KR19980028332A

KR19980028332A - 식물성 항균제

Info

Publication number: KR19980028332A
Application number: KR1019960047362A
Authority: KR
Inventors: 김정옥; 하영래
Original assignee: 김정옥
Priority date: 1996-10-22
Filing date: 1996-10-22
Publication date: 1998-07-15

Abstract

쑥, 인경쑥, 호프, 정향, 방아초 등 방향성 식용·약용식물 건조물(수분 5-10%)과 추출용매를 1:4 - 1:10 비율로 혼합하여 추출, 농축하여 얻은 식물성항균성 추출물을 얻고, 이를 광감작화(photosensitization)하여 강한 항균활성을 갖는 카리오필렌 산화물 용액(caryophyllene oxidation products(COPs)solution)을 얻는다.

COPs 혼합물로부터 TLC(박충크래마토그래피)분리하고 자외선 광( UV(200mm)Light)과 10% 황산용액으로 발색시켜 Rf(전개율) 0.66인 강한 항균 물질을 분리함. 분사형 완효성농약(살균제), 식품용보존제, 항균성 사료 첨가제를 얻음.

Description

식물성 항균제

도 1은 광감작화 시험창치의 도해설명도

도 2는 TLC에서 분리된 COPs의 크로마토그램

* 도면의 주요부분에 대한 부호의 설명

1 : 시험관 2 : 형광등(10W) 3 : 목상자

[발명의 목적]

본 발명은 안전성이 높고, 항균작용이 우수한 식물성 항균제를 효율적으로 공급할 수 있는 방법을 제공하고, 이를 식품 및 농약용 소개로 제공하는 것을 목적으로 한다.

[발명이 속하는 기술분야 및 그 분야의 종래기술]

본 발명은 식물에 병해를 유발하는 진균류에 대한 농약분야, 과일, 야채 등의 유통기간 중에 부패를 유발하는 부패 미생물에 대한 보존제 및 어패류를 매개로한 인체 병원균인 비브리오(vibrio)의 감염을 막아주기 위한 양식용 항균사료의 원료등에 이용이 가능한 식물성 항균제(抗菌劑) 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 항균성 소재를 효율적으로 수출하는 방법과 이들 통해서 얻은 항균제를 식물병원성균에 대한 살균제로서 저독성 농약, 야채 및 과일 등의 유통을 연장시키는 식품용 보존제 및 양식어류용 항균사료의 원료를 제조하는 것에 관한 것이다.

현재 사용되고 있는 농약에는 화학합성계와 천적, 식물추출물 등을 이용한 천연물계로 나누어 볼 수 있다.

대부분이 화학합성계 농약으로 이들의 약효는 우수하다고 인정받고 있으나 인체 및 기타 자연의 생태계에 대해 비선택적인 강한 독성을 유발하므로 사용에 있어서 많은 제약을 받고 있는 실정이다.

또한 천연계 살충, 살균제는 인체 독성은 비교적 약하나 효능이 낮거나, 효능이 시험관내(in vitro)에서 높더라도 실제 적용(field)에서 낮기 때문에 널리 사용되고 있지 못하다.

또한 식품용 적용 보존료로는 각종 화학합성품계의 보존료와 천연유래의 보존료가 사용되고 있다.

안식향산, 솔비산, 디페닐, 파라옥시안식향산나트륨 등의 화학합성품계 보존료등이 주로 사용되고 있으며 천연유래의 보존료로는 글리신, 페닐알라닌, 라이신, 프로타민, 감초, 양파, 호두, 와사비, 계피 등의 천연추출물등이 보고되고 있다.

그러나 화학합성품계 보존료는 상용기준이 엄격히 규정되어 있어 사용량 및 적용대상에 대한 제한을 받으며 인체의 유해성 여부로 소비자들로부터 외면을 받고 있어서 사용을 기피하고 있는 실정이다.

천연계 보존료는 비교적 항균력이 낮고 외부환경에 불안정한 것들이 대부분이어서 아직 상품으로 각광을 받는 것은 극히 제한적이다.

