KR102684852B1 - 하이브리드 pcr 카트리지용 웰 어레이 및 이를 이용한 pcr 분석 방법 - Google Patents

하이브리드 pcr 카트리지용 웰 어레이 및 이를 이용한 pcr 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 디지털 PCR 및 실시간 PCR을 하나의 카트리지에서 동시에 동작 가능한 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이 및 이를 이용한 PCR 분석 방법을 개시한다. 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이는, 제1 영역에 형성되고 제1 체적의 시료를 각각 수용하도록 구성된 복수의 마이크로-웰들; 및 제2 영역에 형성되고 제2 체적의 시료를 각각 수용하도록 구성된 하나 이상의 매크로-웰을 포함한다. 이에 따라, 디지털 PCR 및 실시간 PCR을 하나의 카트리지에서 유전자나 단백질 등의 바이오 물질 검사를 동시에 수행할 수 있도록 구성되어 형광 채널을 늘리지 않고도 다양한 종류의 바이오 물질 검출을 개별 분리된 웰들에서 동시에 실시간 및 정량 검출을 할 수 있다.

Description

하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이 및 이를 이용한 PCR 분석 방법{WELL ARRAY FOR A HYBRID PCR CARTRIDGE AND PCR ANALYSIS METHOD USING THE SAME}
본 발명은 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이 및 이를 이용한 PCR 분석 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 하나의 카트리지에서 디지털 PCR 및 실시간 PCR을 동시에 수행할 수 있도록 구성된 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이 및 이를 이용한 PCR 분석 방법에 관한 것이다.
중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)은 현재 유전물질을 조작하여 실험하는 거의 모든 과정에 사용하고 있는 검사법으로, 검출을 원하는 특정 표적 유전물질을 증폭하는 방법이다. PCR에 의해, 소량의 유전물질로부터 염기 순서가 동일한 유전물질을 많은 양으로 증폭할 수 있으므로, 인간의 DNA와 같은 핵산을 증폭하여 여러 종류의 유전질환을 진단하는 데 사용된다. 또한 세균이나 바이러스, 진균의 핵산에 적용하여 감염성 질환의 진단 등에 사용할 수 있다.
PCR의 순서는 열을 이용하여 두 가닥의 DNA를 분리하기 위하여 열변성시키는(denaturation) 과정, 온도를 낮추어 프라이머(primer)가 증폭을 원하는 서열 말단에 결합(annealing)시키는 과정, 및 다시 열을 약간 올려서 DNA를 합성하는 중합 반응을 일으키는(polymerization or extension) 과정의 3단계로 이루어진다. PCR을 1회 수행하면 유전 물질은 2배로 증폭되므로, PCR의 반복 수행에 의하여 핵산의 기하급수적인 증폭이 가능하다.
일반적으로, 절대 정량 검출을 위해서는 디지털 PCR(digital PCR)이 사용되지만, 형광채널을 늘리지 않고는 한번에 여러 종류의 유전자 검출을 하기는 어렵다.
한편, 실시간 PCR(real-time PCR)의 경우, 분리된 웰의 수를 늘린다면, 형광채널 수에 관계없어 여러 유전자를 검출할 수 있다. 즉, 개별 분리된 웰에 검출하고자 하는 프라이머 및 프로브(Primer & Probe)를 고정할 수 있다. 하지만, 실시간 PCR은 정량 검출을 하기 어렵다는 단점이 있다.
또한, 현재의 PCR 검출 카트리지는 디지털 PCR과 실시간 PCR을 통해 유전자 및 단백질 검사를 동시에 할 수 있는 형태가 아닌 개별적인 기능으로만 동작 가능한 구조이다.
한국공개특허 제10-2017-0024827호(2017. 03. 08.) 한국공개특허 제10-2016-0086937호(2016. 07. 20.)
이에 본 발명의 기술적 과제는 이러한 점에 착안한 것으로, 본 발명의 목적은 유전자나 단백질 등의 바이오 물질 검사를 위한 디지털 PCR 및 실시간 PCR을 하나의 카트리지에서 동시에 수행할 수 있도록 구성된 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기한 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이를 이용한 PCR 분석 방법을 제공하는 것이다.
