KR102685652B1 - 신규한 듀얼 헬퍼 플라스미드 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 재조합 아데노부속바이러스 생산용 듀얼 헬퍼 플라스미드에 관한 것이다. 본 발명의 듀얼 헬퍼 플라스미드를 이용한 이중 형질감염 방법은 전통적인 아데노부속바이러스 생산에 사용되는 삼중 형질감염 방법과 비교하여 1) 동시 형질감염 확률의 증가, 2) 재조합 아데노부속바이러스의 생산율 증가, 3) 플라스미드 생산 및 정제에 드는 비용 및 시간 감소 등의 장점으로, 유전자 치료제의 효율적 생산에 유용하게 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 유전자 전달체인 재조합 AAV 생산용 신규한 듀얼 헬퍼 플라스미드에 관한 것이다.
아데노부속바이러스(Adeno-associated virus, AAV)는 단일사슬 DNA 바이러스로서 증식을 위해 아데노바이러스 등의 도움이 필요한 헬퍼 의존형 파보바이러스(helper-dependent parvoviruses)에 속한다. 게놈 크기는 약 4.7kbp인 비병원성 바이러스로 세포성 면역반응을 유도하지 않는다. 감염 대상은 혈청형(serotype)에 따라 크게 다르며 바이러스는 비분열(non-dividing) 및 분열(dividing) 세포에 유전자를 전달할 수 있다. 특히, AAV에 의해 전달되는 유전자의 발현은 생체 내에서 장기간 지속된다[1-3].
일반적으로 재조합 아데노부속바이러스는 숙주 세포(예: HEK293 세포)의 삼중 형질감염(triple transfection)으로 생산된다[4]. 삼중 형질감염을 이용한 재조합 AAV 생산은 1) ITR(역말단반복서열(inverted terminal repeats))로 둘러 쌓인 유전자 발현 카세트를 가진 AAV 구축물(construct) 플라스미드, 2) 아데노부속바이러스 게놈의 복제에 필요한 Rep 단백질과 바이러스 입자(virus psrticle)를 구성하는 캡시드(capsid) 단백질을 제공하는 "Rep-Cap 플라스미드", 마지막으로 3) 아데노부속바이러스의 생활사(life cycle)에 도움을 주는 아데노바이러스의 단백질(E2a, E4) 및 RNA(VA RNA)를 제공해 주는 "헬퍼(helper) 플라스미드"가 필요하다. 이 세 종류의 플라스미드가 아데노바이러스의 E1 및 E3 유전자를 제공해 주는 HEK293 세포주 등에 형질감염되면 아데노부속바이러스가 생산된다[5].
상술된 세 가지 플라스미드들이 동시에 형질감염된 세포에서만 재조합 아데노부속바이러스 벡터가 생산된다. 만일 두 종류의 플라스미드를 하나로 합쳐 이중 형질감염(double transfection)을 하면 동시-형질감염(co-transfection)의 확률이 높아져 결과적으로 재조합 아데노부속바이러스의 생산률이 높아질 것이다[6, 7]. 또한, 재조합 아데노부속바이러스를 생산하는데 필요한 플라스미드의 수가 세 가지에서 두 가지로 줄어들게 되면, 플라스미드를 생산 및 정제하는 데 사용되는 시간과 비용도 절약될 것이다[8].
재조합 아데노부속바이러스 벡터는 rep 및 cap 유전자를 보유하지 않고 아데노바이러스 유래 유전자를 가지고 있지 않기 때문에 생체 내에서 복제될 수 없다[9].
하지만, 듀얼 헬퍼 플라스미드를 만드는 과정에서, Rep-Cap 플라스미드와 헬퍼 플라스미드를 합치는 방법에 따라 플라스미드 내의 rep, cap, E2, E4, VA RNA 유전자들의 상대적인 위치가 달라지게 되는데, 이에 따라 각각의 유전자 발현에 다른 정도의 영향을 주어, 생산성에 미치는 결과를 예측하기는 매우 어렵다.
따라서, 재조합 아데노부속바이러스 벡터의 형질감염 확률 및 이를 통한 재조합 아데노부속바이러스의 생산율 증가와 동시에 생산 및 정제에 드는 시간과 비용을 줄이도록 고안된 조작 듀얼 헬퍼 플라스미드 및 그 제조방법이 절실히 요구되고 있다.
[선행기술문헌]
[비특허문헌]
1. BioDrugs. 2017. 31(4): 317-334. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy. M. F. Naso, B. Tomkowicz, W. L. Perry 3rd, W. R. Strohl.
2. Expert Opin. Drug Saf. 2002. 1(1): 79-91. Safety of Adeno-Associated Viral gene Therapy Vectors: A Current Evaluation. P. E. Monahan, K. Jooss, M. S. Sands.
3. Gene Ther. 1996. 3(8): 658-68. Safety of single-dose administration of an adeno-associated virus (AAV)-CFTR vector in the primate lung. C. K. Conrad, S. S. Allen, S. A. Afione, T. C. Reynolds, S. E. Beck, M. Fee-Maki, X. Barrazza-Ortiz, R. Adams, F. B. Askin, B. J. Carter, W. B. Guggino, T. R. Flotte.
4. J. Virology. 1998. 72(3): 2224-2232. Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus. X. Xiao, J. Li, R. J. Samulski.
5. Viruses. 2010. 2(8): 1681-1703. Adenoviral producer cells. I. Kovesdi and S. J. Hedley.
6. Hum. Gene Ther. 1998. 9(18): 2745-2760. Novel tools for production and purification of recombinant adeno-associated virus vectors. D. Grimm, A. Kern, K. Rittner, J. A. Kleinschmidt.
7. Mol. Ther. 2003. 7(6): 839-850. Helper virus-free, optically controllable, and two-plasmid-based production of adeno-associated virus vectors of serotypes 1 to 6. D. Grimm, M. A. Kay, J. A. Kleinschmidt.
8. Biores. Open Access. 2020. 9(1): 219-228. Two-Plasmid Packaging System for Recombinant Adeno-Associated Virus. Q. Tang, A. M. Keeler, S. Zhang, Q. Su, Z. Lyu, Y. Cheng, G. Gao, T. R. Flotte.
9. Hum. Gene Ther. 2017. 28(11): 1075-1086 Small But Increasingly Mighty: Latest Advances in AAV Vector Research, Design, and Evolution. D. Grimm, H. Buening.
본 발명은 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자 및 rep-cap 유전자를 포함하는 듀얼 헬퍼 플라스미드를 제공하며, 상기 E2a, E4 및 VA RNA 유전자는 순차적으로 연결되고, 상기 rep-cap 유전자는 E2a 유전자의 5' 말단 및 VA RNA 유전자의 3' 말단 사이에 시계 방향으로(5'에서 3'으로) 위치된다.
본 발명은 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자 및 rep-cap 유전자를 포함하는 듀얼 헬퍼 플라스미드를 제공하며, 상기 E2a, E4 및 VA RNA 유전자는 순차적으로 연결되고, 상기 rep-cap 유전자는 E2a 유전자의 5' 말단과 VA RNA 유전자의 3' 말단 사이에 반시계 방향으로(3'에서 5'로) 위치된다.
본 발명은 조절 요소(regulatory component)을 포함하는 듀얼 헬퍼 플라스미드를 제공하며, 상기 조절 요소는 (5'에서 3'으로) 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 E2a 유전자;
(ii) 서열번호 35에 제시된 서열을 포함하는 E4 유전자;
(iii) 서열번호 36에 제시된 서열을 포함하는 VA RNA 유전자;
(iv) 서열번호 30에 제시된 서열을 포함하는 cap 유전자; 및
(v) 서열번호 29에 제시된 서열을 포함하는 rep 유전자.
본 발명은 조절 요소를 포함하는 듀얼 헬퍼 플라스미드를 제공하며, 상기 조절 요소는 (5'에서 3'으로) 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 E2a 유전자;
(ii) 서열번호 35에 제시된 서열을 포함하는 E4 유전자;
(iii) 서열번호 36에 제시된 서열을 포함하는 VA RNA 유전자;
(iv) 서열번호 31에 제시된 서열을 포함하는 cap 유전자; 및
(v) 서열번호 29에 제시된 서열을 포함하는 rep 유전자.
본 발명은 조절 요소를 포함하는 듀얼 헬퍼 플라스미드를 제공하며, 상기 조절 요소는 (5'에서 3'으로) 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 E2a 유전자;
(ii) 서열번호 35에 제시된 서열을 포함하는 E4 유전자;
(iii) 서열번호 36에 제시된 서열을 포함하는 VA RNA 유전자;
(iv) 서열번호 32에 제시된 서열을 포함하는 cap 유전자; 및
(v) 서열번호 29에 제시된 서열을 포함하는 rep 유전자.
본 발명은 조절 요소를 포함하는 듀얼 헬퍼 플라스미드를 제공하며, 상기 조절 요소는 (5'에서 3'으로) 하기를 포함한다:
(i) 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 E2a 유전자;
(ii) 서열번호 35에 제시된 서열을 포함하는 E4 유전자;
(iii) 서열번호 36에 제시된 서열을 포함하는 VA RNA 유전자;
(iv) 서열번호 33에 제시된 서열을 포함하는 cap 유전자; 및
(v) 서열번호 29에 제시된 서열을 포함하는 rep 유전자.
본 발명은 본 발명의 듀얼 헬퍼 플라스미드를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 듀얼 헬퍼 플라스미드 또는 조성물을 포함하는 세포를 제공한다.
본 발명은 제1 플라스미드 및 제2 플라스미드를 포함하도록 세포를 변형시키는 단계를 포함하는 재조합 AAV를 제조하는 방법을 제공하며, 상기 제1 플라스미드는 본 발명의 듀얼 헬퍼 플라스미드이고, 상기 제2 플라스미드는 외래유전자(transgene)를 포함한다.
본 발명은 제1 플라스미드 및 제2 플라스미드를 포함하도록 세포를 변형시키는 단계를 포함하는 재조합 AAV의 생산 수율을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 제1 플라스미드는 본 발명의 듀얼 헬퍼 플라스미드이고 상기 제2 플라스미드는 외래유전자를 포함하고, 상기 변형 후 생산된 재조합 AAV의 양은 기준 방법으로 생산된 상응하는 양과 비교하여 증가된다.
본 발명은 본 발명의 방법에 의해 생산된 재조합 AAV를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 재조합 AAV 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는 약제학적 제제를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 재조합 AAV 또는 약제학적 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이를 필요로 하는 대상체에서 질병 또는 장애를 치료하기 위한 약물의 제조에서의 본 발명의 재조합 AAV 또는 약제학적 제제의 용도를 제공한다.
도 1a-f는 본 발명자들에 의해 제조된 아데노부속바이러스 벡터 혈청형 8(AAV8)을 생산하기 위한 pHelper-NG 및 Helper-In-One 구축물(pHION8 시리즈)의 개열지도를 나타낸다. 도 1a는 삼중 형질감염을 위한 pHelper-NG 구축물을 개략적으로 나타내며, 아데노바이러스 혈청형 5의 E2a, E4 유전자 및 VA RNA 유전자를 포함한다. 도 1b-f는 5개의 Helper-In-One-NG 플라스미드(pHION8) 구축물을 개략적으로 나타내며, 이는 rep2-cap8 유전자 단편을 pHelper-NG 구축물의 여러 영역에 삽입하여 제조된 듀얼 헬퍼 플라스미드이다. 도 1b 및 1c는 E2a 유전자의 시작부분과 VA RNA 유전자의 끝부분 사이에 존재하는 BamHI 부위를 이용하여 rep2-cap8 구축물을 정방향(시계 방향, 5' -> 3')으로 클로닝하여 제조한 pHION8-BF 구축물(도 1b) 및 역방향(반시계 방향, 3' -> 5')으로 클로닝하여 제조한 pHION8-BR 구축물(도 1c)을 개략적으로 나타낸다. 도 1d 및 1e는 E4 유전자의 시작 부분에 존재하는 NotI 부위를 이용하여 rep2-cap8 구축물을 정방향으로 클로닝하여 제조한 pHION8-NF 구축물(도 1d) 및 역방향으로 클로닝하여 제조한 pHION8-NR 구축물을 개략적으로 나타낸다(도 1e). 도1f는 VA RNA 유전자의 시작 부분과 E4 유전자의 끝 부분 사이에 존재하는 AsiSI 부위를 사용하여 rep2-cap8 구축물을 정방향으로 클로닝하여 제조한 pHION8-AF 구축물을 개략적으로 나타낸다.
도 2는 아데노부속바이러스 벡터 혈청형 2(AAV2) 생산용 듀얼 헬퍼 플라스미드인 pHNG2 구축물의 개열지도를 나타낸다. pHelper-NG 플라스미드 내의 E2a 유전자의 시작 부분과 VA RNA 유전자의 끝부분 사이에 존재하는 BamHI 부위를 이용하여 rep2-cap2 유전자 단편을 정방향으로 삽입하여 pHNG2 구축물을 제조하였다.
도 3은 아데노부속바이러스 벡터 혈청형 9(AAV9) 생산용 듀얼 헬퍼 플라스미드인 pHNG9 구축물의 개열지도를 나타낸다. 이중 형질감염을 위하여 rep2-cap9 유전자 단편을 E2a 유전자의 시작 부분과 VA RNA 유전자의 끝부분 사이에 존재하는 BamHI 부위를 이용하여 순방향으로 클로닝하여 pHNG9 구축물을 제조하였다.
도 4는 아데노부속바이러스 벡터 혈청형 5(AAV5) 생산용 듀얼 헬퍼 플라스미드인 pHNG5K 구축물의 개열지도를 나타낸다. 이중 형질감염을 위하여 rep2-cap5 유전자 단편을 E2a 유전자의 시작 부분과 VA RNA 유전자의 끝부분 사이에 존재하는 BamHI 부위를 이용하여 순방향으로 클로닝하여 pHNG5K 구축물을 제조하였다.
도 5a 및 5b는 pHNG 및 pHNGR 구축물의 개열지도를 나타낸다. 도 5a는 rep-cap 유전자 단편이 E2a 유전자의 시작 부분과 VA RNA 유전자의 끝부분 사이에 정방향으로 삽입된 것을 나타내고, 도 5b는 rep-cap 유전자 단편이 역방향으로 삽입된 것을 나타낸다.
도 6은 부착세포주(HEK293)에서 삼중 형질감염(Triple) 대비 pHION8 시리즈를 이용한 이중 형질감염(Double)에 따른 AAV8 생산량의 증가 또는 감소 효과를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 7은 부유세포주(Expi293)에서 삼중 형질감염(Triple) 대비 pHION8 시리즈를 사용한 이중 형질감염(Double)에 따른 AAV8 생산량의 증가 또는 감소 효과를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 8은 부착세포주(HEK293)에서 삼중 형질감염(Triple) 대비 pHNG2를 이용한 이중 형질감염(Double)에 따른 AAV2 생산량 증가 효과를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 9는 부착세포주(HEK293)에서 삼중 형질감염(Triple) 대비 pHNG9을 이용한 이중 형질감염(Double)에 따른 AAV9 생산량 증가 효과를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 10은 부착세포주(HEK293)에서 삼중 형질감염(Triple) 대비 pHNG5K을 이용한 이중 형질감염(Double)에 따른 AAV5 생산량 증가 효과를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 11은 삼중 형질감염(Triple) 또는 Helper-In-One 구축물로 이중 형질감염(Double)하여 생산된 AAV8들 간의 세포 형질도입(transduction) 효율의 동등성 결과를 나타낸다.
도 12는 삼중 형질감염(Triple) 또는 pHNG2 구축물을 사용하는 이중 형질감염(Double)에 의해 생산된 AAV2들 간의 세포 형질도입 효율의 동등성 결과를 나타낸다.
도 13은 삼중 형질감염(Triple) 또는 pHNG9 구축물을 사용한 이중 형질감염(Double)에 의해 생산된 AAV9들 간의 세포 형질도입 효율의 동등성 결과를 나타낸다.
도 2는 아데노부속바이러스 벡터 혈청형 2(AAV2) 생산용 듀얼 헬퍼 플라스미드인 pHNG2 구축물의 개열지도를 나타낸다. pHelper-NG 플라스미드 내의 E2a 유전자의 시작 부분과 VA RNA 유전자의 끝부분 사이에 존재하는 BamHI 부위를 이용하여 rep2-cap2 유전자 단편을 정방향으로 삽입하여 pHNG2 구축물을 제조하였다.
도 3은 아데노부속바이러스 벡터 혈청형 9(AAV9) 생산용 듀얼 헬퍼 플라스미드인 pHNG9 구축물의 개열지도를 나타낸다. 이중 형질감염을 위하여 rep2-cap9 유전자 단편을 E2a 유전자의 시작 부분과 VA RNA 유전자의 끝부분 사이에 존재하는 BamHI 부위를 이용하여 순방향으로 클로닝하여 pHNG9 구축물을 제조하였다.
도 4는 아데노부속바이러스 벡터 혈청형 5(AAV5) 생산용 듀얼 헬퍼 플라스미드인 pHNG5K 구축물의 개열지도를 나타낸다. 이중 형질감염을 위하여 rep2-cap5 유전자 단편을 E2a 유전자의 시작 부분과 VA RNA 유전자의 끝부분 사이에 존재하는 BamHI 부위를 이용하여 순방향으로 클로닝하여 pHNG5K 구축물을 제조하였다.
도 5a 및 5b는 pHNG 및 pHNGR 구축물의 개열지도를 나타낸다. 도 5a는 rep-cap 유전자 단편이 E2a 유전자의 시작 부분과 VA RNA 유전자의 끝부분 사이에 정방향으로 삽입된 것을 나타내고, 도 5b는 rep-cap 유전자 단편이 역방향으로 삽입된 것을 나타낸다.
도 6은 부착세포주(HEK293)에서 삼중 형질감염(Triple) 대비 pHION8 시리즈를 이용한 이중 형질감염(Double)에 따른 AAV8 생산량의 증가 또는 감소 효과를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 7은 부유세포주(Expi293)에서 삼중 형질감염(Triple) 대비 pHION8 시리즈를 사용한 이중 형질감염(Double)에 따른 AAV8 생산량의 증가 또는 감소 효과를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 8은 부착세포주(HEK293)에서 삼중 형질감염(Triple) 대비 pHNG2를 이용한 이중 형질감염(Double)에 따른 AAV2 생산량 증가 효과를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 9는 부착세포주(HEK293)에서 삼중 형질감염(Triple) 대비 pHNG9을 이용한 이중 형질감염(Double)에 따른 AAV9 생산량 증가 효과를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 10은 부착세포주(HEK293)에서 삼중 형질감염(Triple) 대비 pHNG5K을 이용한 이중 형질감염(Double)에 따른 AAV5 생산량 증가 효과를 관찰한 결과를 나타낸다.
도 11은 삼중 형질감염(Triple) 또는 Helper-In-One 구축물로 이중 형질감염(Double)하여 생산된 AAV8들 간의 세포 형질도입(transduction) 효율의 동등성 결과를 나타낸다.
도 12는 삼중 형질감염(Triple) 또는 pHNG2 구축물을 사용하는 이중 형질감염(Double)에 의해 생산된 AAV2들 간의 세포 형질도입 효율의 동등성 결과를 나타낸다.
도 13은 삼중 형질감염(Triple) 또는 pHNG9 구축물을 사용한 이중 형질감염(Double)에 의해 생산된 AAV9들 간의 세포 형질도입 효율의 동등성 결과를 나타낸다.
본 발명은 재조합 AAV 생산용 조성물 및 방법, 그리고 질환 또는 장애를 치료하기 위한 이러한 rAAV의 용도에 관한 것이다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 발명의 듀얼 헬퍼 플라스미드는 다수의 유전자(예를 들어, E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자)를 포함한다. 본 출원인은 특정 구성으로 다중 유전자를 배열함으로써 재조합 AAV 생산시 수율 또는 생산성이 증가 또는 감소될 수 있음을 확인하였다. 본 발명의 다른 측면들은 본 출원 전체에 걸쳐 제공된다.
I. 정의
본 발명 전반에 걸쳐 용어 "하나" 또는 "한"은 해당 엔티티 중 하나 이상을 의미한다. 예를 들어, "하나의 폴리펩타이드"는 하나 이상의 폴리펩타이드를 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "하나"(또는 "한"), "하나 이상" 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 "및/또는"은 다른 것이 있거나 없는 두가지의 명시된 특징 또는 구성요소 각각의 특정 개시로 간주되어야 한다. 따라서, 본 명세서에서 "A 및/또는 B"와 같은 구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A"(단독) 및 "B"(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 다음의 각각의 측면을 포함하도록 의도된다: A, B 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A와 C; A와 B; B와 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
숫자 또는 일련의 숫자 앞의 "적어도"라는 용어는 "적어도"라는 용어에 인접한 숫자 및 논리적으로 포함될 수 있는 문맥에서 명확하게 모든 후속 숫자 또는 정수를 포함하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 핵산 분자의 뉴클레오타이드 수는 정수여야 한다. 예를 들어, "21-뉴클레오타이드 핵산 분자의 적어도 18개 뉴클레오타이드"는 18, 19, 20 또는 21개 뉴클레오타이드가 표시된 특성을 갖는다는 것을 의미한다. 적어도 일련의 숫자 또는 범위 앞에 있는 경우 "적어도"는 일련의 숫자 또는 범위의 각 숫자를 수정할 수 있음으로 이해된다. "적어도"는 정수에 한정되지 않는다(예를 들어, "적어도 5%"는 유효숫자의 수를 고려하지 않고 5.0%, 5.1%, 5.18%를 포함한다).
본 명세서에서 "포함하는"이라는 용어로 기술되는 경우, "구성되는" 및/또는 "본질적으로 구성되는"의 용어로 기술되는 유사한 형태가 또한 제공되는 것으로 이해된다.
별도로 정의되지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 관련된 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌(The Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press)은 당업자에게 본 명세서에서 사용된 많은 용어의 일반적인 의미를 제공한다.
단위, 접두사 및 기호는 SI(Systeme International de Unites) 허용 형식으로 표시된다. 숫자 범위에는 범위를 한정하는 숫자가 포함된다. 별도로 표시되지 않는 한, 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록된다. 본 명세서에 제공된 제목은 명세서 전체를 참조하여 가질 수 있는 본 발명의 다양한 측면의 제한이 아니다. 따라서 하기 정의된 용어들은 본 명세서 전체를 참조함으로써 보다 완전하게 정의된다.
