수분해a)(%) | 당 전이 반응a)(%) |
| H2O | 94.1 | 0.0 |
| MeOH | 33.2 | 64.0 |
| EtOH | 45.5 | 46.9 |
| PrOH | 4.5 | 8.0 |
| iPrOH | 72.4 | 9.6 |
| 알릴 알콜 | 0.0 | 0.0 |
| 글리세롤 | 27.8 | 56.5 |
| a)출발 공여체 기질을 기준함 |
표에서 알 수 있는 바와 같이, 효소는 올리고사카라이드를 MeOH 및 EtOH로 이동시켰고, 수율은 각각 64% 및 47%였다. MeOH를 갖는 생성물의 아노머성 배치는1H-NMR(데이터를 나타내지 않음)에 의하여 β로 밝혀졌다. PrOH(수율 8%) 및 이소-PrOH(수율 10%)는 또한 당 전이 반응의 수용체로 작용할 수 있으나, 알릴 알콜은 수용체로 작용할 수 없었다. 효소는 30% MeOH 및 EtOH 중에서는 안정하지만, 30% PrOH 및 알릴 알콜 중에서는 불안정해 보였다[MeOH 및 EtOH의 전체 효소 활성(가수 분해 및 당 전이 반응 활성을 결합)은 H2O에서의 전체 효소 활성과 유사하였으나 고급 알콜 중에서는 훨씬 낮게 나타났다]. 글리세롤은 MeOH 또는 EtOH와 같이 우수한 수용체로 밝혀졌으며, 당 전이 반응 수율이 57%나 되었다.
Endo-A에 의한 다양한 GlcNAc 글리코사이드로의 당 전이 반응
Endo-A에 의한 작용기화된 몇가지 GlcNAc 글리코사이드로의 당 전이 반응은 표 2에서와 같이 효과적이었다. 수용체 농도가 0.2M인 경우, Endo-A는 Man9GlcNAc를, GlcNAc-O-(CH2)6NH2(전환된 기질의 93%), GlcNAc-O-CH2CH=CH2(99%), GlcNAc-O-(CH2)3CH=CH2(90%) 및 GlcNAc-O-(CH2)3NHCOCH=CH2(78%)로 이동시켰으며, 출발 기질 중 수율이 각각 81%, 81%, 84% 및 70%였다. Man9GlcNAc2Asn 3nmol, 효소 0.88mU 및 지정된 수용체를 함유하고, 30% 아세톤을 포함하고 있는 25mM 아세트산 암모늄 완충액(pH 6.0) 20μl을 37℃에서 15분간 반응시켰다. 30분동안 30에서 80mM까지 증가하는 NaOAc 선형 농도 구배로, 100mM NaOH를 사용하여 HPAEC 분석하였다.
| 수용체 | 농도a)(M) | 수율b) | 포도당전이 반응인덱스c)(%) | |
| 가수분해(%) | 포도당전이 반응(%) | |||
| GlcNAc | 0.2 | 4.1 | 84.7 | 95.4 |
| Bn-GlcNAc | 0.05 | 15.0 | 66.7 | 81.6 |
| 4mU-GlcNAc | sat.d) | 19.9 | 65.5 | 76.7 |
| pNP-GlcNAc | sat. | 45.8 | 32.8 | 41.7 |
| GlcNAc-O-(CH2)6NH2 | 0.2 | 6.5 | 81.1 | 92.6 |
| GlcNAc-O-CH2CH=CH2 | 0.2 | 1.2 | 80.8 | 98.5 |
| GlcNAc-O-(CH2)3CH=CH2 | 0.2 | 9.8 | 83.6 | 89.5 |
| GlcNAc-O-(CH2)3NHCOCH=CH2 | 0.2 | 20.2 | 69.8 | 77.6 |