상기한 본 발명의 목적을 실현하기 위하여 일실시예에 따른 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이는, 제1 영역에 형성되고 제1 체적의 시료를 각각 수용하도록 구성된 복수의 마이크로-웰들; 및 제2 영역에 형성되고 제2 체적의 시료를 각각 수용하도록 구성된 하나 이상의 매크로-웰을 포함한다.
일실시예에서, 상기 제1 영역은 실시간 디지털 PCR용 웰 영역이고, 상기 제2 영역은 실시간 PCR용 웰 영역일 수 있다.
일실시예에서, 상기 제1 영역은 디지털 PCR용 웰 영역이고, 상기 제2 영역은 디지털 PCR에서 포지티브 콘트롤 영역일 수 있다.
일실시예에서, 상기 제2 영역은 상기 제1 영역의 주변 영역에 형성될 수 있다.
일실시예에서, 상기 제2 영역은 상기 제1 영역을 기준으로 양측에 형성될 수 있다.
일실시예에서, 상기 제2 영역은 상기 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이의 코너에 형성될 수 있다.
일실시예에서, 상기 매크로-웰의 높이와 상기 마이크로-웰들 각각의 높이는 동일할 수 있다.
일실시예에서, 상기 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이는 상기 매크로-웰에 제1 수용부를 형성하기 위해 균일하게 형성된 복수의 파티션들을 더 포함할 수 있고, 상기 제1 수용부의 폭은 상기 마이크로-웰들 각각의 폭과 동일할 수 있다. 여기서, 상기 파티션들 각각의 높이는 상기 마이크로-웰들 각각의 높이보다 낮을 수 있다.
일실시예에서, 상기 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이는 상기 매크로-웰에 제1 수용부를 형성하기 위해 균일하게 형성된 복수의 파티션들을 더 포함할 수 있고, 상기 제1 수용부의 폭은 상기 마이크로-웰들 각각의 폭과 상이할 수 있다. 여기서, 상기 파티션들 각각의 높이는 상기 마이크로-웰들 각각의 높이보다 낮을 수 있다.
일실시예에서, 상기 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이는 상기 매크로-웰에 제1 수용부 및 제2 수용부를 형성하기 위해 국부적으로 형성된 복수의 파티션들을 더 포함할 수 있고, 상기 제1 수용부의 폭은 상기 마이크로-웰들 각각의 폭과 동일하고, 상기 제2 수용부의 폭은 상기 제1 수용부의 폭보다 클 수 있다. 여기서, 상기 매크로-웰의 높이는 상기 마이크로-웰들의 높이보다 낮을 수 있다.
일실시예에서, 상기 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이는 상기 매크로-웰에 제1 수용부 및 제2 수용부를 형성하기 위해 국부적으로 형성된 복수의 파티션들을 더 포함할 수 있고, 상기 제1 수용부의 폭은 상기 마이크로-웰들 각각의 폭과 상이할 수 있고, 상기 제2 수용부의 폭은 상기 제1 수용부의 폭보다 클 수 있다. 여기서, 상기 매크로-웰의 높이는 상기 마이크로-웰들의 높이보다 낮을 수 있다.
일실시예에서, 상기 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이는, 상기 매크로-웰의 중심 영역에 형성된 중심 채움부재, 및 상기 매크로-웰에서 상기 중심 채움부재를 둘러싸는 제1 수용부를 형성하기 위해 균일하게 형성된 복수의 파티션들을 더 포함할 수 있다. 여기서, 상기 제1 수용부의 폭은 상기 마이크로-웰들 각각의 폭과 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다. 한편, 상기 매크로-웰의 높이는 상기 마이크로-웰들의 높이보다 낮을 수 있다. 또한 상기 중심 채움부재의 높이는 상기 파티션들의 높이보다 낮을 수 있다.
상기한 본 발명의 다른 목적을 실현하기 위하여 일실시예에 따른 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이를 이용한 PCR 분석 방법은, 제1 영역에 형성되고 제1 체적의 시료를 각각 수용하도록 구성된 복수의 마이크로-웰들과, 제2 영역에 형성되고 제2 체적의 시료를 각각 수용하도록 구성된 하나 이상의 매크로-웰을 포함하는 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이를 준비하는 단계; 디지털 PCR 및 실시간 PCR에 적합한 개별 혹은 일체의 검사 시약을 준비하는 단계; PCR 혼합을 상기 웰 어레이의 주입구에 주입하는 단계; PCR 리더기 시스템에 검체 정보를 입력하는 단계; 상기 PCR 리더기 시스템에 상기 웰 어레이를 로딩하는 단계; 주입된 유효 웰을 인식하는 단계; 상기 PCR 리더기 시스템에서 히트 사이클 동작을 수행하는 단계; 개별 히트 사이클 완료 후 각 웰에서 표시되는 형광 신호를 촬상하는 단계; 및 모든 히트 사이클 완료 후 분석 결과 보고서를 생성하는 단계를 포함한다.