또한 이들은 유효농도에서 적용식품에 대해서 독특한 맛, 냄새들을 부여하므로 식품에 사용할 때 풍미를 변화시키는 단점을 가지고 있다.

현대는 경제수준의 향상과 아울러 소비자들의 건강에 대한 관심이 고조 되면서 인체에 비교적 해가 적으며 항균력이 강한 농약 및 식품용 보호제의 개발이 절실히 요구되고 있다.

따라서 본 발명은 이러한 배경하에서 안전성이 높고, 항균작용이 우수한 식물성 항균제를 효율적으로 공급할 수 있는 방법을 제공하고, 이를 식품 및 농약용 소재로 이용 가능성을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명에서는 쑥, 인경쑥, 호프, 정향, 방아초, 감잎 등의 방향성 식용, 약용 식물전체를 체취하여 햇볕이나 그늘에서 말린 건조물(수분 5-10 중량%)과 추출 용매(물, 에탄올, 메탄올, 클로로포름, 에테르, 아세토나이트릴등에서 선택한 1가지 이상의 용매)를 1:4-1:10의 비율로 혼합하여 추출하고 이를 여과하여 암갈색의 추출액을 얻고, 이를 식품 및 농약용소재로 이용하는 것을 목적으로 한다.

상기의 항균제는 천연물로서 안전성이 보장되고, 추출물을 이용한 제품을 단독으로 사용할시에도 항균력이 우수하고, 항균성 물질을 정제하여 사용할 때는 적은 농도에서 항균력이 탁월하므로 천연 농약용 살균제 및 유효농도에서 식품의 풍미에 영향을 주지 않으므로 식품중 특히 과일, 야채류의 보존성을 증대시키는 목적의 보존제로 탁월한 천연항균제이다.

본 발명의 항균제는 제품의 제조 공정시 원료와 함께 혼합하거나 별도의 수용성 현택액 또는 알콜용액으로 제조해서 첨가, 침시, 분사하여도 좋다.

이하, 본 발명을 실시예, 시험 등을 들어 상세히 설명하지만 본 발명은 이러한 예에 한정된 것은 아니며, 각각의 실시예, 시험예 등은 반복실시하여 그 결과의 재현성을 확인하였다.

[실시예 1]

식물추출물의 제조 방법

쑥, 인경쑥, 호프, 정향, 방아초, 감잎 등의 방향성 식용, 약용 식물 전체를 체취하여 햇볕이나 그늘에서 말린 건조물(수분 5-10 증량%)과 추출 용매(물, 에탄올, 메탄올, 클로로포름, 에테르, 아세토나이트릴)를 1:4-1:10의 비율로 혼합하여 추출하고 이를 여과하여 암갈색의 추출액을 얻는다. 이때 건시를 대비 수율(량)이 25-30 중량%의 식물 추출물을 얻는다. 이렇게 얻은 추출액을 여과하고 여과액은 감압농축하여 4-10배정도를 농축액을 얻어 순수한 추출액기스를 제조한다.

항균성물질의 제조

상기에서 얻은 추출물에 대해 아세토나이트릴 등과 같은 수소공여체 용매(protic solvent) 및 광감작제(로즈벤칼)(photosensitizer (rose bengal)를 표1과 같은 비율로 혼합한다.

혼합액 20m1를 취하여 그림 1과 같이 시험관(Wheaton, USA:16:mm×125mm)에 넣는다. 이들 시험관을 광감작화 상(photosensitization box(광할성화)에 넣고형광등(fluorescent lamp(파장180∼380mm,10W×4bulbs)으로 30분-7시간 정도광감작화(photosensitization)하였다. 이렇게하여 강한 항균활성을 갖는 카리오필렌 산화 물 용액(caryophyllene oxidation products(COPs) solution)을 얻는다.

반응물의 혼합 비율

성분	추출 농축액	Rose bengal	용매
비율(10중량%)	10-20	80-10	10-70

[시험예 1]

항균력이 강한 COPs의 분리 및 동정 박층 크로마토 그래피(TLC(Thin Layer Chromatography)

실시예 1에서 얻은 항균성 물질을 TLC에 결어(1oading), 전개 용매인 벤젠:에틸아세테이트=9:1 혼합용매를 사용하여 분리하고 UV(220nm)-광(light)과 10% 황산 용액으로 발색시켜 항균성 혼합물에 함유된 항균활성 주체인 COPs(분리된 band)를 확인하였다.