| GlcNAc-S-CH2CN | 0.2 | 11.3 | 83.4 | 88.1 |
| GlcNAc-S-(CH2)3CH3 | 0.2 | 12.4 | 77.5 | 86.2 |
| (GlcNAc-S-CH2CH2CH2)2 | sat. | 42.0 | 42.6 | 50.4 |
| GlcNAc-S-CH2CONHCH2CH(OMe)2 | 0.2 | 4.0 | 81.0 | 95.3 |
| a)수용체의 농도b)출발 기질을 기준한 수율c)소화된 기질 전체에서 당 전이 반응 산물의 백분율d)sat.: 포화된 용액 |
용해도가 낮기 때문에, 사용된 벤질 β-GlcNAc의 농도는 0.05M이었고, 4mU B-GlcNAc 및 pNP β-GlcNAc는 포화 상태(0.05M 미만)에서 사용되었다. 이러한 농도에서도, 효소는 출발 올리고사카라이드 사슬 중 67%, 66% 및 33%를 각각 이동시킬 수 있었으며, 당 전이 반응 인텍스(소화된 기질로의 당 전이 반응 산물의 백분율)는 각각 82%, 77% 및 42%로 밝혀졌다. GlcNAc의 티오-글리코사이드는 Endo-A 당 전이 반응 수용체로 우수하다. GlcNAc-S-CH2CN, GlcNAc-S(CH2)3CH3및 GlcNAc-S-CH2CONHCH2CH(OMe)2를 0.2M에서 수용체로 사용하는 경우, 당 전이 반응 인덱스는 88%, 86% 및 95% 이고, 수율이 각각 83%, 78% 및 81%였다. 또한, GlcNAc의 2가 티오-글리코사이드인 (GlcNAc-S-CH2CH2CH2)2는 저농도(0.05M 미만)에서 Endo-A 당 전이 반응을 위한 수용체로 사용될 수 있고, 당 전이 반응 인덱스 50%, 수율 43%였다.
Endo-A에 의한 대규모 당 전이 반응의 반응 조건 최적화
당 전이 반응을 대규모로 실시하기 위하여, 고농도 기질에서 당 전이 반응을 위한 효소 및 아세톤 함량의 최적 수준을 결정하였다. 도 1A에서와 같이, 가수 분해 산물은 효소의 양에 비례하여 증가하였다. 당 전이 반응 산물의 수율은 효소 첨가에 따라 2.2mU까지 증가하였고, 효소가 더욱 첨가됨에 따라 감소하였다. 효소 2.2mU를 사용하는 경우, 기질은 5.6%만이 남았다. 반면에, 아세톤 함량이 35%까지 증가함에 따라, 당 전이 반응 산물은 증가하였고, 가수분해 산물은 감소하였다(도 1B). 35% 아세톤에서, HPAEC 분석을 통하여 당 전이 반응 86% 및 가수분해 7%가 관찰되었다. 40% 아세톤 배지에서 가수분해 산물이 발견되지 않았지만, 다량의 기질(출발 물질 64%)이 잔류하였으므로, 반응 효율은 다른 배지와 비교하여 낮았다.
Endo-A의 당 전이 반응 활성에 의한 Man
9
GlcNAc
2
-NAP의 합성
Man9GlcNAc2-NAP를 중합에 필요한 양만큼 제조하기 위하여, 반응 규모를 최적 조건에서 상기 규모의 500배로 하였다. 당 전이 반응 산물, Man9GlcNAc2-NAP는 HPAEC로 90%를 초과하였고(도 2), 출발 공여 기질 뿐 아니라 가수 분해 산물은 거의 검출되지 않았다. 미반응 수용체를 세파덱스 G-25 칼럼으로 겔 여과하여 회수하고, Man9GlcNAc2-NAP는1H-NMR 분석하여, 더 이상 정제하지 않고 중합에 사용하였다.