이러한 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이 및 이를 이용한 PCR 분석 방법에 의하면, 유전자나 단백질 등의 바이오 물질 검사를 위한 디지털 PCR 및 실시간 PCR을 하나의 카트리지에서 동시에 수행할 수 있도록 구성함으로써, 형광 채널을 늘리지 않고도 다양한 종류의 바이오 물질 검출을 개별 분리된 웰들에서 동시에 실시간 및 정량 검출을 할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일실시예에 따른 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이를 설명하기 위한 평면도이고, 도 1b는 도 1a에 도시된 라인 I-I'으로 절단한 단면도이다.
도 2a는 본 발명의 다른 실시예에 따른 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이를 설명하기 위한 평면도이고, 도 2b는 도 2a에 도시된 라인 II-II'으로 절단한 단면도이다.
도 3은 도 2b에 도시된 마이크로-웰과 매크로-웰간의 영역을 개략적으로 확대한 단면도이다.
도 4는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이를 설명하기 위한 단면도이다.
도 5는 도 4에 도시된 영역 B를 확대한 단면도이다.
도 6은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이를 설명하기 위한 단면도이다.
도 7은 도 6에 도시된 영역 C를 확대한 단면도이다.
도 8은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이를 설명하기 위한 평면도이다.
도 9a는 도 8에 도시된 라인 III-III'으로 절단한 단면도이고, 도 9b는 도 8에 도시된 라인 IV-IV'으로 절단한 단면도이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이를 이용한 PCR 분석 방법을 설명하기 위한 흐름도이다.
도 11은 본 발명에 따라 디지털 PCR 및 실시간 PCR의 동시 진행에 따른 PCR 분석 결과 보고서의 일례를 설명하기 위한 도면이다.
도 12는 본 발명에 따라 디지털 PCR 및 실시간 PCR의 동시 진행에 따른 PCR 분석 결과 보고서의 일례를 설명하기 위한 도면이다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 발명을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 본문에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
각 도면을 설명하면서 유사한 참조부호를 유사한 구성요소에 대해 사용하였다. 첨부된 도면에 있어서, 구조물들의 치수는 본 발명의 명확성을 기하기 위하여 실제보다 확대하여 도시한 것이다.
제1, 제2 등의 용어는 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만 사용된다. 예를들어, 본 발명의 권리 범위를 벗어나지 않으면서 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.
본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 발명의 바람직한 실시예를 보다 설명하고자 한다. 도면상의 동일한 구성요소에 대해서는 동일한 참조부호를 사용하고 동일한 구성요소에 대해서 중복된 설명은 생략한다.
본 발명은 웰 어레이에 일정 배열로 시료들, 시료 용적들 또는 반응 용적들을 탑재하기 위한 구조이며, 보다 구체적으로는 웰 어레이 내의 각각의 반응 위치들의 일정한 배열로 시료들을 탑재하는 것에 관한다.
다양한 실시예들에서, 대량의 작은 용적 시료들에서 타겟들을 검출하기 위해 사용되는 물품 내에 시료들을 탑재하기 위한 장치, 기기, 시스템, 및 방법들이 제공된다. 이러한 타겟들은 임의의 적절한 생물학적 타겟일 수 있지만, DNA 서열(무 세포 DNA를 포함함), RNA 서열, 유전자, 올리고 뉴클레오타이드(oligonucleotides), 분자, 단백질, 생체표식(biomarkers), 세포(예, 순환 종양 세포), 또는 다른 적당한 타겟 생체 분자를 포함하는 것들로서, 그들로 한정되지 않는다. 다양한 실시예들에서, 이러한 생물학적 성분들은 태아 진단, 다중화 디지털 PCR, 바이러스 검출, 및 정량 표준화, 유전자형(genotyping), 서열 검증, 돌연변이 검출, 유전자 생물, 희귀 대립 유전자 검출, 및 복제 수 변화 검출 등의 응용들에서 다양한 PCR, PCR 방법 및 시스템과 연관하여 사용될 수도 있다.