용어 "약"은 본 명세서에서 대략, 대충, 주변 또는 영역을 의미하는 것으로 사용된다. "약"이라는 용어가 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 명시된 수치 값 위아래로 경계를 확장하여 해당 범위를 수정한다. 일반적으로, "약"이라는 용어는 예를 들어 10%의 변동에 의해 위 또는 아래로(더 높거나 낮음) 명시된 값의 위아래로 수치 값을 수정할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "아데노부속바이러스"(AAV)는 AAV 유형1, AAV 유형2, AAV 유형3(유형 3A 및 3B 포함), AAV 유형4, AAV 유형5, AAV 유형6, AAV 유형7, AAV 유형8, AAV 유형9, AAV 유형10, AAV 유형11, AAV 유형12, AAV 유형13, AAVrh.74, 뱀 AAV, 조류 AAV, 소 AAV, 개(canine) AAV, 말(equine) AAV, 양(ovine) AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, 그들의 AAV 혈청형과 계통물(Gao et al. (J. Virol. 78:6381 (2004)) 및 Moris et al. (Virol. 33:375 (2004)), 및 현재 알려지거나 후에 발견될 다른 AAV를 포함하나 이에 제한되지 않는다(예를 들어, 문헌(FIELDS et al. Virology 2, Chapter 69(4th ed., Lippincott-Raven Publishers) 참조). 일부 측면에서, "AAV"는 공지된 AAV의 유도체를 포함한다. 일부 측면에서, "AAV"는 수정된 또는 인공 AAV를 포함한다.
용어 "투여", "투여하는" 및 이의 유의어는 조성물(예를 들어, 본 발명의 듀얼 헬퍼 플라스미드를 사용하여 생산된 재조합 AAV 전달체 벡터)을 약학적으로 허용가능한 경로를 통해 대상체에 도입하는 것을 의미한다. 대상체에 조성물을 도입하는 것은 종양내(intratumorally), 경구, 폐(pulmonarily), 비강내(intranasally), 비경구(parentally)(정맥내(intavenously), 동맥내(intra-arterially), 근육내(intramuscularly), 복강내(intraperitoneally) 또는 피하(subcutaneously)), 직장내(rectally), 림프내(intralymphatically), 척수강내(intrathecally), 안구주위(periocularly) 또는 국소(topically)를 포함하는 임의의 적합한 경로에 의한다. 투여는 자가 투여와 다른 사람에 의한 투여가 포함된다. 적합한 투여 경로는 조성물 또는 작용제가 의도된 기능을 수행하도록 한다. 예를 들어, 적합한 경로가 정맥내인 경우, 조성물 또는 작용제를 대상체의 정맥에 도입함으로써 조성물을 투여한다.
본 발명에서 "항생제 저항성 유전자(antibiotic resistance gene)"란 미생물이 항생제에 노출되어도 생존할 수 있도록 약물 내성을 부여하기 위해 플라스미드에 삽입된 유전자를 의미한다. 본 출원에 기재된 바와 같이, 일부 측면에서, 클로닝을 통해 원하는 플라스미드를 갖는 세포를 스크리닝하기 위해 항생제 저항성 유전자를 플라스미드(예를 들어, 듀얼 헬퍼 플라스미드)에 도입할 수 있다. 본 발명에 유용한 항생제 저항성 유전자의 예는 암피실린 (Ampicillin), 카나마이신 (Kanamycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 젠타마이신(Gentamycin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 테트라사이클린(Tetracycline), 에리스로마이신(Erythromycin), 반코마이신(Vancomycin), 페니실린(penicillin), 스펙티노마이신(spectinomycin), 클로람페니콜(Chloramphenicol), 술파디아진(Sulfaciazine) 및 트리메소프림(trimethoprim) 저항성 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 또한 기술된 바와 같이, 본 발명의 듀얼 헬퍼 플라스미드는 특정 배향(orientation)/구성(configuration)으로 듀얼 헬퍼 플라스미드와 함께 존재하는 rep 유전자 및 cap 유전자를 포함한다. 일부 측면에서, rep 및 cap 유전자는 "시계 방향(clockwise direction)", "정방향(forward direction)" 또는 "5' → 3'"(예를 들어, 도 5a에 도시된 바와 같음)이고, 이는 rep-cap 유전자가 시계 방향 또는 복제가 시작되는 부위(5')에서 복제가 종료되는 부위(3') 방향으로 삽입 또는 포함됨을 의미한다. 일부 측면에서, rep 및 cap 유전자는 "반시계 방향(counterclockwise direction)", "역방향(reverse direction)" 또는 "3' → 5'"(예를 들어, 도 5b에 도시된 바와 같음)이고, 이는 rep-cap 유전자가 반시계 방향 또는 복제가 끝나는 부위(3')에서 복제가 시작되는 부위(5') 방향으로 삽입 또는 포함됨을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "rep 유전자"는 하나 이상의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 인코딩하는 유전자를 의미하며, 상기 ORF는 AAV Rep 단백질 또는 이의 변이체 또는 유도체를 인코딩한다. 이러한 AAV Rep 단백질(또는 이의 변이체 또는 유도체)은 AAV 게놈 복제 및/또는 AAV 게놈 패키징에 관여하며, 야생형 rep 유전자는 4가지 Rep 단백질 Rep78, Rep68, Rep52 및 Rep40을 인코딩한다. 별도로 언급되지 않는 한, "rep 유전자"는 야생형 rep 유전자, 이의 유도체 및 동등한 기능을 갖는 인공 rep 유전자를 포함한다. 일부 측면에서, rep 유전자는 아데노부속바이러스 혈청형 2(AAV2)로부터 유래된 rep2 유전자일 수 있다. 일부 측면에서, rep2 유전자는 서열번호 29에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "cap 유전자"는 하나 이상의 오픈 리딩 프레임(ORF)을 인코딩하는 유전자를 의미하며, ORF는 AAV Cap 구조 단백질, 또는 이의 변이체 또는 유도체를 인코딩한다. 4개의 단백질이 cap 유전자에서 번역된다. 그 중 VP1, VP2, VP3 단백질은 AAV 입자를 구성하는 구조 단백질로 AAP(assembly-activating protein)는 구조 단백질에 의한 AAV 입자의 형성(조립)을 촉진한다. 별도의 언급이 없는 한, "cap 유전자"는 야생형 캡 유전자, 이의 유도체 및 이와 동등한 기능을 갖는 인공 캡 유전자를 포함한다. 일부 측면에서, cap 유전자는 아데노부속바이러스 혈청형 2(AAV2; cap2), 혈청형 5(AAV5; cap5), 혈청형 8(AAV8; cap8) 또는 혈청형 9(AAV9; cap9)로부터 유래된 cap 유전자이다. 일부 측면에서, cap 유전자는 서열번호 30(cap2), 서열번호 31(cap5), 서열번호 32(cap8) 또는 서열번호 33(cap9)에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "E2a 유전자"는 AAV의 프로모터를 조절하고, AAV 게놈 복제를 도와주며, Rep mRNA의 스플라이싱과 캡시드 mRNA의 안정성(stability) 증대를 통한 캡시드 단백질의 생산성 증가에 관여하는 아데노바이러스의 단백질 E2a를 코딩하는 유전자를 의미한다. 별도의 언급이 없는 한, "E2a 유전자"는 야생형 E2a 유전자, 이의 유도체 및 이와 동등한 기능을 갖는 인공 E2a 유전자를 포함한다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 상기 E2a 유전자는 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5) 유래의 E2a 유전자이다. 일부 측면에서, 상기 E2a 유전자는 서열번호 34에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "E4 유전자"는 AAV의 생활사에 있어 AAV 게놈의 두번째 사슬(second-strand)의 합성에 관여하며, AAV 게놈의 복제를 억제하는 세포 내 기작을 담당하는 MRN(Mre11-Rad50-Nbs1) 컴플렉스 형성 억제를 통해 AAV 게놈의 복제에 도움을 주는 아데노바이러스의 단백질 E4를 코딩하는 유전자를 의미한다. 별도의 언급이 없는 한, "E4 유전자"는 야생형 E4 유전자, 이의 유도체 및 동등한 기능을 가진 인공 E4 유전자를 포함한다. 일부 측면에서, E4 유전자는 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5)로부터 유래된 E4 유전자이다. 일부 측면에서, E4 유전자는 서열번호 35에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "VA RNA 유전자" 또는 "VA RNA 영역"은 AAV 캡시드 mRNA의 안정성(stability) 증가 및 번역(translation) 효율성을 향상시키며, Rep52 단백질의 분해 방지를 돕는 VA RNA를 생산하는 VA 영역을 의미한다. 별도의 언급이 없는 한, "VA RNA 유전자"는 야생형 VA RNA 유전자, 이의 유도체 및 동등한 기능을 갖는 인공 VA RNA 유전자를 포함한다. 일부 측면에서, VA RNA 유전자는 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5)로부터 유래된 VA RNA 유전자이다. 일부 측면에서, VA RNA 유전자는 서열번호 36에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "보존된(conserved)"은 각각 비교되는 2개 이상의 서열의 동일한 위치에서 변경되지 않고 발생하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 폴리펩타이드 서열의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기를 의미한다. 상대적으로 보존된 뉴클레오타이드 또는 아미노산은 서열의 다른 곳에 나타나는 뉴클레오타이드 또는 아미노산보다 더 관련된 서열 사이에서 보존된 것들이다.
본 명세서에서, 용어 "조절 요소(control element)"는 작동 가능하게 연결된 핵산(예를 들어, 외래유전자)의 발현을 조절(예를 들어, 증가 또는 감소)하는 핵산 서열을 의미한다. 적절한 조절 요소의 비제한적 예는 본 발명의 다른 곳에서 제공된다.
일부 측면에서, 2개 이상의 서열이 서로 100% 동일한 경우, "완전히 보존된(completely conserved)" 또는 "동일한(identical)" 것으로 나타낸다. 일부 측면에서, 2개 이상의 서열이 서로 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 경우, "고도로 보존된(highly conserved)" 것으로 나타낸다. 일부 측면에서, 2개 이상의 서열이 서로 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 98% 또는 약 99% 동일할 경우, "고도로 보존된" 것으로 나타낸다. 일부 측면에서, 2개 이상의 서열이 서로 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95% 동일한 경우, "보존된(conserved)" 것으로 나타낸다. 일부 측면에서, 2개 이상의 서열이 서로 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 경우, "보존된(conserved)" 것으로 나타낸다. 서열의 보존은 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 전체 길이에 적용될 수 있거나 이의 부분, 영역 또는 특징에 적용될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "인핸서(enhancer)"는 향상된 전사를 제공할 수 있는 서열을 포함하고 일부 경우에 또 다른 제어 서열에 대한 이들의 배향과 독립적으로 기능할 수 있는 DNA의 분절을 의미한다. 인핸서는 프로모터 및/또는 다른 인핸서 요소와 협력적으로 또는 부가적으로 기능할 수 있다.
용어 "부형제(excipient)" 및 "담체(carrier)"는 상호교환적으로 사용되며 화합물, 예를 들어 외래유전자를 포함하고 본 명세서에 제공된 듀얼 헬퍼 플라스미드를 사용하여 생산된 재조합 AAV 전달체 벡터의 투여를 더욱 용이하게 하기 위해 약제학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 의미한다.
용어 "엑손(exon)"은 단백질을 인코딩하는 핵산의 한정된 부분, 또는 사전 처리된(또는 전구체) RNA의 일부가 스플라이싱으로 제거된 후 RNA 분자의 성숙한 형태로 표현되는 핵산 서열을 의미한다. 성숙한 RNA 분자는 메신저 RNA(mRNA) 또는 rRNA 또는 tRNA와 같은 비암호화 RNA의 기능적 형태일 수 있다.
용어 "발현(expression)"은 폴리뉴클레오타이드가 유전자 산물, 예를 들어 RNA 또는 폴리펩타이드를 생산하는 과정을 의미한다. 이는 메신저 RNA(mRNA)로의 폴리뉴클레오타이드의 전사 및 폴리펩타이드로의 mRNA의 번역을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 발현은 "유전자 산물" 또는 "인코딩된 단백질"을 생산한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 유전자 생성물은 예를 들어 유전자의 전사에 의해 생성된 RNA와 같은 핵산일 수 있다. 본 명세서에서, 유전자 산물은 전사체로부터 번역되는 핵산 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 본 명세서에 기술된 유전자 산물은 전사후 변형, 예를 들어 폴리아데닐화 또는 스플라이싱을 갖는 핵산, 또는 번역후 변형, 예를 들어 인산화, 메틸화, 글리코실화, 지질의 첨가, 다른 단백질 서브유닛과의 결합 또는 단백질분해 절단을 갖는 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "동일성(identity)"은 중합체 분자 사이, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 분자 사이의 전체적인 단량체 보존을 의미한다. 추가 수식어가 없는 "동일한(identical)"이라는 용어와 관련하여, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 A가 폴리뉴클레오타이드 B와 동일하다는 것은 폴리뉴클레오타이드 서열이 100% 동일함(100% 서열 동일성)을 의미한다. 예를 들어, "70% 동일"과 같이 두 개의 서열을 기술하는 것은 "70% 서열 동일성"을 갖는 것으로 설명하는 것과 같다.
예를 들어, 2개의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 퍼센트 동일성의 계산은 최적의 비교 목적을 위해 2개의 서열을 정렬함으로써 수행될 수 있다(예를 들어, 최적 배열을 위해 제1 및 제2 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 중 하나 또는 둘 모두에 갭이 도입될 수 있고, 동일하지 않은 서열은 비교 목적으로 무시할 수 있다). 특정 측면에서, 비교 목적을 위해 정렬된 서열의 길이는 기준 서열의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 참조 서열 길이이다. 해당 아미노산 위치의 아미노산 또는 폴리뉴클레오타이드의 경우 염기를 비교한다.
첫 번째 서열의 위치가 두 번째 서열의 해당 위치와 동일한 아미노산 또는 뉴클레오타이드에 의해 점유된 경우, 분자는 해당 위치에서 동일하다. 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성은 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여 서열에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이며, 이는 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 한다. 서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 퍼센트 동일성의 측정은 수학적 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다.
다양한 서열(예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 서열)을 정렬하는데 사용될 수 있는 적합한 소프트웨어 프로그램은 다양한 소스로부터 입수 가능하다. 퍼센트 서열 동일성을 측정하기 위한 하나의 적절한 프로그램은 미국 정부의 국립 생명공학 정보 센터 BLAST 웹 사이트(blast.ncbi.nlm.nih.gov)에서 이용 가능한 프로그램의 BLAST 제품군의 일부인 bl2seq이다. bl2seq는 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 두 시퀀스 간의 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는 데 사용되는 반면 BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는 데 사용된다. 다른 적합한 프로그램은 예를 들어 EMBOSS 생물정보학 프로그램 제품군의 일부인 Needle, Stretcher, Water 또는 Matcher이며, www.ebi.ac.uk/Tools/psa의 European Bioinformatics Institute(EBI)에서도 사용할 수 있다.
서열 정렬은 MAFFT, Clustal(ClustalW, Clustal X 또는 Clustal Omega), MUSCLE 등과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 참조 서열과 정렬되는 단일 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 표적 서열 내의 다양한 영역은 각각 그들 자신의 퍼센트 서열 동일성을 가질 수 있다. 퍼센트 서열 동일성 값은 가장 가까운 10분의 1로 반올림된다는 점에 유의해야한다. 예를 들어 80.11, 80.12, 80.13 및 80.14는 80.1로 내림되고, 80.15, 80.16, 80.17, 80.18 및 80.19는 80.2로 올림된다. 또한 길이 값은 항상 정수이다.
일부 측면에서, 제2 아미노산 서열(또는 핵산 서열)에 대한 제1 아미노산 서열(또는 핵산 서열)의 백분율 동일성(%ID)은 %ID = 100 x (Y/Z)로 계산되고, 여기서 Y는 첫 번째 및 두 번째 서열의 정렬(육안 검사 또는 특정 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬됨)에서 동일한 일치로 기록된 아미노산 잔기(또는 핵염기)의 수이고 Z는 두 번째 서열에 있는 잔기의 총 수이다. 제1 서열의 길이가 제2 서열보다 긴 경우, 제1 서열과 제2 서열의 동일성 백분율은 제1 서열에 대한 제2 서열의 동일성 백분율보다 높을 것이다.
당업자는 퍼센트 서열 동일성의 계산을 위한 서열 정렬의 생성이 1차 서열 데이터에 의해 배타적으로 구동되는 이원 서열-서열 비교에 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 또한, 구조적 데이터(예를 들어, 결정학적 단백질 구조), 기능적 데이터(예를 들어, 변이의 위치), 또는 계통발생학적 데이터와 같은 이종 소스로부터의 데이터와 서열 데이터를 통합함으로써 서열 정렬이 얻어질 수 있음이 이해될 것이다. 다중 서열 정렬을 얻기 위해 이종 데이터를 통합하는 적합한 프로그램은 T-Coffee이며, www.tcoffee.org에서 이용 가능하고 대안으로 예컨대, EBI에서 이용 가능하다. 또한, 서열 동일성 백분율을 계산하는 데 사용되는 최종 정렬은 자동 또는 수동으로 선별될 수 있음을 이해할 것이다.
본 명세서에서, 용어 "분리된(isolated)", "정제된(purified)", "추출된(extracted)" 및 그의 유의어는 상호교환적으로 사용되며 하나 이상의 정제 과정을 거친 본 발명의 소정의 조성물, 예컨대, 외래유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 제제(preparation)의 상태를 의미한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 사용된 분리 또는 정제는 본 발명의 조성물, 예컨대, 오염물을 함유하는 샘플로부터 본 명세서에 기술된 폴리뉴클레오타이드의 제거, 부분적 제거(예컨대, 분획) 과정이다.
본 명세서에서, 용어 "연결된(linked)"은 각각 제2 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에 공유 또는 비공유 결합된 제1 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 제1 아미노산 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 제2 아미노산 또는 폴리뉴클레오타이드 서열에 직접 연결되거나 병치될 수 있거나, 대안적으로 개재 서열이 제1 서열을 제2 서열에 공유적으로 연결할 수 있다. 용어 "연결된"은 5'-말단 또는 3'-말단에서 제1 폴리뉴클레오타이드 서열과 제2 폴리뉴클레오타이드 서열이 융합된 것을 의미할 뿐만 아니라 전체 제1 폴리뉴클레오타이드 서열(또는 제2 폴리뉴클레오타이드 서열)의 두 번째 폴리뉴클레오타이드 서열(또는 첫 번째 폴리뉴클레오타이드 서열)의 임의의 두 뉴클레오타이드로의 삽입도 포함한다. 제1 폴리뉴클레오타이드 서열은 포스포디에스테르 결합 또는 링커에 의해 제2 폴리뉴클레오타이드 서열에 연결될 수 있다. 링커는 예컨대, 폴리뉴클레오타이드일 수 있다.
용어 "miRNA", "miR" 및 "microRNA"는 상호교환적으로 사용되며 RNA 기반 유전자 조절에 관여하는 진핵생물에서 발견되는 마이크로RNA 분자를 의미한다. 이 용어는 전구체로부터 처리된 단일사슬 RNA 분자를 나타내는데 사용된다. 일부 측면에서, 용어 "안티센스 올리고머"는 또한 본 발명의 마이크로RNA 분자를 기술하는데 사용될 수 있다. 본 발명과 관련된 miRNA의 명칭 및 그의 서열이 본 명세서에 제공된다. microRNA는 불완전한 염기쌍을 통해 표적 mRNA를 인식하고 결합하여 표적 mRNA의 불안정화 또는 번역 억제를 유도하여 표적 유전자 발현을 하향 조절한다. 역으로, miRNA 결합 부위를 포함하는 분자(일반적으로 miRNA의 시드 영역에 상보적인 서열을 포함하는 분자)를 통해 miRNA를 표적화하는 것은 표적 유전자의 상향 조절을 야기하는 miRNA-유도 번역 억제를 감소시키거나 억제할 수 있다.
"핵산(nucleic acid)", "핵산 분자(nucleic acid molecule)", "뉴클레오타이드 서열(nucleotide sequence)", "폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)" 및 이들의 유의어는 상호교환적으로 사용되며 포스포다이에스터 결합에 의해 연결된 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에서 5'에서 3' 방향으로 제시된다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 데옥시리보핵산(DNA) 분자 또는 리보핵산(RNA) 분자일 수 있다. 뉴클레오타이드 염기는 본 명세서에서 다음과 같은 단일 문자 코드로 표시된다: 아데닌(A), 구아닌(G), 티민(T), 시토신(C), 이노신(I) 및 우라실(U).
본 명세서에서, 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)" 또는 "작동 가능하게 연결된(operably linked)"은 연결된 DNA 서열들이 서로 인접하여 원하는 기능을 수행하는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터가 코딩 서열(예를 들어, 외래유전자)의 전사를 개시하는데 도움을 주는 경우, 이러한 프로모터는 코딩 영역과 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 기능적 관계가 유지되는 한 프로모터와 코딩 영역이 반드시 인접하여 위치할 필요는 없다.
"약제학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)", "약제학적으로 허용가능한 부형제(pharmaceutically acceptable excipient)" 및 이들의 유의어는 미국 연방 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 인간을 포함한 동물에 대한 사용에 관하여 미국 약전에 나열된 임의의 제제와 대상체에 대한 조성물의 투여를 금지하고 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 방해하지 않는 정도로 바람직하지 않은 생리학적 효과의 생성을 유발하지 않는 임의의 담체 또는 희석제를 포함한다. 이는 약제학적 조성물을 제조하는데 유용하고 일반적으로 안전하고 무독성이며 바람직한 부형제 및 담체를 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "약제학적 조성물(pharmaceutical composition)"은 약제학적으로 허용가능한 담체 및 부형제 같은 하나 이상의 다른 화학 성분과 혼합되거나 섞인 또는 부유된 본 명세서에 기술된 하나 이상의 조성물(예컨대, 폴리뉴클레오타이드, 벡터, 세포 및/또는 재조합 바이러스)을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로모터(promoter)" 및 "프로모터 서열(promoter sequence)"은 상호교환가능하며 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 일반적으로 코딩 서열은 프로모터 서열의 3'에 위치한다. 프로모터는 본래 유전자(native gene)로부터 전체적으로 유래될 수 있거나, 자연에서 발견되는 다양한 프로모터로부터 유래된 다양한 요소로 구성되거나, 심지어 합성 DNA 세그먼트를 포함할 수 있다. 다양한 프로모터가 다양한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 다양한 발달 단계에서, 또는 다양한 환경적 또는 생리학적 조건에 대한 반응으로 유전자의 발현을 지시할 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해된다. 대부분의 경우 대부분의 세포 유형에서 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 일반적으로 "구성적 프로모터(constitutive promoter)"라고 한다. 유전자가 특정 세포 유형에서 발현되도록 하는 프로모터는 일반적으로 "세포-특이적 프로모터(cell-specific promoter)" 또는 "조직-특이적 프로모터(tissue-specific promoter)"라고 한다. 발달 또는 세포 분화의 특정 단계에서 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 일반적으로 "발달-특이적 프로모터(developmentally-specific promoters)" 또는 "세포 분화-특이적 프로모터(cell differentiation-specific promoters)"라고 한다. 프로모터를 유도하는 작용제, 생물학적 분자, 화학물질, 리간드, 빛 등에 의한 세포의 노출 또는 처리 후에 유도되어 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 일반적으로 "유도성 프로모터(inducible promoters)" 또는 "조절가능한 프로모터(regulatory promoters)"를 나타낸다. 또한, 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았기 때문에 길이가 다른 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있음이 인식된다.
