KR102707661B1 - Pha 타입 1b의 치료를 위한 고리형 폴리펩티 - Google Patents
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Abstract
상염색체 열성 가성저알도스테론혈증 타입 1(PHA 타입 1B)의 치료에서 사용하거나, 또는 기능소실 돌연변이 ENaC의 Na+ 이온 수송 능력의 회복을 위한 아미노산 서열 Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr(SEQ ID NO:1)로부터 적어도 6개 연속 아미노산을 포함하는 고리형 폴리펩티드을 개시한다.
Description
본 발명은 고리형 폴리펩티드, 및 상염색체 열성 가성저알도스테론증(pseudohypoaldosteronism) 타입 1(PHA 타입 1B)의 치료 또는 기능소실 돌연변이 ENaC의 Na+ 수송 능력의 회복을 위한 이의 용도에 관한 것이다.
상염색체 열성(autosomalrecessive, AR) 가성저알도스테론증 타입 1(PHA 타입 1B)는 성장장애, 체중손실, 염 손실, 고칼륨혈증 및 대사성 산증을 동반하는 출생 후 며칠 이내에 나타나는 생명을 위협하는 희귀한 질환이다. 이는 1958년에 최초로 특정되었다(Cheek & Perry, 1958). 상염색체 열성 가성저알도스테론혈증 타입 1은 생명을 위협하며, 신장, 결장, 침샘 및 땀샘, 및 폐에서 발견되는 나트륨 이온 채널 ENaC가 세포층을 가로지른 나트륨 이온(Na+ 이온) 이동을 촉진하는 기능을 상실케한다. ENaC의 기능상실은 소변과 대변에서 나트륨의 상실 및 신체의 심각한 염 불균형을 가져온다. 이와 관련된 특징은 낮은 혈중 나트륨 수준(저나트륨혈증)과 높은 혈중 칼륨 수준(고칼륨혈증)이다. 이 장애는 다중장기 시스템을 수반하므로, 염 손실이 주로 신장에 제한되고 상이한 유전자에서의 돌연변이에 의해 야기되는 더 경증인 상염색체 우성(AD) 또는 신성(renal) PHA 타입 1과 구별하기 위해 전신(systemic) PHA 타입 1이라고도 한다(Riepe, 2009). 신성 PHA와 전신 PHA 타입 1의 구별은 Na 요건, 전해질 불균형의 관리 용이성, 땀 테스트 결과 및 유전자 검사에 기초하여 이루어질 수 있다(Amin et al, 2013). 주목할 점은 전신적이지만 신성은 아닌 가성저알도스테론혈증을 가진 아동은 원인불명의 하부 호흡기 질병이 빈번하고, 낭성 섬유증으로 자주 오진된다는 것이다(Hanukoglu et al, 1994; Marthinsen et al, 1998; Huberetal, 2010).
PHA 타입 1B로 최초로 진단된 신생아는 특징적으로 상승된 레닌 및 알도스테론 값을 갖지만 혈압을 유지하는 것이 불가능하다. PHA 타입 1B 환자는 높은 혈청 알도스테론 농도를 동반한 증가된 혈장 레닌 활성 및 이미 언급된 저나트륨혈증과 고칼륨혈증을 나타낸다. 이러한 환자의 생존을 위해서는 공격적인 염 대체와 고칼륨혈증의 제어가 필요하다.
상염색체 열성 가성저알도스테론혈증 타입 I(PHA 타입 1B)는 상피 나트륨 채널(ENaC)의 서브유닛(알파 서브유닛, 베타 서브유닛, 감마 서브유닛)을 암호화하는 3개의 유전자 중 어느 하나에 존재하는 동형접합성 또는 화합물 이형접합성 돌연변이에 의해 야기된다.
상피 나트륨 채널(epithelial sodium channel, ENaC)의 알파, 베타 및 감마 서브유닛을 암호화하는 3개의 유전자 중 어느 하나에 존재하는 돌연변이로 인해 발현된 ENaC 단백질의 아미노산 서열은 불완전하거나 성숙한(비-돌연변이) ENaC와 상이하게 된다. 돌연변이 ENaC는 사실상 비활성이며 세포 및 막을 가로지른 나트륨 이온의 수송을 촉진하지 않는다.
전신 PHA 타입 1의 임상적 징후는 신생아 기간 내에 발생하며, 보통은 땀에서 상승된 Na 농도 및 신장 또는 직장의 상피경유 전압 차이의 부재에 기초하여 진단된다(Riepe, 2009). 임상적 표현형은 심각한 신장 염-소모, 고칼륨혈증, 대사성 산증 및 상승된 혈정 레닌 및 알도스테론 수준 중 하나이다. AR PHA 타입 1에 걸린 아동은 주로 감소된 Na-의존성 액체 흡수 및 기도 표면 액체의 증가된 부피로 인한 폐 합병증을 나타낸다(Kerem et al, 1999). 호흡기 증상이 나타나는 시기는 전형적으로 출생 후 몇주 또는 몇개월 이내이고, 지속성 비루, 재발성 귀 및 부비강 감염, 흉부 울혈, 주로 열과 관련된 기침 및 빈호흡, 천명 및 수포음이 빈번히 관찰된다. 이와 관련하여 매년 빈번하게 발생할 수 있는 호흡기 환자의 흉부 엑스선은 기관지주변 비대, 무기폐 및/또는 작은 솜털형 침윤물을 나타낼 수 있다(Thomas et al, 2002). 폐 합병증은 때로 치명적일 수 있다(Sharma et al, 2013).
