KR19990008239A - 성장인자-유사 활성을 갖는 펩티드 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열 ANVAENA (서열식별번호: 1) 의 합성 펩티드에 관한 것이다. 시토모듈린이라 명명된 상기 펩티드는 다양한 세포유형에서 광범위한 TGF-β1 활성을 모방할 수 있다. 조직 치유과 같은 용도의, 시토모듈린이 부가부가혼합된 또는 매트릭스상에 수반된 생체적합성 매트릭스를 함유하는 조성물이 제공된다.

Description

성장인자-유사 활성을 갖는 펩티드 조성물

성장인자는 체내에서 또는 시험관내에서 동물세포중 제한된 집단의 성장에 영향을 미치는 펩티드 호르몬과 같은 물질이나, 영양물질은 아니다. 조직의 성장 및 분화에 관여하는 단백질은 성장을 촉진 또는 저해하고, 분화를 촉진 또는 저해하며, 따라서 일반적인 용어 성장인자는 사이토킨 및 영양인자를 포함한다.

성장인자는 전형적으로 분자량이 5000 내지 50,000 달톤의 범위인 폴리펩티드이다. 구조적인 유사성을 기준으로, 성장인자는 하기: 인슐린-유사 성장인자 (IGFs), 혈소판-유래 성장인자 (PDGFs), 섬유아세포 성장인자 (FGFs), 외배엽성 성장인자 (EGFs), 신경 성장인자 (NGFs), 및 형질전환 성장인자-베타 (TGF-βs) 를 포함하는 군으로 분류되어진다.

형질전환 성장인자-β 는 원래 정상 섬유아세포를 고착-비의존성 성장이 가능한 세포로 형질전환시키는 그들의 능력때문에 명명되었다. 그러나, 상기 명칭에도 불구하고, TGF-β 는 다양한 외배엽성, 내배엽성, 및 중배엽성 세포의 정상적인 발달, 성장 및 분화에 요구되는 다기능성 성장인자이다. 다른 사이토킨과 같이, TGF-β 의 특이적 효과는 특정 세포유형 및 그의 주변환경에 의존한다. 세포에 미치는 TGF-β 의 효과는 일반적으로 증식성 및 비-증식성으로 분류된다. 섬유아세포에 대한 1차 실험에서 처음으로 확립된 바와 같이, TGF-β 는 진정한 성장인자이다. TGF-β 에 의해 증식이 증가되는 2 개의 중요한 세포 유형은 골아세포 (osteoblast) 와 말초신경 시스템의 쉬반 (Schwann) 세포이다. 그러나, 많은 세포에서, TGF-β 는 세포증식의 강력한 저해자이다. 이러한 음성 성장제어는 특정 조직의 재생을 억제하는 조절기작일 수 있으며, 암발생 초기에 작용할 수 있다.

TGF-β 의 가장 중요한 비-증식성 기능은 세포외성 매트릭스의 형성을 증가시키는 것이다. 비록 이것이 기본적으로 콜라겐 및 피브로넥틴 모두의 증가된 전사를 통해 달성된다 할지라도, 프로테아제가 매트릭스를 분해하는 것을 저해하는 것도 그의 안정성에 기여한다. 세포외성 매트릭스의 분해는 프로테아제 자체의 분비 감소 및 프로테아제 저해자 수준의 동시적인 증가에 의해 억제된다. 세포외성 매트릭스에 미치는 TGF-β 의 현저하고 일반화된 효과는 조직 치유 과정 및 특정 섬유아성 질환의 발병에서 중요한 역할을 한다고 여겨진다.

최근에, TGF-β 에 대한 몇몇 상이한 수용체를 코딩하는 DNA 가 문헌 [Lin 등, PCT 출원 WO93/09228, 1993년 5월 13일 공개] 에 기재되었다. TGF-β 수용체의 입수가능성이 TGF-β 기능의 그 이상의 평가를 촉진할 것이다.

TGF-β 수퍼군중 많은 원들의 특성이 규명되었다. 예를 들어, 바슬러 (Basler) 등은 TGF-β 수퍼군 원간의 서열 유사성을 도식적으로 나타내었다 [Cell, 73, pp. 687-702 (1993)]. 또한, 문헌 [Massague, Annu. Rev. Cell Biol., 6, pp. 597-641 (1990)] 은 TGF-β 작용의 기작에 관한 논의를 포함하여, 형질전환 성장인자-β 군을 고찰하고 있다. 문헌 [Daopin 등, Proteins, 17, pp. 176-192 (1993)] 은 TGF-β1 2차 구조의 NMR 특성을 보고하고 있으며, TGF-β2 의 정제된 3차 결정 구조를 기재하고 있다. TGF-β2 의 단량체는 손의 4 손가락을 형성하는 2 개의 역-평행 (anti-parallel) β-시이트를 갖는 약간 구부린 왼손과 유사한 폴드(fold)를 채택한다. 보존된 디술피드와 함께 상기 4 손가락 지역이 TGF-β 수퍼군에 대한 폴드를 정의한다.

또한, TGF-β 원중에는, 뼈 형성 단백질 (Bone Morphogenetic protein: BMP) 이 있다. BMP 는 상처치료, 조직치료에 유용하며, 연골 및/또는 뼈성장을 유발한다고 알려져 있다. 예를 들어, PCT 출원 9309229 (발명자: Israel 및 Wolfman, 1993년 5월 13일 공개) 는 뼈 골절 치료 및 가능하다면 치근막 질병의 치료 및 다른 치아 치유 과정과 같은 뼈 자극 활성을 갖는 단백질의 용도를 기재하고 있다. CEN 의 최근 특별호 [Hubbel 및 Langer, pp. 42-54 (1995년 3월 13일)] 은 BMP 가 중합체 입자내에 함입되어, 중합체가 분해됨에 따라, 단백질이 주변 조직으로 서서히 방출되고, 거기에서 세포의 다공성 매트릭스내로의 이동, 궁극적으로 신규 뼈의 합성을 자극한다는 것을 보고하고 있다. 상기 문헌은 또한 서서히 방출되는 TGF-β 에 의해 뼈가 생성된다는 것을 특별히 언급하고 있다.

