KR102841663B1 - 중간엽 줄기세포 활성 측정용 조성물 및 이를 이용한 키트 - Google Patents

중간엽 줄기세포 활성 측정용 조성물 및 이를 이용한 키트

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Abstract

본 발명은 중간엽 중기세포의 활성 측정용 조성물, 이를 포함하는 활성 측정 키트 및 상기 조성물을 이용한 중간엽 줄기세포의 활성 측정 방법을 제공한다. 상기 조성물은 HGF, PTGES, COX2, VCAM, ICAM1, 및 IDO로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍 및 프로브를 포함하며, 이를 이용해 안정적으로 중간엽 줄기세포의 활성을 측정할 수 있다.

Description

중간엽 줄기세포 활성 측정용 조성물 및 이를 이용한 키트 {Composition for activation check of mesenchymal stem cell and kit using thereof}
본 발명은 중간엽 줄기세포의 활성 측정용 조성물, 이를 이용하는 키트, 및 상기 조성물을 이용하여 중간엽 줄기세포의 활성을 측정하는 방법에 관한 것이다.
중간엽 줄기세포(Mesenchymal stem cell; MSC)는 뼈, 연골, 지방 등으로 분화할 수 있는 능력을 가진 성체줄기세포의 일종으로, 골수, 지방, 태반, 탯줄, 성선 등 다양한 장기에 분포하며, 세포 치료제의 주요 성분이 된다.
중간엽 줄기세포를 유효 성분으로 하는 세포치료제는 크게 (1) 줄기세포의 분화능을 이용하여 뼈나 연골의 재생을 촉진하거나; (2) 중간엽 줄기세포가 가지는 항염증 효과를 이용하여 체내의 염증을 완화하는; 두 가지의 작용 기전을 가진다.
이 때 중간엽 줄기세포의 항염증 효과를 이용하는 세포치료제는 염증성 환경에서 줄기세포가 HGF, PTGES, COX2, VCAM, ICAM1, 및/또는 IDO 단백질을 발현하는 정도에 따라 항염증 효과를 발휘하는 것으로 알려져 있다.
세포치료제는 종래의 화학적 치료제와 달리 살아 있는 세포를 이용하므로, 세포를 배양하는 배지의 변경, 배양 조건(온도, 공급 공기 조건, 교반 등)에 따라 의약품의 품질에 차이가 발생할 수 있다. 이에 따라 환자에게 적용하기 전 유효성 확보 여부를 확인하기 위한 품질 관리 기준을 충족할 필요가 있다.
'역가 시험법'으로 명명되는 세포치료제의 개발 및 생산 공정에서 수행되는 세포의 활성도 평가 단계는 세포치료제의 품질을 관리하는 데에 매우 중요한 역할을 수행하는 반면, 현재까지 이를 위한 정형화된 키트나 검사법이 존재하지 않는다. 이에 따라 세포치료제 개발사는 자체적으로 실험을 진행하여 세포치료제의 역가를 정의하고 있어 세포치료제의 개발 비용과 시간이 증가할 뿐만 아니라, 일관적인 시험 결과를 도출하기 어려운 문제점이 있다.
본 발명은 중간엽 줄기세포의 활성도를 측정하기 위한 조성물, 상기 조성물을 포함하는 중간엽 줄기세포의 활성도 측정 키트, 및/또는 상기 조성물을 이용하여 중간엽 줄기세포의 활성을 측정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 중간엽 줄기세포의 활성 측정용 조성물을 제공한다.
본 발명은 중간엽 줄기세포의 활성 측정용 조성물을 포함하는, 중간엽 줄기세포의 활성도 측정 키트를 제공한다.
본 발명은 상기 조성물을 이용하여 중간엽 줄기세포의 활성을 확인하는 방법을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 명세서에서, "중간엽 줄기세포"는 동물 유래의 중간엽 줄기세포라면 그 유래를 가리지 않으며, 예를 들어, 포유류 유래의 중간엽 줄기세포일 수 있다. 예를 들어, 본 명세서의 중간엽 줄기세포 인간, 개, 돼지, 토끼, 말, 고양이, 고릴라, 침팬지, 오랑우탄, 또는 쥐 유래의 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에서, 별도의 설명이 없는 한 모든 단위는 SI 단위계를 기초로 기술되었으며, 예를 들어, 온도는 섭씨 온도를, 부피는 리터(L), 길이는 미터(m), 질량은 그램(g)을 기준으로 작성되었다.