이때, 각 벤드(band)를 모아서 에틸 아세테이트(ethyl acetate)로 추출하여 여과한 다음 감압 농축하고 에탄올에 용해하여 항균활성을 측정하였다.

그 결과 도 2에서와 같이 Rf(전개율)-0.66을 특징으로 하는 항균물질을 얻었다.

[시험예 2]

항균력 측정

실시예 1과 시험예 1에서 얻은 추출액 및 정제액을 여지 확산법에 의한 항균 활성을 측정하였다.

사용균주는 Vibrio parahaemolyticus WP, Vibrio vulicus E8, Vibrio colera, Staphylococcus aureus IAM1011, Escherichia coli ATCC1129, Bacillus subtilis ATCC6633, Enterobacter aerogenes ATCC29751 등, 세균 4종과 Pyricularia oryzae IFO30517, Rhizooctonia solani ATCC30930, Phizopus chinesis ATCC62417, Rhizopus solani, Pythium ultimum ATCC10930, Fusarium oxsporum ATCC44107 등 진균 6종 등 총 10종의 미생물을 사용하였다.

이들의 전 배양은 세균 4종의 경우 영양육즙배지(Nutrient broth(Bacto Beef Extract 0.3%, Bacto peptone 0.5%, pH 6.8)를 사용하여 37℃의 항온 진탕배양기에서 24시간 배양하였다.

또한 진균류 6종의 경우는 감자 덱스트로스(Potato Dextrose(Potato 20%, Dextrose 2%)배지를 이용하여 26-30℃의 항온 진탕배양기에서 4일간 배양하였다.

세균 6종의 항균활성 실험은 먼저 한천(Nutrient agar)배지를 제조하고 여기에앞에서 기술한 세균 전배양액 각각을 살균한 soft-Nutrient agar(한천농도 0.8%)에 비색계로 660m의 파장에서의 0.5 O.D(광학적 밀도)의 균 농도로 첨가하여 고루 섞은 후 이를 Nutrient agar 배지위에 얇게 부어 굳힌다.

여기에 직경 8mm(TOYO사) 종이 디스크(paper disc)를 올려놓고 디스크(disc)당 항균성 물질 및 추출반응물을 각각 40μ씩(100㎍농도) 적용하였다.

이를 37℃에서 24시간 배양하여 종이디스크 주위의 저지 환(inhibition zone)의 직경(mm)을 측정하여 항균력을 표2에서 나타내었다.

진균 6종의 항균활성 실험은 먼저 감자 포도당 한천(Potato Dextrose Agar) 배지를 제조하고 여기에 앞에서 기술한 진균 배양 균사체를 살균된 균질기로 균질(중속으로 30초씩 3회 반복)하여 균사체액 각각을 살균된 soft-Patato Dextrose Agar(한천 농도 0.8%)에 비색계로 660nm의 파장에서 0.5 O.D의 세포 농도로 첨가하여 고루 섞은후 이를 Patato Dextrose agar 배지위에 얇게 부어 굳힌다.

여기에 적경 8nm(TOYO사)paper disc를 올려 놓고 disc 당 항균성물질 및 추출반응물을 각각40m씩(100mg 농도) 적용하였다.

이들을 26-30℃의 항온기에서 3-4일간 배양하여 paper disc 주위의 inhibition zone(저지환)의 적경(mm)을 측정하여 표 2에서와 같이 항균력을 나타내었다.