본원에 기재된 다양한 실시예들에 따른 후술되는 바와 같이, 반응 위치들은 예를 들어 관통 구멍, 시료 보유 영역, 우물, 요홈(indentations), 지점(spots), 공동, 및 반응 챔버들을 포함하지만 그들로 제한되지 않는다.
여기에 설명되는 다양한 실시예들은 디지털 PCR(dPCR)및 실시간 PCR(RT PCR)에 적합하다. 디지털 PCR에서, 타겟 폴리 뉴클레오타이드 또는 핵산 서열의 상대적으로 적은 수를 내장하는 용액을 각각의 시료를 대량의 작은 시료들로 더 분할할 수도 있으며, 그에 의해 각 시료는 일반적으로 타겟 뉴클레오타이드 서열의 한 분자를 포함하던가 또는 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않을 수도 있다. 연이어, 시료들이 PCR 프로토콜, 절차, 또는 실험에서 열적으로 순환되는 경우, 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 시료가 증폭되어 양의 검출 신호를 생성하는 반면 어떠한 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 시료들은 증폭되지 않고 검출 신호를 생성하지 않는다. 푸아송 통계(Poisson statistics)를 사용하여, 원래 용액에서 타겟 뉴클레오타이드 서열들의 숫자를 양의 검출 신호를 생성하는 시료들의 개수와 상관할 수도 있다.
전형적인 디지털 PCR 프로토콜, 절차, 또는 실험을 위해서, 간단하여 비용에 효과적인 방법으로 수만 또는 수십만의 시료들에, 즉 각각 수 나노리터, 1 또는 대략 1 나노리터, 또는 1 나노리터 미만의 용적을 갖는 시료들에 초기 시료 용액을 분할할 수 있는 이점이 있다. 타겟 뉴클레오타이드 서열의 수를 매우 작게 할 수 있기 때문에, 초기 용액의 전체 내용물이 복수의 반응 위치들을 고려하여 내장하는 그러한 환경들에서도 중요할 수도 있다.
본원에서 설명되는 실시예들은 이들 및 기타 디지털 PCR 설계 제약들을 초기 시료 용액을 복수의 반응 위치들에 시료 용액의 모두, 또는 필수적인 것들 모두를 고려하는 방식으로 분배함으로써 해결한다.
높은 처리량의 실시간 PCR 분석들 및 디지털 PCR 방법들 때문에, 한번에 수행되는 반응들의 수를 증가시키면서 액체시료의 반응 용적을 감소시키기 위해 배열 형식을 사용하는 전략이 적용될 수도 있다. 액체시료의 반응 용적들의 배열은 복수의 반응 위치들을 갖는 웰 어레이일 수도 있다. 반응 위치들은 관통 구멍들, 우물들, 요부들, 지점들, 공동들, 반응실들, 또는 본 명세서에 기재된 다양한 실시예들에 따른 시료를 보유할 수 있는 임의의 구조들일 수 있으며, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시예들에서, 관통 구멍 또는 우물들은 지름이 테이퍼질 수도 있다.
주어진 영역 내에서 더 많은 반응이 수행될 수 있도록 액체시료의 반응 용적을 줄이면 반응 용적들의 밀도를 더 높일 수도 있다. 본원에 기재된 다양한 실시예들에 따른 반응 용적들은 약 1 pL 로부터 30 nL까지의 액체시료일 수도 있다. 더욱이, 동적 범위는 액체시료의 희석액을 1이상 사용하여 증가될 수도 있다.
도 1a는 본 발명의 일실시예에 따른 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이(100)를 설명하기 위한 평면도이고, 도 1b는 도 1a에 도시된 라인 I-I'으로 절단한 단면도이다.