본 명세서에서, 별도의 설명이 없는 한, 핵산의 염기 서열은 5'말단에서 3' 말단 방향으로, 아미노산 서열은 N 말단에서 C 말단 방향으로 기재되었다.
본 발명은 중간엽 줄기세포의 활성 측정용 조성물을 제공한다.
본 발명이 제공하는 중간엽 줄기세포의 활성 측정용 조성물은 중합효소 연쇄반응(PCR)을 사용하여 중간엽 줄기세포의 활성을 측정하기 위한 것일 수 있다. 상기 중합효소 연쇄반응은, 당업계에 알려진 중합효소 연쇄반응이라면 제한 없이 사용 가능하며, 예를 들어, 실시간 중합효소 연쇄 반응(real-time PCR, RT-PCR), 택맨-프로브 실시간 중합효소 연쇄 반응(Taqman-probe RT-PCR), 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명이 제공하는 중간엽 줄기세포의 활성 측정용 조성물은, HGF, PTGES, COX2, VCAM, ICAM1, 및 IDO로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자를 목적으로 하는 프라이머(프라이머쌍) 및/또는 프로브를 포함할 수 있다.
일 예에서, 상기 HGF 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열과 각각 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산, 또는 서열번호 22 및 서열번호 23의 염기서열과 각각 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 일 수 있다. 또는, HGF 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍은 상기 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 핵산, 또는 서열번호 22 및 서열번호 23의 염기서열로 이루어지는 핵산일 수 있다.
일 예에서, 상기 PTGES 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍은 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열과 각각 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산, 또는 서열번호 28 및 서열번호 29의 염기서열과 각각 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 일 수 있다. 또는, PTGES 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍은 상기 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어지는 핵산, 또는 서열번호 28 및 서열번호 29의 염기서열로 이루어지는 핵산일 수 있다.
일 예에서, 상기 COX2 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍은 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열과 각각 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산, 또는 서열번호 31 및 서열번호 32의 염기서열과 각각 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 일 수 있다. 또는, COX2 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍은 상기 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어지는 핵산, 또는 서열번호 31 및 서열번호 32의 염기서열로 이루어지는 핵산일 수 있다.
일 예에서, 상기 VCAM 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍은 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열과 각각 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산, 또는 서열번호 34 및 서열번호 35의 염기서열과 각각 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 일 수 있다. 또는, VCAM 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍은 상기 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어지는 핵산, 또는 서열번호 34 및 서열번호 35의 염기서열로 이루어지는 핵산일 수 있다.
일 예에서, 상기 ICAM1 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍은 서열번호 16 및 서열번호 17의 염기서열과 각각 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산, 또는 서열번호 37 및 서열번호 38의 염기서열과 각각 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 일 수 있다. 또는, ICAM1 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍은 상기 서열번호 16 및 서열번호 17의 염기서열로 이루어지는 핵산, 또는 서열번호 37 및 서열번호 38의 염기서열로 이루어지는 핵산일 수 있다.
일 예에서, 상기 IDO 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍은 서열번호 19 및 서열번호 20의 염기서열과 각각 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산, 또는 서열번호 40 및 서열번호 41의 염기서열과 각각 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산 일 수 있다. 또는, IDO 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍은 상기 서열번호 19 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어지는 핵산, 또는 서열번호 40 및 서열번호 41의 염기서열로 이루어지는 핵산일 수 있다.
일 예에서, 본 발명이 제공하는 중간엽 줄기세포의 활성 측정용 조성물은, HGF, PTGES, COX2, VCAM, ICAM1, 및 IDO로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자를 목적으로 하는 프로브를 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로브는 상기 각 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍과 일 세트를 구성할 수 있다.
상기 프로브는 각 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍에 의해 증폭되는 가닥에 상보적으로 결합할 수 있다면 제한 없이 설계되어 사용될 수 있다.