임상치료에서 TGF-β 의 광범위한 용도로 인하여, 이들은 많은 연구의 초점이 되고 있다. 비록 많은 연구가 시험관내 용도를 포함하고 있다 할지라도, 최근의 생체 연구는 보다 전도가 유망한 시험관내 효과중 약간을 확인하였다. 결과적으로, TGF-β 에 대한 가능한 임상용도중 약간은 혈관형성 자극, 상처치료와 관련된 육아(肉芽) 조직의 형성, 뼈 및 연골의 형성을 포함한다.

TGF-β 를 코딩하는 핵산 및 TGF-β 에 대한 다양한 용도가 문헌 [미국특허 5,284,763, 1994년 2월 8일 출원, 발명자: Derynk 및 Goeddel] 에 기재되어 있다.

문헌 [미국특허 5,258,029, 1993년 11월 2일 출원, 발명자: Chu 등] 은 이식후 일어나는 뼈의 비성장과 함께 내충격성 보철 (stress-bearing prothesis) 을 기재하고 있으며, 보철은 콜라겐 조성물 또는 세라믹에 의해 수반되는 TGF-β 를 포함한다. 미국특허 제 5,368,858 호 [1994년 11월 29일 출원, 발명자: Hunziker] 는 증식제, 화학주화성제 (chemotactic agent), 및 형질전환 인자로서 TGF-β 를 포함하는 생분해성 매트릭스의 제조를 기재하고 있다.

미국특허 제 5,055,447 호 [1991년 10월 8일 출원, 발명자: Palladino 등] 는 균혈(菌血)성 감염에 의해 야기되는 패혈증 쇼크의 치료 및 예방법, 및 치료 및 예방조성물을 기재하고 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 특허는 형질전환 성장인자-β 를 투여함에 의한 패혈증 쇼크의 위험으로 고생하는 환자를 위한 치료법을 제공한다. 최근에, 패혈증의 개념은 염증성 질병과 같이 보다 광범위하게 고찰되고 있으며, 일단의 연구자들은 패혈증 (혈류내 박테리아의 존재에 의한 감염) 과 다른 (비-패혈성) 감염성 질병을 기술하기 위하여 전신성 염증성 반응 증후군 (systemic inflammatory response syndrome) 이라는 명칭을 제안하였다 [Chest, 101, pp. 1644-1655 (1992)].

따라서, 성장인자는 다수의 치료, 임상, 연구, 진단 및 약물 설계 용도로 유용하다. 그러나, 전기한 바와 같이, 성장인자는 전형적으로 크다. 형질전환 성장인자-β 군의 자연적인 원들은 25 KDa 분자량 이상의 범위이다. TGF-β 를 포함하여, 성장인자의 임상적 용도는 그들의 크기로 인하여, 예를 들어 면역 반응의 야기에 기인하여 제한될 수 있다. 예를 들어, 사람 TGF-β 는 25,000 달톤의 동종이량체성 단백질이다. 일어날 수 있는 불리한 면역학적 반응과 더불어, 큰 단백질은, 때때로 투여 및 전달의 어려움으로 인하여, 약물로서 최선의 후보는 아니다.

결과적으로, 상기 문제점 등을 대부분 피할 수 있는 천연 성장인자의 소형 펩티드 유사물이 TGF-β 에 대해 제안된 것들을 포함한 용도로 바람직할 것이다. 몰당 1 몰의 기준으로 소형 펩티드가 투여용으로 보다 적은 순수 량을 필요로 하고, 국부적 용도가 보다 용이하기 때문에, 소형 펩티드가 큰, 천연원의 생물학적 활성을 모방하도록 하는 것이 유리하다. 또한, 초소형 펩티드는 불리한 면역학적 반응을 거의 갖고 있지 않으며, 간단한 펩티드 화학적 방법을 사용하여 용이하게 합성할 수 있었다.

발명의 개요

본 발명은 시토모듈린이라 불리는 신규 펩티드의 특성, 성질 및 용도를 개시하고 있다. 시토모듈린은 광범위한 TGF-β 활성을 다양한 세포유형에서 모방할 수 있다. 또한, 사람 골형성성 육종 (human osteogenic sarcoma) 세포 계열에서의 초기 결과는, 골아세포 표현형의 특징적인 마커 (알칼라인 포스파타아제 및 오스테오넥틴) 를 특이적으로 자극하는 그의 능력에 의해 증거되는 바와 같이, 시토모듈린 또한 뼈 형성 단백질 (BMP) 및 골형성성 단백질 (OP) 와 같이 TGF-β 수퍼군의 다른 원들에 대한 유사물일 수 있다는 것을 암시하고 있다.

우리가 시토모듈린 이라 부르는 상기 신규 화합물은 하기의 아미노산 서열: Ala-Asn-Val-Ala-Glu-Asn-Ala (서열식별번호: 1) 을 갖고 있으며, 당 분야에 공지된 기술에 의해 용이하게 합성된다. 따라서, 본 발명의 한 측면으로, 전기한 서열식별번호: 1 의 아미노산 서열을 갖는 생물학적으로 활성인 펩티드가 제공된다.