당 전이 반응 산물을 확인하기 위하여1H-NMR을 사용하였다. 도 3A에 도시된 바와 같이, 수용체의 신호는 분리 기술(decoupling technique)로 완전히 부여되었다. GlcNAc의 H-4 신호는 3.436ppm에서 확인되었고, 아노머성 양자 신호는 4.495ppm 근처에서 확인되었다. 반면에, 당 전이 반응 산물의1H-NMR 분석을 통해 10개의 새로운 아노머성 양자 신호가 관찰되어, 고 만노스형 당 사슬이 수용체로 이동되었음이 제시되었다. 참조값(Vliegenthart et al., 1983)을 기준한1H-NMR 부여값(assignments)은 표 3에 기재하고 있다. 내부 표준물로서 아세톤을 사용하고(δ=2.225ppm), 300 MHz 광도계를 사용하여, 25℃, D2O 중에서 GlcNAc-NAP 및 Man9GlcNAc2-NAP의1H-NMR 데이터를 기록하였다. 600MHz 광도계를 사용하여, 60℃, D2O 중에서 HDO(δ=4.441ppm)에 대한 Man9GlcNAc2-중합체의 화학적 이동을 기록하였다.
| 잔기 번호a) | Man9GlcNAc2-Asnb) | GlcNAc-NAP | Man9GlcNAc2-NAP | Man9GlcNAc2-중합체 |
| 1의 H-1 | 5.092 | - | 4.475 | 4.510 |
| 2의 H-1 | 4.610 | - | 4.579 | 4.611 |
| 1의 NAc | 2.015 | - | 2.021 | 2.041 |
| 2의 NAc | 2.067 | - | 2.060 | 2.070 |
| 3의 H-1 | -4.77 | - | 4.744 | 4.763 |
| 4의 H-1 | 5.334 | - | 5.324 | 5.322 |
| 4'의 H-1 | 4.869 | - | 4.859 | 4.874 |
| A의 H-1 | 5.404 | - | 5.395 | 5.379 |
| B의 H-1 | 5.143 | - | 5.135 | 5.122 |
| C의 H-1 | 5.308 | - | 5.300 | 5.290 |
| D1의 H-1 | 5.049 | - | 5.034 | 5.057 |
| D2의 H-1 | 5.061 | - | 5.034 | 5.073 |
| D3의 H-1 | 5.042 | - | 5.034 | 5.057 |
| a의 CH | - | 6.163 | 5.739 | 1.701 |
| a'의 CH | - | 5.748 | 6.161 | 1.701 |
| b의 CH | - | 6.278 | 6.262 | -2.307 |
| c의 CH | - | 3.301 | 3.291 | 3.136 |
| d의 CH | - | 1.802 | 1.791 | -1.701 |
| e의 CH | - | 3.944 | u.k.c) | u.k. |
| e'의 CH | - | 3.630 | u.k. | u.k. |
| a)상기 수는 도 3에 기재된 것과 동일하다.b)공개된 레포트(17)를 인용c)u.K.: 알려지지 않음 |
아노머성 신호는, 참조 화합물의 신호보다 높은 장에서 관찰되는 두 개의 GlcNAc 아노머성 양자를 제외한 Man9GlcNAc2Asn의 신호와 동일하였다. 이것은 GlcNAc 및 아글리콘 사이의 결합이, Man9GlcNAc2-중합체에서는N-아미드 결합이고, Man9GlcNAc2Asn에서는O-글리코사이드 결합이기 때문이다. GlcNAc-2 아노머성 양자의 커플링 상수는 7.8Hz로, Endo-A 당 전이 반응에 의하여 새로 형성된 결합이 β-형이라는 것을 나타내었다. 메틸 α-GlcNAc에서 얻은 결과와 동일하게, 3.436ppm인 환원된 말단에서의 GlcNAc H-4 신호는 더 이상 관찰되지 않았고, GlcNAc의 4-OH에서 결합이 일어나고 있음을 나타내었다. 질량 분광 분석법을 통하여, 당 전이 반응 산물이 원하던 분자량임을 알았다.