일 예에서, 상기 HGF 유전자를 목적하는 프로브는 서열번호 3 또는 서열번호 24의 염기서열로 이루어지는, 또는 서열번호 3 또는 서열번호 24의 염기서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성을 가지는 핵산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예에서, 상기 PTGES 유전자를 목적하는 프로브는 서열번호 9 또는 서열번호 30의 염기서열로 이루어지는, 또는 서열번호 9 또는 서열번호 30의 염기서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성을 가지는 핵산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예에서, 상기 COX2 유전자를 목적하는 프로브는 서열번호 12 또는 서열번호 33의 염기서열로 이루어지는, 또는 서열번호 12 또는 서열번호 33의 염기서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성을 가지는 핵산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예에서, 상기 VCAM 유전자를 목적하는 프로브는 서열번호 15 또는 서열번호 36의 염기서열로 이루어지는, 또는 서열번호 15 또는 서열번호 36의 염기서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성을 가지는 핵산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예에서, 상기 ICAM1 유전자를 목적하는 프로브는 서열번호 18 또는 서열번호 39의 염기서열로 이루어지는, 또는 서열번호 18 또는 서열번호 39의 염기서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성을 가지는 핵산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예에서, 상기 IDO 유전자를 목적하는 프로브는 서열번호 21 또는 서열번호 42의 염기서열로 이루어지는, 또는 서열번호 21 또는 서열번호 42의 염기서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성을 가지는 핵산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 프로브들은 5' 말단과 3' 말단에 각각 형광 염료(dye)와 퀀처(quencher)가 결합된 형태로 제공될 수 있다. 상기 형광 염료와 퀀처의 종류는 핵산 증폭 수준의 검출이라는 목적 범위 내에서 당업계에 알려진 것을 제한 없이 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 형광 염료는 FAM, Cy5, HEX, 및 TR로 이루어지는 군에서 선택되는 하나일 수 있으며, 퀀처는 BHQ1, BHQ2, 및 BHQ3으로 이루어지는 군에서 선택되는 하나일 수 있다.
일 예에서, 본 발명이 제공하는 중간엽 줄기세포의 활성 측정용 조성물은 Actin 유전자 또는 GAPDH 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍 및 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
상기 Actin 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍은 서열번호 25 및 서열번호 26의 염기서열과 각각 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산일 수 있다. 또는, 상기 Actin 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍은 서열번호 25 및 서열번호 26의 염기서열로 이루어지는 핵산일 수 있다.
상기 GAPDH 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍은 서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열과 각각 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 서열 상동성을 갖는 핵산일 수 있다. 또는, 상기 GAPDH 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍은 서열번호 4 및 서열번호 5의 염기서열로 이루어지는 핵산일 수 있다.
상기 Actin 유전자를 목적으로 하는 프로브는 서열번호 27의 염기서열로 이루어지는, 또는 서열번호 27의 염기서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성을 가지는 핵산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 GAPDH 유전자를 목적으로 하는 프로브는 서열번호 6의 염기서열로 이루어지는, 또는 서열번호 6의 염기서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 또는 99.9% 이상의 상동성을 가지는 핵산을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 상술한 중간엽 줄기세포의 활성 측정용 조성물을 포함하는, 중간엽 줄기세포의 활성 측정 키트를 제공한다.
상기 중간엽 줄기세포의 활성 측정용 조성물은 상술한 바와 같다.
일 예에서, 본 발명이 제공하는 중간엽 줄기세포의 활성 측정 키트의 각 프라이머쌍은 정방향(forward) 및 역방향(reverse) 프라이머가 1:1의 몰 비율을 갖도록 포함될 수 있다. 일 예에서, 본 발명이 제공하는 중간엽 줄기세포의 활성 측정 키트의 프라이머쌍과 프로브는 각 프라이머(정방향 또는 역방향)와 프로브의 몰 비율이 1:2 내지 1:1, 3:5 내지 1:1, 또는 2:3 내지 1:1 비율이 되도록 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예에서, 본 발명이 제공하는 중간엽 줄기세포의 활성 측정 키트는 중간엽 줄기세포 배양 단계에서 첨가할 사이토카인, 예를 들어 TNF-α, IL-1, 및 IFN-γ로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다. 상기 사이토카인은 줄기세포 배양 배지에 최종 농도 1 내지 100ng/ml, 1 내지 75ng/ml, 1 내지 50ng/ml, 1 내지 25ng/ml, 10 내지 100ng/ml, 10 내지 75ng/ml, 10 내지 50ng/ml, 또는 10 내지 25ng/ml가 되도록 첨가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서 상기 사이토카인은 각각 최종 농도 20ng/ml이 되도록 첨가되었다.