본 발명의 다른 측면으로, 조직 치유용 조성물은 실질적으로 서열식별번호: 1 과 동일한 아미노산 서열을 갖는 펩티드 (성장인자) 와 결합된 생체적합성 매트릭스를 함유한다. 생체적합성 매트릭스는 생분해성 또는 비생분해성일 수 있다. 상기 펩티드는 세포성장을 촉진하기에 유효한 양으로 매트릭스와 부가혼합되거나 또는 매트릭스 상에 수반된다. 상기 매트릭스는 연조직 및 경조직의 치유용, 결손 조직의 신속한 대체용, 및 복원성 및 성형 수술용 주형 제조에 유용하다. 상기 합성물은 세포성 재생을 제공 및 지속시키며, 비록 놀랍게도 본 발명의 바람직한 펩티드 구현예가 외배엽성 성장인자 및 혈소판-유래 성장인자와 같은 추가적인 성장인자 없이 상피세포 콜로니 형성을 야기한다 할지라도, 다른 성장인자와 결합하여 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 측면으로, 실질적으로 동일한 서열식별번호: 1 화합물 (염형태일 수 있음) 및 약학적으로 상화적인 담체를 함유하는 약제학적 제형이 제공된다.

우리가 시토모듈린이라 이름붙인 서열식별번호: 1 화합물은, Mv-1-Lu 밍크 폐 표피세포내 DNA 합성의 저해, NRK-49 F 상피세포에 의한 성장 및 콜로니 형성의 촉진, 유형 I 콜라겐의 증진된 발현 유도, 및/또는 TGF-β 발현 유도와 같은, TGF-β 의 생물학적 활성중 하나 이상과 유사한 생물학적 활성을 갖고 있다.

본 발명은 일반적으로 성장인자 및 친신경성 (neurotrophic) 인자, 보다 특별히 TGF-β 성장인자 활성을 갖는 (또는 모방하는) 소형, 합성 펩티드 및 상기 소형 펩티드를 포함하는 매트릭스 및 조성물에 관한 것이다.

도 1 은 시토모듈린에 의한 Mv-1-Lu 밍크 폐 표피세포 DNA 합성의 저해를 그래프로 나타낸 것이다.

도 2 는 현미경 사진 (배율 500배) 으로, 패널 (A) 는 대조군이고, 패널 (B) 는 100nM 시토모듈린, 패널 (C) 는 100 nM 시토모듈린과 EGF 및 PDGF 를 처리한 것이다. 모두 소프트 아가 (soft agar) 에서 NRK-49 F 정상 쥐 신장 상피세포에 5 일간 처리하였다.

도 3 은 시토모듈린에 의한 HOS 세포에서의 유전자 발현 조절을 그래프로 나타낸 것으로, 패널 (A), (B), 및 (D) 는 증가되는 발현을 나타내는 반면에, 패널 (C) 는, 세포에서 TGF-β 의 특징인, 농도에 따른 조절된 활성을 나타낸다.

도 4 의 패널 (A) 에서 (D) 는 도 3 과 각 패널 (A) - (D) 에 그래프로 나타낸 데이타에 해당하는 노던 블롯이다.

도 5 는 본 발명의 시토모듈린 구현예중 원자번호 1-101 에 대한 원자성 좌표를 나타낸다.

본 발명의 펩티드는 생리학적 조건에서 -Val-Ala- 에 의해 형성된 안정한 β-굴곡을 갖는다. 상기 안정한 β-굴곡은 하나 이상의 인접 하전 아미노산 잔기에 의해 안정화된다. 우리가 시토모듈린 이라 부르는 상기 신규 화합물은 하기의 아미노산 서열: Ala-Asn-Val-Ala-Glu-Asn-Ala (서열식별번호: 1) 을 갖고 있으며, 당 분야에 공지된 방법에 의해 용이하게 합성된다.

상기 펩티드는 다양한 적합한 방법, 바람직하게는 알.비. 메리필드에 의해 처음으로 개발되고 문헌 [Solid Phase Peptide Synthesis, 1984] 에 제이.엠. 스튜어트 및 제이.디. 영에 의해 기재된 바와 같이, 자동 또는 수동의 고형상 합성법에 의해 합성될 수 있다. 화학적 합성은 C-말단에서 시작하여 예정된 순서로 아미노산을 결합시킨다. 염기성 고형상 방법은 C-말단이 보호된 α-아미노산을 적절한 불용성 수지 지지체에 커플링시키는 것이 필요하다. 합성용 아미노산은 다음의 잔기 (또는 수지 지지체) 와 적합한 펩티드 결합 형성을 보증하기 위하여 α-아미노상의 보호를 필요로 한다. 카르복시 말단에서의 축합반응을 완료한 후, α-아미노 보호기를 제거하여 다음의 잔기가 추가될 수 있게 한다. 몇몇 부류의 α-보호기가 문헌 [J.M. Stewart 및 J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis] 에 기재되어 있으며, 산 불안정성 우레탄-기재 3차-부틸옥시카르보닐 (Boc) 이 역사적으로 바람직하다.

염기 불안정성 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐 (FMOC) 를 포함하여, 다른 보호기와 관련 화학적 스트라티지가 사용될 수 있다. 복잡한 배열의 기능성 블로킹기가 스트라티지 및 그의 용도의 한계와 함께 문헌 [M. Bodansky, Peptide Synthesis (1976); J.M. Stewart 및 J.D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis (1984)] 에 고찰되어 있다.