아크릴아미드를 사용하는 Man
9
GlcNAc
2
-NAP의 중합
촉매로서 TEMED 및 ASP를 사용하여, Man9GlcNAc2-NAP 및 아크릴아미드로부터 글리코폴리머를 얻었다. 세파덱스 G-50 칼럼의 보이드 부피(void volume)에서 용리된 중합체(도 4)를 포함하는 분획을 합하여 동결 건조하였다.1H-NMR 분석(도 5)에서, 아글리콘 및 아크릴아미드 모노머의 불포화 결합에 기인하는 6.2ppm 및 5.7ppm에서의 신호가 사라짐으로써 중합이 완결되었음을 알았다. 또한, NMR을 통하여 11 아노머성 양자 신호가 관찰되었고, 화학적 이동은 모노머에서 관찰되는 이동(표 3)과 유사하여, 중합체가 Man9GlcNAc2-당 사슬을 포함하는 것을 확인하였다. 표준물로서 만노스를 사용하는 페놀-H2SO4방법을 통하여, 중합체의 당 함량은 37%로 밝혀졌다. 따라서, 당 측쇄 대 아크릴아미드 잔기의 비율은 도 6에 도시된 바와 같이 1:44로 추정된다.
실질적으로 동일한 방법으로, 말단 위치에 2중 결합을 갖는 다른 화합물(예를 들면, 표 2의 GlcNAc-O-CH2CH=CH 및 다른 대표적인 화합물)을 합성할 수 있다. 아크릴아미드에 추가로, 다른 모노머(예를 들면, 스티렌 유도체, 비닐, 에폭시 및 에틸렌이민형 화합물 및 불포화 결합을 갖는 다른 화합물)도 중합할 수 있다.
글리코폴리머의 분자량 측정
참조 화합물로서 블루 덱스트란, B-아밀라아제, 알코올 디히드로게나아제, 소 혈청 알부민 및 탄소성 안히드라아제를 사용하여 HPGFC함으로써 글리코폴리머의 분자량을 측정하였다. 중합체는 보이드 부피 근처에 나타났으며, 머무른 부피(retention volume)는 블루 덱스트란보다 약간 더 컸다(분자량=2,000,000). 검정 곡선(도 7)에 따르면, 분자량은 1,500,000 내지 2,000,000였다.
글리코폴리머에 의한 만노스-결합 단백질 저해
Man9GlcNAc2글리코폴리머 및 동일한 Man9GlcNAc2를 포함하는 대두 아글루티닌(SBA)을 사용하여, 혈청- 및 간-MBP-CRDs상에서 고체-상 결합 검정을 실시하였다. 검정 결과는 도 8에 도시하였다. 실험한 SBA 농도 범위에서는, 혈청-MBP-CRD의 저해가 크게 관찰되지 않았다. 그러나, 간-MBP-CRD에서, I50값은 Man9GlcNAc2을 기준하여 13.2μM 또는 SBA 0.4mg/ml을 얻었다. 그러나, 글리코폴리머는 혈청-MBP-CRD에서 I503.5μM 및 간-MBP-CRD에서 I5074.5 nM이 관찰되었다. 글리코폴리머 전체로 볼 때, I50값은 각각 혈청-MBP-CRD에서 약 2.0x10-2mg/ml, 간-MBP-CRD에서 3.8x10-4mg/ml였다. Man9GlcNAc2가 혈청 형태의 MBP-CRD를 거의 저해하지 않으므로, 이러한 혈청 형태의 MBP-CRD에 대하여 전구체에 대한 글리코폴리머의 저해력 강화도(magnitude of inhibitory potency enhancement)를 정확하게 측정할 수 없다. 그러나, 간 형태에서는, 당 중합체의 당 함량이 SBA의 5.6배일 뿐이지만, Man9GlcNAc2을 기준하여 180배, 분자를 기준하여 약 1000배 강화되었다.
