KR19980078033A - 신규 고온성 공생 심비오박테리움 속 미생물 및 그로부터 생산되는 내열성 티로신 페놀리아제 및 프립토파나아제 - Google Patents

신규 고온성 공생 심비오박테리움 속 미생물 및 그로부터 생산되는 내열성 티로신 페놀리아제 및 프립토파나아제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 고온성 공생 미생물 및 이로부터 생산되는 내열성 티로신 페놀리아제 및 트립토파나아제에 관한 것으로, 본 발명의 고온성 공생 미생물 균주인심비오박테리움속 SC-1(Symbiobacteriumsp. SC-1)은바실러스속 SK-1(Bacillussp. SK-1)과의 혼합 배양에 의해서만 생육될 수 있는 절대 공생 미생물 균주로서, 고부가가치를 갖는 의약용 물질인 L-DOPA의 효소적 합성에 사용되는 신규 내열성 티로신 페놀리아제와 고부가가치의 유용한 아미노산인 L-트립토판의 효소적 합성에 사용되는 신규 내열성 트립토파나아제를 생산한다.

Description

신규 고온성 공생심비오박테리움속 미생물 및 그로부터 생산되는 내열성 티로신 페놀리아제 및 트립토파나아제
본 발명은 한국의 토양에서 분리된 신규 고온성 공생 미생물 및 이로부터 생산되는 내열성 티로신 페놀리아제 및 트립토파나아제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 티로신을 페놀, 피루브산 및 암모니아로 분해시키는 내열성 티로신 페놀리아제(thermostable L-tyrosine phenol-lyase, EC 4.1.99.2)와 트립토판을 인돌, 피루브산 및 암모니아로 분해시키는 내열성 트립토파나아제(thermostable tryptophanase, L-tryptophan indole-lyase, EC 4.1.99.1)를 생산하며, 고온성 미생물 균주인바실러스속 SK-1(Bacillussp. SK-1; KCTC 0306BP)과의 혼합 배양에 의해서만 생육이 가능한 고온성 절대 공생 미생물인심비오박테리움속 SC-1(Symbiobacteriumsp. SC-1), 이에 의해 생산되는 상기 효소들 및 상기 공생 균주와 고온성 바실러스 속 균주와의 혼합 배양법에 관한 것이다.
자연계에는 두 미생물이 생육 및 생리적 기능의 발현을 위하여 공생 또는 기생의 관계로서 함께 환경에 적응하며 살아가는 경우가 많이 알려져 있다. 그 예로는 에탄올로부터 메탄을 생산하기 위해 다른 미생물과 상호협력하는메타노박테리움속 미생물(Bryant. et al.,Archiv.frMikrobiologie, 50, 20-31 (1967)), 그리고 폴리비닐알콜의 산화적 분해를 위해 협력하는 두 개의슈도모나스속 미생물(Shimao. et al.,Argic. Biol. Chem., 48, 2873-2876 (1984)) 등을 들 수 있다. 한편, 기생의 관계에서는 기생하는 미생물의 생장을 위해 성장인자의 공급 등 파트너로서의 다른 미생물의 절대적 협력이 요구된다. 예를 들어,브데로비브리오스(Bdellovibrios)의 경우, 이들의 성장에 필수적인 그램 음성 박테리아를 용혈(lysis)시켜 생육한다.
티로신 페놀리아제는 티로신이 유도 물질로 첨가된 배지에서 배양한어위니아속,에스케리치아속과 같은 그램 음성의 장내세균에 널리 분포하는 효소로서, 티로신을 페놀과 피루브산, 그리고 암모니아로 가수분해하는 α,β-제거반응 및 티로신으로부터 페놀과 세린을 생성하는 β-교환반응 등 다양한 효소반응을 촉매한다(Enei et al.,Argic. Biol. Chem., 37,725-735 (1973)). 트립토파나아제는 트립토판을 인돌, 피루브산 및 암모니아로 가수분해하는 α,β-제거반응과 트립토판으로부터 인돌과 세린을 생성하는 β-교환반응 등을 촉매하는 다기능의 효소로서(Newton et al.,Proc. Natt. Acad. Sci. U.S.A, 51, 382-389 (1964)), 인돌, 피루브산 및 암모니아에서 L-트립토판을 합성하는 생물 촉매로 사용될 수 있다. 이와 같은 티로신 페놀리아제와 트립토파나아제는 배지에서 각각 L-티로신과 L-트립토판에 의해 효소 활성이 유도된다.