상염색체 열성 가성저알도스테론혈증 타입 I은 생애 내내 지속되는 질환이며 시간이 지나도 거의 개선이 없다(Zennaro et al, 2004). PHA 타입 1B에 걸린 환자는 전 생애 동안 심각한 고칼륨혈증 및 탈수와 함께 생명을 위협하는 염 손실에 의한 위기에 처할 위험이 있다(Riepe, 2009).
현재 PHA 타입 1B의 치료는 유체 및 전해질 관리에 제한된다. PHA 타입 1B의 현행 대증치료는 과잉의 폐 유체를 감소시키기 위한 베타2 아고니스트 요법과 전해질 균형을 회복하기 위한 공격적 염 대체 및 고칼륨혈증의 제어를 병용하는 것이다.
기능소실 돌연변이 ENaC의 Na+ 이온 수송 능력을 회복시키거나 적어도 증가시키는 약물-기반 요법이 아직 개발되지 않았다.
따라서, 본 발명의 목적은 기능소실 돌연변이 ENaC의 Na+ 이온 수송 능력을 생리학적 수준으로 회복시키는 약물-기반 요법을 제공하는 것이다.
이 목적은 상염색체 열성 가성저알도스테론혈증 타입 1(PHA 타입 1B)의 치료에서 사용하고, 기능소실 돌연변이 ENaC의 Na+ 이온 수송 능력을 회복시키기 위한 아미노산 서열 SEQ ID NO:1:
Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr
로부터 적어도 6개 연속 아미노산을 포함하는 고리형 폴리펩티드에 의해 해결된다.
돌연변이인 사실상 비활성인 ENaC를 생리학적으로 활성인 ENaC로 전환하는 약물-기반 요법은 현재 존재하지 않지만, 본 발명에 따른 고리형 폴리펩티드가 Na+ 이온 수송 능력을 회복시키고 기능소실 돌연변이 ENaC의 아미노산 돌연변이를 정상 수준으로 보상한다는 것이 밝혀졌다. 아래 상세히 설명된 고리형 펩티드는 "정상"(야생형 활성) 비-돌연변이 ENaC의 ENaC 활성을 조정하며, 놀라운 점은 이 고리형 펩티드가 또한 아미노산 돌연변이를 보상하고 기능소실 돌연변이 ENaC를 다시 정상 수준으로 회복시킬 수 있다는 것이다.
바람직한 구체예에서, 고리형 폴리펩티드는 아미노산 서열 SEQ ID NO:1로부터 적어도 9개 연속 아미노산을 포함한다.
SEQ ID NO:1의 아미노산 서열의 Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu(= SEQ ID NO:5)를 포함하는 고리형 폴리펩티드는 ENaC 수용체에 가장 강한 결합을 나타내는 것으로 판명되었다. 따라서, 한 구체에에서, 고리형 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1의 아미노산 서열 Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu(SEQ ID NO:5 )를 포함하는 것이 바람직하다.
한 구체예에서, 고리형 폴리펩티드는 아미노산 서열:
Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr
를 특징으로 한다.
본 발명에 따른 고리형 폴리펩티드를 제공하기 위해 링을 형성하는 다음과 같은 상이한 방식들이 있다.
a) 한 구체에에서, 고리형 링은 펩티드 백본을 형성하기 위한 단일 아미노산들의 폴리펩티드의 아미드 결합 및 링을 형성하기 위한 2개의 시스테인 아미노산 사이의 이황화 브릿지에 의해 형성된다. 따라서, 한 구체예는 2개의 시스테인 아미노산 사이의 이황화 결합을 포함한다.
다른 구체예에서, 폴리펩티드는 바람직하게 SEQ ID NO:2:
Cys-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Cys
를 포함하며, 여기서 이황화 결합은 SEQ ID NO:2의 Cys1과 Cys17 사이에 형성된다.
바람직한 고리형 폴리펩티드는 SEQ ID NO:3일 수 있으며, 이것은 또한 AP301이라고도 한다:
,
b) 한 구체예에서, 고리형 링은 원형 폴리펩티드를 형성하기 위한 단일 아미노산들의 폴리펩티드의 아미드 결합에 의해 형성된다. 한 구체예에서, 이러한 고리형 링은 γ-아미노부티르산(GABA)과 같은 비-천연 아미노산을 포함한다.
바람직한 고리형 폴리펩티드는 SEQ ID NO:4일 수 있으며, 이것은 또한 AP318이라고도 한다.
,
상기 언급된 모든 구체예에서 가장 바람직하게 고리형 폴리펩티드는 고리형 링이 SEQ ID NO:1의 적어도 10개, 바람직하게 적어도 14개 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 한 양태는 상기 언급된 고리형 폴리펩티드를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 본 발명에 따른 고리형 펩티드(또는 본 발명에 따른 펩티드들의 혼합물)와 제약학적 담체 분자를 함유하는 제약 조성물에 관한 것이다. 이 제약 조성물은 PHA 타입 1B의 치료를 위해 사용된다.