프로모터 서열은 전형적으로 전사 개시 부위에 의해 그의 3' 말단에 결합되고 배경에서 검출 가능한 수준으로 전사를 개시하는데 필요한 최소 수의 염기 또는 요소를 포함하도록 상향(5' 방향)으로 연장된다. 프로모터 서열 내에서 RNA 폴리머라제의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인(컨센서스 서열)뿐만 아니라 전사 개시 부위(예를 들어, 뉴클레아제 S1과의 매핑에 의해 편리하게 정의됨)가 확인될 것이다. 일부 측면에서, 본 발명에 사용될 수 있는 프로모터는 조직 특이적 프로모터를 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "유전자 조절 영역(gene regulatory region)" 또는 "조절 영역(regulatory region)"은 코딩 영역의 상류(5' 비코딩 서열), 내부 또는 하류(3' 비코딩 서열)에 위치한 뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 관련된 코딩 영역의 전사, RNA 처리, 안정성 또는 번역에 영향을 미친다. 조절 영역은 프로모터, 번역 리더 서열(translation leader sequence), 인트론(intron), 폴리아데닐화 인식 서열(polyadenylation recognition sequence), RNA 가공 부위(processing site), 이펙터 결합 부위 또는 스템-루프 구조(stem-loop structure)를 포함할 수 있다. 코딩 영역이 진핵 세포에서 발현되도록 의도된 경우, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 일반적으로 코딩 서열의 3'에 위치될 것이다.
일부 측면에서, 본 명세서에서 제공되는 핵산 조성물(예컨대, 발현 구축물)은 하나 이상의 코딩 영역과 작동가능하게 연관된 프로모터 및/또는 다른 발현(예컨대, 전사) 조절 요소를 포함할 수 있다. 작동 가능한 연관에서 유전자 산물에 대한 코딩 영역은 조절 영역(들)의 영향 또는 제어 하에 유전자 산물의 발현을 두는 방식으로 하나 이상의 조절 영역과 연관된다. 예를 들어, 프로모터 기능의 유도가 코딩 영역에 의해 코딩되는 유전자 산물을 코딩하는 mRNA의 전사를 유도하고 프로모터와 코딩 영역 사이의 연결 특성이 유전자 산물의 발현을 지시하는 프로모터의 능력을 방해하거나 전사될 DNA 주형의 능력을 방해하지 않아야 하는 경우, 코딩 영역과 프로모터는 "작동가능하게 연결된(operably associated)"다. 프로모터 이외의 다른 발현 조절 요소, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서 및 전사 종결 신호는 또한 유전자 산물 발현을 지시하는 코딩 영역과 작동가능하게 연관될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "외래유전자(transgene)"는 재조합 발현 구축물 내에 인코딩된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역의 발현 산물, 폴리펩타이드 또는 다중-폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 조절 핵산(modulatory or regulatory nucleic acid)을 의미한다. 일부 측면에서, 상기 외래유전자는 대상체 또는 환자의 신체 내에서 지속적인 발현을 목적으로 하는, 특정 질환의 치료용 펩타이드를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열일 수 있다. 일부 측면에서, "작동적으로 연결된" 또는 "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 원하는 기능을 수행하도록 인접하여 위치함을 의미하며, 예를 들어, 특정 프로모터가 코딩 서열(예컨대, 외래 유전자)의 전사를 개시하는 데 도움을 주는 경우, 이러한 프로모터는 코딩 영역과 작동적으로 연결될 수 있다. 이러한 기능적 관계가 유지되는 한 프로모터와 코딩 영역이 반드시 인접하여 위치할 필요는 없다.
본 명세서에서, 용어 "벡터(vector)" 또는 "구축물(construct)"은 핵산 또는 유전자를 삽입할 수 있는 구축물을 의미하며, 바람직하게는 핵산 서열을 복제할 수 있는 세포로의 도입을 위해서 핵산 서열을 삽입할 수 있는 전달체를 포함한다. 핵산 서열은 외생 (exogenous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. 핵산 서열은 외래유전자일 수 있다. 구축물로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예컨대, AAV)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 상기 벡터 또는 구축물을 구축할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc., NY, 1994).
본 명세서에서, 용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구축물"은 전사된 유전자 산물의 적어도 일부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터 또는 구축물을 의미한다. 일부 경우에는 전사된 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 구축물에는 다양한 조절요소(control element)를 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 뉴클레오타이드 서열도 포함될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "대상체(subject)"는 AAV(본원에서 제공된 방법을 사용하여 생성됨) 또는 이러한 AAV를 포함하는 조성물이 투여되는 대상체를 의미한다. 비제한적인 예로, 진단, 치료 또는 요법이 필요한 인간, 가축(예: 개, 고양이 등), 농장 동물(예: 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험실 동물(예: 원숭이, 쥐, 생쥐, 토끼, 기니피그 등), 특히 인간이다. 본 명세서에 기재된 방법은 인간 치료 및 수의학 적용 모두에 적용가능하다.
본 명세서에서, "이를 필요로 하는 대상체(subject in need thereof)"는 본 명세서에 기술된 조성물의 투여로부터 이익을 얻을 대상체, 예컨대 포유동물을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)"은 원하는 치료 효과를 나타내기에 충분한 본 발명의 조성물(예를 들어, 외래유전자 및 비번역 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드)을 포함하는 시약 또는 약제학적 화합물의 양이다. 치료적 유효량은 예방이 요법으로 간주될 수 있기 때문에 "예방적 유효량(prophylactically effective amount)"일 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "외래유전자(transgene)"는 재조합 발현 구축물 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 영역의 발현 산물, 폴리펩타이드 또는 다중-폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 변조(modulatory) 또는 조절(regulatory) 핵산을 의미한다. 일부 측면에서, 상기 외래유전자는 그것이 삽입(또는 형질도입)되는 세포에 대해 이종일 수 있다(즉, 세포에서 자연적으로 발현되지 않음).
용어 "치료하다(treat)", "치료(treatment)" 또는 "치료하는(treating)"은 예를 들어 질병 또는 상태의 중증도 감소; 질병 진행 기간 단축; 질병 또는 상태와 관련된 하나 이상의 증상의 개선 또는 제거; 질병 또는 상태를 반드시 치료하지 않고 질병 또는 상태를 가진 피험자에게 유익한 효과를 제공하는 것을 의미한다. 이 용어는 또한 질병 또는 상태 또는 이의 증상의 예방 또는 방지를 포함한다.
용어 "업스트림(upstream)"은 기준 뉴클레오티드 서열에 대해 5'에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
본 명세서에서, 용어 "벡터(vector)" 또는 "구축물(construct)"은 핵산 또는 유전자가 삽입될 수 있는 임의의 운반체를 의미하며, 이는 복제될 수 있는 세포로의 도입을 위해 핵산 서열이 삽입될 수 있는 전달 운반체 같은 것이다. 핵산 서열은 외생 (exogenous) 또는 이종 (heterologous)일 수 있다. 핵산 서열은 외래유전자일 수 있다. 구축물로서는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예컨대, AAV)를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 상기 벡터 또는 구축물을 구축할 수 있다(Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988; 및 Ausubel et al., In: Current Protocols in Molecular Biology, John, Wiley & Sons, Inc., NY, 1994). 본 명세서에서, 용어 "발현 벡터" 또는 "발현 구축물"은 전사된 유전자 산물의 적어도 일부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터 또는 구축물을 의미한다. 일부 경우에는 전사된 RNA 분자가 단백질, 폴리펩타이드 또는 펩타이드로 번역된다. 발현 구축물에는 다양한 조절요소(control element)를 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 또 다른 기능도 제공하는 뉴클레오타이드 서열도 포함될 수 있다.
벡터는 벡터가 혼입된 세포의 선택 또는 식별을 제공하는 선택가능한 마커 또는 리포터를 인코딩하도록 조작될 수 있다. 선택 가능한 마커 또는 리포터의 발현은 벡터에 포함된 다른 코딩 영역을 포함하고 발현하는 숙주 세포의 식별 및/또는 선택을 허용한다. 당업계에 공지되고 사용되는 선별가능한 마커 유전자의 예는 암피실린(ampicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 젠타마이신(gentamycin), 카나마이신(kanamycin), 히그로마이신(hygromycin), 비알라포스(bialaphos) 제초제(herbicide), 술폰아미드(sulfonamide) 등에 대한 내성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커로 사용되는 유전자, 즉 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 트랜스퍼라제 유전자 등이다. 당해 분야에서 공지되고 사용되는 리포터의 예는 루시퍼라제(Luc), 녹색 형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), β-갈락토시다제(LacZ), β-글루쿠로니다제(Gus) 등을 포함한다. 선택 가능한 마커는 리포터로 고려될 수도 있다.
II. 듀얼 헬퍼 플라스미드
II.A. E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자, cap 유전자
본 발명의 일부 측면은 듀얼 헬퍼 플라스미드에 관한 것이다. 본 명세서에서 입증된 바와 같이, 이러한 듀얼 헬퍼 플라스미드는 (예를 들어, 관심 단백질을 코딩하는 외래유전자 포함하는) 재조합 아데노부속바이러스(AAV)를 생산하는데 특히 유용할 수 있다.
아데노부속바이러스(AAV)는 단일사슬 DNA 바이러스이자 헬퍼 의존형 인간 파보바이러스이다. 게놈 크기는 약 4.7kbp이다. 게놈의 N-말단은 바이러스 복제 및 바이러스 유전자 발현에 관여하는 rep 유전자를 인코딩하고, C-말단은 바이러스의 캡시드 단백질을 암호화하는 cap 유전자를 인코딩한다. 약 145 염기의 역말단반복서열(ITR)이 양 말단부위에 삽입되어 있다. T자 모양의 구조를 가진 145 bp 크기의 ITR(역말단반복서열)은 바이러스 유전체 복제시 복제원점의 기능을 수행하고, 1차적인 패키징 신호로 작용한다. ITR은 재조합 AAV 구축물을 만들 때 유일하게 필요한 cis-acting 염기서열이고, Rep 단백질 존재 하에서는 인핸서 활성을 갖지만, Rep 단백질이 없을 때에는 매우 약한 활성을 가지므로, 재조합 AAV 구축물에 외래 유전자를 클로닝할 때 이를 고려하여 인핸서, 프로모터, pA 등을 적절히 구성하여 발현 구축물을 제작한다(RJ Samulski and N Muzyczka, Annu. Rev. Virolo. 2014. 1:427-451). rep 유전자로부터는 4개의 단백질이 번역되는데, 이들은 그 분자량에 따라 rep78, rep68, rep52, rep40으로 구분되며, AAV DNA복제에 중요한 기능을 수행한다. cap 유전자로부터는 4개의 단백질이 번역되는데, 이중, VP1, VP2, VP3 단백질은 AAV 입자를 구성하는 구조 단백질들이며, 조립-활성화 단백질(AAP, assembly-activating protein)은 상기 구조 단백질들에 의한 AAV 입자의 형성을 촉진한다. 상기 아데노부속바이러스가 효율적으로 복제되기 위해서는 아데노바이러스 혹은 헤르페스 심플렉스 바이러스 같은 헬퍼바이러스(helper virus)에서 유래한 일부 단백질들 및 RNA들을 필요로 한다(Muzyczka N. Curr Top Microbiol Immunol 158, 97-129, 1992).
본 명세서에서, 용어 "듀얼 헬퍼 플라스미드(dual-helper plasmid) "는 세포에서 AAV를 생성하기 위한 요건 중 2개 이상을 제공할 수 있는 플라스미드를 의미한다. 외래유전자를 포함하는 재조합 AAV 벡터를 생산하기 위해서는 하기 구성요소가 숙주 세포에 제공되어야 한다: (1) 외래유전자, (2) rep 및 cap 단백질, 및 (3) E2a, E4 및 VA RNA 단백질. 본 발명의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 전통적인 방법으로, 다른 요건이 3개의 상이한 플라스미드(즉, ① ITR 측면에 있는 외래유전자를 포함하는 AAV 구축물 플라스미드, ② Rep-Cap 플라스미드 및 ③ 헬퍼 플라스미드)를 사용하여 세포에 제공된다.
본 발명으로부터 명백한 바와 같이, 일부 측면에서, 본 명세서에 기재된 듀얼 헬퍼 플라스미드는 상기 기재된 요건 (2) 및 (3)을 제공한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드는 rep 유전자, cap 유전자, E2a 유전자, E4 유전자 및 VA RNA 유전자를 포함한다.
본 명세서에서 입증된 바와 같이, 본 명세서에 기술된 듀얼 헬퍼 플라스미드는 상기 기술된 유전자를 포함할 뿐만 아니라 상기 유전자는 또한 플라스미드 내에서 특정 구성으로 배열된다. 예를 들어, 일부 측면에서, E2a 유전자, E4 유전자 및 VA RNA 유전자는 듀얼 헬퍼 플라스미드 내에서 순차적으로 연결되고, rep 유전자 및 cap 유전자(본 명세서에서는로 "rep-cap 유전자"로 언급됨)는 E2a 유전자의 5' 말단과 VA RNA 유전자의 3' 말단 사이를 시계 방향(5'에서 3'으로)으로 순차적으로 연결한다. 보다 구체적으로, 일부 측면에서, rep-cap 유전자의 5'-말단은 E2a 유전자의 5'-말단에 연결되고, rep-cap 유전자의 3'-말단은 VA RNA 유전자의 3'-말단에 연결된다. 이러한 듀얼 헬퍼 플라스미드의 비제한적 예는 도 5a에 제시되어 있다.
일부 측면에서, E2a 유전자, E4 유전자 및 VA RNA 유전자는 순차적으로 연결되고, rep-cap 유전자는 반시계 방향(3'에서 5'로)으로 E2a 유전자의 5'-말단과 VA RNA 유전자의 3'-말단 사이에 있다. 보다 구체적으로, 일부 측면에서, rep-cap 유전자의 3'-말단은 E2a 유전자의 5'-말단에 연결되고, rep-cap 유전자의 5'-말단은 VA RNA 유전자의 3'-말단에 연결된다. 이러한 듀얼 헬퍼 플라스미드의 비제한적 예는 도 5b에 제시되어 있다.
본 발명으로부터 명백한 바와 같이, 일부 측면에서, 상술된 각각의 E2a 유전자, E4 유전자 및 VA RNA 유전자는 아데노바이러스로부터 유래된다. 일부 측면에서, cap 유전자 및 rep 유전자는 동일한 AAV 혈청형으로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 측면에서, cap 유전자 및 rep 유전자 모두는 AAV2로부터 유래된다(예를 들어, 실시예 1-4에 기술된 pUC-R2C2 구축물 참조). 일부 측면에서, cap 유전자 및 rep 유전자는 다양한 혈청형을 갖는 AAV로부터 유래된다. 예를 들어, 본 명세서에서 입증된 바와 같이, 일부 측면에서, cap 유전자는 AAV8(cap8 또는 이의 단편)에서 유래하고 rep 유전자는 AAV2(rep2 또는 이의 단편)에서 유래한다(예를 들어, 실시예1-2에 기술된 pUC-R2C8 구축물 참조). 일부 측면에서, cap 유전자는 AAV9(cap9 또는 이의 단편)에서 유래하고 rep 유전자는 AAV2(rep2 또는 이의 단편)에서 유래한다(예를 들어, 실시예 1-6에 기술된 pUC-R2C9 구축물 참조). 일부 측면에서, cap 유전자는 AAV5(cap5 또는 이의 단편)로부터 유래되고 rep 유전자는 AAV2(rep2 또는 이의 단편)로부터 유래된다(예를 들어, 실시예 1-7에 기술된 pUC-R2C5 구축물 참조).
본 발명에서 사용될 수 있는 AAV의 유형 또는 혈청형의 비제한적 예는 AAVrh.lO(AAVrhlO), AAV-DJ(AAVDJ), AAV-DJ8(AAVDJ8), AAV1, AAV2, AAV2G9, AAV3, AAV3a, AAV3b, AAV3-3, AAV4, AAV4-4, AAV5, AAV6, AAV6.1, AAV6.2, AAV6.1.2, AAV7, AAV7.2, AAV8, AAV9, AAV9.11, AAV9.13, AAV9.16, AAV9.24, AAV9.45, AAV9.47, AAV9.61, AAV9.68, AAV9.84, AAV9.9, AAV10, AAV11, AAV 12, AAV16.3, AAV24.1, AAV27.3,AAV42.12, AAV42-lb, AAV42-2, AAV42-3a, AAV42-3b, AAV42-4, AAV42-5a, AAV42-5b, AAV42-6b, AAV42-8, AAV42-10, AAV42-11, AAV42-12, AAV42-13, AAV42-15, AAV42-aa, AAV43-1, AAV43-12, AAV43-20, AAV43-21, AAV43-23, AAV43-25, AAV43-5, AAV44.1, AAV44.2, AAV44.5, AAV223.1, AAV223.2, AAV223.4, AAV223.5, AAV223.6, AAV223.7, AAVl-7/rh.48, AAVl-8/rh.49, AAV2- 15/rh.62, AAV2-3/rh.61, AAV2-4/rh.50, AAV2-5/rh.51, AAV3.1/hu.6, AAV3.1/hu.9, AAV3-9/rh.52, AAV3-11/rh.53, AAV4-8/rl 1.64, AAV4-9/rh.54, AAV4-19/rh.55, AAV5-3/rh.57, AAV5-22/rh.58, AAV7.3/hu.7, AAV16.8/hu.10, AAV16.12/hu.11, AAV29.3/bb.1, AAV29.5/bb.2, AAV106.1/hu.37, AAV114.3/hu.40, AAV127.2/hu.41, AAV127.5/hu.42, AAV128.3/hu.44, AAV130.4/hu.48, AAV145.1/hu.53, AAV145.5/hu.54, AAV145.6/hu.55, AAV161.10/hu.60, AAV161.6/hu.61, AAV33.12/hu.l7, AAV33.4/hu. l5, AAV33.8/hu. l6, AAV52/hu. l9, AAV52.1/hu.20, AAV58.2/hu.25, AAVA3.3, AAV A3.4, AAVA3.5, AAV A3.7, AAVC1, AAVC2, AAVC5, AAVF3, AAVF5, AAVH2, AAVrh.72, AAVhu.8, AAVrh.68, AAVrh.70, AAVpi.1, AAVpi.3, AAVpi.2, AAVrh.60, AAVrh.44, AAVrh.65, AAVrh.55, AAVrh.47, AAVrh.69, AAVrh.45, AAVrh.59, AAVhu.12, AAVH6, AAVLK03, AAVH-l/hu.1, AAVH-5/hu.3, AAVLG-10/rh.40, AAVLG-4/rh.38, AAVLG-9/hu.39, AAVN721-8/rh.43, AAVCh.5, AAVCh.5R1, AAVcy.2, AAVcy.3, AAVcy.4, AAVcy.5, AAVCy.5Rl, AAVCy.5R2, AAVCy.5R3, AAVCy.5R4, AAVcy.6, AAVhu.1, AAVhu.2, AAVhu.3, AAVhu.4, AAVhu.5, AAVhu.6, AAVhu.7, AAVhu.9, AAVhu.10, AAVhu.11, AAVhu.13, AAVhu.15, AAVhu.16, AAVhu.17, AAVhu.18, AAVhu.20, AAVhu.21, AAVhu.22, AAVhu.23.2, AAVhu.24, AAVhu.25, AAVhu.27, AAVhu.28, AAVhu.29, AAVhu.29R, AAVhu.31, AAVhu.32, AAVhu.34, AAVhu.35, AAVhu.37, AAVhu.39, AAVhu.40, AAVhu.41, AAVhu.42, AAVhu.43, AAVhu.44, AAVhu.44Rl, AAVhu.44R2, AAVhu.44R3, AAVhu.45, AAVhu.46, AAVhu.47, AAVhu.48, AAVhu.48Rl, AAVhu.48R2, AAVhu.48R3, AAVhu.49, AAVhu.51, AAVhu.52, AAVhu.54, AAVhu.55, AAVhu.56, AAVhu.57, AAVhu.58, AAVhu.60, AAVhu.61, AAVhu.63, AAVhu.64, AAVhu.66, AAVhu.67, AAVhu.14/9, AAVhu.t 19, AAVrh.2, AAVrh.2R, AAVrh.8, AAVrh.8R, AAVrh.12, AAVrh.13, AAVrh.13R, AAVrh.14, AAVrh.17, AAVrh.18, AAVrh.19, AAVrh.20, AAVrh.21, AAVrh.22, AAVrh.23, AAVrh.24, AAVrh.25, AAVrh.31, AAVrh.32, AAVrh.33, AAVrh.34, AAVrh.35, AAVrh.36, AAVrh.37, AAVrh.37R2, AAVrh.38, AAVrh.39, AAVrh.40, AAVrh.46, AAVrh.48, AAVrh.48.1, AAVrh.48.1.2, AAVrh.48.2, AAVrh.49, AAVrh.51, AAVrh.52, AAVrh.53, AAVrh.54, AAVrh.56, AAVrh.57, AAVrh.58, AAVrh.61, AAVrh.64, AAVrh.64Rl, AAVrh.64R2, AAVrh.67, AAVrh.73, AAVrh.74, AAVrh8R, AAVrh8R A586R mutant, AAVrh8R R533A mutant, AAAV, BAAV, caprine AAV, bovine AAV, AAVhEl.1, AAVhErl.5, AAVhER1.14, AAVhErl.8, AAVhErl.16, AAVhErl.18, AAVhErl.35, AAVhErl.7, AAVhErl.36, AAVhEr2.29, AAVhEr2.4, AAVhEr2.16, AAVhEr2.30, AAVhEr2.31, AAVhEr2.36, AAVhER1.23, AAVhEr3.1, AAV2.5T, AAV-PAEC, AAV-LK01, AAV-LK02, AAV-LK03, AAV-LK04, AAV-LK05, AAV- LK06, AAV-LK07, AAV-LK08, AAV-LK09, AAV-LK10, AAV-LK11, AAV-LK12, AAV-LK13, AAV-LK14, AAV-LK15, AAV-LK16, AAV-LK17, AAV-LK18, AAV- LK19, AAV-PAEC2, AAV-PAEC4, AAV-PAEC6, AAV-PAEC7, AAV-PAEC 8, AAV- PAEC 11, AAV-PAEC 12, AAV-2-pre-miRNA-101, AAV-8h, AAV-8b, AAV-h, AAV- b, AAV SM 10-2, AAV Shuffle 100-1 , AAV Shuffle 100-3, AAV Shuffle 100-7, AAV Shuffle 10-2, AAV Shuffle 10-6, AAV Shuffle 10-8, AAV Shuffle 100-2, AAV SM 10- 1, AAV SM 10-8, AAV SM 100-3, AAV SM 100-10, B P61 AAV, B P62 AAV, B P63 AAV, AAVrh.50, AAVrh.43, AAVrh.62, AAVrh.48, AAVhu.19, AAVhu.11, AAVhu.53, AAV4-8/rh.64, AAVLG-9/hu.39, AAV54.5/hu.23, AAV54.2/hu.22,AAV54.7/hu.24, AAV54.1/hu.21, AAV54.4R/hu.27, AAV46.2/hu.28, AAV46.6/hu.29, AAV128.1/hu.43, true type AAV(ttAAV), UPENN AAV10, Japanese AAV10 혈청형, 및 이들의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명에 유용한 아데노부속바이러스의 혈청형은 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, 또는 이들의 조합을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드의 다중 유전자 중 하나 이상은 AAV1에서 유래된다. 예를 들어, 일부 측면에서, rep 유전자는 AAV1에서 유래된다. 일부 측면에서, cap 유전자는 AAV1에서 유래된다. 일부 측면에서, rep 유전자 및 cap 유전자 둘 모두는 AAV1에서 유래된다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드의 다중 유전자 중 하나 이상은 AAV2로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 측면에서, rep 유전자는 AAV2에서 유래된다. 일부 측면에서, cap 유전자는 AAV2에서 유래된다. 일부 측면에서, rep 유전자 및 cap 유전자 둘 모두는 AAV2로부터 유래된다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드의 다중 유전자 중 하나 이상은 AAV3에서 유래된다. 예를 들어, 일부 측면에서 rep 유전자는 AAV3에서 유래된다. 일부 측면에서, cap 유전자는 AAV3에서 유래된다. 일부 측면에서, rep 유전자 및 cap 유전자 둘 모두는 AAV3로부터 유래된다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드의 다중 유전자 중 하나 이상은 AAV4로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 측면에서 rep 유전자는 AAV4에서 유래된다. 일부 측면에서, cap 유전자는 AAV4에서 유래다. 일부 측면에서, rep 유전자 및 cap 유전자 둘 모두는 AAV4로부터 유래된다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드의 다중 유전자 중 하나 이상은 AAV5로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 측면에서 rep 유전자는 AAV5에서 유래된다. 일부 측면에서, cap 유전자는 AAV5에서 유래된다. 일부 측면에서, rep 유전자 및 cap 유전자 둘 모두는 AAV5로부터 유래된다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드의 다중 유전자 중 하나 이상은 AAV6에서 유래된다. 예를 들어, 일부 측면에서, rep 유전자는 AAV6에서 유래된다. 일부 측면에서, cap 유전자는 AAV6에서 유래된다. 일부 측면에서, rep 유전자 및 cap 유전자 둘 모두는 AAV6에서 유래된다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드의 다중 유전자 중 하나 이상은 AAV7에서 유래된다. 예를 들어, 일부 측면에서 rep 유전자는 AAV7에서 유래된다. 일부 측면에서, cap 유전자는 AAV7에서 유래된다. 일부 측면에서, rep 유전자 및 cap 유전자 둘 모두는 AAV7로부터 유래된다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드의 다중 유전자 중 하나 이상은 AAV8에서 유래된다. 예를 들어, 일부 측면에서 rep 유전자는 AAV8에서 유래된다. 일부 측면에서, cap 유전자는 AAV8에서 유래된다. 일부 측면에서, rep 유전자 및 cap 유전자 둘 모두는 AAV8로부터 유래된다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드의 다중 유전자 중 하나 이상은 AAV9로부터 유래된다. 예를 들어, 일부 측면에서 rep 유전자는 AAV9에서 유래된다. 일부 측면에서, cap 유전자는 AAV9에서 유래된다. 일부 측면에서, rep 유전자 및 cap 유전자 둘 모두는 AAV9로부터 유래된다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드의 다중 유전자 중 하나 이상은 AAVrh10에서 유래된다. 예를 들어, 일부 측면에서, rep 유전자는 AAVrh10에서 유래된다. 일부 측면에서, cap 유전자는 AAVrh10에서 유래된다. 일부 측면에서, rep 유전자 및 cap 유전자 둘 모두는 AAVrh10으로부터 유래된다.