티로신 페놀리아제를 이용한 고부가가치 의약용 아미노산인 L-DOPA(L-디하이드록시 페닐알라닌)의 효소적 합성 공정은 중온성 미생물 유래의 효소를 사용하고 있다. 효소를 이용한 생물 전환 공정에 있어서 효소의 안정성은 생산성에 매우 중요한 요인으로 작용한다. 일반적으로, 고온 환경에 적응하여 증식하는 고온성 미생물 등은 열에 대하여 안정한 내열성 효소를 갖고 있는 것으로 알려져 있으며, 이러한 내열성 효소는 열에 대하여 안정할 뿐 아니라, 유기 용매에 대한 안정성, 극단의 수소 이온 농도에 대한 안정성 및 화학변성제에 대한 안정성도 가지는 것으로 알려져 있다.
이에 본 발명자들은 고부가가치 의약용 아미노산인 L-DOPA의 효소적 합성 공정에 유용하게 이용할 수 있는 내열성 티로신 페놀리아제를 생산하는 신규 고온성 미생물을 탐색하기 위한 연구를 시도한 결과, 한국 전역의 토양 및 고온 환경에서 모은 샘플로부터 강한 내열성 티로신 페놀리아제 활성을 나타내는 혼합 배양액을 얻은 후 이 혼합 배양액을 생리 희석액으로 희석하여 재접종한 다음 배지에서 페놀이 관찰되는 최소 희석배율에서 간균 형태의 2 종의 고온성 미생물을 확인하고, 이 2 종의 미생물이 내열성 티로신 페놀리아제 활성을 갖는 그램 음성의 고온성 미생물과 그램 양성의 포자를 생성하는 고온성바실러스균으로 서로 절대 공생관계에 있음을 알아 내어 본 발명의 완성에 이르게 되었다.
본 발명의 목적은 내열성 티로신 페놀리아제와 내열성 트립토파나아제를 생산하는 고온성 절대 공생 미생물인심비오박테리움속 SC-1(Symbiobacteriumsp. SC-1), 상기 미생물로부터 생산되는, 고부가가치 아미노산인 L-DOPA 및 L-트립토판의 효소적 합성에 유용하게 이용될 수 있는 내열성 티로신 페놀리아제 및 트립토파나아제, 그리고 상기 공생 균주와 고온성 바실러스 속 균주와의 혼합 배양법을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 절대 공생 미생물 균주인심비오박테리움속 SC-1 및 이와 공생 관계에 있는 균주인바실러스속 SK-1의 전자현미경 사진(배율: 35,000 배)이고,
도 2는 본 발명의심비오박테리움속 SC-1 및 이와 공생 관계에 있는 균주인바실러스속 SK-1을 혼합 배양한 경우와바실러스속 SK-1을 단독 배양한 경우 각 균주의 시간에 따른 생장 정도를 나타낸 그래프이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 한국 토양으로부터 분리된, 고온성바실러스속 SK-1(KCTC 0306BP)과 절대 공생 관계를 갖는 신규 고온성 공생심비오박테리움속 SC-1을 제공한다.
본 발명에서는 또한 상기심비오박테리움속 SC-1으로부터 생산되는 신규 내열성 티로신 페놀리아제 및 내열성 트립토파나아제를 제공한다.
본 발명에 따르면 고온성바실러스속 SK-1(KCTC 0306BP)을 혼합하여 배양하는 것을 특징으로 하는 신규 고온성심비오박테리움속 SC-1의 배양 방법도 또한 제공된다.