용어 "제약 조성물"은 기능소실 돌연변이 ENaC의 Na+ 이온 수송 능력을 정상 수준으로 회복시키는, 상기 정의된, 고리형 펩티드를 함유하는 임의의 조성물 또는 제제를 말한다. 특히, 용어 "제약 조성물"은 본 발명에 따른 고리형 펩티드와 제약학적으로 허용되는 담체 분자 또는 부형제(이 두 용어는 서로 교환하여 사용된다)를 포함하는 조성물을 말한다. 적합한 담체 또는 부형제는 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 식염수, 링거 용액, 덱스트로오스 용액, 버퍼, 행크 용액, 소포 형성 화합물, 고정 오일, 에틸올레에이트, 식염수 중 덱스트로오스, 등장성 및 화학적 안정성을 증진시키는 물질, 버퍼 및 보존제이다. 다른 적합한 담체는 그 자체가 환자에서 환자에게 해로운 항체의 생성을 유도하지 않는 임의의 담체를 포함한다. 관련 예들은 잘 관용되는 단백질, 다당류, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 중합성 아미노산 및 아미노산 공중합체이다. 이 제약 조성물은 당업자에게 알려진 적절한 과정을 통해서 (약물로서) 투여될 수 있다. 바람직한 투여 경로는 에어로졸로서 폐 흡입 또는 정맥내 투여이다. 비경구 투여의 경우, 본 발명의 제약 조성물은 주사가능한 단위 제형으로, 예를 들어 상기 정의된 제약학적으로 허용되는 부형제와 함께 조제된 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로 제공된다. 그러나, 제형 및 투여 방법은 치료될 개별 환자에 의존한다. 일반적으로, 본 발명에 따른 펩티드는 1 μg/kg 내지 10 mg/kg, 더 바람직하게 10 ㎍/kg 내지 5 mg/kg, 가장 바람직하게 0.1 내지 2 mg/kg의 용량으로 투여된다. 바람직하게, 상기 조성물은 복강내 볼루스 제형으로 투여될 것이다. 또한, 연속 주입이 적용될 수 있다. 이 경우, 펩티드는 5 내지 20 ㎍/kg/min, 더 바람직하게 7-15 ㎍/kg/min의 주입 용량으로 송달된다.
에어로졸로서 폐 흡입의 경우, 본 발명의 제약 조성물은 적합한 단위 제형의 건조 분말 또는 액체 제제로서, 예를 들어 동결건조 및/또는 분무건조에 의해 제조된 건조 분말 입자로서, 상기 정의된 제약학적으로 허용되는 부형제와 함께 조제된 용액, 현탁액 및 에멀젼으로서 제공된다. 폐 흡입에 적합한 에어로졸 입자는 건조 분말 입자이든 액체 에어로졸 입자이든 50μm 이하, 더 바람직하게 10㎛ 이하의 입자 직경을 가진다. 건조 분말 입자는 건조 분말 흡입기에 의해 흡입될 수 있다. 액체 입자는 네불라이저에 의해 흡입될 수 있다. 그러나, 폐 흡입을 위한 제형 및 투여 방법은 치료될 개별 환자에 의존한다. 일반적으로, 본 발명에 따른 펩티드는 1 μg/kg 내지 10 mg/kg, 더 바람직하게 10 ㎍/kg 내지 5 mg/kg, 가장 바람직하게 0.1 내지 2 mg/kg의 용량으로 투여된다. 바람직하게, 상기 조성물은 반복적인 흡입 용량으로서 투여될 것이다. 또한, 연속 흡입이 적용될 수 있다. 이 경우, 펩티드는 5 내지 20 μg/kg/min, 더 바람직하게 7-15 ㎍/kg/min의 용량으로 송달된다.
본 발명의 한 양태는 상기 언급된 고리형 펩티드를 포함하는 상염색체 열성 가성저알도스테론형증 타입 1(PHA 타입 1B)에 걸린 환자의 치료 방법에 관한 것이다.
아밀로라이드-감응성(amiloride-sensitive ) 상피 나트륨 이온 채널(ENaC)
기능적으로 활성인 ENaC는 일반적으로 베타 및 감마 유닛과 함께 하나 이상의 알파 또는 델타 서브유닛으로 이루어진다. 각 ENaC 폴리펩티드 사슬은 세포내 위치된 짧은 -NH2 및 -COOH 말단과 큰 세포외 루프 도메인의 어느 한 측쇄 상의 두 경막 영역으로 이루어진다.
ENaC는 폐, 원위 결장, 원위 네프론, 땀샘 및 침샘, 및 다른 장기 및 조직의 분극된 상피 세포의 정단부 막에 위치된다. 분극된 타이트한 상피에서 ENaC는 Na+ 이온 흡수에 대해 속도 제한적이며, 비정상적인 ENaC 기능은 염 및 물 항상성을 교란하고, 그것이 발생한 장기 및 조직에서 생리학적 작동을 교란한다(Garty & Palmer, 1997; Kellenberger & Schild, 2002). 세포를 통한 Na+ 이온의 상피경유 수송은 2-단계 과정으로 설명될 수 있는데, 그 추진력은 정단부 막을 가로질러 존재하는 Na+ 이온에 대한 큰 전기화학적 구배에 의해 제공된다. 기능적으로 활성인 ENaC는 막의 정단부 측으로부터 Na+ 이온의 진입을 매개한다. ENaC를 통한 Na+의 이런 정단부 진입은 아밀로라이드의 마이크로몰 이하 농도의 적용에 의해 차단될 수 있다.
포유류의 폐에서 Na+ 이온 수송의 조절은 효과적인 가스 교환에 필요한 폐포 내막 유체의 최적 수준을 유지하는데 중요하다(Eaton et al, 2009).
ENaC 유전자 내의 또는 상류 조절 영역의 돌연변이가 정상 ENaC 발현을 파괴하여 채널의 기능장애와 비정상적인 조절을 가져온다.
PHA 타입 1B 환자는 알파 ENaC 서브유닛에 기능소실 돌연변이를 지니며, 베타 및 감마 서브유닛의 돌연변이는 보다 덜 관찰된다.