일부 측면에서, 본 발명의 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하고, 상기 rep 유전자는 AAV2로부터 유래된다. AAV2 rep 유전자에 대한 핵산 서열은 서열번호 29에 제시되어 있다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하고, 상기 rep 유전자는 서열번호 29에 제시된 서열과 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하고, 상기 rep 유전자는 서열번호 29에 기재된 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 명세서에 기재된 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하며, 상기 cap 유전자는 AAV2, AAV5, AAV8 또는 AAV9로부터 유래된다.
일부 측면에서, cap 유전자는 AAV2에서 유래된다. 따라서, 일부 측면에서, 본 명세서에 기재된 듀얼 헬퍼 플라스미드는 AAV2로부터 유래된 rep 유전자(rep2) 및 AAV2로부터 유래된 cap 유전자(cap2)를 포함한다. AAV2 cap 유전자에 대한 핵산 서열은 서열번호 30에 제시되어 있다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하고, 상기 cap 유전자는 서열번호 30에 제시된 서열에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하고, 상기 cap 유전자는 서열번호 30에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, cap 유전자는 AAV5에서 유래된다. 예를 들어, 일부 측면에서, 본 명세서에 기재된 듀얼 헬퍼 플라스미드는 AAV2로부터 유래된 rep 유전자(rep2) 및 AAV5로부터 유래된 cap 유전자(cap5)를 포함한다. AAV5 cap 유전자에 대한 핵산 서열은 서열번호 31에 제시되어 있다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하고, 상기 cap 유전자는 서열번호 31에 제시된 서열에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하고, 상기 cap 유전자는 서열번호 31에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, cap 유전자는 AAV8에서 유래된다. 예를 들어, 일부 측면에서 본 명세서에 기재된 듀얼 헬퍼 플라스미드는 AAV2로부터 유래된 rep 유전자(rep2) 및 AAV8로부터 유래된 cap 유전자(cap8)를 포함한다. AAV8 cap 유전자에 대한 핵산 서열은 서열번호 32에 제시되어 있다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하고, 상기 cap 유전자는 서열번호 32에 제시된 서열에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하고, 상기 cap 유전자는 서열번호 32에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, cap 유전자는 AAV9에서 유래된다. 예를 들어, 일부 측면에서 본 명세서에 기재된 듀얼 헬퍼 플라스미드는 AAV2로부터 유래된 rep 유전자(rep2) 및 AAV9로부터 유래된 cap 유전자(cap9)를 포함한다. AAV9 cap 유전자에 대한 핵산 서열은 서열번호 33에 제시되어 있다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하고, 상기 cap 유전자는 서열번호 33에 제시된 서열에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하고, 상기 cap 유전자는 서열번호 33에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 명세서에서 제공되는 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하고, 상기 E2a 유전자는 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5)로부터 유래된다. Ad5 E2a 유전자에 대한 핵산 서열은 서열번호 34에 제시되어 있다. 따라서, 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하고, 상기 E2a 유전자는 서열번호 34에 제시된 서열에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하고, 상기 E2a 유전자는 서열번호 34에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 명세서에서 제공되는 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하며, 상기 E4 유전자는 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5)로부터 유래된다. Ad5 E4 유전자에 대한 핵산 서열은 서열번호 35에 제시되어 있다. 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하고, 상기 E4 유전자는 서열번호 35에 제시된 서열에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하고, 상기 E4 유전자는 서열번호 35에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 본 명세서에서 제공되는 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하며, 상기 VA RNA 유전자는 아데노바이러스 혈청형 5(Ad5)로부터 유래된다. Ad5 VA RNA 유전자에 대한 핵산 서열은 서열번호 36에 제시되어 있다. 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자, 및 cap 유전자를 포함하고, 상기 VA RNA 유전자는 서열번호 36에 제시된 서열에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 포함한다. 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하고, 상기 VA RNA 유전자는 서열번호 36에 제시된 핵산 서열을 포함한다.
본 발명으로부터 명백한 바와 같이, 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 듀얼 헬퍼 플라스미드는 동일한 바이러스 공급원 또는 다중 바이러스 공급원으로부터 유래된 유전자를 포함한다. 일부 측면에서, 기술된 듀얼 헬퍼 플라스미드는 (i) Ad5로부터 유래된 E2a 유전자(예컨대, 서열번호 34); (ii) Ad5로부터 유래된 E4 유전자(예컨대, 서열번호 35); (iii) Ad5에서 유래된 VA RNA 유전자(예컨대, 서열번호 36), (iv) AAV2에서 유래된 cap 유전자(예컨대, 서열번호 30); 및 (v) AAV2로부터 유래된 rep 유전자(예컨대, 서열번호 29)를 포함한다. 일부 측면에서, 기재된 듀얼 헬퍼 플라스미드는 (i) Ad5로부터 유래된 E2a 유전자(예컨대, 서열번호 34); (ii) Ad5로부터 유래된 E4 유전자(예컨대, 서열번호 35); (iii) Ad5에서 유래된 VA RNA 유전자(예컨대, 서열번호 36), (iv) AAV5에서 유래된 cap 유전자(예컨대, 서열번호 31); 및 (v) AAV2로부터 유래된 rep 유전자(서열번호 29)를 포함한다. 일부 측면에서, 기술된 듀얼 헬퍼 플라스미드는 (i) Ad5로부터 유래된 E2a 유전자(예컨대, 서열번호 34); (ii) Ad5로부터 유래된 E4 유전자(예컨대, 서열번호 35); (iii) Ad5에서 유래된 VA RNA 유전자(예컨대, 서열번호 36), (iv) AAV8에서 유래된 cap 유전자(예컨대, 서열번호 32); 및 (v) AAV2로부터 유래된 rep 유전자(예컨대, 서열번호 29)를 포함한다. 일부 측면에서, 기술된 듀얼 헬퍼 플라스미드는 (i) Ad5로부터 유래된 E2a 유전자(예컨대, 서열번호 34); (ii) Ad5로부터 유래된 E4 유전자(예컨대, 서열번호 35); (iii) Ad5에서 유래된 VA RNA 유전자(예컨대, 서열번호 36), (iv) AAV9에서 유래된 cap 유전자(예컨대, 서열번호 33); 및 (v) AAV2로부터 유래된 rep 유전자(예컨대, 서열번호 29)를 포함한다.
본 명세서에 기술되고 입증된 바와 같이, 상기 기술된 유전자(예를 들어, E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자)의 하나 이상의 배열은 본 발명의 듀얼 헬퍼 플라스미드의 특정 특성을 개선하는 데 도움을 줄 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 기술된 듀얼 헬퍼 플라스미드는 (i) Ad5로부터 유래된 E2a 유전자(예컨대, 서열번호 34); (ii) Ad5로부터 유래된 E4 유전자(예컨대, 서열번호 35); (iii) Ad5에서 유래된 VA RNA 유전자(예컨대, 서열번호 36), (iv) AAV2, AAV5, AAV8 또는 AAV9에서 유래된 cap 유전자(예컨대, 각각 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 33); 및 (v) AAV2로부터 유래된 rep 유전자(예컨대, 서열번호 29)을 포함하고, 상기 rep 유전자 및 cap 유전자는 시계 방향이다. 예를 들어, 일부 측면에서, rep 유전자의 5'-말단은 E2a 유전자의 5'-말단에 연결되고, rep 유전자의 3'-말단은 cap의 5'-말단에 연결되고, cap 유전자의 3'-말단은 VA RNA 유전자의 3'-말단에 연결된다(도 5a 참조). 일부 측면에서, 기술된 듀얼 헬퍼 플라스미드는 (i) Ad5로부터 유래된 E2a 유전자(예를 들어, 서열번호 34); (ii) Ad5로부터 유래된 E4 유전자(예를 들어, 서열번호 35); (iii) Ad5에서 유래된 VA RNA 유전자(예컨대, 서열번호 36), (iv) AAV2, AAV5, AAV8 또는 AAV9에서 유래된 cap 유전자(예컨대, 각각 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 33); 및 (v) AAV2로부터 유래된 rep 유전자(예컨대, 서열번호 29)를 포함하고, 상기 rep 유전자 및 cap 유전자는 반시계 방향이다. 일부 측면에서, rep 유전자의 5'-말단은 VA RNA 유전자의 3'-말단에 연결되고, rep 유전자의 3'-말단은 cap 유전자의 5'-말단에 연결되고, cap 유전자의 3'-말단은 E2a 유전자의 5'-말단에 연결된다(도 5b 참조).
본 명세서에 기술된 특징(예컨대, E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자의 특정 배열)에 기초하여, 본 발명의 듀얼 헬퍼 플라스미드는 하기 개선된 특성 중 하나 이상을 나타낸다: 1) 숙주 세포가 재조합 AAV를 생산하는 데 필요한 모든 구성 요소를 갖도록 동시형질감염 확률 증가, 2) 재조합 아데노부속바이러스의 생산성 증가, 3) 플라스미드 생산 및 정제 비용 및 시간 감소. 이러한 특성에 관한 추가 개시는 본 발명의 다른 곳에서 제공된다.
II.B. 추가 특징
본 발명으로부터 명백한 바와 같이, 일부 측면에서, 본 명세서에 기재된 듀얼 헬퍼 플라스미드는 재조합 AAV 생산에 유용한 하나 이상의 추가 특징을 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 본 명세서에 기재된 듀얼 헬퍼 플라스미드는 항생제 저항성 유전자를 더 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 듀얼 헬퍼 플라스미드는 선별 마커를 더 포함한다. 본 명세서에서, 용어 "선별 마커(selection marker)"는 핵산 서열을 발현하는 세포를 식별하는데 사용될 수 있는 임의의 유전자를 의미한다. 따라서, 이러한 선별 마커는 본 명세서에 기술된 듀얼 헬퍼 플라스미드로 형질감염 후 형질전환된 세포를 확인하고 풍부하게 하는데 사용될 수 있다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 선별 마커는 당업계에 공지된 임의의 적합한 선별 마커를 포함한다. 적합한 선별 마커의 비제한적 예는 (i) 항생제에 대한 저항성을 인코딩하는 효소(즉, "항생제 저항성 유전자"), 예를 들어 카나마이신(kanamycin), 네오마이신(neomycin), 퓨로마이신(puromycin), 히그로마이신(hygromycin), 블라스티시딘(blasticidin) 또는 제오신(zeocin); 또는 (ii) 형광 단백질, 예를 들어, 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP) 또는 청색 형광 단백질(BFP)을 포함한다.
일부 측면에서, 선별 마커는 항생제 저항성 유전자를 포함한다. 일부 측면에서, 항생제 저항성 유전자는 암피실린 저항성 유전자, 카나마이신 저항성 유전자, 또는 둘 모두를 포함한다. 암피실린 저항성 유전자에 대한 핵산 서열은 서열번호 37에 제시되어 있다. 카나마이신 저항성 유전자에 대한 핵산 서열은 서열번호 38에 제시되어 있다.
III. 발현 구축물
본 발명으로부터 명백한 바와 같이, 일부 측면에서, 본 명세서에 제공된 듀얼 헬퍼 플라스미드는 예를 들어 재조합 AAV를 생성하는데 있어서 하나 이상의 추가 플라스미드와 조합하여 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 추가 플라스미드는 재조합 발현 구축물, 예컨대, AAV 구축물 플라스미드(여기서 "발현 구축물"로 지칭)를 포함한다. 발현 구축물의 예시적인 측면이 하기 기술되어 있다.
III.A. 외래유전자(예: ITR의 측면에 위치)
본 발명의 다른 곳에서 추가로 기술된 바와 같이, 일부 측면에서, 본 명세서에서 제공되는 듀얼 헬퍼 플라스미드는 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자, rep 유전자 및 cap 유전자를 포함한다. 이러한 측면에서, (예컨대, 생산되는 재조합 AAV에 도입될) 외래유전자는 별도의 발현 구축물(예컨대, AAV 구축물 플라스미드)에 의해 제공될 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 발현 구축물은 외래유전자를 포함한다. 일부 측면에서, 외래유전자는 역말단반복서열(ITR)의 측면에 위치한다. 본 발명에 유용한 외래유전자는 외래유전자가 세포 내로 도입될 때 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 따라서, 임의의 적합한 관심 외래유전자가 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 외래유전자는 폴리펩타이드(또는 이의 임의의 변이체), 융합 단백질, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, RNA 기반 분자(예컨대, miRNA, shRNA, 리보자임, siRNA), 또는 이의 임의의 조합을 인코딩한다.
일부 측면에서, 외래유전자는 본 명세서에 기재된 것과 같은 질환 또는 장애의 치료에 유용한 단백질을 인코딩한다. 일부 측면에서, 외래유전자는 대상체 또는 환자의 신체에서 지속적인 발현을 목적으로 특정 질병에 대한 치료 펩타이드를 인코딩한다.
III.B. 조절 요소
일부 측면에서, 본 발명의 듀얼 헬퍼 플라스미드와 함께 사용될 수 있는 발현 구축물은 조절 요소를 더 포함한다. 일부 측면에서, 조절 요소는 외래유전자에 작동가능하게 연결된다.
따라서, 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 발현 구축물(예컨대, AAV 구축물 플라스미드)은 하기를 포함한다:
(a) ITR(역말단반복서열);
(b) 외래유전자; 및
(c) 외래유전자에 작동가능하게 연결된 조절 요소.
본 발명에 유용한 조절 요소는 인핸서(예컨대, CMV 인핸서), 프로모터(예컨대, CMV 프로모터, EF-1α 프로모터, β-액틴 프로모터), 엑손(예컨대, 엑손 1, 엑손 2), 인트론(예컨대, 인트론 A), 스플라이싱 공여체 또는 수여체 서열, 또는 이들의 조합이 포함된다. 일부 측면에서, 상기 조절 요소는 전사 종결을 위한 서열(예컨대, 폴리 A), 외래유전자를 안정적으로 발현시키기 위한 서열(예컨대, WPRE 서열), 외래유전자-특이적 면역을 감소시키기 위한 서열(예컨대, miRNA 표적 서열), 또는 이들의 조합이 포함될 수 있다. 외래유전자 및 조절 요소에 대한 세부 사항(ITR 서열, 인핸서 서열, 프로모터 서열, E1 서열, 스플라이싱 공여체 서열, EF-1α 인트론 또는 스플라이싱 수여체를 포함하는 이의 단편 서열, EF-1α E2 서열, WPRE 서열, miR 서열, 폴리 서열 등)은 US 2022/0010332 A1에서 확인할 수 있으며, 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함된다.
상술된 바와 같이, 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 발현 구축물은 (i) 외래유전자 및 (ii) 외래유전자에 작동가능하게 연결된 조절 요소를 포함하며, 상기 조절 요소는 하기 성분을 포함한다:
1) CMV 인핸서 서열;
2) CMV 프로모터 서열, EF-1α 프로모터 서열 또는 치킨 β-액틴 프로모터 서열;
3) CMV E1 서열, EF-1α E1 서열 또는 치킨 β-액틴 E1 서열;
4) 스플라이싱 공여체 서열;
5) EF-1α 인트론 단편 서열; 및
6) EF-1α E2 서열.
IV. 벡터
일부 측면에서, 본 명세서에 제공된 임의의 플라스미드(예컨대, 듀얼 헬퍼 플라스미드 및/또는 외래유전자를 포함하는 발현 구축물)를 포함하는 벡터가 본 명세서에 제공된다. 또한, 본 명세서에서 제공된 플라스미드를 사용하여 생산된 재조합 AAV가 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에서, 이러한 벡터는 숙주 세포 및 치료적 중재를 위한 표적 세포에서의 재조합 발현에 유용하다.
본 발명으로부터 명백한 바와 같이, 일부 측면에서, 본 발명에 유용한 벡터는 AAV로부터 유래된다. AAV는 외래 DNA를 세포에 전달하기 위한 벡터 시스템으로서 매력적인 독특한 기능을 가지고 있다. 배양 중 세포의 AAV 감염은 일반적으로 비세포 변성이며, 인간 및 다른 동물의 자연 감염은 조용하고 무증상이다. 게다가, AAV는 많은 다양한 유형의 포유동물 세포를 감염시켜 생체내에서 많은 다양한 조직을 표적화할 수 있다. 또한, AAV는 다른 형태의 유전자 전달체에 비해 상대적으로 약한 면역 반응을 촉진하고, 비통합, 에피솜 벡터 DNA(non-integrating, episomal vector DNA)를 기반으로 분열 및 정지 세포 모두에서 지속적으로 발현하여 유전자 전달체에 대해 특히 매력적인 바이러스 시스템이 되는 추가적인 이점을 가지고 있다. 또한, AAV는 아데노바이러스를 비활성화하는데 사용되는 조건(수 시간 동안 56 내지 65℃)을 견디므로 rAAV 기반 백신의 저온 보존이 덜 중요하다.
본 발명에 사용될 수 있는 아데노부속바이러스의 유형 또는 혈청형의 비제한적 예는 본 발명의 다른 곳에서 제공된다.
V. 세포
일부 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 플라스미드(예컨대, 듀얼 헬퍼 플라스미드 및 외래유전자를 포함하는 발현 구축물)를 포함하는 세포(여기서 "변형된 세포"로 지칭)를 제공한다. 일부 측면에서, 세포(예를 들어, 숙주 세포)는 재조합 AAV를 생산하기 위해 듀얼 헬퍼 플라스미드 및 AAV 구성 플라스미드로 형질감염된다. 본 명세서의 일부 측면에서, (예컨대, 듀얼 헬퍼 플라스미드 및 외래유전자를 포함하는 발현 구축물을 포함하는) 본 발명의 변형된 세포는 재조합 AAV 생산의 하나 이상의 측면을 개선할 수 있다. 예를 들어, 일부 측면에서, 본 명세서에 제공된 변형된 세포는 대조 세포와 비교하여 더 큰 수율로 재조합 AAV를 생산할 수 있다. 일부 측면에서, 대조 세포는 다음의 3가지의 별도 플라스미드를 포함하도록 변형된 해당 세포를 포함한다: (1) rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하는 제1 플라스미드("rep-cap 플라스미드"); (2) E2a 유전자, E4 유전자 및 VA RNA 유전자를 포함하는 제2 플라스미드("헬퍼 플라스미드"); 및 (3) 외래유전자를 포함하는 제3 플라스미드.
일부 측면에서, 대조 세포와 비교하여, (예컨대, 듀얼 헬퍼 플라스미드 및 외래유전자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는) 본 발명의 세포는 생산된 재조합 AAV의 양을 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 약 100% 이상 증가시킬 수 있다. 일부 측면에서, 대조 세포와 비교하여, 본 발명의 세포는 생산된 재조합 AAV의 양을 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 또는 적어도 약 100배 또는 이상 증가시킬 수 있다. 일부 측면에서, (예컨대, 듀얼 헬퍼 플라스미드 및 외래유전자를 포함하는 발현 구축물을 포함하도록 변형된) 본 명세서에 제공된 세포는 대조 세포와 비교하여 생산 및/또는 정제 시간을 감소시킬 수 있다. 일부 측면에서, 대조 세포와 비교하여 생산 및/또는 정제 시간은 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 또는 그 이상 감소된다.