고형상 합성은 상기 기재된 C-말단 α-보호 아미노산 잔기의 커플링에 의해 시작된다. 커플링은 1-히드록시벤조-트리아졸 (HOBT) 이 있는 또는 없는 디시클로헥시카르보디이미드 (DCC), 디이소프로필카르보디이미드 (DIIPC), 또는 에틸디메틸아미노프로필카르보디이미드 (EDC) 와 같은 활성화제를 필요로 한다. C-말단 잔기를 커플링 시킨 후, 산 불안정성 3차-부틸옥시카르보닐 (Boc) 기의 경우, 디클로로메탄중 트리플루오로아세트산 (25% 이상) 에 의해 α-아미노 보호기를 제거한다. 디클로로메탄중 트리에틸아민 (10%) 로 중화시키는 단계는 유리 아민 (염에 대하여) 을 회복시킨다. C-말단 잔기가 수지에 추가된 후, 보호된 펩티드 사슬을 연장시키기 위하여, 탈보호, 중화 및 커플링의 주기가, 중간의 세척단계와 함께 반복된다. 각 보호된 아미노산은 적합한 용매중 동몰량의 커플링 시약과 함께 과량으로 (3 내지 5배) 도입되어진다. 최종적으로, 수지 지지체상에서 완전히 블로킹된 펩티드를 조립한 후, 시약을 처리하여 수지로부터 펩티드를 잘라내고 측쇄 블로킹기를 제거한다. 무수 불화수소 (HF) 는 산 불안정성 3차-부틸옥시카르보닐 (Boc) 화학기를 잘라낸다. 특히 측쇄 기능기상에서의 부가반응을 피하기 위하여, 디메틸술피드 및 아니솔 (anisole) 과 같은 몇몇 친핵성 스캐빈저가 포함되어진다.

우리는, 배양중인 세포에 10 ^-9 내지 10^-6M (1.4 pg/mil 내지 1400 pg/mil) 의 농도로 첨가하였을 때 몇몇 상이한 세포 유형에서 특정 고특이성 효과를 유발하고, 따라서 성장인자 유사 행동을 증명하는, 시토모듈린을 제조하였다. 예를 들어, 관찰된 효과중에는, Mv-1-Lu 밍크 폐 표피세포내 DNA 합성의 저해, 소프트 아가에서 NRK-49 F 상피세포에 의한 성장 및 콜로니 형성, 사람 신생아 피부 상피세포의 1차 배양세포 및 HOS (human osteogenic sarcoma: 사람 골형성 육종) 세포 계열 모두에서 유형 I 콜라겐의 증진된 발현 유도, 및 형질전환 성장인자-β 의 유도가 있다.

신규 Val-Ala β-굴곡 펩티드는 신경 및 근육세포의 생존 증진제 또는 성장유도제로서의 용도가 있다고 생각되어진다. 물론, 시토모듈린은 체외에서 신경세포의 배양에 사용하기 위한 배양배지의 신규 성분으로 유용하다. 또한, 상기 펩티드는 수술시 상처치료 및 재생을 촉진하는 시약으로서; 정형외과에서 뼈 치유 및 삽입물 동화를 촉진하는데; 치과에서 뼈 결합 및 삽입물 동화에; 암 화학치료 및 방사선 치료시 세포-주기 특이적 방법에 대한 정상 지주세포의 보호를 위한 세포증식억제제로서; 류마티스 관절염 치료시; 안과에서 각막성 상해의 회복시; 안과에서 포도막염의 치료시; 장 동맥 폐색 재관류 상해의 보호제로서; 및 성장인자의 생물학적 연구용 시약으로서의 용도를 포함하는 많은 분야에서 천연 사이토킨의 대용품으로의 용도를 갖고 있다.

본 발명의 치료 조성물은 요구되는 유효량 및 사용되는 투여형태에 따른 다양한 농도의 신규 Val-Ala β-굴곡 펩티드를 포함한다. 시토모듈린 조성물을 위한 다양한 치료 적용을 용이하게 생각할 수 있다. 첫 번째 적용은 상처 치료의 촉진을 위한 절개부 또는 노출 조직에의 국부적용이다. 치료될 수 있는 상처 또는 다른 외상으로는 (그러나 여기에 제한되지는 않음) : 1, 2, 3도 화상 (특히 2 및 3도); 미용 외과의 절개를 포함하는 표피성 또는 내부 외과 절개부; 열상, 자상, 및 투과를 포함하는 상처; 욕창, 당뇨, 치과, 혈우병, 및 정맥류를 포함하는 표피성 궤양이 있다.

전신투여, 국부투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 복강내 투여, 골막하 (sub-periosteal) 투여, 기관내 투여, 중합체 또는 펌프에 의한 방출, 삽입물, 또는 리포좀에 의한 방출과 같은 방식의 다양함에 따른 용도가 있을 수 있다. 적절한 삽입물로는 (삽입장치를 사용할 경우), 예를 들어, 겔 포암, 왁스, 또는 미세입자-기재의 삽입물이 있다. 사용되는 투여량은 유효한 활성성분의 순환 혈장농도를 수득하기에 충분해야만 한다. 유효투여량은 체외 또는 동물 모델 시험 시스템에서 유래된 투여량-반응 곡선으로부터 추론될 수 있다.

또한, 상기 신규 시토모듈린은 뼈 성장 유도에 유용하다. 따라서, 해당 부위에서 뼈의 침착 및 성숙을 유도하기 위하여, 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제중 상기 신규 펩티드의 뼈형성에 유효한 양을 투여할 수 있다. 또한, 상기 시토모듈린은, 인용으로 여기에 모두 포함되어 있는 미국특허 제 5,178,845 호 (1993년 1월 12일 출원) 에 기재된 바와 같은 조성물에 의해, 미국특허 제 5,158,934 호 (1992년 10월 27일 출원), 제 5,208,219 호 (1993년 5월 4일) 에 기재된 바와 같은 방법에서, 뼈 생성 및 치유 용도로 히드록시아파타이트와 같은 생합성물질 (biomaterial) 과 부가혼합되거나 이에 의해 수반될 수 있다.