오리지널 AP301 펩티드는 야생형 인간 TNF의 잔기 C101-E116에 상응하는, TNF-알파의 렉틴-유사 또는 TIP 도메인을 의태한다(Lucas et al, 1994). AP301(시클로(CGQRETPEGAEAKPWYC), 이론적 평균 분자 질량 1923.1)에서, C101은 글리신, E116은 시스테인으로 대체되었고, N-말단 시스테인이 부가되며, 렉틴-유사 도메인을 나타내는 아미노산 잔기의 서열은 말단 시스테인 잔기의 측쇄들 사이의 이황화 결합을 통해서 고리형 구조로 국한된다. 이황화물 브릿지를 형성하는 말단 시스테인 잔기의 산화에 의해 고리화가 달성된다.
AP318(시클로(4-아미노부탄산-GQRETPEGAEAKPWYD), 이론적 평균 분자 질량 1901.0)은 N-말단 4-아미노부탄산의 아미노 기와 C-말단 아스파르트산 잔기의 베타-탄소에 부착된 측쇄 카복실 기 사이에 아미드 결합을 생성함으로써 고리화가 달성된 TIP 펩티드이다.
AP301
[CGQRETPEGAEAKPWYC](시클로 Cbeta1-Cbeta17)
Cys-Gly-Gln-Arg-Glu-Thr-Pro-Glu-Gly-Ala-Glu-Ala-Lys-Pro-Trp-Tyr-Cys
AP318
[Gaba-GQRETPEGAEAKPWYD-OH](시클로 1-Dγ17)
본 발명의 더 상세한 내용은 도면을 참조하여 상세한 설명에서 제시된다.
도 1은 펩티드 AP301 및 AP318의 비교를 도시한다.
도 2는 αG70Sβγ-hENaC에 대한 AP301의 효과를 도시한다. 240nM AP301의 존재하에 10μM 아밀로라이드의 첨가 후, 대조군에 대해 플롯팅된 αG70Sβγ-hENaC를 일시적으로 발현하는 HEK-293 세포의 전 세포 I/V 관계.
도 3은 αβγG40S-hENaC에 대한 AP301의 효과를 도시한다. 240nM AP301의 존재하에 10μM 아밀로라이드의 첨가 후, 대조군에 대해 플롯팅된 αβγG40S-hENaC를 일시적으로 발현하는 HEK-293 세포의 전 세포 I/V 관계.
도 4는 δG71Sβγ-hENaC에 대한 AP301의 효과를 도시한다. 240nM AP301의 존재하에 10μM 아밀로라이드의 첨가 후, 대조군에 대해 플롯팅된 δG71Sβγ-hENaC를 일시적으로 발현하는 HEK-293 세포의 전 세포 I/V 관계.
도 5는 PHA 타입 1b 돌연변이 αβG37Sγ-hENaC에 대한 AP301의 효과를 도시한다. 240nM AP301의 존재하에 10μM 아밀로라이드의 첨가 후, 대조군에 대해 플롯팅된 αβG37Sγ-hENaC를 일시적으로 발현하는 HEK-293 세포의 전 세포 I/V 관계.
도 6은 아밀로라이드-감응성 내향 나트륨 전류의 막대 그래프를 도시한다. 돌연변이 서브유닛으로 일시적으로 형질감염된 HEK-293 세포가 전 세포 방식으로 부착되고, 내향 전류가 -100mV에서 유도되었다. 200nM의 AP318 또는 AP301이 적용되었다.
도 1은 펩티드 AP301 및 AP318의 비교를 도시한다.
도 2는 αG70Sβγ-hENaC에 대한 AP301의 효과를 도시한다. 240nM AP301의 존재하에 10μM 아밀로라이드의 첨가 후, 대조군에 대해 플롯팅된 αG70Sβγ-hENaC를 일시적으로 발현하는 HEK-293 세포의 전 세포 I/V 관계.
도 3은 αβγG40S-hENaC에 대한 AP301의 효과를 도시한다. 240nM AP301의 존재하에 10μM 아밀로라이드의 첨가 후, 대조군에 대해 플롯팅된 αβγG40S-hENaC를 일시적으로 발현하는 HEK-293 세포의 전 세포 I/V 관계.
도 4는 δG71Sβγ-hENaC에 대한 AP301의 효과를 도시한다. 240nM AP301의 존재하에 10μM 아밀로라이드의 첨가 후, 대조군에 대해 플롯팅된 δG71Sβγ-hENaC를 일시적으로 발현하는 HEK-293 세포의 전 세포 I/V 관계.
도 5는 PHA 타입 1b 돌연변이 αβG37Sγ-hENaC에 대한 AP301의 효과를 도시한다. 240nM AP301의 존재하에 10μM 아밀로라이드의 첨가 후, 대조군에 대해 플롯팅된 αβG37Sγ-hENaC를 일시적으로 발현하는 HEK-293 세포의 전 세포 I/V 관계.
도 6은 아밀로라이드-감응성 내향 나트륨 전류의 막대 그래프를 도시한다. 돌연변이 서브유닛으로 일시적으로 형질감염된 HEK-293 세포가 전 세포 방식으로 부착되고, 내향 전류가 -100mV에서 유도되었다. 200nM의 AP318 또는 AP301이 적용되었다.
고리형 펩티드의 합성
모든 펩티드는 고체상 방법에 의해 합성된다. 이들은 선형 서열의 고리화를 야기할 수 있는 연결 해법을 모색하는 동시에 렉틴-유사 도메인의 자생 입체형태를 가능한 많이 보유하도록 설계되었다.