본 발명으로부터 명백한 바와 같이, 본 명세서의 플라스미드를 사용하여 생산된 재조합 AAV를 포함하도록 변형(예컨대, 형질감염)된 세포가 또한 제공된다. 이러한 세포는 예를 들어 본 명세서에 기술된 외래유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 생산하는 데 특히 유용할 수 있다. 임의의 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 측면에서, 세포(예컨대, 숙주 세포)가 본 명세서에 기술된 플라스미드(예컨대, 듀얼 헬퍼 플라스미드 및 조절 요소에 작동가능하게 연결된 외래유전자를 포함하는 발현 구축물)로 형질감염될 때, 생산된 재조합 AAV는 개별 플라스미드의 하나 이상의 특징을 포함한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 생산된 재조합 AAV는 조절 요소에 작동 가능하게 연결된 외래유전자를 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 일부 측면에서, 본 명세서에 기재된 하나 이상의 조절 요소는 세포에서 외래유전자에 의해 코딩되는 단백질("암호화된 단백질")의 발현을 향상시킬 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, (예컨대, 본 명세서에 기술된 하나 이상의 조절 요소에 작동가능하게 연결된 외래유전자를 포함하는 재조합 AAV 전달체 벡터로 형질감염된) 본 명세서에 기술된 세포는 대조 세포와 비교하여 인코딩된 단백질의 발현을 더 크게 증가시킨다. 일부 측면에서, 대조 세포는 해당 전달체 벡터로 형질감염되지만 본 명세서에 기술된 조절 요소 중 하나 이상이 결여되어 있다.
일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 세포는 시험관내에서 변형(예컨대, 형질감염)되어 관심 조성물을 생산한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 세포는 재조합 AAV를 생산하기 위해 듀얼 헬퍼 플라스미드 및 발현 구축물(예컨대, 본 명세서에 기재된 것)로 시험관내에서 형질감염된다. 일부 측면에서, 세포는 재조합 유전자 전달체 벡터로 시험관내에서 형질감염되어 외래유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 생산한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 세포는 생체내에서(예컨대, 외래유전자를 포함하는 재조합 AAV의 투여를 받은 대상체에서) 인코딩된 단백질을 생산할 수 있다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 세포는 시험관내 및 생체내 모두에서 관심 조성물(예컨대, 인코딩된 단백질)을 생산할 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 일부 측면에서, 본 발명은 예를 들어 외래유전자 발현을 위한 재조합 발현 구축물로 형질전환, 형질도입 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 본 명세서에서 용어 "숙주 세포(host cell)"는 진핵 세포 및 원핵 세포를 포함하고, 예컨대, 플라스미드 또는 발현 구축물(예를 들어, AAV 구축물 플라스미드, Rep-Cap 플라스미드, 헬퍼 플라스미드, 듀얼 헬퍼 플라스미드 등)에 의해 인코딩되는 유전자가 발현되거나 복제될 수 있도록 형질도입될 수 있는 유기체의 세포를 의미한다. 일부 측면에서, 이는 분리된(진핵) 숙주 세포를 의미한다. 본 명세서에서, 용어 "형질감염(transfection)"은 형질도입 및 형질전환을 포함하는 것으로 의도된다. 숙주 세포는 본 명세서에 기재된 임의의 플라스미드, 구축물 및/또는 벡터로 형질감염, 형질도입 또는 형질전환될 수 있다. 이러한 용어들은 외인성 핵산 분자가 숙주 세포 내로 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다.
일부 측면에서, 숙주 세포는 진핵 세포이다. 일부 측면에서, 숙주 세포는 포유동물 세포, 곤충 세포, 효모 세포, 트랜스제닉 포유동물 세포 및 식물 세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 숙주 세포는 원핵 세포이다. 일부 측면에서, 원핵 세포는 박테리아 세포이다.
일부 측면에서, 본 발명에 유용한 세포(예컨대, 숙주 세포)는 곤충 세포, 포유동물 세포, 또는 둘 모두를 포함한다. 일부 측면에서, 곤충 세포는 Sf9 세포일 수 있다. 일부 측면에서, 포유동물 세포는 HEK293 세포, HeLa 세포, ARPE-19 세포, RPE-1 세포, HepG2 세포, Hep3B 세포, Huh-7 세포, C8D1a 세포, Neuro2A 세포, CHO 세포, MES13 세포, BHK-21 세포, COS7 세포, COP5 세포, A549 세포, MCF-7 세포, HC70 세포, HCC1428 세포, BT-549 세포, PC3 세포, LNCaP 세포, Capan-1 세포, Panc-1 세포, MIA PaCa-2 세포, SW480 세포, HCT166 세포, LoVo 세포, A172 세포, MKN-45 세포, MKN-74 세포, Kato-III 세포, NCI-N87 세포, HT-144 세포, SK-MEL-2 세포, SH-SY5Y 세포, C6 세포 , HT-22 세포, PC-12 세포, NIH3T3 세포, 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 측면에서, 본 발명에 유용한 세포는 인간 세포를 포함한다. 일부 측면에서, 인간 세포는 본 명세서에 기술된 재조합 유전자 전달체 벡터의 투여를 받는 대상체의 세포이다. 일부 측면에서, 인간 세포는 공여자(예컨대, 건강한 인간 피험자)로부터 유래한다.
VI. 조성물
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 듀얼 헬퍼 플라스미드를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 본 발명으로부터 명백한 바와 같이, 일부 측면에서, 이러한 조성물은 추가 플라스미드, 예컨대, 본 명세서에 기재된 발현 구축물(예를 들어, 외래유전자 발현을 위한 AAV 구축물 플라스미드)을 더 포함한다. 본 발명의 다른 곳에서 또한 기술된 바와 같이, 이러한 조성물은 재조합 AAV를 생산하는데 유용할 수 있다.
다양한 플라스미드(예컨대, 듀얼 헬퍼 플라스미드), 구축물(예컨대, 발현 구축물), 벡터(예컨대, 재조합 AAV 전달체 벡터) 및 본 명세서에 개시된 세포(여기서 "활성 화합물(active compounds)"이라고도 지칭)는 투여에 적합한 약제학적 조성물에 포함될 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 본 발명은 이러한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 예를 들어, 일부 측면에서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 플라스미드(예컨대, 듀얼 헬퍼 플라스미드)를 사용하여 생산된 재조합 AAV를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
일부 측면에서, 본 명세서에 기재된 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함한다.
본 발명에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용가능한 담체는 제형에 일반적으로 사용되는 것들을 포함한다. 이러한 약제학적으로 허용가능한 담체의 비제한적 예는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 검, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 및 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 약제학적 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 이들의 조합과 같은 하나 이상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용가능한 담체 및 제제에 대한 추가 세부 사항은 문헌(Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995))에 설명되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 의도된 투여 경로와 호환되도록 제형화된다. 이러한 투여 경로의 비제한적 예는 본 발명의 다른 곳에서 제공된다.
본 명세서에 기술된 약제학적 조성물은 단일 투여 또는 다중 투여 형태로 제공될 수 있다. 일부 측면에서, 본 명세서에서 제공되는 약제학적 조성물은 용액(예컨대, 유성 또는 수성 매질 중), 현탁액, 에멀젼, 추출물, 분말, 과립, 정제 또는 캡슐의 형태로 제형화된다. 일부 측면에서, 본 명세서에 기술된 약제학적 조성물을 포함하는 제형은 분산제, 안정제 또는 둘 모두를 추가로 포함할 수 있다.
VII. 키트
개시된 다양한 플라스미드(예컨대, 듀얼 헬퍼 플라스미드), 구축물(예컨대, 발현 구축물), 벡터(예컨대, 재조합 AAV 전달체 벡터), 세포 및 조성물(예컨대, 약제학적 조성물) 중 하나 이상을 포함하는 키트가 본 명세서에 개시된다. 일부 측면에서, 키트는 사용 설명서(예컨대, 전술한 것 중 임의의 것 또는 이들의 조합을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 설명서)를 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "키트" 및 "시스템"은 다양한 플라스미드(예: 듀얼 헬퍼 플라스미드), 구축물(예: 발현 구축물), 벡터(예: 재조합 AAV 전달체 벡터), 세포, 및 조성물(예컨대, 약제학적 조성물), 또는 이들의 임의의 조합 중 적어도 하나 이상을 나타내는 것으로 의도되고, 일부 측면에서 하나 이상의 다른 유형의 요소 또는 성분(예컨대, 다른 유형의 생화학적 시약, 용기, 판매를 위한 포장, 사용 설명서 등)과 함께 제공된다.
VIII. 용도 및 방법
VIII.A. AAV 생산 방법
본 발명의 특정 측면은 AAV를 생산하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 일부 측면에서, 외래유전자를 포함하는 재조합 AAV를 생산하는 방법이 본 발명에 제공된다. 일부 측면에서, 이러한 방법은 세포(예컨대, 숙주 세포)를 듀얼 헬퍼 플라스미드(예컨대, 본 명세서에 기재된 것) 및 외래유전자를 포함하는 발현 구축물(예컨대, AAV 구축물 플라스미드)로 형질감염시키는 것을 포함한다. 일부 측면에서, 세포는 듀얼 헬퍼 플라스미드 및 발현 구축물로 동시에 형질감염된다. 일부 측면에서, 세포는 듀얼 헬퍼 플라스미드 및 발현 구축물로 순차적으로 형질감염된다. 별도로 언급되지 않는 한, 당업계에 공지된 임의의 적합한 형질감염 방법이 본 발명과 함께 사용될 수 있다.
일부 측면에서, 재조합 AAV를 생산하는 방법은 재조합 AAV가 생산되도록 적합한 조건 하에 형질감염된 세포를 배양하는 단계를 더 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 생산된 재조합 AAV를 회수하는 단계를 더 포함한다.
본 명세서에 기술된 재조합 AAV를 생산하는 방법은 뚜렷한 이점을 제공한다. 본 발명의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, AAV를 생산하는 보다 전통적인 방법은 삼중 형질감염을 필요로 하며, 숙주 세포는 다음 세 가지의 개별 플라스미드로 형질감염된다: i) Rep 단백질 및 Cap 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 Rep-Cap 플라스미드; ii) 아데노바이러스의 단백질(E2a, E4) 및 VA RNA를 인코딩하는 유전자를 포함하는 헬퍼 플라스미드; 및 iii) 외래유전자 발현을 위한 AAV 구축물 플라스미드. 상기 재조합 AAV는 세포가 상술된 세 가지 플라스미드 모두가 성공적으로 형질감염된 경우(즉, 각 유전자가 흡수되어 세포의 핵으로 전달된 후 후속적으로 전사, 세포내에서 복제 및/또는 번역된 경우)에만 생산된다. 관련된 복잡성으로 인해 삼중 형질감염을 필요로 하는 이러한 방법은 낮은 수율, 고 비용 및/또는 더 노동 집약적인 결과를 야기할 수 있다.
이러한 접근법과 비교하여, 본 명세서에 제공된 재조합 AAV를 생산하는 방법은 재조합 AAV의 보다 높은 수율을 야기할 수 있다. 일부 측면에서, 삼중 형질감염을 필요로 하는 방법(즉, "대조 방법")과 비교하여, 본 발명에 의해 생산된 재조합 AAV의 양은 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100% 또는 그 이상 증가된다. 일부 측면에서, 대조 세포와 비교하여, 본 발명의 세포는 생산된 재조합 AAV의 양을 적어도 약 2배, 적어도 약 3배, 적어도 약 4배, 적어도 약 5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 7배, 적어도 약 8배, 적어도 약 9배, 적어도 약 10배, 적어도 약 15배, 적어도 약 20배, 적어도 약 25배, 적어도 약 30배, 적어도 약 35배, 적어도 약 40배, 적어도 약 45배, 적어도 약 50배, 적어도 약 75배, 또는 적어도 약 100배 이상 증가시킬 수 있다.
본 발명의 다른 곳에서 기술된 바와 같이, 일부 측면에서, 본 명세서에 제공된 재조합 AAV를 생산하는 방법은 생산 및/또는 정제 시간을 감소 시킬 수 있다. 추가적인 이점은 본 발명의 다른 곳에서 설명된다.
VIII.B. 단백질 생산 방법
외래유전자에 의해 인코딩되는 단백질(또는 폴리펩타이드)을 생산하는 방법이 본 명세서에 또한 개시된다. 일부 측면에서, 이러한 방법은 적합한 조건 하에서(예컨대, 외래유전자를 포함하는 재조합 AAV 전달체 벡터로 형질감염된) 본 발명의 세포를 배양하는 단계 및 인코딩된 단백질을 회수하는 단계를 포함한다. 특정 측면에서, 외래유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 생산하는 방법은 재조합 AAV를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
VIII.C. 치료 용도
일부 측면에서, 본 발명은 다양한 치료 적용을 위한 본 발명의 듀얼 헬퍼 플라스미드를 사용하여 생산된 재조합 AAV의 용도를 제공한다.
예를 들어, 일부 측면에서, 본 발명은 외래유전자를 포함하고 본 명세서에 기술된 바와 같이 생성된 재조합 AAV를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 제공된 질병을 치료하는 방법은 (예컨대, 외래유전자를 포함하는 재조합 AAV 유전자 전달체 벡터로 형질감염된) 본 명세서에 기술된 임의의 변형된 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 본 명세서에 제공된 질병을 치료하는 방법은 (예컨대, 본 명세서에 제공된 재조합 AAV를 포함하는) 본 명세서에 기재된 임의의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명으로부터 명백한 바와 같이, 상기 방법은 예컨대, 외래유전자를 변형시킴으로써 임의의 관심 질병을 치료 및/또는 예방하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 의해 예방, 완화 또는 치료되는 질병은 제한되지 않으며, 약물 투여 횟수를 줄여야 하는 모든 질병을 포함한다. 이러한 질병의 비제한적 예는 안과 질환 및 신경계 질환을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 안과질환은 당뇨병성 망막병증(diabetic retinopathy), 맥락막 신생혈관형성(choroidalneovascularization), 황반변성(macular degeneration), 망막변성(retinaldegeneration), 황반부종(macular edema), 망막부종(retinal edema) 및 황반 종양(mascular tumentia) 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 측면에서, 상기 신경계 질환은 중추신경계, 말초신경계 또는 둘 모두에 영향을 미치는 질환을 포함한다. 신경계 질환의 비제한적 예는 불안(anxiety), 우울증(depression), 외상 후 스트레스 장애(post-traumatic stress disorder, PTSD), 양극성 장애(bipolar disorder), 주의력 결핍 과잉 행동 장애(attention deficit hyperactivity disorder, ADHD), 자폐증(autism), 정신분열증(schizophrenia), 신경병성 통증(neuropathic pain), 녹내장(glaucoma), 중독증(toxicosis), 지주막 낭종(arachnoid cyst), 긴장증(catatonia), 뇌염(encephalitis), 간질/발작(epilepsy/seizure), 감금 증후군(locked-in syndrome), 수막염(meningitis), 편두통(migraine), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 척수병증(myelopathy), 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 헌팅턴병(Huntington's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 바텐병(Batten disease), 뚜렛 증후군(Tourette's syndrome), 외상성 뇌 손상(traumatic brain injury), 뇌척수 손상(cerebrospinal injury), 뇌졸중(stroke), 떨림(tremor)(본태성 또는 파킨슨병), 근긴장이상(dystonia), 지적 장애(intellectual disability), 뇌종양(brain tumor) 또는 이들의 조합을 포함한다.
본 발명의 일부 측면은 외래유전자의 연속적 발현을 달성할 수 있는 유전자 치료제 또는 질환을 치료하기 위해 이러한 제제를 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에 제공된 유전자 전달체 시스템(예컨대, 외래유전자를 포함하는 재조합 AAV)의 사용은 의사, 환자 또는 대상체의 편의를 위해 약물 투여 횟수를 상당히 감소시킬 수 있는 간격으로 치료제(예컨대, 외래유전자를 포함하는 재조합 AAV)의 투여를 허용한다. 예를 들어, 일부 측면에서, 치료제는 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 4개월, 약 5개월, 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월 또는 약 1년 이상의 간격으로 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 그 간격은 약 2 내지 약 3개월이다. 일부 측면에서 그 간격은 약 6개월이다. 일부 측면에서 그 간격은 약 1년이다. 일부 측면에서, 그 간격은 적어도 약 1년이다. 일부 측면에서, 환자의 증상에 따라 초기에는 약 1 내지 2주 간격으로 2 내지 3회 투여하고, 이후 약 2 내지 3개월, 약 6개월 또는 필요에 따라 약 1년 이상 간격으로 투여할 수 있다.
투여(예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 AAV, 세포 및/또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여) 단계를 포함하는 본 명세서에 제공된 임의의 방법에서, 치료제는 대상체에 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 치료제(예컨대, 본 명세서에 기재된 임의의 AAV, 세포 및/또는 약제학적 조성물)는 비경구적으로 대상체에 투여된다. 비경구 투여의 비제한적 예는 다음을 포함한다: 정맥 내 주입, 경피 투여, 피하 주입, 근육 내 주입, 유리체 내 주입(intravitreal injection), 망막 하 주입(subretinal injection), 맥락막위공간 주입(suprachoroidal injection), 점안 투여(eye drop administration), 뇌실 내 주입(intracerebroventricular injection), 척추강 내주입(intrathecal injection), 양막 내 주입(intraamniotic injection), 동맥 내 주입(intraarterial injection), 관절강 내 주입(intraarticular injection), 심장 내 주입(intracardiac injection), 음경해면체 내 주입(intracavernous injection), 뇌 내 주입(intracerebral injection), 뇌수조 주입(intracisternal injection), 관상 내 주입(intracoronary injection), 두개 내 주입(intracranial injection), 경막 내 주입(intradural injection), 경막 외 주입(epidural injection), 해마 내 주입(intrahippocampal injection), 비강 내 주입(intranasal injection), 골강 내 주입(intraosseous injection), 복강 내 주입(intraperitoneal injection), 흉강 내 주입(intrapleural injection), 척수 내 주입(intraspinal injection), 흉곽 내 주입(intrathoracic injection), 흉선 내 주입(intrathymic injection), 자궁 내 주입(intrauterine injection), 질 내 주입(intravaginal injection), 심실 내 주입(intraventricular injection), 방광내 주입(intravesical injection), 결막 하 주입(subconjunctival injection), 종양 내 주입(intratumoral injection), 국소 주입, 복강 주입(intraperitoneal injection) 및 이들의 조합 등.
당업자에게 자명한 바와 같이, 치료제(예컨대, 본 발명의 약제학적 조성물)의 적절한 투여 용량은 제형 방법, 투여 방식, 연령, 체중, 환자의 성별, 병리학적 상태 및 식이, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 민감도과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 일부 측면에서, 치료제(예컨대, 본 발명의 약제학적 조성물)의 1일 투여 용량은 약 0.00001-100 mg/kg이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 실시예에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실시예
재료 및 방법
실시예 1. 삼중 형질감염용 pUC-R2C2, 5, 8 및 9 구축물의 제조
실시예 1-1. pRC8 구축물 제조
pIDT-Cap8-Kan(Integrated DNA Technologies, USA)을 주형으로 oligo #001/002 조합을 이용해서 중합효소연쇄반응(이하 PCR)을 수행하여 cap8 유전자 단편을 확보하고, pRC6(Takara Bio, Japan)을 주형으로 oligo#003/004 조합을 이용해서 PCR을 수행하여 rep2 유전자를 포함하는 플라스미드 backbone DNA 단편을 확보하였으며, Gibson Assembly®(NEB, USA, Cat No. E2611)를 통해 두 DNA 단편을 연결하여 pRC8 구축물을 제조하였다.
실시예 1-2. pUC-R2C8 구축물 제조
pUC57-WPRE(GenScript, USA)를 주형으로 oligo #005/006 조합을 이용해서 PCR을 수행하여 플라스미드 backbone을 확보하고, 실시예 1-1의 pRC8 구축물을 주형으로 oligo #007/008을 이용해서 PCR을 수행하여 cap8 유전자 단편을, oligo #009/004을 이용해서 rep2 유전자 단편을 각각 확보하였고, Gibson Assembly®를 통해 위에서 얻은 세 DNA 단편을 연결하여 pUC-R2C8 구축물을 제조하였다.
실시예 1-3. pRC2 구축물 제조
pRC2-mi342(Takara Bio, Japan)를 주형으로 oligo #007/010 조합을 이용해서 PCR을 수행하여 cap2 유전자 단편을 확보하고, pRC6(Takara Bio, Japan)을 주형으로 oligo #003/004 조합을 이용해서 PCR을 수행하여 rep2 유전자를 포함하는 플라스미드 backbone 단편을 확보하였으며, Gibson Assembly®를 통해 두 DNA 단편을 연결하여 pRC2 구축물을 제조하였다.
실시예 1-4. pUC-R2C2 구축물 제조
실시예 1-2의 pUC-R2C8 구축물을 주형으로 oligo #011/012 조합을 이용해서 PCR을 수행하여 rep2 유전자를 포함하는 플라스미드 backbone 단편을 확보하였고, 실시예 1-3의 pRC2 구축물을 주형으로 oligo #013/014 조합을 이용해서 PCR을 수행하여 cap2 유전자 단편을 확보하였으며, Gibson Assembly®를 통해 두 DNA 단편을 연결하여 pUC-R2C2 구축물을 제조하였다.
실시예 1-5. pRC9 구축물 제조
pIDT-Cap9-Kan(Integrated DNA Technologies, USA)을 주형으로 oligo #001/015 조합을 이용해서 PCR을 수행하여 cap9 유전자 단편을 확보하고, pRC6 (Takara Bio, Japan)을 주형으로 oligo #003/004 조합을 이용해서 PCR을 수행하여 rep2 유전자를 포함하는 플라스미드 backbone 단편을 확보하였으며, Gibson Assembly® (NEB, USA, Cat No. E2611)를 통해 두 DNA 단편을 연결하여 pRC9 구축물을 제조하였다.
실시예 1-6. pUC-R2C9 구축물 제조
pUC57-WPRE(GenScript, USA)를 주형으로 oligo #005/006 조합을 이용해서 PCR을 수행하여 플라스미드 backbone을 확보하고, 실시예 1-5의 pRC9 구축물을 주형으로 oligo #007/008을 이용해서 PCR을 수행하여 cap9 유전자 단편을, 실시예 1-1의 pRC8을 주형으로 oligo #009/004을 이용해서 rep2 유전자 단편을 각각 확보하였고, Gibson Assembly®를 통해 위에서 얻은 세 DNA 단편을 연결하여 pUCR2C9 구축물을 제조하였다.
실시예 1-7. pUC-R2C5 구축물 제조
pUC57-WPRE(GenScript, USA)를 주형으로 oligo #005/006 조합을 이용해서 PCR을 수행하여 플라스미드 backbone을 확보하고, pRC5 구축물(TakaraBio, Japan)을 주형으로 oligo #008/009을 이용해서 PCR을 수행하여 rep2-cap5 유전자 단편을 확보하여, Gibson Assembly®를 통해 위에서 얻은 두 DNA 단편을 연결하여 pUC-R2C5 구축물을 제조하였다.