도 1a 및 도 1b를 참조하면, 본 발명의 일실시예에 따른 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이(100)는 복수의 마이크로-웰들(110) 및 하나 이상의 매크로-웰(120)을 포함하고, 디지털 PCR 및 실시간 PCR이 하나의 카트리지에서 동시에 구현될 수 있다. 여기서, 디지털 PCR은 절대 복제수를 측정하기 위해 음성 복제(negative replicates)의 비율을 측정한다. 디지털 PCR은 정량적이므로 음성 PCR 반응의 비율은 포아송(Poisson) 통계 알고리즘에 적합하다. 한편, 실시간 PCR은 PCR 증폭을 측정한다. 실시간 PCR은 PCR 산물의 양이 템플릿 핵산의 양에 직접 비례할 때 PCR의 익스포넨셜 성장(로그) 단계 동안 데이터가 수집되기 때문에 정량적이다.
마이크로-웰들(110)은 디지털 PCR용 웰 영역으로 이용되는 제1 영역에 형성되고 제1 체적의 시료를 각각 수용하도록 구성된다. 마이크로-웰들(110)은 평면상에서 관찰할 때 사각형, 오각형, 육각형, 원형, 타원형 등과 다양한 형상을 가질 수 있다. 본 실시예에서, 마이크로-웰들(110)은 벌집 형상을 가질 수 있다. 마이크로-웰들(110)의 수는 수천개 내지 수만개일 수 있다.
매크로-웰(120)은 포지티브 콘트롤 영역으로 사용되는 제2 영역에 형성되고 제2 체적의 시료를 각각 수용하도록 구성된다. 상기 제2 영역은 상기 제1 영역의 주변 영역에 형성될 수 있다. 한편, 상기 제2 영역은 상기 제1 영역을 기준으로 양측에 형성될 수 있다. 한편, 상기 제2 영역은 상기 웰 어레이(100)의 코너에 형성될 수도 있다. 매크로-웰(120)은 평면상에서 관찰할 때 사각형, 오각형, 육각형, 원형, 타원형 등과 다양한 형상을 가질 수 있다. 본 실시예에서, 매크로-웰(120)은 벌집 형상을 가질 수 있다. 매크로-웰(120)의 수는 1개 내지 수십 개일 수 있다.
본 실시예에서, 매크로-웰(120)들 각각의 높이와 마이크로-웰들(110) 각각의 높이는 동일할 수 있다. 이에 따라, 매크로-웰(120)에 투입된 시료는 마이크로-웰들(110)에 유출되지 않는다. 또는 마이크로-웰들(110)에 투입된 시료는 매크로-웰(120)에 유출되지 않는다.
본 실시예에서, 마이크로-웰들(110) 각각은 실시간으로 확인이 가능한 실시간 디지털 PCR용 개별 웰들이고, 매크로-웰(120)은 실시간 PCR용 개별 웰이다. 본 실시예에서, 실시간 디지털 PCR용 개별 웰 및 실시간 PCR용 개별 웰의 개수는 타겟에 따라 변동될 수 있다. 본 실시예에서, 실시간 디지털 PCR용 개별 웰 및 실시간 PCR용 개별 웰의 위치 또한 목적에 따라 변동이 가능하다.
본 실시예에서, 마이크로-웰들(110) 및 매크로-웰(120)은 실리콘(Si), 산화 알루미늄(Al2O3), 유리, 금속, PC 등과 같이 다양한 재질로 구성이 가능하다.
본 실시예에서, 마이크로-웰들(110) 및 매크로-웰(120)은 공정 방법에 따라, 수직 구조, 일정한 각도를 갖는 경사 구조, 모따기 구조 등과 같이 다양한 형상으로 구성이 가능하다.
본 실시예에서, 마이크로-웰들(110) 및 매크로-웰(120)은 상부와 하부가 개구된 관통형일 수도 있고, 일부 영역에서 상부 또는 하부가 폐쇄된 그루브(홈) 형태일 수도 있다.
마이크로-웰들(110) 각각 및 하나 이상의 매크로-웰(120)에는 서로 다른 다종의 항체(antibody) 또는 항원(antigen)들이 배치될 수 있다. 본 실시예에서, "항체"라는 용어는 온전한 항체 분자, 항체 단편 및 항체의 항원 결합 도메인을 포함하는 재조합 단백질 구조체를 포함할 수 있다. 또한 "항체"라는 용어는 온전한 항체 분자, 항체 단편 및, 예를 들면 라벨 도입에 의해 화학적으로 변형된 항체 구조체를 포함할 수 있다. 또한, "항체"라는 용어는 생물학적 물질 분석을 위한 특이성분으로서, 특정한 생물학적 물질, 예를들어 단백질, DNA, RNA 등의 정량 또는 정성 분석을 위한 성분으로서, 프라이머, 프로브, 항체, 앱타머, DNA 또는 RNA 중합효소 등을 의미하며, 특히 실시간 중합효소연쇄반응, 정온 효소반응 또는 LCR(Ligase Chain Reaction) 등을 수행하기 위해 필요한 성분을 의미할 수 있다.