상기 사이토카인은 중간엽 줄기세포와 동종의 또는 이종의 사이토카인이 사용될 수 있다.
일 예에서, 본 발명이 제공하는 중간엽 줄기세포의 활성 측정용 키트는 배양된 세포에서 RNA 추출을 수행하기 위한 추가 구성을 포함할 수 있다. 상기 RNA 추출을 수행하기 위한 추가 구성은, 예를 들어, RNA 추출 용액, 클로로포름:이소아밀알코올(20:1 내지 30:1), 앱솔루트 에탄올(absolute ethanol), 세척용 버퍼(wash buffer), 및 DEPC(diethylpyrocarbonate)로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 RNA 추출을 위한 모든 구성을 포함할 수 있다.
일 예에서, 본 발명이 제공하는 중간엽 줄기세포의 활성 측정용 키트는 RNA 추출을 수행하기 위한 컬럼, 마이크로튜브, 및 RNA 추출을 위한 필터로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 부속을 추가로 포함할 수 있다.
일 예에서, 본 발명이 제공하는 중간엽 줄기세포의 활성 측정용 키트는 1 step RT-qPCR을 위한 구성, 예를 들어, RT-qPCR 마스터 믹스(Master Mix), 핵산 중합효소, 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
일 예에서, 본 발명이 제공하는 중간엽 줄기세포의 활성 측정용 키트는, 세포 배양 단계에서 첨가되는 사이토카인 세트(제1단계), 배양된 세포에서 RNA를 추출하는 RNA 추출용 키트(제2단계), 및 추출된 RNA로부터 핵산을 증폭하기 위한 PCR 키트(제3단계)의 총 3단계의 구성을 분리하여, 또는 이들의 조합으로 제공될 수 있다.
또 다른 일 예에서, 상기 3단계의 구성의 조합으로 제공되는 본 발명의 키트는, 각 구성의 보관 기관 등을 고려하여, 1회분, 5회분, 10회분, 15회분, 20회분, 30회분, 50회분, 또는 그 이상의 용량으로 제공될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명이 제공하는 중간엽 줄기세포의 활성 측정 키트는, 상술된 구성 외에도 당업계에서 필요하다고 여겨지는 추가 구성을 자유롭게 포함할 수 있다. 또한, 필요한 경우 키트를 위한 사용 설명서 또는 매뉴얼을 추가로 제공할 수 있으며, 활성도 판단 기준을 제공하는 가이드라인이 추가로 제공될 수 있다.
본 발명은 중간엽 줄기세포의 활성 측정용 조성물을 사용하여 중간엽 줄기세포의 활성을 확인하는 방법을 제공한다.
본 발명의 중간엽 줄기세포의 활성을 확인하는 방법은, 하기의 단계를 거쳐 수행될 수 있다:
(1) 중간엽 줄기세포에 IFN-γ, IL-1, 및 TNF-α로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 사이토카인을 처리하는 단계; 및
(2) 상기 중간엽 줄기세포의 활성 측정용 조성물을 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계.
상기 중간엽 줄기세포의 활성 측정용 조성물은 상술한 바와 같다.
일 예에서, 상기 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계는, 중합효소 연쇄반응 수행 후 GAPDH 또는 Actin 유전자 대비 HGF, PTGES, COX2, VCAM, ICAM1, 및 IDO로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 상대적 발현량을 계산하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 상대적 발현량을 계산하는 단계는 하기 수학식 1의 방법으로 계산될 수 있다.