토 의
Endo-A는 30% 아세톤에서 충분한 당 전이 반응 활성( 90%)을 가지며, 다른 글리코니다아제(Bardales et al., 1989; Sakai et al., 1992; Cantacuzene et al., 1991; Nilsson, 1987 및 1989; Usui 및 Murata, 1988; 및 Usui et al., 1994)보다 활성이 10 내지 30% 높은 것으로 증명된다. 다른 반응에 적용 가능한 네오글리코컨쥬게이트 중간체를 합성하기 위하여 이를 사용할 수 있다.
또한, Endo-A는 Man9GlcNAc를 MeOH, EtOH 및 PrOH와 같은 알코올에 이동시킨다. MeOH(수득율 64%) 및 EtOH(수득율 47%)로의 당 전이 반응은, 다양한 원료로부터 β-크실로시다아제, α- 및 β-글루코시다아제 및 β-갈락토시다아제(20 내지 60%)를 사용하는 전이 반응(Shinoyama et al., 1988; 및 Shinoyama 및 Yasai, 1988)과 비교하여 유리하다. 그러나, PrOH 및 iPrOH로의 당 전이 반응은 MeOH 및 EtOH로의 반응만큼 효과적이지 못하였다. 흥미롭게도, 전체 효소 활성은 iPrOH에서보다 PrOH에서 더 낮지만, PrOH로의 당 전이 반응은 iPrOH로의 당 전이 반응보다 우수하였다. 또한, 글리세롤은 Endo-A 당 전이 반응에서 우수한 수용체였다. 디플로코커스 뉴모니아[Diplococcus pneumoniae, (Bardales 및 Bharanandan, 1989)]의 Endo-B-N-아세틸글루코사미니다아제 F(Trimble et al., 1986) 및 Endo-α-N-아세틸갈락토사미니다아제는 올리고사카라이드를 글리세롤의 Cl(3) 히드록시로 이동키는 것으로 알려져있다.
네오글리코컨쥬게이트의 합성시 유용한 작용기화 아글리콘을 갖는 몇가지 GlcNAc 유도체를 수용체로 사용하여 Endo-A 당 전이 반응 실험을 실시하였다. 이 시스템에서 출발 공여 기질을 기준한 수율은 0.2M 수용체를 사용하여 80% 이상이고, 0.05M 이하로 사용하는 경우에는 약 50%였다. 수용체 농도가 더 높다면, 당 전이 반응 수율은 더욱 향상될 수 있다.
또한, Endo-A 당 전이 반응은 표 2에서와 같이 반응물의 농도가 더 높으면 효과적이다. GlcNAc-NAP로의 대규모 당 전이 반응에서는, 분석 규모의 반응에서보다 당 전이 반응 수율이 훨씬 높았다(90%). GlcNAcα-OMe로의 당 전이 반응으로부터 비슷한 규모(4μmol)로 유사한 수율(89%)을 얻을 수 있다.
Endo-A 당 전이 반응 산물, Man9GlcNAc2-NAP를 아크릴아미드와 더욱 중합하여 글리코폴리머를 형성하였다. 최근에는 디- 또는 트리사카라이드를 갖는 글리코폴리머를 화학적으로 또는 케모-효소법(chemo-enzymatic method)으로 합성하고 있다(Kochetkov, 1984; Nishimura et al., 1991; Nishimura et al., 1994a 및 1994b; Kobayashi et al., 1994; 및 Fukase et al., 1994). 이것은 고도의 복합당 사슬을 갖는 글리코폴리머를 합성하기 위한 첫 단계로 생각된다. Endo-A 당 전이 반응은 효율이 높아, 이러한 네오글리코컨쥬게이트 쉽게 합성할 수 있다.