이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
내열성 티로신 페놀리아제 및 트립토파나아제 활성을 갖는 본 발명의 신규 고온성 공생 미생물의 분리 및 동정은 다음과 같다.
한국 전국의 토양 및 고온 환경에서 채취한 샘플을 티로신을 함유하는 액체 배지에 접종하여 고온에서 배양 후, 배지중에 생성하는 페놀을 4-아미노안티피린 시약과의 적색의 발색 반응(Lacoste, R. J.,Anal. Chem., 31, 1246-1249(1959))에 의해 검출함으로써 고온성 미생물이 생산하는 신규 내열성 티로신 페놀리아제의 활성을 간단하게 측정할 수 있다. 이와 같은 발색 테스트를 한 결과, 60 ℃에서 생육한 혼합 배양액에서 강한 페놀의 발색 반응을 보여 상기 혼합 배양액을 한천 평판 배지에 도말한 후, 내열성 티로신 페놀리아제 활성을 가지는 콜로니를 분리하려 하였으나 분리할 수 없었다. 배지의 성분 및 한천 농도 등의 조절에 의해서는 유사한 효소 활성을 보이는 콜로니는 분리할 수 없어서, 상기 혼합 배양액을 생리 식염수로 희석하여 재접종한 후에, 배지에서 페놀이 관찰되는 최소 희석 배율에서 간균 형태의 2 종의 고온성 미생물을 분리하였다. 탐색 분리된 2 종의 간균 형태의 고온성 미생물을 조사한 결과, 한 종은 내열성 티로신 페놀리아제 활성을 갖는 그램 음성의 고온성 미생물이며, 다른 한 종은 그램 양성의 포자를 생성하는 고온성바실러스균으로서, 이 두 고온성 미생물은 절대 공생 관계에 있는 것으로 확인되었다.
상기 내열성 티로신 페놀리아제 활성을 갖는 고온성 공생 미생물을 동정하기 위하여 그 미생물학적 특성을 조사한 결과, 60 ℃ 이상의 온도에서 호기적으로 생육하며, 그램 음성이고 버지 매뉴얼(Bergy's manual)에도 아직 등록되지 않은 고온성 공생 미생물인심비오박테리움(Symbiobacterium)(Suzuki et al.,J. Gen. Microbiol., 134,2353-2362 (1988))에 속하는 미생물로 동정되었다. 상기 내열성 티로신 페놀리아제 및 내열성 트립토파나아제를 생산하는 신규의 고온성 공생 미생물은심비오박테리움속 SC-1(Symbiobacteriumsp. SC-1)으로 명명하고, 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소내 유전자원센타에 1997년 1월 24일자 수탁번호 제 KCTC 0307BP 호로 기탁되었다.
본 발명의 고온성 공생 미생물심비오박테리움속 SC-1은 단독 배양액 형태로는 얻을 수 없으며, 고온성바실러스속 미생물과 혼합 배양액으로서만 얻어지기 때문에 반드시 상기 바실러스 속 균주를 혼합하여 배양한 후 두 균의 크기 차이에 기인하여 원심분리에 의해 분리할 수 있다. 본 발명의 공생 미생물과 절대 공생 관계를 갖는바실러스속 균주를 동정한 결과, 본 발명의 미생물보다 크기가 큰 간균으로 그램 양성의 포자를 생성하는, 본 출원인에 의해 밝혀진 고온성바실러스속 SK-1(KCTC 0306BP)으로 확인되었다. 이 고온성바실러스균주는 단독으로 배양가능하며, 단독 배양시 티로신 페놀리아제를 생산하지 않는다.
본 발명의 고온성 공생심비오박테리움속 SC-1으로부터 생산되는 내열성 티로신 페놀리아제 및 트립토파나아제는 상기 균주를바실러스속 SK-1과 MTP 액체 배지에서 48 시간 동안 혼합 배양한 후, 원심분리에 의해 고온성바실러스는 침전시키고 얻은 상등액을 다시 원심분리하여심비오박테리움속 SC-1 균체를 수확한 후, 균체를 파쇄하여 조효소액으로 얻을 수 있다.