실시예 2. pHION8 시리즈 구축물의 제조
실시예 2-1. pHelper-NG 구축물 제조
VA-E4-pUC(GeneScript, USA)와 E2a-pUC57(GeneScript, USA)의 두 구축물의 공통적인 SalI/BamHI site로 두 구축물을 합치는 방법을 통해 클로닝을 진행하여 pHelper-NG를 제조하였다(도 1a). 상기 pHelper-NG는 아데노바이러스 혈청형5의 E2a, E4 및 VA RNA 유전자를 포함한다.
실시예 2-2. pHelper-NG 구축물의 다양한 위치에
rep2-cap8
유전자 삽입
실시예 2-2-1. pHION8-BamHI-정방향 또는 역방향(pHION8-BF 또는 -BR) 클로닝
실시예 1-2의 pUC-R2C8 구축물을 주형으로 oligo #016/017 조합을 이용해서 PCR을 수행하여 rep2-cap8 유전자 단편을 확보하고, 실시예 2-1에서 제조한 pHelper-NG의 BamHI site에 삽입하였다(도 1b 및 c). 도 1b는 pHION8-BF 구축물의 모식도로서, E2a 유전자의 시작 부분과 VA RNA 유전자의 끝부분 사이에 존재하는 BamHI site를 이용하여 rep2-cap8 유전자 단편을 시계방향인 정방향(시계방향, 5' -> 3')으로 삽입하여 상기 구축물을 제조하였다. 도 1c는 pHION8-BR 구축물의 모식도로서, E2a 유전자의 시작 부분과 VA RNA 유전자의 끝부분 사이에 존재하는 BamHI site를 이용하여 rep2-cap8 구축물을 반시계 방향인 역방향 (반시계 방향, 3'-> 5')으로 삽입하여 상기 구축물을 제조하였다. 상기 pHION8-BF는 pHNG8로, pHION8-BR은 pHNGR8로 명명하였다.
실시예 2-2-2. pHION8-NotI-정방향 또는 -역방향(pHION8-NF 또는 -NR) 클로닝
실시예 1-2의 pUC-R2C8 구축물을 주형으로 oligo #018/019 조합을 이용해서 PCR을 수행하여 rep2-cap8 유전자 단편을 확보하고, 실시예 2-1에서 제조한 pHelper-NG의 NotI site에 삽입하였다(도 1d 및 e). 도 1d는 pHION8-NF 구축물의 모식도로서, E4 유전자의 시작부분과 AmpR 유전자의 시작부분 사이에 존재하는 NotI site를 이용하여 rep2-cap8 유전자 단편을 시계 방향인 정방향으로 삽입하여 상기 구축물을 제조하였다. 도 1e는 pHION8-NR 구축물의 모식도로서, E4 유전자의 시작부분과 AmpR 유전자의 시작부분 사이에 존재하는 NotI site를 이용하여 rep2-cap8 유전자 단편을 반시계방향인 역방향으로 삽입하여 상기 구축물을 제조하였다.
실시예 2-2-3. pHION8-AsiSI-정방향(pHION8-AF) 클로닝
실시예 1-2의 pUC-R2C8 구축물을 주형으로 oligo #020/021 조합을 이용해서 PCR을 수행하여 rep2-cap8 유전자 단편을 확보하고, 실시예 2-1에서 제조한 pHelper-NG의 VA RNA 유전자와 E4 유전자 사이의 AsiSI site에 시계방향인 정방향으로 삽입하여 pHION8-AF 구축물을 제조하였다(도 1f).
실시예 3. pHNG2, pHNG5K 및 pHNG9 구축물 제조
실시예 3-1. pHNG2 구축물 제조
실시예 1-4의 pUC-R2C2 구축물을 주형으로 oligo #016/017을 이용해서 PCR을 수행하여 rep2-cap2 유전자 단편을 확보하고 실시예 2-1에서 제조한 pHelper-NG의 BamHI site에 삽입하여 제조한 구축물을 pHNG2라 명명하였다.
도 2는 pHNG2 구축물의 모식도로서, E2a 유전자와 VA RNA 유전자 사이에 존재하는 BamHI site를 이용하여 rep2-cap2 유전자 단편을 시계 방향인 정방향으로 삽입하여 pHNG2 구축물을 제조하였다.
실시예 3-2. pHNG9 구축물 제조
실시예 1-6의 pUC-R2C9 구축물을 주형으로 oligo #016/#017을 이용해서 PCR을 수행하여 rep2-cap2 유전자 단편을 확보하고, 실시예 2-1에서 제조한 pHelper-NG의 BamHI site에 삽입하여 제조한 구축물을 pHNG9이라 명명하였다. 도 3은 pHNG9 구축물의 모식도로서, rep2-cap9 유전자 단편을 E2a 유전자와 VA RNA 유전자 사이에 존재하는 BamHI site를 이용하여 시계방향인 정방향으로 삽입하여 pHNG9 구축물을 제조하였다.
실시예 3-3. pHNG5K 구축물 제조
실시예 3-3-1. pHelper-NG-Kan 구축물 제조
pMK-RQ-1-PM 구축물(Geneart, Thermo Fisher Scientific, USA)을 주형으로 oligo #018/019 조합을 이용해서 PCR을 수행하여 kanamycin 저항성 유전자 단편을 확보하고, 실시예 2-1의 pHelper-NG 구축물을 주형으로 oligo #020/021을 이용해서 PCR을 수행하여 E4 유전자 단편을 확보하고, oligo #022/023를 이용해서 PCR을수행하여 VA RNA 유전자에서 E2a 유전자의 N-단말 단편을 확보하고, oligo #024/025를 이용해서 PCR을 수행하여 E2a 유전자의 C-말단에서 Origin 단편을 확보하였다. Gibson Assembly®를 통해 상기 네 DNA 단편을 연결하여 pHelper-NG-Kan 구축물을 제조하였다.
실시예 3-3-2. pHelper-NG-Kan 구축물에
rep2-cap5
유전자 삽입
실시예 1-7의 pUC-R2C5 구축물을 주형으로 oligo #016, #017을 이용해서 PCR을 수행하여 rep2-cap5 유전자 단편을 확보하고 실시예 3-3-1에서 제조한 pHelper-NG-Kan의 BamHI site에 삽입하여 제조한 구축물을 pHNG5K라 명명하였다(K는 항생제 저항성 유전자로 kanamycin 저항성 유전자를 이용하였다는 의미). 도 4는 pHNG5K 구축물의 모식도로서, rep2-cap5 유전자 단편을 E2a 유전자와 VA RNA 유전자 사이에 존재하는 BamHI site를 이용하여 시계 방향인 정방향으로 삽입하여 pHNG5K 구축물을 제조하였다.
상기 구축물을 제조하기 위해 사용된 올리고의 서열은 표 1에 제시되어 있다:
| 올리고 ID(#) | 서열번호(#) | 서열(5' -> 3') |
| 001 | 1 | TGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAG |
| 002 | 2 | TAACAAGCAATTACAGATTACGGGTGAGGTAACGGG |
| 003 | 3 | TAATCTGTAATTGCTTGTTAATCAATAAACCGTTTAATTCGTTTCAG |
| 004 | 4 | TTTAAATCATTTATTGTTCAAAGATGCAGTCATCCAAATCCAC |
| 005 | 5 | ATTAACTACAAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCC |
| 006 | 6 | GCGGCTGCGCTTAAGCCAGCCCCGACACC |
| 007 | 7 | TGAACAATAAATGATTTAAATCAGGTATGGCTGCCG |
| 008 | 8 | GGAAACAGCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGC |
| 009 | 9 | GCTGGCTTAAGCGCAGCCGCCATG |
| 010 | 10 | TAACAAGCAATTACAGATTACGAGTCAGGTATCTGG |
| 011 | 11 | GGTCGCTGGGGACCTTAATC |
| 012 | 12 | CCATGGCTACGTAGATAAGTAGCATG |
| 013 | 13 | GATTAAGGTCCCCAGCGACC |
| 014 | 14 | ACTTATCTACGTAGCCATGGAAACTAGATAAGAAAGAAATACG |
| 015 | 15 | TAACAAGCAATTACAGATTACGAGTCAGGTATCTGGTGC |
| 016 | 16 | GGAAGATCTTTAAGCGCAGCCGCCATG |
| 017 | 17 | GGAAGATCTTGTAGTTAATGATTAACCCGCCATGC |
| 018 | 18 | GGCACTTTTCGGGGAAATGTG |
| 019 | 19 | CAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAG |
| 020 | 20 | ATGATACCCTTGCGAATTTATCCACC |
| 021 | 21 | CACATTTCCCCGAAAAGTGCC |
| 022 | 22 | GGTGGATAAATTCGCAAGGGTATCAT |
| 023 | 23 | ACCTATCACATCTTTTTCCAAAACTGC |
| 024 | 24 | GCAGTTTTGGAAAAAGATGTGATAGGT |
| 025 | 25 | CTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTG |
| 026 | 26 | GCCAGCCATCTGTTGT |
| 027 | 27 | GGAGTGGCACCTTCCA |
| 028 | 28 | FAM-TCCCCCGTGCCTTCCTTGACC-BHQ1 |
또한, rep-cap 유전자 단편을 E2a 유전자와 VA RNA 유전자 사이에 순방향(시계 방향, 5'->3')으로 삽입하여 제조한 구축물을 총칭하여 pHNG(pHNG2, pHNG5(pHNG5K 포함), pHNG8, pHNG9 등)이라 명명하고, 반대 방향(반시계 방향, 3'->5')으로 삽입하여 제조한 구축물를 총칭하여 pHNGR(pHNGR8 등)이라 명명하였다. 이들의 개열 지도는 도 5a 및 도 5b에 도시되어 있다.
실시예 4. 외래유전자를 포함하는 AAV 구축물 플라스미드의 제조
외래유전자를 포함하는 AAV 구축물 플라스미드는 대한민국 특허출원 제10-2020-0084038호에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 구체적으로, pUC57 플라스미드를 기반으로, AAV 캡시드 packaging에 필요한 요소인 AAV2 ITR 염기서열이 양쪽 말단에 존재하고 그 사이에 CMV 인핸서, chicken β-actin 프로모터, 하이브리드 인트론, 외래유전자로서 eGFP 유전자, WPRE 서열, 네 반복의 miR142-3p 타겟 서열, 소 성장 호르몬(bovine growth hormone)의 pA 서열이 포함되어 있는 형태로 제조하였다.
실시예 5. 염기서열의 확인
상기에서 제조한 모든 구축물의 염기서열을 염기서열분석(DNA sequencing)(Bionics, Korea)을 통해 확인하였다.
실시예 6. 세포 배양
HEK293 세포주는 10% FBS(Fetal Bovine Serum, Gibco, USA, CatNo. 16000-044), 1% penicillin-streptomycin(Gioco, USA, Cat No. 15140-163)이 포함된 MEM 배지(Gibco, USA, Cat No. 42360-032)를 이용하여 5% CO2, 37℃ 조건으로 습윤 배양하였다. Expi293 세포주는 1% penicillin-streptomycin이 첨가된 Expi293 배지(Gibco, USA, Cat. No. A14351-01)를 이용하여 8% CO2, 37℃ 조건으로 250 rpm으로 흔들며 습윤 배양하였다.
실시예 7. 형질감염
실시예 7-1. AAV 생산을 위한 부착세포의 형질감염
형질감염을 위해, HEK293세포주를 DPBS(Gibco, USA, Cat No.14190-250)를 이용해 2회 세척 후 Trypsin-EDTA(Gibco, USA, Cat No. 25200-114)를 처리하여 배양 접시에서 떼어내어 확보한 뒤 150 mm 배양접시에 2 x 107cell/dish로 접종하였다. 24시간 배양 후, 삼중 형질감염(triple transfection)시에는 각각 3.73 pmole의 pHelper-NG 플라스미드와 pUC-R2C2 또는 pUC-R2C8, 또는 pUC-R2C9 플라스미드 및 외래 유전자를 포함한 AAV 구축물 플라스미드를 500 ul의 Opti-MEM(Gibco, USA, Cat No. 51985-034)에 녹여주었다. 이중 형질감염(double transfection) 시에는 각각 3.73 pmole의 pHION8 플라스미드, 외부 유전자를 포함한 AAV 구축물 플라스미드를 500 ul의 Opti-MEM (Gibco, USA, Cat No.51985-034)에 녹여주었다. 그리고, DNA 총량의 두배의 폴리에틸렌이민(PEI,Polyscience, USA, Cat No. 23966-1)를 500 ul의 Opti-MEM에 희석시킨 후, 즉시 두개의 용액을 섞어 형질감염 용액을 제조하였다. 상온에서 30분간 반응시킨 후 배양 플라스크로 총 1 ml의 형질감염 용액을 HEK293세포를 배양하던 배양접시에 넣어주었다.
실시예 7-2. AAV 생산을 위한 부유세포의 형질감염
AAV 생산을 위하여, 1L 엘렌마이어(Erlenmeyer) 배양 플라스크에 6x 108 세포를 220 ml의 Expi293 배지에 접종하였다. 안정화를 위해 약 3 내지 4시간 배양 후, 삼중 형질감염(triple transfection) 시에는 각각 3.73 pmole의 pHelper-NG 플라스미드, pUC-R2C2 또는 pUC-R2C8, 또는 pUC-R2C9 플라스미드, 및 외래 유전자를 포함한 AAV 구축물 플라스미드를 10 ml의 Opti-MEM(Gibco, USA,Cat No. 51985-034)에 녹여주었다. 이중 형질감염(double transfection) 시에는 각각 3.73 pmole의 pHION8 플라스미드 또는 pHNG2 플라스미드, pHNG9 플라스미드와 외부 유전자를 포함한 AAV 구축물 플라스미드를 10 ml의 Opti-MEM(Gibco, USA, Cat No. 51985-034)에 녹여주었다. 그리고 DNA 총량의 두배의 폴리에틸렌이민(PEI, Polyscience, USA, Cat No. 23966-1)를 10 ml의 Opti-MEM에 희석시킨 후, 즉시 두 개의 용액을 섞어 형질감염 용액을 제조하였다. 상온에서 30분간 반응시킨 후 배양 플라스크로 총 20 ml의 형질감염 용액을 넣어주었다.
실시예 8. AAV의 정제
실시예 7-1 또는 7-2의 형질감염 72시간 후, 배양접시 및 배양 플라스크에 500 mM의 농도가 되도록 NaCl을 첨가하여 3시간 동안 반응시켰다. 모든 배양액을 수거하여 원심분리로 잔해물(debris)를 제거하고, 100 kDa의 분획 분자량(molecular weight cut-off) 기공 크기를 가진 centricon(VIVASPIN 20,100,000MWCO PES, Sartorius, Germany)을 이용하여 4℃에서 4000 rpm으로 상층액이 약 200 ul 남을 때까지 원심분리를 진행하였다. 이후, 재조합 아데노부속바이러스 벡터를 포함하고 있는 상층액을 수거하여 실험에 사용 또는 -80℃에 보관하였다.
실시예 9. AAV 역가의 결정
실시예 8에서 정제한 AAV의 역가를 결정하기 위하여 qPCR(Bio-Rad, USA, CFX96)을 수행하였다. DNaseI 반응 완충액(New England Biolab, USA,M0303S)에서 1시간 동안 37℃로 AAV에 DNaseI을 처리하였다. 이후 DNaseI이 처리된 시료에 proteinase K(Invitrogen, USA, Cat No. AM2548)를 55℃에서 30분간 처리하고, 이후 95℃에서 15분간 반응시켜 proteinase K를 불활성화 시켰다. 준비된 시료들을 qPCR의 주형으로 사용하고, AAV 구축물 플라스미드(7.4 x 108 내지 7.4 x 104, 10-배 희석)를 사용하여 표준 곡선을 구했고, 양성 대조군으로 재조합 아데노부속바이러스 2 Reference Standard Stock(rAAV2-RSS, ATCC, USA, CatNo. VR-1616) 또는 재조합 아데노부속바이러스 8 Reference Standard Stock(rAAV8-RSS, ATCC, USA, Cat No. VR-1816)을 사용하였다. 역가 결정을 위한 qPCR을 위해, 2xSsoAdvanced Universal Probe Supermix(Bio-Rad, USA,Cat No. 172-5282)와 bGH poly A 서열 특이적 프라이머(#026, #027) 및 프로브(#028)를 사용하였다. qPCR은 95℃에서 10 분 변성(denaturation) 후, 95℃에서 30초, 60℃에서 1분을 40회 반복하였다. 표준곡선과 정량은 Bio-Rad CFXMaestro 1.1 software(Bio-Rad, USA)를 이용하여 분석하였다.
실시예 10. 시험관 내 아데노부속바이러스 벡터를 이용한 형질감염
아데노부속바이러스 벡터의 형질감염을 위하여, 24-well 배양 플레이트에 well당 4 x 105의 HEK293 세포를 접종하였다. 24시간 후, 각 well에 MG132(Sigma-Aldrich, USA, Cat No. M7449)를 5 uM의 농도로 8시간 동안 처리하였다. AAV2의 경우에는 2,500 MOI(Multiplicity of Infection)로, AAV8 및 AAV9의 경우에는 10,000 MOI로 처리하고, 72시간 동안 배양하였다.
실시예 11. 유세포 분석법을 통한 eGFP 유전자의 발현 강도 측정
eGFP의 발현은 유세포분석(Beckman Coulter, USA, CytoFlex)을 통해 측정하였다. 형질감염 72시간 후 DPBS로 세포를 세척하고 트립신으로 떼어내었다. 1500 rpm으로 5분간 원심분리하여 세포를 확보하고 2% FBS가 첨가된 DPBS를 500 ul 첨가하여 세포를 재현탁하였다. 유세포분석에 있어서, FSC vs SSCplot을 통하여 단일 세포 영역을 구분 지었고, 그 중에서 FL1-A(green)를 측정하였다. 모든 유세포분석 결과는 FlowJo software 10.5.3(Becton Dickinson & Company, USA)를 이용하여 분석하였다.
실시예 12. 통계적 분석
모든 실험은 3회 이상 반복하였다. 두 그룹 간의 비교는 Prism software 8.1.1(GraphPad Software, Inc., USA)을 사용하여 Student's t-test로, 세 그룹 이상의 비교는 one-way ANOVA와 Tukey's multiple comparisons test로 비교하였다. *는 p < 0.05, **는 p < 0.01, ***는 p < 0.001을 나타낸다.
실험 결과
1. 증가된 AAV8 생산량 증가를 보이는 헬퍼-인-원(Helper-In-One) 플라스미드 구축물 선정
1-1. 부착세포주(HEK293)에서 삼중 형질감염과 pHION8 시리즈를 이용한 이중 형질감염에 따른 AAV8 생산량 증가 또는 감소 효과 관찰
이중 형질감염에 사용되는 5가지 Helper-In-One 플라스미드 구축물(pHION8 시리즈; pHION8-BF, pHION8-BR, pHION8-NF, pHION8-NR 및 pHION8-AF) 내의 다양한 rep2-cap8 유전자의 위치가 AAV8 생산량에 미치는 영향을 부착세포주(HEK293)에서 테스트하였다. 삼중 형질감염 방법에 의한 AAV8의 생산량을 100%로 보았을 때, 이중 형질감염 시에는 rep2-cap8 유전자의 위치에 따라 AAV 생산량에 있어 다양한 결과를 얻었다. pHION8-BF 구축물(pHNG8)을 사용한 경우 244.3%, pHION8-BR 구축물(pHNGR8)을 사용한 경우 170.2%로 AAV8 생산량이 증가되었다. pHION8-NF 구축물을 사용한 경우 126.0%의 생산량 증가가 보이지만, 이는 통계적으로 유의하지 않았다(p=0.82). 반면에 pHION8-NR 및 pHION8-AF 구축물을 사용한 경우 AAV8의 생산량이 오히려 감소하였다(62.4% (p=0.50),71.7% (p=0.77))(도6).
1-2. 부유세포주(Expi293)에서 삼중 형질감염과 pHION8 시리즈를 이용한 이중 형질감염에 따른 AAV8 생산량 증가 또는 감소 효과
위의 실험결과 1-1과 동일한 실험을 부유세포 (Expi293F)에서 테스트하였다. 이전 부착세포주와 유사하게, 이중 형질감염 시 pHION8-BF 구축물을 사용한 경우는 삼중 형질감염 방법에 비해 177.1%(p<0.001), pHION8-BR 구축물을 사용한 경우는 173.1%(p<0.001)로 AAV8 생산량이 통계적으로 유의미하게 증가되었다. 하지만, pHION8-NF, pHION8-NR 및 pHION8-AF 등의 구축물을 사용한 경우 40.9%, 66.7%, 43.1% 수준으로 생산량 감소가 통계적으로 유의하게 확인되었다(도7).
상기 결과들은 듀얼 헬퍼 플라스미드 내에서의 rep2-cap8 유전자의 상대적 위치 및 방향에 따라 AAV의 생산량이 결정될 수 있음을 제시한다. 이후, 이중 형질감염을 위한 pHION 플라스미드 내 BamHI site에 정방향(BF)으로 rep2-cap 유전자가 존재하는 구축물을 pHNG라고 명명하였으며, 역방향(BR)으로 존재하는 구축물을 pHNGR이라고 명명하였다. 그 뒤에는 cap 유전자가 유래한 아데노부속바이러스의 혈청형을 숫자로 표기하였다 (pHION8-BF = pHNG8, pHION8-BR = pHNGR8).
2. 부착세포주(HEK293)에서 삼중 형질감염과 pHNG2를 이용한 이중 형질감염에 따른 AAV2 생산량 증가
pHelper-NG 플라스미드 내의 E2a 유전자의 시작 부분과 VA RNA 유전자의 끝부분 사이에 존재하는 BamHI site를 이용하여 rep2-cap2 유전자 단편을 정방향으로 삽입하여 pHNG2 구축물을 제조하였고 이를 이중 형질감염(double transfection) 방법에 사용하였다(도 2).
삼중 형질감염법과 pHNG2를 이용한 이중 형질감염법에 의한 AAV2의 생산을 비교한 결과, 삼중 형질감염에 비하여 이중 형질감염법에서 AAV2 생산량이 279.6%(p<0.001)로 유의하게 증가됨을 확인하였다(도 8). 이러한 결과는 앞서 pHNG8에 의한 이중 형질감염에 의한 AAV8 생산량 증가와 유사하게, rep2-cap2 유전자를 E2a 유전자의 시작 부분과 VA RNA 유전자의 끝부분 사이에 위치시키면 이중 형질감염에 의해 AAV2의 생산량을 증가시킬 수 있음을 제시한다.
3. 부착세포주(HEK293)에서 pHNG9을 이용한 이중 형질감염에 의한 AAV9 생산량 증가
이중 형질감염(double transfection)을 위하여 rep2-cap9 유전자 단편을 E2a 유전자의 시작 부분과 VA RNA 유전자의 끝부분 사이에 존재하는 BamHI site를 이용하여 정방향으로 클로닝을 통해 pHNG9 구축물을 제조하였다(도 3).