간단한 측쇄 팹티드에 부착함으로써 모노사카라이드가 밀집(clustering)하면, 몇가지 C-형 렉틴에 대한 저해력이 강화된다(Lee 및 Lee, 1987; 및 Lee et al., 1992). 1가 리간드에 비하여, 다가 리간드에 의한 친화도 강화는, 부분적으로 농도가 증가하는 단순한 효과로부터 기대되는 것 이상이며, 글리코사이드 밀집 효과(glycoside cluster effect)로 불린다. 글리코폴리머가 형성되면 글리코폴리머 응집이 용이하게 제공된다(Lee 및 Lee, 1994). 본 발명에서, MBP-CRDs의 저해는 동일한 Man9GlcNAc2올리고사카라이드를 포함하는 천연 당단백질(SBA)에 의한 저해시와 비교하여, 급격히 증가하는 것으로 판명된다. 간-MBP-CRD의 경우, 당단백질에 의한 저해력 강화는 천연 당단백질(SBA)에 대하여 약 180배였다. 유사하게, SBA에서 혈청 MBP-CRD의 저해력이 크지 않으나, 이의 올리고사카라이드로부터 유래한 글리코폴리머는 저해력이 놀랄만큼 우수하였다(I50=3.5μM). 이것은 마크로- 대 미크로-밀집(Lee, 1993)의 좋은 예이다[미크로-밀집은 결합 부위 간의 거리가 짧은 표적 당의 공간 배치 상태--예를 들면 1.5 내지 3.0nM이고; 마크로-밀집은 거리가 더 큰 공간 배치 상태이다(예를 들면, 50 내지 100nM)].
본 명세서에 기재된 화합물은 다양한 용도로 사용될 수 있음이 명백하다. 또한, 상기 다양한 화합물은 탄수화물 작용 및 신진대사 연구에 유용할 뿐 아니라, 진단 및 치료 목적으로, 예를 들면, 항원으로서 또는 탄수화물 특이 결합 단백질을 측정하거나 분리하기 위하여 사용할 수 있다.
혈청 시료에서 MBP의 측정
MBP는 미생물 또는 다른 외부물질(foreign agents)의 침투에 대하여 간에서 생성되는 급성 상 단백질(acute phase proteins, Reid, 1983, Sastry et al., 1991) 중 하나이다. MBP는 이러한 물질에 결합하여, 직접적으로 또는 대식세포를 통하여 이들을 파괴한다. 본 발명의 Man9GlcNAc2글리코폴리머는 결합 친화도가 만노스를 함유하는 천연 생성물보다 월등히 우수하고, C-반응 단백질과 유사한 방법으로 진단에 사용되어야 한다(Oyamada et al., 1992; Ohtake, 1993).
혈청 시료에서 MBP의 양을 측정하기 위하여, 다음 방법을 사용할 수 있다.
1) 도 6의 Man9GlcNAc2글리코폴리머를 ELISA 검정에 공통적으로 사용되는 효소, 예를 들면 알칼리 포스파타아제 또는 β-갈락토시다아제에 컨쥬게이트시킨다.
2) 만노스와의 결합능에 영향을 미치지 않는, MBP에 대한 모노클로날 항체를 표면을 도포하기 위하여 웰 안에 넣는다. 이러한 항체는 당업자에게 공지된 표준 기술, 예를 들면, 문헌[Quesenberry 및 Drickamer(1992)]에 기재된 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 실험하고자 하는 혈청 시료를 도포된 웰에 두고, 항체에 MBP를 결합시키기 유리한 조건 하에 배양하였다.
3) 결합되지 않은 물질을 적절히 세척하여 제거하고, (1)의 글리코폴리머-포스파타아제 복합체를 웰에 넣었다. 항체에 결합된 MBP는 글리코폴리머와 결합하여, 포스파타아제 활성을 갖는다. 적절한 기질을 첨가할 때, 포스파타아제 활성 수준은 혈청 시료 중 MBP의 척도이다.
이와 달리, 웰을 컨쥬게이트되지 않은 글리코폴리머로 도포하고, 혈청 시료를 첨가하고, 항-MBP와 반응한 결합 MBP를 포스파타아제 또는 다른 적합한 효소와 컨쥬게이트시킬 수 있다.