수학식 1:
일 예에서, 상기 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계 이후, 사이토카인을 처리하지 않은 대조군 세포와 사이토카인을 처리한 세포에서의 HGF, PTGES, COX2, VCAM, ICAM1, 및 IDO로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 발현량(상술한 GAPDH 또는 Actin 유전자 대비 상대적 발현량을 포함한다)을 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일 예에서, 사이토카인을 처리하지 않은 대조군 세포 대비 사이토카인을 처리한 세포에서 HGF, PTGES, COX2, VCAM, ICAM1, 및 IDO로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 상대적 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하는 경우, 해당 중간엽 줄기세포, 및/또는 상기 중간엽 줄기세포를 포함하는 세포치료제가 활성을 가지는 것으로 판단할 수 있다.
본 발명이 제공하는 중간엽 줄기세포의 활성도 측정용 조성물을 사용함으로써, 일관적인 시험 방법을 통해 중간엽 줄기세포의 활성도를 안정적으로 측정할 수 있고, 이를 활용하여 세포치료제의 역가 시험을 보다 표준화 할 수 있다.
도 1은 중간엽 줄기세포 활성도 측정키트의 개요도를 나타낸 그림이다.
도 2는 PCR 증폭 Cycle에 따라 각 유전자에 해당하는 형광값을 측정함으로써 각 유전자의 PCR 증폭 양상을 실시간으로 기록한 그래프이다.
도 3은 정량 실시간 PCR (quantitative real-time PCR)을 통해 측정한 Ct(cycle threshold) 값 결과를 나타낸 표이다.
도 4는 사이토카인을 처리한 중간엽 줄기세포에서의 mRNA 발현량을 확인한 결과를 나타낸 그래프이다 (CON: 대조군, +: 사이토카인 처리군, MSC: 중간엽 줄기세포, y축 설명: Relative mRNA expression/Actin, 각 그래프 상단에 mRNA 명칭 표기).
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 일 예를 예시하기 위한 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 권리범위가 제한되지 아니한다.
이하 준비예들 및 실시예는 도 1을 참조하여 설명될 수 있다.
준비예 1. 중간엽 줄기세포 배양 및 사이토카인 처리
1-1. 중간엽 줄기세포 배양
중간엽 줄기세포가 부착할 수 있는 6-well 배양 접시(6-well plate, Corning)에 5x105 cells/well만큼 중간엽 줄기세포를 분주 후, 중간엽 줄기세포 배양배지(10% 소 태아 혈청(Fetal Bovine Serum, VBS; R&D system) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin, P/S; Welgene) 포함)에서 섭씨 37도, 5%(v/v) CO2 환경에서 24시간 배양하였다.
1-2. 사이토카인 처리
사이토카인 3종(IFN-γ(Novus Biologicals), IL-1(R&D system), 및 TNF-α(Peprotech))을 각각 20ng/ml 농도가 되도록 실시예 1-1의 중간엽 줄기세포 배양 배지에 첨가하여 준비하였다.
준비예 1-1의 배양 후 배양 배지를 제거하고, 각 사이토카인 첨가 배지를 6-well plate에 넣어준 후 다시 준비예 1-1과 동일한 환경에서 24시간 배양하였다.
준비예 2. mRNA 추출
준비예 1-2의 사이토카인 처리 후 배지를 제거하고 Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS; Welgene)을 이용, 세포를 2회 세척하였다. 세척된 세포에 Trizol(Thermo scientific)을 처리한 후 이를 microtube에 옮겨 담아 클로로포름:이소아밀알콜(chloroform:isoamylalcohol, 24:1; 바이오세상)을 첨가한 뒤, 원심분리 하였다 (13,000rpm, 15min). 원심분리한 microtube 중 상층액을 새 microtube로 옮기고, 상층액과 동량의 absolute ethanol(Millipore)를 넣어준 뒤 수 회(7~8회) 흔들어 주었다.
RNA 분리 키트(Bioneer)의 컬럼에 에탄올 처리된 위 용액을 넣고 14,000rpm으로 1분 원심분리 후 컬럼의 아래 튜브에 모인 액체를 제거하였다. 그 후 1차 세척액을 넣고 14,000rpm으로 1분 원심분리하고 다시 컬럼의 아래 튜브에 모인 액체를 제거하였다. 그 후 2차 세척액을 넣고 14,000rpm으로 1분 원심분리하고 다시 컬럼의 아래 튜브에 모인 액체를 제거하였다. 그 후 2차 세척액을 다시 넣고 14,000rpm으로 2분 원심분리하여 컬럼의 아래 튜브에 모인 액체를 제거하였다.