상기 뼈 치유 조성물로는, 예를 들어, 신토그라프트 (Synthograft), 트리칼슘 포스페이트, 또는 페리오그라스라는 표시하에 시판중인 히드록시아파타이트와 같은 다양한 인산칼슘 광물성분 물질이 있다. 히드록시아파타이트 (트리칼슘 포스페이트) 는 시중에서 구입하는 것보다, 문헌 [Termine 등, Arch. Biochem. Biophys., 140, TP307-325 (1970)] 에 공개된 방법과 같은 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 물질은 전형적으로 약 100 - 2,000 μ 의 바람직한 입자크기의 분말형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 시토모듈린 조성물용의 또 다른 치료 적용은 매트릭스 형성 물질과의 결합이다. 바람직하게는, 상기 제제로는 뼈 및 연골을 발달시키기 위한 구조를 제공할 수 있는 매트릭스가 있다. 잠재적인 매트릭스는 생분해성 또는 비-생분해성일 수 있고, 화학적으로 또는 생물학적으로 정의될 수 있다.

하나의 예로는, 상기 매트릭스는 공지되어 있고 또한 현재 세포배양 용기로 사용중인 것과 같이 불활성, 고형 비-다공성일 수 있다.

본 발명의 매트릭스로 취해질 수 있는 또 다른 형태는 용해성 중합체 형태이다.

본 발명의 실시를 위한 다른 적합한 매트릭스로는 다양한 중합체 및 히드로겔이 있다. 상기 합성품은 연조직의 치유용, 결손조직의 신속한 대체, 및 복원성 및 성형수술용 주형을 제조하는 데 유용하다.

따라서, 본 발명의 합성물은 펩티드가 수반된 또는 중합체성 물질의 격자형 배열상에 이식되어 있는 다양한 종류의 재흡수성 중합체로 만들어질 수 있다. 물론, 몇몇의 예로서, 히드록시에틸 메트아크릴레이트, 폴리메틸메트아크릴레이트, 및 N-비닐피롤리돈 메틸메트아크릴레이트와 같이 흡수성 면에서 제한되어 있는 중합체성 지지체도 적합하다. 상기 합성물은 이후에 조직 결손부위에 삽입될 수 있다.

공지된 적합한 흡수성 히드로겔중에는 폴리악탁테 및 폴리글리콜레이트의 조합물이 있다. 본 발명의 화합물은 중합체 자체의 합성중에 상기 물질에 공유결합될 수 있거나, 중합체를 조사하거나 또는 화학적으로 활성화시켜 유리 라디칼을 생성함으로써 부착부위를 만드는 방식으로 상기 중합체가 가수분해되어 될 수 있다. 이후, 펩티드를 중합체 지지체상에 이식 또는 공정시키는 통상적인 기술을 사용하여 본 발명의 합성물을 제조할 수 있다. 이렇게 제조된 흡수성 히드로겔 또는 중합체는 연조직 복원에 특히 유용하다. 경조직 복원 또는 치유을 위해서는 (예를 들어, 뼈 치유), 수용성, 또는 흡수성 중합체 종류와, 예를 들어 바이오글라스와 같은 바이오세라믹, 칼슘 알루미네이트, 트리칼슘 포스페이트, 및 히드록시아파타이트를 조합시키는 것이 바람직하다.

시토모듈린이 생리학적으로 허용가능한 담체, 즉 사용된 투여량 및 농도에서 수여자에게 비-독성인 담체와 부가혼합함으로써 투여용으로 제조되는 경우, 이는 정상적으로는 시토모듈린의 완충액, 아스코르브산과 같은 항산화제, 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드, 단백질, 아미노산, 글루코오즈 또는 덱스트린을 함유하는 탄수화물, EDTA 와 같은 킬레이트화제, 및 다른 부형제와의 조합이 일어난다. 치료용 투여에 사용하기 위한 시토모듈린은 멸균된 것이어야 한다. 이는 멸균여과막 (0.22 미크론) 을 통과시키는 여과법에 의해 용이하게 달성된다.

신규 Val-Ala β-굴곡 펩티드는 모든 약학적으로 허용가능한 담체내에서, 투여의 원하는 양태에 따라 투여될 수 있으며, 액체 담체와 리포좀, 미크로캡슐, 중합체 또는 왁스-기재의 제어되는 방출제제로 제형화되거나, 또는 정제, 알약, 또는 캡슐 형태로 제형화될 수 있다.

상기 펩티드는 유기 및 무기산과 약학적으로 허용가능한 염을 형성하고, 염 형태로 투여되거나 상기 신규 펩티드를 아미드화시킬 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염의 형성을 위한 적절한 산의 예로는 염산, 황산, 인산, 아세트산, 벤조산, 시트르산, 말론산, 살리실산, 말산, 푸마르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산, 아스코르브산, 말레산, 벤젠-술폰산, 메탄 및 에탄술폰산, 히드록시메탄 및 히드록시에탄술폰산이 있다.