본 발명은, 현재 가장 실질적이고 바람직한 실시 형태로 고려되는 것을 기재한 것이나, 개시된 실시형태에만 한정되는 것이 아니며, 하기 청구항의 정신과 범위를 벗어나지 않는 한 다양한 변형이 가능하다.
상기한 참조문헌들은 다음과 같이 상세하게 기재하였으며, 이를 참조로 병합한다. 이어서, 결합 효소 활성을 통하여, MBP 수준을 앞서와 같이 결정할 수 있다.
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상기 다양한 화합물은 탄수화물 작용 및 신진대사 연구에 유용할 뿐 아니라, 진단 및 치료 목적으로, 예를 들면, 항원으로서 또는 탄수화물 특이 결합 단백질을 측정하거나 분리하기 위하여 사용할 수 있다.
Claims (11)
- 아트로박테르 프로토포르미아(Arthrobacter protophormiae)의 Endo-β-N-아세틸글루코사미니다아제 및 유기 용매를 포함하는 반응 혼합물 중에서 글리코사이드를 합성하는 단계를 포함하는 방법을 통하여 제조되는 네오글리코컨쥬게이트.
- 아트로박테르 프로토포르미아의 Endo-β-N-아세틸글루코사미니다아제를 사용하여 유기 용매를 포함하는 반응 혼합물 중에서 합성되는 모노머 또는 중간체로서,R-GlcNAc-O-(CH2)3NHCOCH=CH2,R-GlcNAc-O-CH2CH=CH2,R-GlcNAc-O-(CH2)3CH=CH2,R-GlcNAc-S-CH2CN,R-GlcNAc-S-CH2CONHCH2CH(OMe)2및R-GlcNAc-O-(CH2)6NH2(단, 상기 식에서 R은 ManxGlcNAc이고, x는 3 내지 12의 정수이다.)를 포함하여 이루어지는 그룹에서 선택되는, 네오글리코컨쥬게이트 합성용 모노머 또는 중간체.
- 제 2항에 있어서, 상기 유기 용매는 아세톤임을 특징으로 하는 모노머.
- 제 2항에 있어서, 상기 x는 6 내지 9의 정수임을 특징으로 하는 모노머.
- 제 3항에 있어서, 상기 x가 9임을 특징으로 하는 모노머.
- i) 아트로박테르 프로토포르미아의 Endo-β-N-아세틸글루코사미니다아제 및 유기 용매를 포함하는 반응 혼합물 중에서 공여체 및 수용체를 결합시키고,ii) 상기 반응 혼합물을 적당한 조건 하에 배양하여 당 전이 반응 산물을 제조하고,iii) 상기 반응 혼합물 중의 당 전이 반응 산물을 세파덱스 칼럼 상에서 정제하고,iV) 상기 당 전이 반응 산물을 중합하는 단계를 포함하여 합성하는, 고 만노스형 당 사슬을 갖는 글리코폴리머.
- 제 6항에 있어서, 상기 중합시 아크릴아미드를 사용하는 것을 특징으로 하는 글리코폴리머.
- 간의 만노스 결합 단백질을 저해하는, 부속 Man9GlcNAc2사슬을 갖는 글리코폴리머.
- 도 6의 글리코폴리머.
- i) 아트로박테르 프로토포르미아의 Endo-β-N-아세틸글루코사미니다아제 및 유기 용매를 포함하는 반응 혼합물 중에서 공여체 및 수용체를 결합시키고,ii) 상기 반응 혼합물을 당 전이 반응 산물 생성에 적당한 조건 하에서 배양하고,iii) 상기 당 전이 반응 산물을 중합하는 단계를 포함하여 이루어지는, 만노스 함유 글리코폴리머의 합성 방법.
- 제 10항에 있어서, 상기 글리코폴리머가 부속 Man9GlcNAc2사슬을 갖는 글리코폴리머임을 특징으로 하는 방법.
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