이후 컬럼의 잔여 에탄올을 완전히 제거하기 위해 14,0000rpm으로 1분간 추가 원심분리 후 컬럼을 새 microtube로 옮겨 DEPC를 첨가한 증류수(diethylpryocarbonate-treated water)를 넣고 14,000rpm으로 1분간 원심분리하여 mRNA를 추출하였다.
준비예 3. 1-step RT-qPCR
준비예 2에서 분리된 mRNA를 주형으로 하여 GoTaq® Probe 1-Step RT-qPCR System (Promega) 키트를 사용해 1-step RT-qPCR을 수행하였다. PCR 사이클은 섭씨 45도 15분, 섭씨 95도 15초, 섭씨 60도 1분의 조건으로 총 40회 반응 수행하였다. 대조군으로는 GAPDH(인간) 또는 Actin(개) 유전자의 mRNA를 이용하였으며, 각 유전자의 mRNA 발현량은 Actin 유전자의 mRNA 발현량과의 상대적 발현량으로 표시되었다.
하기 [표 1]에 인간 중간엽 줄기세포의 mRNA 발현량 확인에 사용된 프라이머 및 프로브의 염기서열을 나타내었다.
대상
유전자		 PCR 결과물
크기(bp)		 프라이머 및 프로브 정보 서열번호
종류 서열(5'>3')
HGF 134 Forward TGGGGCTACACTGGATTGAT 1
Reverse GCCCCAGCACATATTTCAGA 2
Probe FAM-TGCAGCCAGCATCATCGAGGGAAGGTG-BHQ1 3
GAPDH 123 Forward GGTGTGAACCATGAGAAGTATGA 4
Reverse GAGTCCTTCCACGATACCAAAG 5
Probe Cy5-AGATCATCAGCAATGCCTCCTGCA-BHQ3 6
PTGES 107 Forward CCAGTATTGCAGGAGCGAC 7
Reverse GAAAGGAGTAGACGAAGCCC 8
Probe HEX-CGCTGCCTCAGGGCCCACCG-BHQ1 9
COX2 144 Forward CTGGGAAGCCTTCTCTAACC 10
Reverse AGGAAGCTGCTTTTTACCTTTG 11
Probe FAM-GCCTGATGATTGCCCGACTCCCTTGGG-BHQ1 12
VCAM 103 Forward GGATAATGTTTGCAGCTTCTCA 13
Reverse GGGTTCTCCAAGAGAAAAATGG 14
Probe TR-ACTTGCAGCACCACAGGCTGTGAGTCC-BHQ2 15
ICAM1 149 Forward GCTTCGTGTCCTGTATGGC 16
Reverse GTGGGAAAGTGCCATCCTTT 17
Probe HEX-TGTGCCAGGCTTGGGGGAACCCA-BHQ1 18
IDO 133 Forward CGCATATATTTGTCTGGCTGG 19
Reverse CGTCAAAGCACTGAAAGACG 20
Probe TR-GCAGGGGGCAGTGCAGGCCA-BHQ2 21
하기 [표 2]에 개 중간엽 줄기세포의 mRNA 발현량 확인에 사용된 프라이머 및 프로브의 염기서열을 나타내었다.