적절한 유기 약학적으로 허용가능한 염기 첨가 염과 함께 염이 형성될 수도 있다. 상기 유기 염기는 그의 한계가 당 분야의 숙련자에게는 용이하게 이해되어지는 군을 형성한다. 단지 예시를 위하여, 상기 군으로는 메틸아민, 디메틸아민, 및 트리메틸아민과 같은 모노-, 디, 및 트리알킬아민; 모노-, 디-, 및 트리에탄올아민과 같은 모도, 디, 또는 트리히드록시알킬아민; 아르기닌 및 리신과 같은 아미노산; 구아니딘; N-메틸글루코사민; N-메틸글루카민; L-글루타민; N-메틸피페라진; 모르폴린; 에틸렌디아민; N-벤질펜에틸아민; 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 등이 있다는 것을 들 수 있다 [참조: 예를 들어 Pharmaceutical Salts, J. Pharm. Sci., 66(1), 1-19 (1977)].

골세포 성장 촉진용과 같은 시토모듈린의 치료제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 신규 펩티드를 임의의 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제와 부가혼합함으로써 동결건조된 케이크 또는 수용액 형태의 보존용으로 제조될 수 있다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 투여시 사용된 투여량 및 농도에서 수여자에게 비독성이며, 인산, 시트르산, 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산을 포함하는 항산화제; 저분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로뷸린과 같은 단백질을 포함한다.

다른 성분으로는 글리신, 블루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 또는 리신; 글루코오스, 만노오스, 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물; EDTA 와 같은 킬레이트화제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 슈가 알코올; 나트륨과 같은 염-형성 카운터이온; 및/또는 TWEEN, PLURONICS 또는 PEG 와 같은 비이온성 계면활성제를 들 수 있다. 시토모듈린의 치료제중에 바람직하게 포함되는 추가적인 유효성분으로는, 예를 들어, 외배엽성 성장인자 (EGF) 및 혈소판-유래 성장인자 (PDGF) 와 같은 하나 이상의 다른 성장인자가 있다.

상처 치료와 같은 국부적용용 시토모듈린의 초기 투여량은 약 50 내지 500 ng/ml 의 농도로 치료부위에 전달된 후 임상적 경험에 따라 조정되어야만 한다. 시토모듈린 조성물은 세포의 재생을 제공하고 동시에 유지하기 때문에, 상기 조성물의 계속적인 적용 또는 주기적인 재적용이 표시된다. 임상의사가 임상적 경험에 따라 투여량을 변화시키는 것이 기대된다.

시토모듈린 조성물은, 예를 들어, 여기에 참고로 포함되어 있는 미국특허 제 5,354,736 호 (1994년 10월 11일 출원, 발명자: Bhatnagar) 에 기재되어 있는 바와 같이, 멸균 자극제의 형태로, 바람직하게는 생리 식염수와 조합하여, 또는 연고 또는 현탁액 형태로, 바람직하게는 일찍이 명시한 다른 성장인자, 및 콜라겐, 콜라겐 아날로그, 또는 콜라겐 유사체와 조합하여 사용될 수 있다. 상기 조성물은 또한 경피 패취, 고약, 및 밴드류, 바람직하게는 액테 또는 반-액체 형태로 스며들게 할 수 있다. 실버 술파디아진과 같은 자가미생물제 (automicrobial agent) 가 상기 물품 또는 조성물에 포함되어야만 한다.

시토모듈린은 또한 상처 및 유사한 외상의 치료를 위해 전신에 투여될 수 있다. 전신 투여는, 암 환자에서 종양성 세포성장을 자극하는 것과 같은 원치 않는 부작용이 없거나 또는 제한적일 경우 유용하다. 전신 투여용 시토모듈린 조성물은 바람직하게는 멸균, 등장 경구 주사 또는 주입의 형태로 제형화된다.

앞에서 기재된 바와 같이, 시토모듈린 조성물은 시토모듈린 단독 또는 전기한 바와 같은 다른 성장인자, 콜라겐, 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제와 조합의 형태로 생물학적으로 상화성인 매트릭스에 의해 (또는 이와 부가혼합된 형태로) 수반될 수 있다. 본 발명의 매트릭스는 다공성이며, 비드, 입자 또는 섬유 형태일 수 있다. 예를 들어, 아파타이트-기재 세라믹과 같은 인산칼슘 물질이 다공성 조직 삽입물 또는 조직 접합을 가능하게 하기에 충분한 미세기공을 갖는 인공삽입물 물질의 제조용으로 제안되어 왔다. 따라서, 본 발명의 시토모듈린 조성물을 위한 치료적용은 매트릭스 형성 물질가 생분해성인 곳이며, 예를 들어, 연골 치유에 사용될 수 있다.

연골내 결함을 다듬거나 그렇지 않으면 손질하기에 유용한 매트릭스 물질로는, 예를 들어, 피브리노겐 (결함 및 손상부위에서 트롬빈으로 활성화되어 피브린을 형성), 콜라겐, 젤라틴 또는, 매트릭스내에서 세포가 증식하여 상해를 회복하는 것이 가능할 만큼 충분히 큰 기공을 갖는 매트릭스를 형성하고, 치유 과정동안 생분해되어 연골로 대체될 수 있는 모든 다른 생분해성 물질이 있다.

본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 매트릭스는 예비성형되거나, 예를 들어, 화합물 또는 피브리노겐과 같은 조성물을 중합화시켜 피브린 매트릭스를 형성함으로써 체외에서 성형될 수 있다. 예비성형될 수 있는 매트릭스로는 콜라겐, 콜라겐 아날로그 또는 콜라겐 유사물 (예를 들어, 콜라겐 스폰지 및 콜라겐 플리스), 화학적으로 개질된 콜라겐, 젤라틴 비드 또는 스폰지, 겔-형성 물질, 조직 또는 뼈 결함을 채우고 세포를 치유시켜 매트릭스에서 생장할 수 있게 하는 생분해성 매트릭스 물질 또는 이들의 부가혼합물로 구성된 다른 겔 형성 또는 합성물질을 들 수 있다.