삼중 형질감염과 pHNG9를 이용한 이중 형질감염에 의한 AAV9의 생산을 비교한 결과, 삼중 형질감염에 비하여 이중 형질감염에서 AAV9 생산량이 214.0%(p<0.001)으로 유의하게 증가됨을 확인하였다 (도 9). 이러한 결과는 앞서 pHNG8 및 pHNG2에 의한 이중 형질감염에 의한 AAV8 또는 AAV2 생산량 증가와 유사하였다. 결론적으로, 이 결과는 아데노부속바이러스의 혈청형9(AAV9)에서도 rep2-cap9 유전자를 E2a 유전자의 시작 부분과 VA RNA 유전자의 끝부분 사이에 위치시키면 이중 형질감염법에 의한 AAV의 생산량을 증가시킬 수 있음을 제시한다.
4. 부착세포주(HEK293)에서 pHNG5K를 이용한 이중 형질감염에 의한 AAV5 생산량 증가
이중 형질감염(double transfection)을 위하여 Rep2-Cap5 유전자 단편을 E2a 유전자의 시작 부분과 VA RNA 유전자의 끝부분 사이에 존재하는 BamHIsite를 이용하여 정방향으로 클로닝을 통해 pHNG5K 구축물을 제조하였다(도 4).
삼중 형질감염과 pHNG5K를 이용한 이중 형질감염에 의한 AAV5의 생산을 비교한 결과, 삼중 형질감염에 비하여 이중 형질감염에서 AAV5 생산량이 194.7%(p=0.002)으로 유의하게 증가됨을 확인하였다(도 10). 이러한 결과는 앞서 pHNG8, pHNG2 및 pHNG9에 의한 이중 형질감염에 의한 AAV8, AAV2 또는 AAV9 생산량 증가와 유사하였다.
결론적으로, 이 결과는 아데노부속바이러스의 혈청형5(AAV5)에서도 rep2-cap5 유전자를 E2a 유전자의 시작 부분과 VA RNA 유전자의 끝부분 사이에 위치시키면 이중 형질감염법에 의한 AAV의 생산량을 증가시킬 수 있음을 제시한다.
5. 삼중 형질감염 또는 이중 형질감염(pHNG8 또는 pHNGR8 구축물)으로 생산한 AAV8 들간의 세포 형질도입(transduction) 효율의 동등성
삼중 형질감염을 통해 생산한 AAV8과 pHNG8 및 pHNGR8을 이용한 이중 형질감염을 통해 생산한 AAV8들간의 세포감염력 및 유전자 발현 능력을 비교하였다. 제작한 AAV8들은 eGFP 단백질을 발현하도록 설계하였다. HEK293 세포주에 10,000 MOI의 조건으로 AAV8을 감염시켰고, 72시간 후 유세포분석을 통하여 세포 내 eGFP의 발현 정도를 측정하였다. 그 결과, 삼중 형질감염을 통한 AAV8과 비교했을 때 pHNG8 및 pHNGR8을 이용한 이중 형질감염에 의해 생산된 AAV8 모두 비슷한 세포감염력(Triple: 6.0%, pHNG8: 5.4%, pHNGR8: 5.7%)을 보였고, 또한 감염된 세포내에서 eGFP 발현 수준도 유사함(pHNG8: 93.4%, pHNGR8: 94.6%)을 확인하였다. 이상의 결과는 삼중 형질감염을 통해 생산된 AAV8과 pHNG8 및 pHNGR8을 이용한 이중 형질감염을 통해 생산한 AAV8의 세포 감염력 및 감염 후 유전자 발현 능력에는 차이가 없음을 제시한다(도 11).
6. 삼중 형질감염 또는 이중 형질감염(pHNG2)으로 생산한 AAV2 형질도입(transduction) 효율의 동등성
AAV2를 이용하여 유전자를 전달하는 경우에 있어 삼중 형질감염을 통해 생산한 AAV2와 pHNG2를 이용한 이중 형질감염을 통해 생산한 AAV2의 세포 감염력 및 유전자 발현 능력을 비교하였다. 제작한 AAV2들은 eGFP 단백질을 발현하도록 설계하였다. HEK293 세포주에 2,500 MOI의 조건으로 AAV2를 감염시켰고, 72시간 후 유세포분석을 통하여 eGFP를 발현하는 세포의 비율 및 세포내 eGFP의 발현 정도를 측정하였다. 그 결과, 삼중 형질감염을 통한 AAV2와 비교했을 때 pHNG2를 이용한 이중 형질감염에 의해 생산된 AAV2는 세포 감염 능력이 최소한 동등하였으며(Triple: 32.0%, BF: 44.7%; p=0.38), 감염된 세포당 eGFP 발현수준이 동등하거나 약간 더 높음을(129.6%, p=0.02)을 확인하였다. 다만 두 경우 모두 통계적으로 유의미한 차이는 보이지 않았다. 이상의 결과는 삼중 형질감염을 통해 생산된 AAV2 대비 pHNG2를 이용한 이중 형질감염을 통해 생산한 AAV2의 세포 감염력 및 감염 후 유전자 발현 능력이 최소 동등함을 제시한다(도 12).
7. 삼중 형질감염 또는 이중 형질감염(pHNG9)으로 생산한 AAV9 형질도입 (transduction) 효율의 동등성
AAV9을 이용하여 유전자를 전달하는 경우에 삼중 형질감염을 통해 생산한 AAV9과 pHNG9을 이용한 이중 형질감염을 통해 생산한 AAV9의 세포 감염력 및 유전자 발현 능력을 비교하였다. 제작한 AAV9들은 eGFP 단백질을 발현하도록 설계하였다. HEK293 세포주에 10,000 MOI의 조건으로 AAV9을 감염시켰고, 72시간 후 유세포분석을 통하여 세포 내 eGFP의 발현 정도를 측정하였다. 그 결과, 삼중 형질감염을 통한 AAV9과 비교했을 때 pHNG9을 이용한 이중 형질감염에 의해 생산된 AAV9은 유사한 eGFP 발현 수준을 나타내는 것(90.9%, p=0.35)을 확인하였다. 이상의 결과는 삼중 형질감염을 통해 생산된 AAV9과 pHNG9을 이용한 이중 형질감염을 통해 생산한 AAV9의 세포 감염력 및 유전자 발현 능력에는 차이가 없음을 제시한다(도 13).
이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.
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<400> 29
atgccggggt tttacgagat tgtgattaag gtccccagcg accttgacga gcatctgccc 60
ggcatttctg acagctttgt gaactgggtg gccgagaagg aatgggagtt gccgccagat 120
tctgacatgg atctgaatct gattgagcag gcacccctga ccgtggccga gaagctgcag 180
cgcgactttc tgacggaatg gcgccgtgtg agtaaggccc cggaggccct tttctttgtg 240
caatttgaga agggagagag ctacttccac atgcacgtgc tcgtggaaac caccggggtg 300
aaatccatgg ttttgggacg tttcctgagt cagattcgcg aaaaactgat tcagagaatt 360
taccgcggga tcgagccgac tttgccaaac tggttcgcgg tcacaaagac cagaaatggc 420
gccggaggcg ggaacaaggt ggtggatgag tgctacatcc ccaattactt gctccccaaa 480
acccagcctg agctccagtg ggcgtggact aatatggaac agtatttaag cgcctgtttg 540
aatctcacgg agcgtaaacg gttggtggcg cagcatctga cgcacgtgtc gcagacgcag 600
gagcagaaca aagagaatca gaatcccaat tctgatgcgc cggtgatcag atcaaaaact 660
tcagccaggt acatggagct ggtcgggtgg ctcgtggaca aggggattac ctcggagaag 720
cagtggatcc aggaggacca ggcctcatac atctccttca atgcggcctc caactcgcgg 780
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cccgactacc tggtgggcca gcagcccgtg gaggacattt ccagcaatcg gatttataaa 900
attttggaac taaacgggta cgatccccaa tatgcggctt ccgtctttct gggatgggcc 960
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accaacatcg cggaggccat agcccacact gtgcccttct acgggtgcgt aaactggacc 1080
aatgagaact ttcccttcaa cgactgtgtc gacaagatgg tgatctggtg ggaggagggg 1140
aagatgaccg ccaaggtcgt ggagtcggcc aaagccattc tcggaggaag caaggtgcgc 1200
gtggaccaga aatgcaagtc ctcggcccag atagacccga ctcccgtgat cgtcacctcc 1260
aacaccaaca tgtgcgccgt gattgacggg aactcaacga ccttcgaaca ccagcagccg 1320
ttgcaagacc ggatgttcaa atttgaactc acccgccgtc tggatcatga ctttgggaag 1380
gtcaccaagc aggaagtcaa agactttttc cggtgggcaa aggatcacgt ggttgaggtg 1440
gagcatgaat tctacgtcaa aaagggtgga gccaagaaaa gacccgcccc cagtgacgca 1500
gatataagtg agcccaaacg ggtgcgcgag tcagttgcgc agccatcgac gtcagacgcg 1560
gaagcttcga tcaactacgc agacaggtac caaaacaaat gttctcgtca cgtgggcatg 1620
aatctgatgc tgtttccctg cagacaatgc gagagaatga atcagaattc aaatatctgc 1680
ttcactcacg gacagaaaga ctgtttagag tgctttcccg tgtcagaatc tcaacccgtt 1740
tctgtcgtca aaaaggcgta tcagaaactg tgctacattc atcatatcat gggaaaggtg 1800
ccagacgctt gcactgcctg cgatctggtc aatgtggatt tggatgactg catctttgaa 1860
caataa 1866
<210> 30
<211> 2208
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cap2 gene
<400> 30
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca ctctctctga aggaataaga 60
cagtggtgga agctcaaacc tggcccacca ccaccaaagc ccgcagagcg gcataaggac 120
gacagcaggg gtcttgtgct tcctgggtac aagtacctcg gacccttcaa cggactcgac 180
aagggagagc cggtcaacga ggcagacgcc gcggccctcg agcacgacaa agcctacgac 240
cggcagctcg acagcggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgcggagttt 300
caggagcgcc ttaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcggacgagc agtcttccag 360
gcgaaaaaga gggttcttga acctctgggc ctggttgagg aacctgttaa gacggctccg 420
ggaaaaaaga ggccggtaga gcactctcct gtggagccag actcctcctc gggaaccgga 480
aaggcgggcc agcagcctgc aagaaaaaga ttgaattttg gtcagactgg agacgcagac 540
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tccagccaat caggagcctc gaacgacaat cactactttg gctacagcac cccttggggg 840
tattttgact tcaacagatt ccactgccac ttttcaccac gtgactggca aagactcatc 900
aacaacaact ggggattccg acccaagaga ctcaacttca agctctttaa cattcaagtc 960
aaagaggtca cgcagaatga cggtacgacg acgattgcca ataaccttac cagcacggtt 1020
caggtgttta ctgactcgga gtaccagctc ccgtacgtcc tcggctcggc gcatcaagga 1080
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cagatgctgc gtaccggaaa caactttacc ttcagctaca cttttgagga cgttcctttc 1260
cacagcagct acgctcacag ccagagtctg gaccgtctca tgaatcctct catcgaccag 1320
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ccctgttacc gccagcagcg agtatcaaag acatctgcgg ataacaacaa cagtgaatac 1500
tcgtggactg gagctaccaa gtaccacctc aatggcagag actctctggt gaatccgggc 1560
ccggccatgg caagccacaa ggacgatgaa gaaaagtttt ttcctcagag cggggttctc 1620
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cttccaggca tggtctggca ggacagagat gtgtaccttc aggggcccat ctgggcaaag 1860
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caccctcctc cacagattct catcaagaac accccggtac ctgcgaatcc ttcgaccacc 1980
ttcagtgcgg caaagtttgc ttccttcatc acacagtact ccacgggaca ggtcagcgtg 2040
gagatcgagt gggagctgca gaaggaaaac agcaaacgct ggaatcccga aattcagtac 2100
acttccaact acaacaagtc tgttaatgtg gactttactg tggacactaa tggcgtgtat 2160
tcagagcctc gccccattgg caccagatac ctgactcgta atctgtaa 2208
<210> 31
<211> 2175
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cap5 gene
<400> 31
atgtcttttg ttgatcaccc tccagattgg ttggaagaag ttggtgaagg tcttcgcgag 60
tttttgggcc ttgaagcggg cccaccgaaa ccaaaaccca atcagcagca tcaagatcaa 120
gcccgtggtc ttgtgctgcc tggttataac tatctcggac ccggaaacgg tctcgatcga 180
ggagagcctg tcaacagggc agacgaggtc gcgcgagagc acgacatctc gtacaacgag 240
cagcttgagg cgggagacaa cccctacctc aagtacaacc acgcggacgc cgagtttcag 300
gagaagctcg ccgacgacac atccttcggg ggaaacctcg gaaaggcagt ctttcaggcc 360
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agctacaaca accaccagta ccgagagatc aaaagcggct ccgtcgacgg aagcaacgcc 780
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cactggagcc cccgagactg gcaaagactc atcaacaact actggggctt cagaccccgg 900
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accaccatcg ccaacaacct cacctccacc gtccaagtgt ttacggacga cgactaccag 1020
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agttaccagg tgcccccgca gccgaacggc atgaccaaca acctccaggg cagcaacacc 1560
tatgccctgg agaacactat gatcttcaac agccagccgg cgaacccggg caccaccgcc 1620
acgtacctcg agggcaacat gctcatcacc agcgagagcg agacgcagcc ggtgaaccgc 1680
gtggcgtaca acgtcggcgg gcagatggcc accaacaacc agagctccac cactgccccc 1740
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acgcctgtgc ccggaaatat caccagcttc tcggacgtgc ccgtcagcag cttcatcacc 1980
cagtacagca ccgggcaggt caccgtggag atggagtggg agctcaagaa ggaaaactcc 2040
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tttgccccgg acagcaccgg ggaatacaga accaccagac ctatcggaac ccgatacctt 2160
acccgacccc tttaa 2175
<210> 32
<211> 2217
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cap8 gene
<400> 32
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca acctctctga gggcattcgc 60
gagtggtggg cgctgaaacc tggagccccg aagcccaaag ccaaccagca aaagcaggac 120
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aagggggagc ccgtcaacgc ggcggacgca gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240
cagcagctgc aggcgggtga caatccgtac ctgcggtata accacgccga cgccgagttt 300
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gccaagaagc gggttctcga acctctcggt ctggttgagg aaggcgctaa gacggctcct 420
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gagtcagttc cagaccctca acctctcgga gaacctccag cagcgccctc tggtgtggga 600
cctaatacaa tggctgcagg cggtggcgca ccaatggcag acaataacga aggcgccgac 660
ggagtgggta gttcctcggg aaattggcat tgcgattcca catggctggg cgacagagtc 720
atcaccacca gcacccgaac ctgggccctg cccacctaca acaaccacct ctacaagcaa 780
atctccaacg ggacatcggg aggagccacc aacgacaaca cctacttcgg ctacagcacc 840
ccctgggggt attttgactt taacagattc cactgccact tttcaccacg tgactggcag 900
cgactcatca acaacaactg gggattccgg cccaagagac tcagcttcaa gctcttcaac 960
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gtgcctttcc acagcagcta cgcccacagc cagagcttgg accggctgat gaatcctctg 1320
attgaccagt acctgtacta cttgtctcgg actcaaacaa caggaggcac ggcaaatacg 1380
cagactctgg gcttcagcca aggtgggcct aatacaatgg ccaatcaggc aaagaactgg 1440
ctgccaggac cctgttaccg ccaacaacgc gtctcaacga caaccgggca aaacaacaat 1500
agcaactttg cctggactgc tgggaccaaa taccatctga atggaagaaa ttcattggct 1560
aatcctggca tcgctatggc aacacacaaa gacgacgagg agcgtttttt tcccagtaac 1620
gggatcctga tttttggcaa acaaaatgct gccagagaca atgcggatta cagcgatgtc 1680
atgctcacca gcgaggaaga aatcaaaacc actaaccctg tggctacaga ggaatacggt 1740
atcgtggcag ataacttgca gcagcaaaac acggctcctc aaattggaac tgtcaacagc 1800
cagggggcct tacccggtat ggtctggcag aaccgggacg tgtacctgca gggtcccatc 1860
tgggccaaga ttcctcacac ggacggcaac ttccacccgt ctccgctgat gggcggcttt 1920
ggcctgaaac atcctccgcc tcagatcctg atcaagaaca cgcctgtacc tgcggatcct 1980
ccgaccacct tcaaccagtc aaagctgaac tctttcatca cgcaatacag caccggacag 2040
gtcagcgtgg aaattgaatg ggagctgcag aaggaaaaca gcaagcgctg gaaccccgag 2100
atccagtaca cctccaacta ctacaaatct acaagtgtgg actttgctgt taatacagaa 2160
ggcgtgtact ctgaaccccg ccccattggc acccgttacc tcacccgtaa tctgtaa 2217
<210> 33
<211> 2211
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cap9 gene
<400> 33
atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca accttagtga aggaattcgc 60
gagtggtggg ctttgaaacc tggagcccct caacccaagg caaatcaaca acatcaagac 120
aacgctcgag gtcttgtgct tccgggttac aaataccttg gacccggcaa cggactcgac 180
aagggggagc cggtcaacgc agcagacgcg gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240
cagcagctca aggccggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgccgagttc 300
caggagcggc tcaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360
gccaaaaaga ggcttcttga acctcttggt ctggttgagg aagcggctaa gacggctcct 420
ggaaagaaga ggcctgtaga gcagtctcct caggaaccgg actcctccgc gggtattggc 480
aaatcgggtg cacagcccgc taaaaagaga ctcaatttcg gtcagactgg cgacacagag 540
tcagtcccag accctcaacc aatcggagaa cctcccgcag ccccctcagg tgtgggatct 600
cttacaatgg cttcaggtgg tggcgcacca gtggcagaca ataacgaagg tgccgatgga 660
gtgggtagtt cctcgggaaa ttggcattgc gattcccaat ggctggggga cagagtcatc 720
accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca atcacctcta caagcaaatc 780
tccaacagca catctggagg atcttcaaat gacaacgcct acttcggcta cagcaccccc 840
tgggggtatt ttgacttcaa cagattccac tgccacttct caccacgtga ctggcagcga 900
ctcatcaaca acaactgggg attccggcct aagcgactca acttcaagct cttcaacatt 960
caggtcaaag aggttacgga caacaatgga gtcaagacca tcgccaataa ccttaccagc 1020
acggtccagg tcttcacgga ctcagactat cagctcccgt acgtgctcgg gtcggctcac 1080
gagggctgcc tcccgccgtt cccagcggac gttttcatga ttcctcagta cgggtatctg 1140
acgcttaatg atggaagcca ggccgtgggt cgttcgtcct tttactgcct ggaatatttc 1200
ccgtcgcaaa tgctaagaac gggtaacaac ttccagttca gctacgagtt tgagaacgta 1260
cctttccata gcagctacgc tcacagccaa agcctggacc gactaatgaa tccactcatc 1320
gaccaatact tgtactatct ctcaaagact attaacggtt ctggacagaa tcaacaaacg 1380
ctaaaattca gtgtggccgg acccagcaac atggctgtcc agggaagaaa ctacatacct 1440
ggacccagct accgacaaca acgtgtctca accactgtga ctcaaaacaa caacagcgaa 1500
tttgcttggc ctggagcttc ttcttgggct ctcaatggac gtaatagctt gatgaatcct 1560
ggacctgcta tggccagcca caaagaagga gaggaccgtt tctttccttt gtctggatct 1620
ttaatttttg gcaaacaagg aactggaaga gacaacgtgg atgcggacaa agtcatgata 1680
accaacgaag aagaaattaa aactactaac ccggtagcaa cggagtccta tggacaagtg 1740
gccacaaacc accagagtgc ccaagcacag gcgcagaccg gctgggttca aaaccaagga 1800
atacttccgg gtatggtttg gcaggacaga gatgtgtacc tgcaaggacc catttgggcc 1860
aaaattcctc acacggacgg caactttcac ccttctccgc tgatgggagg gtttggaatg 1920
aagcacccgc ctcctcagat cctcatcaaa aacacacctg tacctgcgga tcctccaacg 1980
gccttcaaca aggacaagct gaactctttc atcacccagt attctactgg ccaagtcagc 2040
gtggagatcg agtgggagct gcagaaggaa aacagcaagc gctggaaccc ggagatccag 2100
tacacttcca actattacaa gtctaataat gttgaatttg ctgttaatac tgaaggtgta 2160
tatagtgaac cccgccccat tggcaccaga tacctgactc gtaatctgta a 2211
<210> 34
<211> 5340
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E2a gene
<400> 34
cgaccgcacc ctgtgacgaa agccgcccgc aagctgcgcc cctgagttag tcatctgaac 60
ttcggcctgg gcgtctctgg gaagtaccac agtggtggga gcgggacttt cctggtacac 120
cagggcagcg ggccaactac ggggattaag gttattacga ggtgtggtgg taatagccgc 180
ctgttccaag agaattcggt ttcggtgggc gcggattccg ttgacccggg atatcatgtg 240
gggtcccgcg ctcatgtagt ttattcgggt tgagtagtct tgggcagctc cagccgcaag 300
tcccatttgt ggctggtaac tccacatgta gggcgtggga atttccttgc tcataatggc 360
gctgacgaca ggtgctggcg ccgggtgtgg ccgctggaga tgacgtagtt ttcgcgctta 420
aatttgagaa agggcgcgaa actagtcctt aagagtcagc gcgcagtatt tactgaagag 480
agcctccgcg tcttccagcg tgcgccgaag ctgatcttcg cttttgtgat acaggcagct 540
gcgggtgagg gatcgcagag acctgttttt tattttcagc tcttgttctt ggcccctgct 600
ctgttgaaat atagcataca gagtgggaaa aatcctgttt ctaagctcgc gggtcgatac 660
gggttcgttg ggcgccagac gcagcgctcc tcctcctgct gctgccgccg ctgtggattt 720
cttgggcttt gtcagagtct tgctatccgg tcgcctttgc ttctgtgtgg ccgctgctgt 780
tgctgccgct gccgctgccg ccggtgcagt atgggctgta gagatgacgg tagtaatgca 840
ggatgttacg ggggaaggcc acgccgtgat ggtagagaag aaagcggcgg gcgaaggaga 900
tgttgccccc acagtcttgc aagcaagcaa ctatggcgtt cttgtgcccg cgccatgagc 960
ggtagccttg gcgctgttgt tgctcttggg ctaacggcgg cggctgcttg gacttaccgg 1020
ccctggttcc agtggtgtcc catctacggt tgggtcggcg aacgggcagt gccggcggcg 1080
cctgaggagc ggaggttgta gccatgctgg aaccggttgc cgatttctgg ggcgccggcg 1140
aggggaatgc gaccgagggt gacggtgttt cgtctgacac ctcttcgacc tcggaagctt 1200
cctcgtctag gctctcccag tcttccatca tgtcctcctc ctcctcgtcc aaaacctcct 1260