본 실시예에서, "항원"이라는 용어는 당업계에서 충분히 이해되는 것이며, 면역원성 물질, 즉 면역원, 및 면역학적 비반응 또는 면역성 결여(anergy)를 유도하는 물질, 즉 아너겐(anergen)을 포함할 수 있다. 항원이 폴리펩티드인 경우, 항원은 막횡단 분자(예, 수용체) 또는 리간드, 예를 들어 성장 인자일 수 있다. 항원의 예로는 레닌과 같은 분자, 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 포함하는 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 인자, 부갑상선 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 지단백질, 알파-1-항트립신, 인슐린 A-쇄, 인슐린 B-쇄, 프로인슐린, 여포 자극 호르몬, 칼시토닌, 황체형 성 호르몬, 글루카곤, 응고 인자, 예를 들어 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자(TF), 및 폰 빌레브란트(von Willebrands) 인자, 항-응고 인자, 예를 들어 단백질 C, 심방 나트륨배설증가 인자, 폐 계면활성제, 플라스미노겐 활성자, 예를 들어 유로키나제 또는 인간 뇨 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성자(t-PA), 봄베신, 트롬빈, 조혈 성장 인자, 종양 괴사 인자-알파 및 -베타, 엔케팔리나제, RANTES(정상적으로 활성화된 T-세포에 의한 발현 및 분비를 조절), 인간 대식세포 염증 단백질(MIP-1-알파), 혈청 알부민, 예를 들어 인간 혈청 알부민, 뮬러리안(Muellerian)-억제성 물질, 릴랙신 A-쇄, 릴랙신 B-쇄, 프로릴랙신, 마우스 성선자극호르몬-관련 펩티드, 미생물 단백질, 예를 들어 베타-락타마제, DNase, IgE, 세포독성 T-림프구 관련 항원(CTLA), 예를 들어 CTLA-4, 인히빈, 액티빈, 혈관 내피 성장 인자(VEGF), 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체, 단백질 A 또는 D, 류머티즘성 인자, 신경영양성 인자, 예를 들어 골-유도 신경영양성 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6(NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예를 들어 NGF-β, 혈소판-유도 성장 인자(PDGF), 섬유아세포 성장 인자, 예를 들어 aFGF 및 bFGF, 표피 성장 인자(EGF), 변형 성장 인자(TGF), 예를 들어 TGF-알파 및 TGF-베타(TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5 포함), 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II(IGF-I 및 IGF-II), 데스(1-3)-IGF-I(뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질, CD 단백질, 예를 들어 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20, 에리트로포이에틴, 골유도 인자, 면역독소, 골 형태형성 단백질(BMP), 인터페론, 예를 들어 인터페론-알파, -베타 및 -감마, 콜로니 자극 인자(CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF, 인터루킨(IL), 예를 들어 IL-1 내지 IL-10, 수퍼옥시드 디스뮤타제, T-세포 수용체, 표면 막 단백질, 쇠퇴 촉진 인자, 바이러스 항원, 예를 들어 AIDS 엔벨로프의 부분, 운반 단백질, 호밍(homing) 수용체, 어드레신, 조절 단백질, 인테그린, 예를 들어 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM, 종양 관련 항원, 예를 들어 HER2, HER3 또는 HER4 수용체, 및 상기 나열된 임의의 폴리펩티드의 단편이 포함된다.
본 발명의 일실시예에 따른 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이(100)는 반응 챔버(미도시)의 하부 면에 부착되고, CMOS 포토센서 어레이(미도시) 위에 배치되어 사용될 수 있다.