이제 시토모듈린의 생물학적 활성을 하기의 실시예에 의해 더 설명하며, 이는 예시를 목적으로 하지 제한하지 않는다.

실시예 1

Mv-1-Lu 밍크 폐 표피세포내 DNA 합성의 저해

총 산-불용성 DNA 내로의 [¹H]티미딘 함입율 및 세포수을 측정함으로써 TGF-β 및 시토모듈린의 효과를 평가하였다. 일반적으로, 문헌 [Sampath 등, Journal of Biological Chemistry, 267, pp. 20352-20362 (1992)] 을 참조하였다. 다양한 농도 (10-9 M 내지 10-6 M) 의 TGF-β 또는 시토모듈린 (메리필드벙에 의해 합성) 중 어느 하나로 24 시간 처리한 후, 배양종료전 6시간동안 [메틸-³H]티미딘 (2μCi/ml, 80Ci/mmol) 를 첨가함으로써 3중 배양세포에서 DNA 합성율을 측정하였다. 배지를 빨아내어 함입을 종료하고, 인산-완충액 식염수로 3회 세척후, 트리클로로아세트산 (10%)-침전된 방사성 DNA 룰 1.0% (w/v) 소듐 도데실 술페이트, 0.1 M NaOH 로 추출하여 액체 신틸레이션 카운팅 (liquid Scintillation counting) 에 의해 정량하였다. 세포수를 결정하기 위하여, 10% FBS 를 함유하는 MEM 이 들어있는 플라스크에 1×10⁵세포를 플레이팅하고, 24시간후, 성장배지를 다양한 농도의 TGF-β 및 시토모듈린을 함유하는 무혈청 배지로 대체하였다. 3중 배양세포를 7일간의 기간동안 매 24시간마다 수확하고, 고정 부피 헤모사이토미터내에서 트립신-소화에 의해 방출된 세포를 셈으로써 결정하였다.

시토모듈린에 대한 성장 저해 곡선은 동일한 농도 범위에서 TGF-β 에 대해 관찰된 것과 유사하였다.

실시예 2

소프트 아가내 NRK-49 F 상피세포에 의한 성장 및 콜로니 형성

TGF-β 에 대한 최초의 검정법에서, 정상 섬유아세포의 고착 비의존성 성장은 여전히 TGF-β 활성의 보증중 하나이다. 37℃, 10% 소 태아 혈청으로 보충한 DEM 에서 NRK-49 F 섬유아세포를 키웠다. 10ng/mg 외배엽성 성장인자 (EGF) 및 10ng/ml 혈소판-유래 성장인자 (PDGF) 를 함유한 배양배지로 실험을 수행하였다; 그러나, 상기 두 인자가 없을 경우 콜로니 형성을 유도하지 않는 TGF-β 와는 달리 [참조: 예를 들어, Massagu, J. Biol. Chem., 259, pp. 9756-9761 (1984)], 시토모듈린은 상기 두 성장인자 없이 콜로니 형성을 유도하였다. 여기에, 100nM TGF-β (양성 대조군) 또는 100nM 시토모듈린을 첨가하였다. 0.3% 아가와 부가혼합한 NRK-49 F 섬유아세포 (5 X 10⁴세포/ml) 를 35 mm 배양접시 바닥에 플레이팅하였다. 배양 3 일째부터 시작하여 콜로니 형성을 관찰하였다.

예상한 바와 같이, 기본 배지만을 포함하는 배양세포에서는 콜로니가 형성되지 않았다. 또한, 예상한 바와 같이, TGF-β 와 배양한 배양세포는 콜로니를 형성하였다. 놀랍게도, 시토모듈린 배양세포 또한 TGF-β 배양세포와 거의 동일한 정도로 콜로니를 형성하였다. TGF-β 와 시토모듈린 사이의 시간에 따른 상기 콜로니들의 성장 특징은 유사하였다.

도 2 는 섬유아세포 배양 5 일째 찍은 현미경 사진을 나타낸다. 배양 3 일째부터 실제적인 콜로니가 관찰되었다. 도 2(A) 에서 보듯이, 성장인자가 없는 배양에서는 세포가 거의 생존하지 않았다. 도 2 의 패널 (B) 및 패널 (C) 는 시토모듈린의 존재시 작은 콜로니 (화살표) 가 형성되는 것을 보여주며, EGF 및 PDGF 를 함유하는 패널 (C) 에서는 보다 큰 콜로니가 유도되었다 (화살표). 이는, TGF-β 가 외배엽성 성장인자 (EGF) 및 혈소판-유래 성장인자 (PDGF) 의 동시적인 존재를 필요로 하는 것을 제외하고는, TGF-β 에 의한 콜로니 형성의 유도와 유사하다; 그러나, 패널 (B) 에서 보듯이, 시토모듈린은 자체적으로 콜로니 형성을 유도하였다.

실시예 3

RNA 단리 및 노던 (Northern) 분석

기본적으로 문헌 [Maniatis. Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2판 (1989)] dp 기재된 방법을 사용하여, 총 세포성 RNA 를 단리하였다. 0.5% SDS 및 0.1 아세트산 칼륨으로 세포를 세포를 용해시켰다. 상기 용해물을 페놀로 추출하고 5000 rpm 에서 15분간 원심분리하였다. 수성상을 0.1M 트리스, pH 8.0 및 0.2M NaCl 내에서 2배 부피의 에탄올로 침전시켰다. 침전물을 재현탁하고 260nm 에서의 자외선 흡광도를 측정함으로써 정량하였다. 260nm 에서의 자외선 흡광도와 280nm 에서의 자외선 흡광도를 비교하여 RNA 순도를 조사하였다.