펩티드는 2-클로로트리틸클로라이드 수지 상에서 플루오레닐메틸옥시카보닐/t-부틸 보호 전략에 따라서 고체상 펩티드 합성에 의해 합성된다. 디이소프로필 카보디이미드와 N-하이드록시벤조트리아졸이 커플링 시약으로 사용된다. 모든 커플링 단계는 N-N-디메틸 폼아미드에서 수행된다. 보호된 아미노산은 C-말단 아미노산에서 시작하여 펩티드 사슬과 차례대로 커플링된다. 플루오레닐메톡시카보닐의 탈보호는 N-N-디메틸 폼아미드 중 20% 피페리딘에서 수행된다. 수지로부터 완성된 부분적으로-보호된 펩티드의 절단은 아세트산과 디클로로메탄의 1:1 혼합물에서 수행된다. 졸나타이드 및 돌연변이 TIP 펩티드의 경우, 수지로부터 절단 후에 95% 트리플루오로아세트산, 5% 물에서 측쇄 탈보호가 수행된 후, 90시간 동안 pH 8.5에서 조 선형 펩티드의 에어레이션에 의해 말단 시스테인 잔기의 산화에 의해 고리화가 달성된다. 조 펩티드 생성물은 5%-40% 아세토니트릴의 구배에서 RP-C18-실리카겔 칼럼 역상 중압 액체 크로마토그래피(RP-MPLC)에 의해 정제된다. 마지막으로, 트리플루오로아세테이트 반대-이온이 Lewatit MP64 칼럼(아세테이트 형태) 상에서 아세테이트로 대체된다. 물에서 최종 세척 후에 정제된 펩티드는 아세테이트 염으로서 동결건조되고 백색 내지는 회백색 분말이 얻어진다. 시스테인-무함유 펩티드의 경우, 고리화 단계는 2-클로로트리틸클로라이드 수지로부터 절단 후 부분적으로-보호된 선형 펩티드 상에서 수행된다. 시스테인-무함유 펩티드의 선택적 고리화 후에 트리플루오로아세트산에서 측쇄 탈보호가 수행된 후, 예비 RP-MPLC, 아세테이트에 의한 트리플루오로아세테이트 이온의 대체 및 펩티드의 아세테이트 형태의 동결건조가 시스테인-함유 펩티드에 대해서처럼 수행되었다. 고리화가 아스파르트산의 측쇄 카복실기를 통한 아미드 결합 형성을 수반하는 AP318의 경우, 선택적 고리화는 플루오레닐메틸옥시카보닐 기로 N-보호된 C-말단 아스파르트산과 3차 부틸(OtBu) 기로 보호된 C-알파 카복실을 사용하여 합성을 시작함으로써 달성된다. 합성은 측쇄 카복실 기를 통한 트리틸 수지에 C-말단 아스파르트산 잔기의 연결과 이후 펩티드 사슬에 보호된 아미노산 잔기의 단계적 부가에 의해 진행된다. N-말단 4-아미노부탄산의 아미노 기의 탈보호 및 수지로부터 측쇄 보호된 펩티드의 절단 후, N-말단 4-아미노부탄산의 자유 측쇄 카복실기와 아미노 기를 통해서 고리화가 수행된다. 마지막으로, 측쇄 보호기가 트리플루오로아세트산으로 제거되고, 다른 펩티드에 대해서처럼 RP-MPLC에 의해 펩티드가 정제된다.
펩티드의 분자 질량은 전기분무 이온화 질량분광법 또는 MALDI-TOF-MS에 의해 확인되며, 이들의 순도는 분석적 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 결정된다.
내인성 및 이종성 발현된 ENaC의 AP301 및 AP318 활성화의 전기생리학적 분석
고리형 펩티드의 ENaC-활성화 특성이 전 세포 및 단일 세포 패치 클램프 기술을 사용하여 전기생리학적으로 시험관내 시험된다(Hazemi et al, 2010; Tzotzos et al, 2013; Shabbir et al, 2013). 전 세포 패치 클램프 분석은 유도된 아밀로라이드-감응성 Na+ 전류를 측정하고, 농도-반응 곡선을 계산하여, 고리형 펩티드에 대해 절반 최대 반응(EC50)에서 유효 농도로서 측정되는 효능을 추정하기 위해 사용된다.
패치 클램프 실험은 HEK-293, CHO 세포 및 A549 세포에서 일시적으로 발현된 αbγ-hENaC 상에서 AP301/AP318의 효능을 추정하기 위해 수행된다.
PHA 타입 1b에 걸린 환자의 폐 증상의 치료를 위한 AP301 및 AP318의 적용 가능성에 대한 근거
가성저알도스테론혈증 타입 1B(PHA 타입 1B)는 아밀로라이드-감응성 상피 나트륨 채널(ENaC)을 암호화하는 유전자에 존재하는 기능소실 돌연변이에 의해 야기된다. 이 증상은 신장, 결장, 폐 및 땀샘과 침샘을 포함하는 나트륨 손실로 인한 생명을 위협하는 심각한 탈수, 저나트륨혈증 및 고칼륨혈증으로서 신생아에서 나타난다. 아동은 감소된 나트륨-의존성 액체 흡수가 상승된 폐 액체 수준을 야기하기 때문에 폐 질병을 겪게 된다. 이 질환은 나이가 들어도 개선되지 않고, 환자는 칼륨 수준을 감소시키기 위해 생애 내내 염 보충 및 식이조절을 필요로 하게된다.