상기 반응 챔버는 시료에 존재하는 분석물질과 결합 또는 반응하여 분석신호를 측정하기 위해 배치된다. 상기 반응 챔버에 시료가 유입되면, 시료 내에 존재하는 분석물질과 효소반응(enzyme reaction), 면역반응(immunoreaction), 화학반응(chemical reaction), DNA 또는 RNA의 교잡(hybridizaion) 반응, 응고(aggregation) 및 응집(agglutination) 반응이 일어나 분석물질에 의한 분석신호(detection signal)를 발생한다. 분석신호는 발색, 발광, 형광, 굴절률 변화, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 등의 분광학적 방법(optical method), 산화/환원을 통한 전기화학적 방법(electrochemical method), 무게변화에 의한 수정진동자저울(quartz crystal microbalance) 방법 또는 마이크로캔틸레버(microcantilever) 방법 등이 사용 가능하다. 또한 상기 반응 챔버에는 분석물질에 의한 분석신호를 발생하기 위해, 효소(enzyme), 항원(antigen), 항체(antibody), DNA, RNA, 압타머(apatmer), 리간드(ligand), 리셉터(receptor), 결합 탐침(binding probe), 효소의 기질(enzyme substrate) 등을 포함할 수 있다. 필요에 따라, 상기 반응 챔버에 유입된 시료는 정확하게 부피를 정량하여야 하므로, 상기 반응 챔버에 다양한 형태의 전극(electrode)을 도입하여 시료의 유입에 의한 전극 간의 전도도(conductivity) 변화 또는 저항(resistance)의 변화를 전기화학적으로 측정하여 상기 반응 챔버에 유입된 시료의 부피를 정량하거나, 상기 반응 챔버가 투명한 경우 분광학적 방법을 통해 상기 반응 챔버에 유입된 시료의 부피를 정량할 수 있다.
상기 형광센서 어셈블리는 상기 반응 챔버의 바닥면에 배치되어 각 항체 스팟에서 면역 반응에 의해 일어나는 화학발광신호를 각 픽셀별로 측정하여 미세한 신호를 의미있는 값으로 해석하는 이미지 분석을 위해 영상을 평면적으로 촬영한다.
본 실시예에서, 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이(100)는 사각 평판 형상인 것을 도시하였으나, 특정 응용 또는 설계에 적합한 어느 형태를 포함할 수도 있다. 상기한 웰 어레이(100)는, 국한되는 것은 아니지만, 금속, 유리, 세라믹, 실리콘 재료 등을 포함하는 제주 분야에 알려져 있는 다양한 재료 중 어떠한 것이라도, 전체적으로 또는 부분적으로, 포함할 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 상기한 웰 어레이(100)는 아크릴, 스타이렌, 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 및 폴리프로필렌 재료와 같은 중합체 재료를 포함할 수 있다. 상기한 웰 어레이(100), 마이크로-웰들(110) 및 매크로-웰(120)은 머신잉, 인젝션 몰딩, 핫 엠보싱, 레이저 드릴링, 포토리소그래피 등 중 하나 이상에 의해 형성될 수 있다.
본 실시예에 따르면, 디지털 PCR 영역 및 실시간 PCR 영역에 대해 한번의 동시 시약 주입 혹은 별도로 구분하여 시약이 주입될 수 있다. 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이에 검사 시약을 주입 후 PCR 리더기에 하이브리드 PCR 카트리지를 로딩 후 동작은 종래와 다르지 않다.
디지털 PCR에서의 PCR 정상 동작 여부 확인을 위해 포지티브 콘트롤(Positive Control)을 확인하기 위해서는, 디지털 PCR 영역내에 타겟 반응과 포지티브 콘트롤을 분리하기 위한 형광 채널 구성이 필요한데, 본 발명에서는 디지털 PCR 영역 내에 형광 채널을 증가하지 않고도, 디지털 PCR 영역과 분리된 실시간 PCR 영역으로부터 포지티브 콘트롤 반응을 확인할 수 있다.
실시간 PCR 영역 내에 단수 혹은 복수의 분리된 웰 내 혹은 웰 공간과 수직 방향으로 결합되는 다른 구조물에 개별 타겟 검출을 위한 프라이머 및 프로브(Primer & Probe)가 로딩됨으로써, 하이브리드 PCR 카트리지로 주입되는 검사 시약과의 반응할 수 있다.
디지털 PCR 영역과 실시간 PCR 영역의 동일한 타겟 반응을 통해, 디지털 PCR 영역의 절대 정량값과 실시간 PCR 영역의 임계 사이클값(CT)의 관계를 토대로, 실시간 PCR 영역의 나머지 분리된 웰의 개별 타겟의 임계 사이클값(CT)에 대해 상대 정량값을 추출할 수 있다.