상기와 같이 얻어진 조효소액을 이용하여, 0.1 M 트리스 완충액(Tris-HCl, pH 8.5) 또는 0.1 M 포스페이트 완충액(pH 8.0) 중에서 기질로서 각각 L-티로신 및 L-트립토판과 반응시켜 효소 반응에 의해 생성된 반응 산물인 피루베이트의 양을 측정함으로써 본 발명의 고온성 공생 미생물로부터 생성되는 티로신 페놀리아제 및 트립토파나아제의 활성을 측정할 수 있다.
이상과 같은 본 발명의 신규 고온성 공생 미생물로부터 생성되는 내열성 티로신 페놀리아제 및 내열성 트립토파나아제를 이용하여 이들이 촉매하는 효소 반응의 역반응에 의해, 카테콜, 피루브산 및 암모니아로부터 L-DOPA를, 인돌, 피루브산 및 암모니아로부터 L-트립토판을 각각 효소적으로 합성할 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 미생물의 분리, 동정 및 배양
(단계 1) 고온균으로부터 내열성 티로신 페놀리아제 활성 균주의 탐색
먼저, 전국 각지의 건초더미, 부식토, 하천, 폐수, 온천 등지에서 채취한 샘플을 0.4 % L-티로신(L-tyrosine), 0.3 % K2HPO4, 0.1 % KH2PO4, 0.01 % HN4Cl의 조성을 갖는 최소 액체 배지에 접종하고 60 ℃에서 48 시간 동안 부유 배양(enrichment culture)하였다. 이 배양액의 상층액을 취하여 생성된 페놀을 알카리 수용액에서 4-아미노안티피린과의 적색의 발색 반응에 의해 구별하여 내열성 티로신 페놀리아제의 활성 보유 균주를 탐색하였다. 이렇게 선택된 샘플은 순수 분리를 위하여 다시 0.05 % L-티로신, 0.1 % L-페닐알라닌(L-phenylalanine), 0.5 % 폴리펩톤(polypeptone), 0.1 % 효모 추출물(Yeast extract), 0.3 % K2HPO4, 0.05 % MgSO4의 조성을 갖는 고온성 미생물의 생육 배지인 MTP 배지에 접종하여 부유배양한 후, 2 % 한천(agar)을 포함한 MTP 평판 배지(agar plate medium)에 도말하고 60 ℃에서 배양하여 순수한 콜로니의 분리를 시도했으나, 내열성 티로신 페놀리아제 활성을 나타내는 콜로니는 얻을 수 없었다. 배지의 성분 및 한천 농도 등을 조절하여도 티로신 페놀리아제 효소 활성을 보이는 콜로니는 분리할 수 없었다. 따라서 최초 내열성 티로신 페놀리아제 활성을 보인 혼합 배양액을 생리식염수로 10 배씩 희석도에 따라 희석하여 MTP 액체 배지에 재접종한 후, 배지에서 페놀이 관찰되는 최소 희석 배율에서 간균 형태의 2 종의 고온성 미생물을 확인하였다.
상기와 같이 탐색 분리된 2 종의 간균 형태의 고온성 미생물에 대하여 조사한 결과, 한 종은 내열성 티로신 페놀리아제 활성을 가지는 그램 음성의 고온성 미생물이고, 다른 한 균은 그램 양성의 포자를 생성하는 고온성바실러스균이었다. 선별된 2 종의 간균을 MTP 액체 배지에서 혼합 배양하여 전자현미경으로 관찰한 결과, 세포의 계측에 의하면 1 종은 폭 0.2-0.3 ㎛, 길이 1.5-6 ㎛ 이었고, 다른 1 종은 폭 0.5-0.9 ㎛, 길이 2.5-7 ㎛ 이었다. 도 1은 본 발명의 내열성 티로신 페놀리아제 활성을 갖는 고온성 미생물과 이와 공생 관계에 있는바실러스균주의 전자현미경 사진(배율: 35,000 배)으로, 여기에서 내열성 티로신 페놀리아제 활성을 나타내는 본 발명의 고온성 미생물은 크기가 작은 그램 음성 간균으로 확인되었다.