0.7% 아가로오스 2.2M 포름알데히드 변성 겔을 통해 3 내지 4 v/cm 에서 RNA (10㎍/레인) 를 전기영동하였다. 모세관 이동법에 의해 나일론막에 RNA 를 이동시켰다. 메틸렌 블루우로 염색한 28S 및 18S 밴드에 의해 RNA 온전성 (integrity), 겔 로딩, 및 이동효율을 조사하였다. 필터를 80℃ 에서 2시간동안 구워 RNA 를 고정시켰다. 구운 후, 상기 필터를 65℃, 1mM EDTA, 7% 소듐 도데실 술페이트 및 1% 소 혈청 알부민을 함유하는 0.5M NaPO₄완충액 (pH 7.0) 에서 혼성화시켰다. cDNA 탐침자를 랜덤 프라이머 방법에 의해 클레나우 효소를 사용하여 dDIG (형광 탐침자) 로 표지하였다. 65℃ 에서 18시간동안 혼성화시킨 후 세척을 수행하였다.

제조자의 방법 (베링거 만하임 바이오케미카, DIG DNA 표지키트, 카탈로그번호 1175033) 에 따라 디그옥시게닌-dVTP 를 스캐닝하여 데이터를 분석하였다.

도 5 에서는, 시토모듈린 생활성 구조의 원자 좌표를 나타낸다 (원자 1-101). 따라서, 도 5 는 본 발명의 펩티드의 생물학적 활성 표면을 기재하고 있다. 우리는 본 발명의 시토모듈린과 동일하게 되도록 세포막 수용체와 동일한 또는 실질적으로 동일한 표면을 제공하는 유사물을 합성할 수 있다고 생각한다. 선택적으로, 알로스테릭 결합기전을 이용함으로써 시토모듈린에 관하여 증진된 또는 감소된 활성내에서 화합물을 합성할 수 있다. 따라서, 조직 치유에 유용한 조성물과 같은 본 발명의 구현예들은 생체적합성 매트릭스 및 실질적으로 시토모듈린의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 함유하며, 여기에서, 시토모듈린 자체 또는 그의 유사물들은, 매트릭스와 부가혼합되거나 또는 매트릭스상에 수반되고 세포성장을 유도하기에 효과적인 양으로 존재할 경우, 도 5 에 예시된 바와 같은 동일한 또는 실질적으로 동일한 생물학적 활성 표면을 제공하게 된다.

본 발명은 바람직한 특정 구현예와 함께 기재되었으나, 이는 명세서 및 실시예가 예시를 위한 것이지, 첨부된 청구항의 범위로 정의된 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아니라는 것이 이해되어야만 한다.

[서열목록]

(1) 일반정보

(i) 출원인: 더 리전츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아

(ii) 발명의명칭: 성장인자-유사 활성을 갖는 펩티드 조성물

(iii) 서열수: 1

(iv) 해당 주소:

(A) 주소: 로빈스, 베를라이너 앤드 칼슨

(B) 거리: 201 엔. 피구에로아 스트리트, 5 플로어

(C) 시: 로스 엔젤레스

(D) 주: 캘리포니아

(E) 국가: 미국

(F) 우편번호: 90012-2628

(v) 컴퓨터 인식형태

(A) 매체유형: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종

(C) 작동시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: 특허판 #1.0, 판본 #1.30

(vi) 현행 출원 데이터:

(A) 출원번호:

(B) 출원일자:

(C) 분류기호:

(viii) 변리사/대리인 정보

(A) 명칭: 베를라이너, 로버트

(B) 등록번호: 20,121

(C) 참조/도켓번호: 5555-378

(ix) 텔레커뮤니케이션 정보:

(A) 전화: 213-977-1001

(B) 팩스: 213-977-1003

(2) 서열식별번호: 1 에 대한 정보:

(i) 서열특성:

(A) 길이: 7 아미노산

(B) 형태: 아미노산

(D) 토폴로지: 선형

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 하이포테티칼: NO

(iv) 안티-센스: NO

(xi) 서열기재: 서열식별번호: 1:

Claims (9)

1. 서열 1 (서열식별번호: 1) 의 아미노산 서열을 갖는 생물학적 활성 펩티드:

   [서열 1]
2. 생체적합성 매트릭스 및 매트릭스와 부가혼합되거나 매트릭스 상에 수반되고, 실질적으로 하기 서열 1 (서열식별번호: 1) 의 아미노산 서열을 세포성장을 촉진하기에 유효한 양으로 갖는 펩티드를 함유하는 것을 특징으로 하는 조직 치유에 유용한 조성물:

   [서열 1]
3. 아미노산 서열이 생리학적 조건에서 안정한 β-굴곡을 형성하는 -Val-Ala- 로 주요구성되는 것을 특징으로 하는 제 2 항의 펩티드.
4. 제 2 항에 있어서, 생체적합성 매트릭스가 생분해성인 조성물.
5. 제 4 항에 있어서, 매트릭스가 재흡수성 중합체를 포함하는 조성물.
6. 제 2 항에 있어서, 생체적합성 매트릭스가 비-생분해성인 조성물.
7. 제 6 항에 있어서, 매트릭스가 다공성인 조성물.
8. 서열 1 (서열식별번호: 1) 의 아미노산 서열을 갖는 화합물 및 그의 염; 및 생리학적으로 허용가능한 담체를 함유하는 것을 특징으로 하는 약제학적 제제.

   [서열 1]
9. 제 8 항에 있어서, 화합물이 실질적으로 TGF-β 와 유사한 하나 이상의 생물학적 성질을 갖는 것을 특징으로 하는 제제.