항균성물질 및 추출반응물의 항균활성 측정결과

피험균(被驗菌)	항균 활성
피험균(被驗菌)	항균성 물질	추출 반응물질
Vibrio parahaemolyticus	A	A
Vibrio vulicus E8	A	A
Vibrio colera	A	A
Escherichia coli	C	C
Staphylococcus aureus	A	A
Baillus subtilits	B	B
Pyricularia oryzae	A	A
Rhiaooctonia solana	A	A
Rhizopus chinesis	A	A
R.solani	A	A
Pythium ultimum	B	B
Fusarium oxysporum	C	C

1) 항균활성 A : 저지환 20mm 이상

B : 저지환 10-20mm

C : 저지환 0-10mm

2) 항균성물질 : 시험예 1에서 TLC 결과 Rf = 0.00의 물질로 에탄올 용해물

3) 추출반응물 : 실험예 1에서 얻은 COPs혼합물질

[시험예 3]

항균성 물질의 급성독성 실험

실시예 1에서 얻은 항균성 물질을 C57b1계 숫컷 마우스(1군=10마리, 중량:18-20g)에 경구 투여하였다. 이때 항균성 물질을 g/㎏을 투여하고, 7일간 관찰한 바 치사는 없었다. 이결과로부터 마우스에 대한 LD50은 300mg/kg이상이었다.

실시예 2 완효성 살균제(농약)의 제조 및 효능 실험

항균성 물질을 이용한 완효성농약의 제조 및 이의 효능에 대한 결과는 표3에서 나타내었다.

항균성물질을 이용한 농약제조 및 효능실험 결과

성분 배합물	1	2	3	4	5
물	100	80	70	60	90
에탄올	-	10	10	10	10
추출반응물(항균성물질-고형분 30%)	-	10	20	30	-
합 계	100	100	100	100	100
효 능	오 이	-	__	+++	+++	-
	벼	-	__	+++	+++	-
	잔 디	-	__	+++	+++	-

표3 살균제의 효능 실험은 폿트(pot)에 오이, 벼, 잔디 종묘를 심어 항온, 항습, 주기적인 빛의 공급이 가능한 온실에서 배양하여 벼에는 도열병균액(Pyricularia oryzae), 문고병균액을 오이에는 오이 진무름 병균액(R.solani)배합물을 분사한후 2일 경과후에 각각의 살균제 배합물을 분사기로 10초간 2회 분사하여 재배하면서 병발생 유무를 눈으로 관찰하여 약효를 평가 하였다.

[실시예 3]

식품 보존제의 제조 및 효능 실험

항균성 물질을 이용한 식품용 보조제의 제조 및 이들을 오이, 딸기, 토마토 등에적용하여 저장하면서 보존효과를 표4에서 나타내었다.

표 4의 배합물들을 분사용기에 넣고 이를 폴리에칠렌 포장지(두께 60mm)에 중량비로 각각 0.5% 정도 흡착시키고 오이, 딸기, 토마토 등을 Aspergilus niger, Rhizopus등의 균액에 20초 동안 침지하여 말린 다음 이를 폴리에칠렌 포장지로 밀착 포장한 후 30℃의 배양기에서 배양하면서 부패여부를 관찰하였다.

항균성물질을 이용한 보존제시제 및 보존효과 실험 결과

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
물	100	90	80	70	90	90	80	70	80	70	60	70	60	50	60	50	40	50	40	30
알콜	-	10	20	30	-	-	-	-	10	20	30	10	20	30	10	20	30	10	20	30
유기산	-	-	-	-	-	-	-	-	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10	10
추출반응물(항균성물질:고형분30%)	-	-	-	-	-	10	20	30	-	-	-	10	10	10	20	20	20	30	30	30
합계	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100	100
효능*	딸기	-	-	-	-	-	+	+	++	-	-	-	+	+	++	+	+	+++	+++	++	+++
	오이	-	-	-	-	-	++	++	+	-	-	-	++	++	+++	++	++	+++	+++	+++	++
	토마토	-	-	-	-	-	++	++	+++	+	+	+	++	++	+++	++	++	+++	+++	+++	+++

*효능 : -없음, +약간 있음, ++강함, +++매우 강함

[실시예 4]

항균성 사료의 제조.

양식어류용 일반사료(Casein 37%, Gelatin 8%, Dextrin 33%, Cellulose 11%:CMC 5%, Vitamin premix 2%, Mineral premix 1%, Fish oil 6%)에 항균물질을 0,0.1,0.5,1.0,2.0,5.0% 첨가하여 혼합한 뒤 펠릿(pellet)을 제조하고 건조해서 양식 어류용 항균사료로 사용하였다.