(단계 2) 절대 공생 미생물 심비오박테리움 의 생육 및 단리
단계 1의 조건에서와 같이 페놀 생성이 검출되는 샘플을 생리식염수에 적절한 희석도에 따라 희석 후, MTP 액체 배지에 접종하여 얻은 2 종의 미생물은 도 1에서 보이는 바와 같이 크기에 의해 구별되었다. 따라서, MTP 액체 배지에서 혼합 배양 후 원심력에 의해 침전되는 차이에 착안하여 먼저 500xg(원심력)에서 10 분간씩 2 회 반복하여 원심분리하여 고온성 바실러스를 침전시켰다. 얻어진 상등액을 다시 8000xg에서 10 분간 원심분리하여 내열성 티로신 페놀리아제 활성을 보이는 고온성 미생물 균체를 획득할 수 있었다.
보다 큰 대형의 간균은 그램 양성이며 포자를 생성하는 고온성바실러스속의 SK-1 균주(Bacillussp. SK-1; KCTC 0306BP)로 확인되었으며, 이 고온성바실러스는 단독으로 배양가능하였으나, 티로신 페놀리아제는 생산하지 않았다.
크기가 작은 고온성 미생물은 60 ℃ 이상의 온도에서 호기적으로 생육하며 그램 음성이고 포자를 생성하지 않았으며, 버지 매뉴얼(Bergy's manual)에도 아직 등록되지 않은 고온성 공생 미생물인심비오박테리움(Symbiobacterium)(Suzuki et al.,J. Gen. Microbiol., 134, 2353-2362 (1988))에 속하는 미생물로 동정되었다. 이 고온성심비오박테리움속 미생물은 LB(1 % 트립톤, 0.5 % 효모 추출물, 0.5 % NaCl), MY(1 % 폴리펩톤, 0.2 % 효모 추출물, 0.2 % 미이트 추출물(meat extract), 0.2 % 글리세롤, 0.2 % K2HPO4, 0.2 % KH2PO4, 0.026 % NH4Cl), SLB(1.5 % 트립톤, 0.75 % 효모 추출물, 1 % NaCl, 0.1 % 카사미노산) 등의 다양한 배지 및 각종 비타민, 당 등의 영양원을 공급하여도 단독으로는 생육하지 못하였다. 상기 그램 음성 단간균은 MTP 액체 배지에서 상기바실러스속 SK-1과 혼합 배양한 경우에만 도 2에 나타낸 바와 같은 성장 곡선을 그리며 생육하였으며,바실러스 스테아로더모필러스와 같은 다른 고온성바실러스와 혼합 배양을 한 경우에는 내열성 티로신 페놀리아제를 생산하는 고온성 공생심비오박테리움은 생육하지 못하였다. 도 2는 본 발명의 내열성 티로신 페놀리아제 활성을 갖는 고온성 공생 미생물 및 이와 공생 관계에 있는 균주인바실러스속 SK-1을 혼합 배양한 경우와바실러스속 SK-1을 단독 배양한 경우 각 균주의 시간에 따른 생장 정도를 나타낸 그래프이다.
상기의 결과로부터 내열성 티로신 페놀리아제 활성을 가지는 그램 음성의 소형 간균은 그램 양성의 포자를 생성하는 고온성 바실러스 균과 절대 공생 관계에 있음이 확인되었으며,심비오박테리움속 SC-1(Symbiobacteriumsp. SC-1)으로 명명되었다.
본 발명에 따른 내열성 티로신 페놀리아제 및 트립토파나아제 활성을 갖는 신규 고온성 공생 미생물인심비오박테리움속 SC-1(Symbiobacteriumsp. SC-1)은 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소내 유전자원센타에 1997년 1월 24일자로 기탁되어 수탁번호 제 KCTC 0307BP 호를 부여받았다.