ctgcctgact gtcccagtat tcctcctcgt ccgtgggtgg cggcggcagc tgcagcttct 1320
ttttgggtgc catcctggga agcaagggcc cgcggctgct gctgataggg ctgcggcggc 1380
ggggggattg ggttgagctc ctcgccggac tgggggtcca agtaaacccc ccgtcccttt 1440
cgtagcagaa actcttggcg ggctttgttg atggcttgca attggccaag aatgtggccc 1500
tgggtaatga cgcaggcggt aagctccgca tttggcgggc gggattggtc ttcgtagaac 1560
ctaatctcgt gggcgtggta gtcctcaggt acaaatttgc gaaggtaagc cgacgtccac 1620
agccccggag tgagtttcaa ccccggagcc gcggactttt cgtcaggcga gggaccctgc 1680
agctcaaagg taccgataat ttgactttcg ttaagcagct gcgaattgca aaccagggag 1740
cggtgcgggg tgcataggtt gcagcgacag tgacactcca gtagaccgtc accgctcacg 1800
tcttccatta tgtcagagtg gtaggcaagg tagttggcta gctgcagaag gtagcagtgg 1860
ccccaaagcg gcggagggca ttcgcggtac ttaatgggca caaagtcgct aggaagtgca 1920
cagcaggtgg cgggcaagat tcctgagcgc tctaggataa agttcctaaa gttctgcaac 1980
atgctttgac tggtgaagtc tggcagaccc tgttgcaggg ttttaagcag gcgttcgggg 2040
aaaatgatgt ccgccaggtg cgcggccacg gagcgctcgt tgaaggccgt ccataggtcc 2100
ttcaagtttt gctttagcag tttctgcagc tccttgaggt tgcactcctc caagcactgc 2160
tgccaaacgc ccatggccgt ctgccaggtg tagcatagaa ataagtaaac gcagtcgcgg 2220
acgtagtcgc ggcgcgcctc gcccttgagc gtggaatgaa gcacgttttg cccaaggcgg 2280
ttttcgtgca aaattccaag gtaggagacc aggttgcaga gctccacgtt ggagatcttg 2340
caggcctggc gtacgtagcc ctgtcgaaag gtgtagtgca atgtttcctc tagcttgcgc 2400
tgcatctccg ggtcagcaaa gaaccgctgc atgcactcaa gctccacggt aacgagcact 2460
gcggccatca ttagtttgcg tcgctcctcc aagtcggcag gctcgcgcgt ttgaagccag 2520
cgcgctagct gctcgtcgcc aactgcgggt aggccctcct ctgtttgttc ttgcaaattt 2580
gcatccctct ccaggggctg cgcacggcgc acgatcagct cactcatgac tgtgctcatg 2640
accttggggg gtaggttaag tgccgggtag gcaaagtggg tgacctcgat gctgcgtttt 2700
agtacggcta ggcgcgcgtt gtcaccctcg agttccacca acactccaga gtgactttca 2760
ttttcgctgt tttcctgttg cagagcgttt gccgcgcgct tctcgtcgcg tccaagaccc 2820
tcaaagattt ttggcacttc gttgagcgag gcgatatcag gtatgacagc gccctgccgc 2880
aaggccagct gcttgtccgc tcggctgcgg ttggcacggc aggatagggg tatcttgcag 2940
ttttggaaaa agatgtgata ggtggcaagc acctctggca cggcaaatac ggggtagaag 3000
ttgaggcgcg ggttgggctc gcatgtgccg ttttcttggc gtttgggggg tacgcgcggt 3060
gagaataggt ggcgttcgta ggcaaggctg acatccgcta tggcgagggg cacatcgctg 3120
cgctcttgca acgcgtcgca gataatggcg cactggcgct gcagatgctt caacagcacg 3180
tcgtctccca catctaggta gtcgccatgc ctttcgtccc cccgcccgac ttgttcctcg 3240
tttgcctctg cgttgtcctg gtcttgcttt ttatcctctg ttggtactga gcggtcctcg 3300
tcgtcttcgc ttacaaaacc tgggtcctgc tcgataatca cttcctcctc ctcaagcggg 3360
ggtgcctcga cggggaaggt ggtaggcgcg ttggcggcat cggtggaggc ggtggtggcg 3420
aactcagagg gggcggttag gctgtccttc ttctcgactg actccatgat ctttttctgc 3480
ctataggaga aggaaatggc cagtcgggaa gaggagcagc gcgaaaccac ccccgagcgc 3540
ggacgcggtg cggcgcgacg tcccccaacc atggaggacg tgtcgtcccc gtccccgtcg 3600
ccgccgcctc cccgggcgcc cccaaaaaag cggatgaggc ggcgtatcga gtccgaggac 3660
gaggaagact catcacaaga cgcgctggtg ccgcgcacac ccagcccgcg gccatcgacc 3720
tcggcggcgg atttggccat tgcgcccaag aagaaaaaga agcgcccttc tcccaagccc 3780
gagcgcccgc catcaccaga ggtaatcgtg gacagcgagg aagaaagaga agatgtggcg 3840
ctacaaatgg tgggtttcag caacccaccg gtgctaatca agcatggcaa aggaggtaag 3900
cgcacagtgc ggcggctgaa tgaagacgac ccagtggcgc gtggtatgcg gacgcaagag 3960
gaagaggaag agcccagcga agcggaaagt gaaattacgg tgatgaaccc gctgagtgtg 4020
ccgatcgtgt ctgcgtggga gaagggcatg gaggctgcgc gcgcgctgat ggacaagtac 4080
cacgtggata acgatctaaa ggcgaacttc aaactactgc ctgaccaagt ggaagctctg 4140
gcggccgtat gcaagacctg gctgaacgag gagcaccgcg ggttgcagct gaccttcacc 4200
agcaacaaga cctttgtgac gatgatgggg cgattcctgc aggcgtacct gcagtcgttt 4260
gcagaggtga cctacaagca tcacgagccc acgggctgcg cgttgtggct gcaccgctgc 4320
gctgagatcg aaggcgagct taagtgtcta cacggaagca ttatgataaa taaggagcac 4380
gtgattgaaa tggatgtgac gagcgaaaac gggcagcgcg cgctgaagga gcagtctagc 4440
aaggccaaga tcgtgaagaa ccggtggggc cgaaatgtgg tgcagatctc caacaccgac 4500
gcaaggtgct gcgtgcacga cgcggcctgt ccggccaatc agttttccgg caagtcttgc 4560
ggcatgttct tctctgaagg cgcaaaggct caggtggctt ttaagcagat caaggctttt 4620
atgcaggcgc tgtatcctaa cgcccagacc gggcacggtc accttttgat gccactacgg 4680
tgcgagtgca actcaaagcc tgggcacgcg ccctttttgg gaaggcagct accaaagttg 4740
actccgttcg ccctgagcaa cgcggaggac ctggacgcgg atctgatctc cgacaagagc 4800
gtgctggcca gcgtgcacca cccggcgctg atagtgttcc agtgctgcaa ccctgtgtat 4860
cgcaactcgc gcgcgcaggg cggaggcccc aactgcgact tcaagatatc ggcgcccgac 4920
ctgctaaacg cgttggtgat ggtgcgcagc ctgtggagtg aaaacttcac cgagctgccg 4980
cggatggttg tgcctgagtt taagtggagc actaaacacc agtatcgcaa cgtgtccctg 5040
ccagtggcgc atagcgatgc gcggcagaac ccctttgatt tttaaacggc gcagacggca 5100
agggtggggg taaataatca cccgagagtg tacaaataaa agcatttgcc tttattgaaa 5160
gtgtctctag tacattattt ttacatgttt ttcaagtgac aaaaagaagt ggcgctccta 5220
atctgcgcac tgtggctgcg gaagtagggc gagtggcgct ccaggaagct gtagagctgt 5280
tcctggttgc gacgcagggt gggctgtacc tggggactgt tgagcatgga gttgggtacc 5340
5340
<210> 35
<211> 3037
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> E4 gene
<400> 35
gttttagggc ggagtaactt gtatgtgttg ggaattgtag ttttcttaaa atgggaagtt 60
acgtaacgtg ggaaaacgga agtgacgatt tgaggaagtt gtgggttttt tggctttcgt 120
ttctgggcgt aggttcgcgt gcggttttct gggtgttttt tgtggacttt aaccgttacg 180
tcatttttta gtcctatata tactcgctct gcacttggcc cttttttaca ctgtgactga 240
ttgagctggt gccgtgtcga gtggtgtttt tttaataggt tttctttttt actggtaagg 300
ctgactgtta tggctgccgc tgtggaagcg ctgtatgttg ttctggagcg ggagggtgct 360
attttgccta ggcaggaggg tttttcaggt gtttatgtgt ttttctctcc tattaatttt 420
gttatacctc ctatgggggc tgtaatgttg tctctacgcc tgcgggtatg tattcccccg 480
ggctatttcg gtcgcttttt agcactgacc gatgtgaatc aacctgatgt gtttaccgag 540
tcttacatta tgactccgga catgaccgag gagctgtcgg tggtgctttt taatcacggt 600
gaccagtttt tttacggtca cgccggcatg gccgtagtcc gtcttatgct tataagggtt 660
gtttttcctg ttgtaagaca ggcttctaat gtttaaatgt ttttttgtta ttttattttg 720
tgtttatgca gaaacccgca gacatgtttg agagaaaaat ggtgtctttt tctgtggtgg 780
ttccggagct tacctgcctt tatctgcatg agcatgacta cgatgtgctt tcttttttgc 840
gcgaggcttt gcctgatttt ttgagcagca ccttgcattt tatatcgccg cccatgcaac 900
aagcttacat cggggctacg ctggttagca tagctccgag tatgcgtgtc ataatcagtg 960
tgggttcttt tgtcatggtt cctggcgggg aagtggccgc gctggtccgt gcagacctgc 1020
acgattatgt tcagctggcc ctgcgaaggg acctacggga tcgcggtatt tttgttaatg 1080
ttccgctttt gaatcttata caggtctgtg aggaacctga atttttgcaa tcatgattcg 1140
ctgcttgagg ctgaaggtgg agggcgctct ggagcagatt tttacaatgg ccggacttaa 1200
tattcgggat ttgcttagag atatattgag aaggtggcga gatgagaatt atttgggcat 1260
ggttgaaggt gctggaatgt ttatagagga gattcaccct gaagggttta gcctttacgt 1320
ccacttggac gtgagggccg tttgcctttt ggaagccatt gtgcaacatc ttacaaatgc 1380
cattatctgt tctttggctg tagagtttga ccacgccacc ggaggggagc gcgttcactt 1440
aatagatctt cattttgagg ttttggataa tcttttggaa taaaaaaaaa aacatggttc 1500
ttccagctct tcccgctcct cccgtgtgtg actcgcagaa cgaatgtgta ggttggctgg 1560
gtgtggctta ttctgcggtg gtggatgtta tcagggcagc ggcgcatgaa ggagtttaca 1620
tagaacccga agccaggggg cgcctggatg ctttgagaga gtggatatac tacaactact 1680
acacagagcg atctaagcgg cgagaccgga gacgcagatc tgtttgtcac gcccgcacct 1740
ggttttgctt caggaaatat gactacgtcc ggcgttccat ttggcatgac actacgacca 1800
acacgatctc ggttgtctcg gcgcactccg tacagtaggg atcgtctacc tccttttgag 1860
acagaaaccc gcgctaccat actggaggat catccgctgc tgcccgaatg taacactttg 1920
acaatgcaca acgtgagtta cgtgcgaggt cttccctgca gtgtgggatt tacgctgatt 1980
caggaatggg ttgttccctg ggatatggtt ctaacgcggg aggagcttgt aatcctgagg 2040
aagtgtatgc acgtgtgcct gtgttgtgcc aacattgata tcatgacgag catgatgatc 2100
catggttacg agtcctgggc tctccactgt cattgttcca gtcccggttc cctgcagtgt 2160
atagccggcg ggcaggtttt ggccagctgg tttaggatgg tggtggatgg cgccatgttt 2220
aatcagaggt ttatatggta ccgggaggtg gtgaattaca acatgccaaa agaggtaatg 2280
tttatgtcca gcgtgtttat gaggggtcgc cacttaatct acctgcgctt gtggtatgat 2340
ggccacgtgg gttctgtggt ccccgccatg agctttggat acagcgcctt gcactgtggg 2400
attttgaaca atattgtggt gctgtgctgc agttactgtg ctgatttaag tgagatcagg 2460
gtgcgctgct gtgcccggag gacaaggcgc cttatgctgc gggcggtgcg aatcatcgct 2520
gaggagacca ctgccatgtt gtattcctgc aggacggagc ggcggcggca gcagtttatt 2580
cgcgcgctgc tgcagcacca ccgccctatc ctgatgcacg attatgactc tacccccatg 2640
taggcgtgga cttctccttc gccgcccgtt aagcaaccgc aagttggaca gcagcctgtg 2700
gctcagcagc tggacagcga catgaactta agtgagctgc ccggggagtt tattaatatc 2760
actgatgagc gtttggctcg acaggaaacc gtgtggaata taacacctaa gaatatgtct 2820
gttacccatg atatgatgct ttttaaggcc agccggggag aaaggactgt gtactctgtg 2880
tgttgggagg gaggtggcag gttgaatact agggttctgt gagtttgatt aaggtacggt 2940
gatctgtata agctatgtgg tggtggggct atactactga atgaaaaatg acttgaaatt 3000
ttctgcaatt gaaaaataaa cacgttgaaa cataaca 3037
<210> 36
<211> 731
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VA RNAs gene
<400> 36
atccgtagat gtacctggac atccaggtga tgccggcggc ggtggtggag gcgcgcggaa 60
agtcgcggac gcggttccag atgttgcgca gcggcaaaaa gtgctccatg gtcgggacgc 120
tctggccggt caggcgcgcg caatcgttga cgctctagac cgtgcaaaag gagagcctgt 180
aagcaagcac tcttccgtgg tctggtggat aaattcgcaa gggtatcatg gcggacgacc 240
ggggttcgag ccccgtatcc ggccgtccgc cgtgatccat gcggttaccg cccgcgtgtc 300
gaacccaggt gtgcgacgtc agacaacggg ggagtgctcc ttttggcttc cttccaggcg 360
cggcggctgc tgcgctagct tttttggcca ctggccgcgc gcagcgtaag cggttaggct 420
ggaaagcgaa agcattaagt ggctcgctcc ctgtagccgg agggttattt tccaagggtt 480
gagtcgcggg acccccggtt cgagtctcgg accggccgga ctgcggcgaa cgggggtttg 540
cctccccgtc atgcaagacc ccgcttgcaa attcctccgg aaacagggac gagccccttt 600
tttgcttttc ccagatgcat ccggtgctgc ggcagatgcg cccccctcct cagcagcggc 660
aagagcaaga gcagcggcag acatgcaggg caccctcccc tcctcctacc gcgtcaggag 720
gggcgacatc c 731
<210> 37
<211> 861
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Ampicillin Resistance Gene
<400> 37
atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct 60
gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca 120
cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc 180
gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc 240
cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg 300
gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta 360
tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc 420
ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt 480
gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg 540
cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct 600
tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc 660
tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct 720
cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac 780
acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc 840
tcactgatta agcattggta a 861
<210> 38
<211> 798
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Kanamycin Resistance Gene
<400> 38
atgattgaac aggatggcct gcatgcgggt agcccggcag cgtgggtgga acgtctgttt 60
ggctatgatt gggcgcagca gaccattggc tgctctgatg cggcggtgtt tcgtctgagc 120
gcgcagggtc gtccggtgct gtttgtgaaa accgatctga gcggtgcgct gaacgagctg 180
caggatgaag cggcgcgtct gagctggctg gccaccaccg gtgttccgtg tgcggcggtg 240
ctggatgtgg tgaccgaagc gggccgtgat tggctgctgc tgggcgaagt gccgggtcag 300
gatctgctgt ctagccatct ggcgccggca gaaaaagtga gcattatggc ggatgccatg 360
cgtcgtctgc ataccctgga cccggcgacc tgtccgtttg atcatcaggc gaaacatcgt 420
attgaacgtg cgcgtacccg tatggaagcg ggcctggtgg atcaggatga tctggatgaa 480
gaacatcagg gcctggcacc ggcagagctg tttgcgcgtc tgaaagcgag catgccggat 540
ggcgaagatc tggtggtgac ccatggtgat gcgtgcctgc cgaacattat ggtggaaaat 600
ggccgtttta gcggctttat tgattgcggc cgtctgggcg tggcggatcg ttatcaggat 660
attgcgctgg ccacccgtga tattgcggaa gaactgggcg gcgaatgggc ggatcgtttt 720
ctggtgctgt atggcattgc ggcaccggat agccagcgta ttgcgtttta tcgtctgctg 780
gatgaatttt tctaataa 798
Claims (47)
- E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자 및 rep-cap 유전자를 포함하는 듀얼 헬퍼 플라스미드로서, 상기 E2a 유전자, E4 유전자, VA RNA 유전자 및 rep-cap 유전자가 순차적으로 연결되고,
(i) 상기 rep-cap 유전자는 E2a 유전자의 5'말단과 VA RNA 유전자의 3'-말단 사이에 시계 방향으로(5'에서 3'으로) 위치되는 것; 또는
(ii) 상기 rep-cap 유전자는 E2a 유전자의 5'말단과 VA RNA 유전자의 3'-말단 사이에 반시계 방향으로(3'에서 5'으로) 위치되는 것;
을 특징으로 하는 듀얼 헬퍼 플라스미드.
- 제1항에 있어서, 상기 rep-cap 유전자의 5' 말단은 E2a 유전자의 5' 말단에 연결되고, 상기 rep-cap 유전자의 3' 말단은 VA RNA 유전자의 3' 말단에 연결되는 것을 특징으로 하는 듀얼 헬퍼 플라스미드.
- 제1항에 있어서, 상기 rep-cap 유전자의 3'말단은 E2a 유전자의 5'말단에 연결되고, 상기 rep-cap 유전자의 5'말단은 VA RNA 유전자의 3' 말단에 연결되는 것을 특징으로 하는 듀얼 헬퍼 플라스미드.
- 제1항에 있어서, 상기 rep-cap 유전자는 rep 유전자 및 cap 유전자를 포함하고, 상기 rep 유전자의 3' 말단은 상기 cap 유전자의 5' 말단에 연결되는 것을 특징으로 하는 듀얼 헬퍼 플라스미드.
- 제4항에 있어서, 상기 rep 유전자는 아데노부속바이러스 혈청형 2 (adeno-associated virus serotype 2, AAV2) 유래의 rep2 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 듀얼 헬퍼 플라스미드.
- 제4항에 있어서, 상기 cap 유전자는 아데노부속바이러스 혈청형 2 (AAV2; cap2), 혈청형 5 (AAV5; cap5), 혈청형 8 (AAV8; cap8), 또는 혈청형 9 (AAV9; cap9) 유래의 cap 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 듀얼 헬퍼 플라스미드.
- 제1항에 있어서, 상기 E2a 유전자는 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5) 유래의 E2a 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 듀얼 헬퍼 플라스미드.
- 제1항에 있어서, 상기 E4 유전자는 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5) 유래의 E4 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 듀얼 헬퍼 플라스미드.
- 제1항에 있어서, 상기 VA RNA 유전자는 아데노바이러스 혈청형 5 (Ad5) 유래의 VA RNA 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 듀얼 헬퍼 플라스미드.
- 제1항에 있어서, 상기 듀얼 헬퍼 플라스미드는 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 듀얼 헬퍼 플라스미드:
(i) 서열번호 34에 제시된 서열을 포함하는 E2a 유전자;
(ii) 서열번호 35에 제시된 서열을 포함하는 E4 유전자;
(iii) 서열번호 36에 제시된 서열을 포함하는 VA RNA 유전자;
(iv) 서열번호 30, 서열번호 31, 서열번호 32 또는 서열번호 33에 제시된 서열을 포함하는 cap 유전자; 및
(v) 서열번호 29에 제시된 서열을 포함하는 rep 유전자.
- 제1항의 듀얼 헬퍼 플라스미드를 포함하는 아데노부속바이러스 생산용 조성물.
- 제11항에 있어서, 추가 플라스미드를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 추가 플라스미드는 AAV 구축물 플라스미드인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 추가 플라스미드는 하기를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물:
(a) 역말단반복서열(inverted terminal repeat, ITR);
(b) 외래유전자; 및
(c) 외래유전자에 작동 가능하게 연결된 조절 요소.
- 제14항에 있어서, 상기 조절 요소는 프로모터 (promoter), 인핸서 (enhancer), 엑손 (exon) 서열, 인트론 (intron) 서열, 스플라이싱 공여체 (splicing donor) 또는 수여체 (acceptor) 서열, miRNA 표적 (target) 서열, 우드척간염바이러스 전사후 조절 요소 (woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element, WPRE) 서열, 폴리아데닐화 (polyadenylation, pA) 서열 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 외래유전자는 야생형 폴리펩타이드 또는 이의 임의의 변이체, 융합 단백질, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, RNA-기반 분자 또는 이의 임의의 조합을 인코딩하는 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항의 듀얼 헬퍼 플라스미드 또는 제11항의 조성물을 포함하는 시험관내 세포.
- 제1 플라스미드 및 제2 플라스미드를 포함하도록 세포를 시험관내에서 변형시키는 단계를 포함하는 재조합 AAV 생산 방법으로서, 상기 제1 플라스미드는 제1항의 듀얼 헬퍼 플라스미드이고, 상기 제2 플라스미드는 외래유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 변형시키는 단계는 상기 세포를 상기 제1 플라스미드 및 제2 플라스미드로 형질감염시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 생산된 재조합 AAV를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제1 플라스미드 및 제2 플라스미드를 포함하도록 세포를 시험관내에서 변형시키는 단계를 포함하는 재조합 AAV의 생산 수율을 증가시키는 방법으로서, 상기 제1 플라스미드는 제1항의 듀얼 헬퍼 플라스미드이고, 상기 제2 플라스미드는 외래유전자를 포함하고, 상기 변형 후 생산된 재조합 AAV의 양은 대조 방법으로 생산된 상응하는 양과 비교하여 증가되는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 대조 방법은 하기 세 종류의 별도의 플라스미드를 포함하도록 해당 세포를 시험관내에서 변형시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: i) Rep 단백질 및 Cap 단백질을 인코딩하는 유전자를 포함하는 Rep-Cap 플라스미드; ii) 아데노바이러스의 단백질 (E2a, E4) 및 VA RNA를 인코딩하는 유전자를 포함하는 헬퍼 플라스미드; 및 iii) 외래유전자를 포함하는 AAV 구축물 플라스미드.
- 제21항에 있어서, 상기 생산된 재조합 AAV의 양이 상기 대조 방법을 사용하여 생산된 상응하는 양과 비교하여, 적어도 2배 증가된 것을 특징으로 하는 방법.
- 제21항의 방법에 의해 생산된 재조합 AAV.
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