PHA 타입 1B를 야기한다고 알려진 기능소실 돌연변이가 부위-지정 돌연변이유발에 의해 도입된, 인간 ENaC 서브유닛을 이종성 발현하는 세포의 반응을 시험하기 위해 AP301과 AP318이 패치 클램프 분석에 적용될 수 있다. 이 방식에서, 이들 돌연변이된 기능소실 ENaC 서브유닛을 발현하는 세포에서 아밀로라이드-감응성 나트륨 전류를 회복시키는 AP301 및 AP318의 능력이 측정될 수 있다. 고리형 펩티드의 존재하에 나트륨 전류의 증가는 PHA 타입 1B 돌연변이를 보유한 기능소실 ENaC에 의한 Na+ 이온 이동을 회복시키고 ENaC 기능을 회복시키는 능력을 나타내므로, PHA 타입 1B 환자를 위한 치료법으로서 이들의 가능성을 나타낸다.
놀랍게도 AP301 및 AP318과 같은 고리형 펩티드는 기능소실 돌연변이 ENaC에 대해 Na+ 이온 수송 활성을 회복시킬 수 있는 것으로 확인되었다. 따라서, AP301 및 AP318은 PHA 타입 1B의 폐 증상을 위한 가능한 치료법이다.
실험 프로토콜
PHA 타입 IB 돌연변이를 지닌 이종성 발현된 ENaC에 대한 AP301 및 AP318의 효과의 시험관내 연구
아밀로라이드-감응성 Na+ 전류에 대한 고리형 펩티드의 효과가 PHA 타입 IB에 걸린 환자의 병리학적 표현형을 담당한다고 밝혀진 것들과 동일한 알파, 베타 및 감마 ENaC의 단일 점 돌연변이가 부위-지정 돌연변이유발에 의해 도입된 인간 ENaC 서브유닛을 이종성 발현하는 HEK 세포에서 관찰되었다(HEK 세포는 ENaC의 내인성 발현을 나타내지 않는다[Ruffieux-Daidie et al, 2008]). 게다가, 나머지 3개의 ENaC 서브유닛의 보존된 위치에서 관찰된 것들에 대한 상동성 돌연변이를 함유하는 돌연변이 델타 ENaC 서브유닛이 또한 부위-지정 돌연변이에 의해 구성되었다.
ENaC PHA 타입 I 돌연변이의 구성 및 HEK-293에서의 발현
ENaC의 돌연변이의 다양한 타입이 플라스미드 벡터에 클로닝된 야생형 ENaC 서브유닛 DNA의 부위-지정 돌연변이유발에 의해 재현될 수 있다.
부위-지정 돌연변이유발(Site-directed mutagenesis)
상업적으로 이용가능한 부위-지정 돌연변이유발 키트(QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit; Agilent Technologies)를 사용하여 알파, 베타, 감마 및 델타 ENaC를 암호화하는 cDNA에 점 돌연변이가 도입되었다. 알파, 베타 및 감마-hENaC를 암호화하는 cDNA는 Dr. Peter Snyder(University of Iowa, Carver College of Medicine, Iowa City, IA)가 기증했고, 델타-hENaC를 암호화하는 cDNA는 Dr. Mike Althaus(Justus-Liebig University, Giessen, Germany)가 기증했다.
돌연변이성 프라이머는 원본 과학 보고서에 있는 개별 돌연변이의 설명에 기초하여 개별적으로 설계되었다. 제조자의 웹사이트에 제공된 프라이머 설계 프로그램이 가이드로서 사용되었고, 프라이머 자체는 Sigma-Aldrich에서 주문했다. 돌연변이 가닥은 알파, 베타, 감마 또는 델타-hENaC를 암호화하는 100ng 야생형(WT) cDNA를 사용하여 Pfu-기반 DNA 중합효소에 의한 PCR에 의해 합성되었다. 모(WT) 가닥이 제거되었고, 돌연변이된 ENaC를 함유하는 플라스미드 DNA가 E. coli 컴페턴트 세포에 형질변환되었다. 배양물에서 성장 후, 상업적으로 이용가능한 플라스미드 분리 키트(GeneJET Plasmid Miniprep Kit; Thermoscientific)를 사용하여 E. coli 세포로부터 플라스미드 DNA가 추출되었고 칼럼 크로마토그래피에 의해 분리되었다. 모든 돌연변이 구성물은 제한 부위 맵핑 및 시퀀싱에 의해 점검되었다.
hENaC의 이종성 발현을 위한 HEK-293 세포의 형질감염
제조자에 의해 권장된 프로토콜에 따라서 상업적으로 이용가능한 키트(X-treme Gene HP 형질감염 시약(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany))를 사용하여 HEK-293 세포가 돌연변이 알파-, 베타-, 감마- 및 델타-hENaC 및 WT 알파-, 베타-, 감마- 및 델타-hENaC 플라스미드 DNA로 형질감염되었다. 트라이머 돌연변이 ENaC의 발현을 제공하기 위해 하나의 돌연변이 서브유닛이 나머지 2개의 WT 서브유닛과 함께 동시에 형질감염되었다. WT ENaC의 발현은 WT 알파-, 베타- 및 감마-hENaC 플라스미드 DNA 또는 WT 델타-, 베타- 및 감마-hENaC 플라스미드 DNA에 의한 동시 형질감염에 의해 달성되었다.
돌연변이 ENaC를 일시적으로 발현하는 HEK 세포에서 AP301 및 AP318의 ENaC-활성화 능력의 패치 클램프 시험
WT 서브유닛과 함께 공-발현되는 WT αβγ-hENaC, WT δβγ-hENaC 또는 돌연변이 hENaC를 일시적으로 발현하는 각 HEK-293 셀라인이 AP301을 사용한 전 세포 패치 클램프 분석에서 시험되었고, AP318을 사용하여 보존된 위치에서 돌연변이가 선택되었다. 앞서 설명된 대로 전 세포 전류가 기록되었다(Shabbir et al, 2013).