실시예 2 : 내열성 티로신 페놀리아제와 트립토파나아제의 활성 정량
본 발명의 신규 고온성 공생심비오박테리움속 SC-1을바실러스속 SK-1과 MTP 액체 배지에서 48 시간 동안 혼합 배양한 후, 원심분리에 의해심비오박테리움속 SC-1을 분리 수확하고 균체를 파쇄하여 조효소액을 제조한 후 내열성 티로신 페놀리아제와 트립토파나아제 활성을 측정하였다.
(1) 내열성 티로신 페놀리아제 활성의 정량
내열성 티로신 페놀리아제 활성을 측정하기 위한 반응액은 0.1 M 트리스 완충액(Tris-HCl, pH 8.5) 0.2 ㎖에 10 mM의 L-티로신과 배양액 0.1 ㎖에 해당하는 조효소액을 포함하도록 조제되었으며, 55 ℃에서 1 시간 동안 정치 반응시켰다. 내열성 티로신 페놀리아제 반응에 의하여 생성된 반응 산물인 피루베이트의 양은 반응액에 0.2 ㎖의 60 % 수산화칼륨염 용액과 2 % 살리실알데히드(salicylaldehyde) 0.1 ㎖를 가한 후 37 ℃에서 30 분간 정치반응시켜 발색시킨 후, 물로 2 배 희석하여 480 nm에서 흡광도를 측정하였다(Berntsson S.,Anal. Chem., 27, 1659-1660(1995)). 그 결과는 표 1에 나타내었다.
(2) 내열성 트립토파나아제 활성의 정량
내열성 트립토파나아제 활성을 측정하기 위한 반응액은 0.1 M 포스페이트 완충액(KPB, pH 8.0) 0.2 ㎖에 10 mM의 L-트립토판과 배양액 0.1 ㎖에 해당하는 조효소액을 포함하도록 조제되었으며, 60 ℃에서 1 시간 동안 정치반응시켰다. 내열성 트립토파나아제 반응에 의하여 생성된 반응산물 피루베이트의 양은 반응액에 0.2 ㎖의 60 % 수산화칼륨염 용액과 2 % 살리실알데히드 0.1 ㎖를 가한 후 37 ℃에서 30 분간 정치 반응시켜 발색시킨 후, 물로 2 배 희석하여 480nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 표 1에 나타내었다.
효소 활성 1 Unit은 1 분 동안 반응산물 1 μmol을 만드는 효소량으로 정의하였고, 단백질 함량은 브래드포드 방법(Bradford, M.,Anal. Biochem., 72,248-254 (1976))으로 측정하였다.
내열성 티로신 페놀리아제 효소비활성(Units/㎎ 단백질) 0.01
내열성 트립토파나아제 효소비활성(Units/㎎ 단백질) 0.34
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따라 한국의 토양에서 분리한, 본 발명의 고온성 공생 미생물 균주인심비오박테리움속 SC-1(Symbiobacteriumsp. SC-1)은 티로신을 페놀, 피루브산 및 암모니아로 분해시키는 내열성 티로신 페놀리아제와 트립토판을 인돌, 피루브산 및 암모니아로 분해시키는 내열성 트립토파나아제를 생산하여, 이들이 촉매하는 효소 반응의 역반응에 의해 고부가가치를 갖는 의약용 물질인 L-DOPA 및 고부가가치 아미노산인 L-트립토판을 효소적으로 합성하는데 이용될 수 있다.

Claims (4)

  1. 한국 토양으로부터 분리된, 고온성바실러스속 SK-1(KCTC 0306BP)과 절대 공생 관계를 갖는 신규 고온성 절대 공생심비오박테리움속 SC-1(KCTC 0307BP).
  2. 제 1 항의심비오박테리움속 SC-1 균주로부터 생산되는 신규 내열성 티로신 페놀리아제.
  3. 제 1 항의심비오박테리움속 SC-1 균주로부터 생산되는 신규 내열성 트립토파나아제.
  4. 고온성바실러스속 SK-1(KCTC 0306BP) 균주를 혼합하여 배양하는 것을 특징으로 하는, 제 1 항의 고온성 공생심비오박테리움속 SC-1의 배양 방법.
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