대상
유전자		 PCR 결과물
크기(bp)		 프라이머 및 프로브 정보 서열번호
종류 서열(5'>3')
HGF 148 Forward TCGAGCTATCGGGGTAAAGA 22
Reverse AGGTCATGCATTCAACTTCTGA 23
Probe FAM-CCTCGAGGGGAAGAAGGGGGACCTTGG-BHQ1 24
Actin 106 Forward CAGCAAATGTGGATCAGCAAG 25
Reverse GAAAGGGTGTAACGCAACTAAAG 26
Probe Cy5-TCGTCCACCGCAAATGCTTCTAGG-BHQ3 27
PTGES 137 Forward GCTTCGGAAGAAGGCTTTTG 28
Reverse ACAGGAAGGGGTAGATGGTC 29
Probe HEX-CGCTGCCTCAGAGCCCACCGG-BHQ1 30
COX2 115 Forward CCATCTGTTCACCTGACTACTG 31
Reverse GGACAGCCCTTCACGTTATT 32
Probe FAM-AAGCCTAGCACCTTTGGTGGAGAA-BHQ1 33
VCAM 125 Forward GTGGACCTCTACTCATTCCCT 34
Reverse TCAATCTCCAGTCGGTCAGA 35
Probe TR-CCCAGTCACTGTGAGCTGCGAGGTTCC-BHQ2 36
ICAM1 79 Forward CAGCTATGGTGTGAGGTGAC 37
Reverse GTGCCGGGAAGCTATAGAAG 38
Probe HEX-TGGGAGACGAGAATCGGAGGTGGCAGG-BHQ1 39
IDO 101 Forward TGTTCTGGTGAAGAATTCGCT 40
Reverse GAGGGGCCTGACTTTAACA 41
Probe TR-TGCCCCCAGCTCACCGGGACTT-BHQ2 42
실시예 1. 사이토카인 처리 중간엽 줄기세포에서 활성화되는 유전자의 확인
도 2에 준비예 3의 1-step RT-qPCR 수행 결과, PCR 증폭 Cycle에 따라 각 유전자에 해당하는 실시간 형광값과 문턱값(threshold)을 나타내었다. 유전자 증폭 신호의 증가 양상이 확연하게 구분되는 시점을 문턱값(threshold)으로 지정하여, 해당 문턱값과의 접점이 되는 PCR cycle 수를 Ct(cycle threshold) 값으로 계산하였다.
도 3에 각 유전자 별 계산된 Ct 값을 표로 나타내었다.
도 4에 Actin 대비 각 유전자의 mRNA 발현 양상 확인을 위해 각 유전자의 발현량을 계산하여 그래프로 나타내었다. 도 4에서, y축 값은 하기 수학식 1과 같이 계산되었다.
수학식 1:
상기 수학식 1에서, mRNA expression level은 mRNA 발현량을, Delta-Ct()는 목적 유전자의 Ct값과 Actin의 Ct값의 차()를 의미한다.
도 3 및 도 4에서 확인 가능한 바와 같이, HGF, PTGES, COX2, VCAM, ICAM1, IDO 유전자에 대하여 사이토카인을 처리하지 않은 대조군(CON)보다 사이토카인을 처리한 군에서 mRNA 발현량이 높게 나타남을 확인하였다.
따라서 상기 유전자들을 목적으로 하여 PCR을 수행함으로써 중간엽 줄기세포의 활성을 확인할 수 있음을 실험적으로 확인하였다.
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primer for PTGES <400> 7 ccagtattgc aggagcgac 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PTGES <400> 8 gaaaggagta gacgaagccc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for PTGES <400> 9 cgctgcctca gggcccaccg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for COX2 <400> 10 ctgggaagcc ttctctaacc 20 <210> 11 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for COX2 <400> 11 aggaagctgc tttttacctt tg 22 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for COX2 <400> 12 gcctgatgat tgcccgactc ccttggg 27 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for VCAM <400> 13 ggataatgtt tgcagcttct ca 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for VCAM <400> 14 gggttctcca agagaaaaat gg 22 <210> 15 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for VCAM <400> 15 acttgcagca ccacaggctg tgagtcc 27 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ICAM1 <400> 16 gcttcgtgtc ctgtatggc 19 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ICAM1 <400> 17 gtgggaaagt gccatccttt 20 <210> 18 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for ICAM1 <400> 18 tgtgccaggc ttgggggaac cca 23 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for IDO <400> 19 cgcatatatt tgtctggctg g 21 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IDO <400> 20 cgtcaaagca ctgaaagacg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for IDO <400> 21 gcagggggca gtgcaggcca 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for HGF <400> 22 tcgagctatc ggggtaaaga 20 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for HGF <400> 23 aggtcatgca ttcaacttct ga 22 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for HGF <400> 24 cctcgagggg aagaaggggg accttgg 27 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Actin <400> 25 cagcaaatgt ggatcagcaa g 21 <210> 26 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Actin <400> 26 gaaagggtgt aacgcaacta aag 23 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for Actin <400> 27 tcgtccaccg caaatgcttc tagg 24 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for PTGES <400> 28 gcttcggaag aaggcttttg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for PTGES <400> 29 acaggaaggg