실험용 양식 어류인 뱀장어(Anguilla japonica)는 충무 수산대학교 양식학과에서 분양받아 실험에 사용하였다.

먼저 실험구당 수조에 개체 100-120g의 어류를 5마리씩 분리하여 2일간 일반사료를 공급하면서 비브리오 배양균액 일정량을 오염시켰다. 3일째부터 항균물질이 농도별로 첨가된 항균사료를 30일간 일정량 먹이면서 10일간격으로 1마리씩 어체를 분리하여 일정량을 정량하여 여기에 살균 증류수를 가하고 마쇄희석하여 영양한천(Nutrient agar) 배지에서 비브리오(vibrio) 생균수를 측정하였다.

그 결과를 아래 표 5에서 나타내었다.

구분	vibrio 생균수 CFU/g flesh
구분	0일	10일후	20일후	30일후
control	2.8*10⁴	3.8*10⁴	4.0*10⁵	4.8*10⁵
0.05%	2.7*10⁴	4.4*10⁴	1.2*10²	2.8*10
0.1%	2.7*10⁴	1.6*10	0	0
0.5%	2.8*10⁴	0.9*10	0	0
1.0%	2.8*10⁴	0	0	0
5.0%	2.8*10⁴	0	0	0

Claims

쑥, 인경쑥, 호프, 정향, 방아초 등 방향성 식용·약용식물을 건조한 건조물(수분 5-10%)과 물, 에탄올, 메탄올, 크로로포름, 에테르, 아세토나이트릴 등으로부터 선택된 하나 이상의 추출용매를 1:4-1:10 비율로 혼합하여 추출, 여과 및 농축하여 얻은 식물성 추출액.
쑥, 인경쑥, 호프, 정향, 방아초 등 방향성 식용·약용식물을 건조한 건조물(수분 5-10%)과 물, 에탄올, 메탄올, 크로로포름, 에테르, 아세토나이트릴 등으로부터 선택된 하나 이상의 추출용매를 1:4-1:10 비율로 혼합하여 추출, 여과 및 농축하여 얻은 식물성 추출액에 대해 아세토나이트릴 등과 같은 수소공여체 용매(protic solvent) 및 로즈벤갈(Rose bengal)등과 같은 광감작제(photosensitizer)를 10-20:10-70:80-10 비율로 혼합하여 광감작반응상(photosensitization box)에 넣고 형광등(파장 180-380nm, 10W×4bulbs)으로 30분-7시간 정도 광감작화(photosensitization)하여 강한 항균활성을 갖는 카리오필렌 산화 물 용액(caryophyllene oxidation products(COPs)solution)을 얻는 방법.
카리오필렌(caryophyllene)과 카리오필렌 산화물(caryophyllene oxide)를 에탄올에 용해시켜 제2항의 식물 추출물 대신 동일량 사용하여 제2항의 방법으로 처리하여 COPs를 얻는 방법.
제 2, 3항에 있어서 COPs 혼합물로부터 TLC(박충크래마토그래피)로 전개용매로 벤젠(benzene):에틸아세테이트(ethy1 acetate)=9:1을 사용하여 분리하고 자외선 광(UV(200mm)Light)과 10% 황산용액으로 발색시켜 Rf(전개율) 0.66인 강한 항균 물질을 분리, 정제하는 방법.
제2, 3항의 항균제와 물, 에탄올을 1-3:8-6:1-0의 비율로 혼합하여 식물 병원균에 효능이 강한 분사형 완효성농약(살균제)의 제조방법
제2, 3항의 항균제와 물, 유기산, 알코올 1-3:9-3:0-1:0-3의 비율로 혼합하여 과일, 야채 등의 보존성을 향상시키는 식품용보존제의 제조 방법.
제2, 3항의 항균제를 통상의 양식 어류용 사료에 대해 0.05%-5% 첨가하는 항균성 사료 첨가제의 제조방법.