농도 반응 측정
농도-반응 곡선이 플롯팅되었고, EC50 값 및 Hill 계수가 Microcal Origin 7.0을 사용하여 결정되었다. WT αβγ-hENaC, WT δβγ-hENaC 또는 돌연변이 hENaC로 일시적으로 형질감염된 HEK-293 세포의 전 세포 나트륨 전류가 최종 농도가 3.5 내지 240nM 졸나타이드의 범위가 되도록 배스(bath) 용액에 AP301 스톡 용액의 누적 첨가 후 -80mV의 유지 전위(Eh)에서 기록되었다. 마지막으로, 아밀로라이드-감응성 Na+ 전류의 펩티드-유도된 증가를 추정하기 위해 아밀로라이드를 첨가했다. AP301의 활성은 배양된 세포의 상이한 배치간 hENaC 발현의 변동성으로 인해 짝을 이룬 아밀로라이드 반응의 퍼센트로서 표시되었다. 아밀로라이드는 WT αβγ-hENaC, WT δβγ-hENaC 또는 돌연변이 hENaC에 대해 10μM로 사용되었다. 이들 농도는 95%를 초과하는 hENaC 억제를 제공했다. 분명한 아밀로라이드 반응을 가진 세포만 데이터 분석에 포함되었다.
전류-전압 관계
αβγ-hENaC, WT δβγ-hENaC 또는 돌연변이 hENaC로 일시적으로 감염된 HEK-293 세포의 전 세포 전류-전압(I/V) 관계가 대조군(AP301 첨가 전)에 대해, 240nM AP301 처리 및 10μM 아밀로라이드 첨가 후에 각각 결정되었다. GOhm-실(G'Ω-실) 형성 및 5분의 평형 기간 후, 각 Eh에서 1분 동안 유지되고 20mV씩 증분시키면서 -80 내지 +80mV의 Eh에서 나트륨 전류가 기록되었다.
통계 분석
데이터는 달리 언급되지 않는다면 평균±S.E를 표시한다. 실험은 HEK-293 이종성 발현 시스템에서 독립적으로 형질감염된 세포의 3개 내지 7개 배치에서 수행되었다. 상이한 그룹간 통계적 유의성은 GraphPad Prism version 3.02(GraphPad Software, San Diego)를 사용하여 언페어드 투-테일드 스튜던트 티 테스트를 사용하여 결정되었다.
결과
| hENaC | 아밀로라이드-감응성 전류(pA) | AP301에 의해 회복된 Na+ 전류(pA) | EC50(nM) |
| αβγ WT | 81.2±5.5 | 54.7±2.2c | |
| δβγ WT | 93.5±9.5 | 46.2±1.5 | |
| αG70Sβγ | 기능소실 | 392.1±14.2 | 61.9±2.1 |
| αβG37Sγa | 기능소실 | 192.8±12.3 | 65.8±3.2 |
| αβγG40S | 기능소실 | 90.8±8.9 | 69.1±2.7 |
| δG71Sβγ | 기능소실 | 185.1±21.2 | 42.9±0.5 |
| αQ101Kβγa | 기능소실 | 79.1±11.2 | |
| αβQ66Kγ | 기능소실 | 448.5±57.5 | 56.9±16.7 |
| αβγQ70K | 기능소실 | 305.2±10.1 | 61.5±4.0 |
| δQ102Kβγ | 기능소실 | 121.9±14.6 | |
| αC133Yβγa | 기능소실 | 111.8±10.6 | |
| αβC98Yγ | 기능소실 | 296.3±4.2 | 79.4±1.7 |
| αβγC100Y | 기능소실 | 307.9±15.7 | 88.2±11.9 |
| δC134Yβγ | 기능소실 | 219.1±19.8 | |
| αG327Cβγa | 기능소실 | 196.8±16.7 | |
| αβG294Cγ | 기능소실 | 76.9±13.5 | |
| αβγG305C | 기능소실 | 125.5±15.7 | |
| δG303Cβγ | 기능소실 | 48.5±8.2 |
(a - 환자에서 관찰된 돌연변이)
PHA 타입 1B 돌연변이 αβG37Sγ-hENaC 및 상동체에 대한 AP301의 효과
PHA 타입 1B 돌연변이 αβG37Sγ-hENaC 또는 그것의 실험실-구성된 상동체 중 하나를 발현하는 HEK-293 세포에 대한 AP301의 효과가 아래 도면에 도시된다. 전 세포 전류-전압(I/V) 관계가 HEK-293 세포에서 일시적으로 발현된 각 기능소실 돌연변이 hENaC에 대해 도시되고, 제어 단계 동안, 240nM AP301의 첨가 후 및 배스 용액에 아밀로라이드(10μM)의 최종 첨가 후에 -80mV의 유지 전위에서 내향 전류 밀도의 절대 평균값이 도시된다.