gtagatggtc 20 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for PTGES <400> 30 cgctgcctca gagcccaccg g 21 <210> 31 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for COX2 <400> 31 ccatctgttc acctgactac tg 22 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for COX2 <400> 32 ggacagccct tcacgttatt 20 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for COX2 <400> 33 aagcctagca cctttggtgg agaa 24 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for VCAM <400> 34 gtggacctct actcattccc t 21 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for VCAM <400> 35 tcaatctcca gtcggtcaga 20 <210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for VCAM <400> 36 cccagtcact gtgagctgcg aggttcc 27 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for ICAM1 <400> 37 cagctatggt gtgaggtgac 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for ICAM1 <400> 38 gtgccgggaa gctatagaag 20 <210> 39 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for ICAM1 <400> 39 tgggagacga gaatcggagg tggcagg 27 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for IDO <400> 40 tgttctggtg aagaattcgc t 21 <210> 41 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for IDO <400> 41 gaggggcctg actttaaca 19 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe for IDO <400> 42 tgcccccagc tcaccgggac tt 22

Claims (7)

  1. HGF 유전자를 목적으로 하는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 프로브;
    PTGES 유전자를 목적으로 하는 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 9의 염기서열로 이루어진 프로브;
    COX2 유전자를 목적으로 하는 서열번호 10 및 서열번호 11의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 프로브;
    VCAM 유전자를 목적으로 하는 서열번호 13 및 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 15의 염기서열로 이루어진 프로브;
    ICAM1 유전자를 목적으로 하는 서열번호 16 및 서열번호 17의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 18의 염기서열로 이루어진 프로브; 및
    IDO 유전자를 목적으로 하는 서열번호 19 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 21의 염기서열로 이루어진 프로브로 이루어진, ‘프라이머쌍 및 프로브 세트 1’; 또는
    HGF 유전자를 목적으로 하는 서열번호 22 및 서열번호 23의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 24의 염기서열로 이루어진 프로브;
    PTGES 유전자를 목적으로 하는 서열번호 28 및 서열번호 29의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 30의 염기서열로 이루어진 프로브;
    COX2 유전자를 목적으로 하는 서열번호 31 및 서열번호 32의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 33의 염기서열로 이루어진 프로브;
    VCAM 유전자를 목적으로 하는 서열번호 34 및 서열번호 35의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 36의 염기서열로 이루어진 프로브;
    ICAM1 유전자를 목적으로 하는 서열번호 37 및 서열번호 38의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 39의 염기서열로 이루어진 프로브; 및
    IDO 유전자를 목적으로 하는 서열번호 40 및 서열번호 41의 염기서열로 이루어진 프라이머쌍, 및 서열번호 42의 염기서열로 이루어진 프로브로 이루어진, ‘프라이머쌍 및 프로브 세트 2’를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 HGF, PTGES, COX2, VCAM, ICAM1, 및 IDO 유전자 발현 측정용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    대조군으로서 Actin 유전자 또는 GAPDH 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍 및 프로브를 추가로 포함하는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 Actin 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍은 서열번호 25 및 서열번호 26으로 이루어지는 핵산이고, 프로브는 서열번호 27로 이루어지는 핵산을 포함하는 것이고;
    상기 GAPDH 유전자를 목적으로 하는 프라이머쌍은 서열번호 4 및 서열번호 5로 이루어지는 핵산이고, 프로브는 서열번호 6으로 이루어지는 핵산을 포함하는 것인, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 중간엽 줄기세포의 HGF, PTGES, COX2, VCAM, ICAM1, 및 IDO 유전자 발현 측정 키트.
  5. 중간엽 줄기세포에 IFN-γ, IL-1 , 및 TNF-α로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 사이토카인을 처리하는 단계; 및
    제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 조성물을 사용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계를 포함하는, 중간엽 줄기세포의 HGF, PTGES, COX2, VCAM, ICAM1, 및 IDO 유전자 발현 측정 방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
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Cell Death and Differentiation. vol. 21, 216-225(2014)
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