PHA 타입 IB 돌연변이 ENaC에 대한 AP318의 효과
PHA 타입 1B 돌연변이 ENaC에 대한 활성 회복 효과가 AP301에만 독점적인지 또는 고리형 펩티드의 일반적인 특성인지를 시험하기 위해, 각각 α-, β- 및 γ-hENaC 서브유닛에 돌연변이를 함유하는 3개의 PHA 타입 IB 돌연변이 ENaC가 AP318뿐만 아니라 AP301의 존재하에 전 세포 패치 클램프 분석에서 시험되었다. 3개의 돌연변이는 모두 PHA 타입 1B에 걸린 환자에서 관찰되었고, ENaC 서브유닛의 보존된 위치에서 발생한다. 이들 돌연변이 중 2개, 즉 αQ101Kβγ-hENaC 및 αβG37Sγ-hENaC는 AP301로 이미 시험되었다. γ 서브유닛에서 발생한 세 번째 돌연변이 αβγV543fs-hENaC는 지금까지 시험된 모든 돌연변이와 대조적으로 말단절단된 γ 서브유닛을 가져오는 프레임 이동 돌연변이이다. AP318 및 AP301의 존재하의 전 세포 패치 클램프 분석에서 3개의 돌연변이 ENaC를 발현하는 HEK-293 세포를 시험한 결과가 표 2 및 도 6에 제시된다.
| ENaC | 펩티드 없음 | AP301 | AP318 |
| 내향 전류(pA) | 측정된 내향 전류(pA) 펩티드 농도 220nM |
||
| WT αβγ-hENaC | 67.2±5.2 | ||
| αQ101Kβγ-hENaC | 기능소실 | 174.7±8.7 | 176.7±6.9 |
| αβG37Sγ-hENaC | 기능소실 | 189.8±7.1 | 191.8±5.8 |
| αβγV543fs-hENaC | 기능소실 | 143.3±8.2 | 177.7±6.5 |
지금까지 얻어진 결과로부터 다음의 결론이 도출될 수 있다:
1) PHA 타입 IB 돌연변이는 WT hENaC와 비교하여 ENaC를 통한 아밀로라이드-감응성 나트륨 전류에서 기능소실을 가져왔다.
2) AP301은 Na+ 이온 수송 능력을 회복시켰고, PHA 타입 IB 환자에서 관찰된 모든 기능소실 돌연변이 hENaC: αβG37Sγ-, αQ101Kβγ- 및 αG327Cβγ-hENaC의 아미노산 돌연변이를 보상했다.
3) WT αβγ- 및 δβγ-hENaC에서 관찰된 아밀로라이드-감응성 나트륨 이온 전류의 생리학적 수준과 비교하여, AP301은 기능소실 돌연변이 ENaC의 아밀로라이드-감응성 나트륨 이온 전류를 비-돌연변이 활성 ENaC와 비슷한 수준까지 회복시켰다.
4) PHA 타입 IB 돌연변이 αβG37Sγ-hENaC 및 상응하는 상동체에 대한 농도-반응 곡선 및 EC50 값은 AP301이 WT αβγ- 및 δβγ-hENaC와 비교하여 기능소실을 가진 이들 돌연변이 ENaC 채널 모두에서 활성을 회복시키고 아미노산 돌연변이를 보상할 수 있는 가능성을 가진다는 것을 나타낸다.
5) PHA 타입 IB 돌연변이 αβG37Sγ-hENaC 및 상응하는 상동체에 대한 전류-전압(I/V) 관계는 이들 돌연변이 채널에 대한 AP301의 회복 효과를 더욱 상세히 특정한다. hENaC의 상이한 서브유닛의 보존된 위치에서 발생하는 동일한 돌연변이는 AP301의 존재하에 회복된 활성에 의해 분명히 반영되는 상이한 기능적 특성 및 표현형적 효과를 가진 나트륨 이온 채널을 야기한다(표 3).
6) AP301 및 AP318의 부재하의 전 세포 전기생리학적 분석의 결과는 야생형과 비교하여 모든 αβγ-hENaC 서브유닛에서 PHA 타입 1B 돌연변이가 기능소실을 가져온다는 것을 보여준다. AP301 및 AP318의 존재하에서는 정상적인 나트륨 이온 채널 기능의 회복을 증명하는 PHA-1B 돌연변이를 통한 유의하게 증가된 아밀로라이드-감응성 나트륨 이온 전류가 관찰되었다.
종합적 결론
이들 결과로부터 AP301 및 AP318이 기능소실 PHA 타입 IB 돌연변이 hENaC에서 Na+ 이온 수송을 회복시키고 아미노산 돌연변이를 보상할 수 있다는 결론을 내릴 수 있으며, 이것은 손상된 ENaC 기능을 회복시키고 이들 돌연변이에서 아미노산 돌연변이를 보상할 수 있으므로, 전신 PHA 타입 I에 걸린 환자를 치료할 수 있는 치료법으로써 작용할 수 있는 고리형 펩티드의 가능성을 나타낸다.
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SEQUENCE LISTING
<110> APEPTICO Forschung und Entwicklung GmbH
<120> Cyclic polypeptide for the treatment of PHA type1B
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<223> SED ID NO:2
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disulfide bond
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Cys
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<223> Ring closure between C-term. Asp and N-term. Gly via amide bond
between the amino grp. of N-term. Gly and C1-carboxyl group of
gamma-aminobutyric acid and between the amino grp. of the
Gamma-aminobutyric acid and C of the carboxyl grp. of the
<400> 4
Gly Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Asp
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEQ ID NO:5
<400> 5
Thr Pro Glu Gly Ala Glu
1 5
Claims (14)
- 하기 아미노산 서열을 포함하는 고리형 폴리펩티드를 포함하는 약학적 조성물로,
SEQ ID NO:3
또는
SEQ ID NO:4
여기에서 상기 약학적 조성물은 상염색체 열성 가성저알도스테론혈증 타입 1(PHA 타입 1B) 치료용인, 약학적 조성물 - 제 1항에 있어서,
적어도 하나의 제약학적 담체 분자를 포함하는 약학적 조성물. - 삭제
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