도 2a는 본 발명의 다른 실시예에 따른 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이(200)를 설명하기 위한 평면도이고, 도 2b는 도 2a에 도시된 라인 II-II'으로 절단한 단면도이다.
도 2a 및 도 2b를 참조하면, 본 발명의 다른 실시예에 따른 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이(200)는 복수의 마이크로-웰들(110) 및 하나 이상의 매크로-웰(220)을 포함하고, 디지털 PCR 및 실시간 PCR을 하나의 카트리지에서 동시에 구현한다.
마이크로-웰들(110)은 실시간으로 확인이 가능한 실시간 디지털 PCR용 웰 영역으로 이용되는 제1 영역에 형성되고 제1 체적의 시료를 각각 수용하도록 구성된다. 마이크로-웰들(110)은 평면상에서 관찰할 때 사각형, 오각형, 육각형, 원형, 타원형 등과 다양한 형상을 가질 수 있다. 본 실시예에서, 마이크로-웰들(110)은 벌집 형상을 가질 수 있다. 마이크로-웰들(110)의 수는 수 천개 내지 수 만개일 수 있다.
본 실시예에서, 매크로-웰(220)들 각각에 제1 수용부를 형성하기 위해 균일하게 형성된 복수의 파티션들(222)을 더 포함한다. 이때, 제1 수용부의 폭은 마이크로-웰들(110) 각각의 폭과 동일할 수 있다. 한편, 제1 수용부의 폭은 마이크로-웰들(110) 각각의 폭과 상이하게 형성될 수도 있다.
본 실시예에서, 파티션들(222) 각각의 높이는 마이크로-웰들(110) 각각의 높이보다 낮을 수 있다.
도 3은 도 2b에 도시된 마이크로-웰과 매크로-웰(220)간의 영역을 개략적으로 확대한 단면도이다. 특히, 매크로-웰(220)들이 형성된 영역에서 PCR에 의한 증폭 과정을 설명하기 위한 단면도이다.
도 3을 참조하면, 마이크로-웰들(110)이 형성된 영역은 실시간 디지털 PCR용 웰 영역으로 이용되고, 매크로-웰(220)들이 형성된 영역은 실시간 PCR용 웰 영역 및 포지티브 콘트롤 영역으로 이용된다.
매크로-웰(220)들이 형성된 영역에는 매크로-웰(220)들의 높이보다 낮은 복수의 파티션들(222)이 형성되어 웰간 격리가 되지 않는다. 따라서, 매크로-웰(220)의 제1 수용부에 제공된 시료는 파티션(222)을 넘어 인접하는 다른 제1 수용부에 도달될 수 있고, 인접하는 다른 제1 수용부에서도 증폭 과정이 수행될 수 있다.
도 4는 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이(300)를 설명하기 위한 단면도이다. 도 5는 도 4에 도시된 영역 B를 확대한 단면도이다. 특히, 매크로-웰(320) 영역으로 이용되는 제2 영역에서 PCR에 의한 증폭 과정을 설명하기 위한 단면도이다.
도 4 및 도 5를 참조하면, 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이(300)는 복수의 마이크로-웰들(110) 및 하나 이상의 매크로-웰(320)을 포함하고, 디지털 PCR 및 실시간 PCR을 하나의 카트리지에서 동시에 구현한다.
마이크로-웰들(110)은 실시간으로 확인이 가능한 실시간 디지털 PCR용 웰 영역으로 이용되는 제1 영역에 형성되고 제1 체적의 시료를 각각 수용하도록 구성된다. 마이크로-웰들(110)은 평면상에서 관찰할 때 사각형, 오각형, 육각형, 원형, 타원형 등과 다양한 형상을 가질 수 있다. 본 실시예에서, 마이크로-웰들(110)은 벌집 형상을 가질 수 있다. 마이크로-웰들(110)의 수는 수 천개 내지 수 만개일 수 있다.
본 실시예에서, 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이(300)는 매크로-웰들(320) 각각에 제1 수용부(323) 및 제2 수용부(325)를 형성하기 위해 단속적으로 형성된 복수의 파티션들(322)을 더 포함한다. 이때, 제1 수용부(323)의 폭은 마이크로-웰들(110) 각각의 폭과 동일할 수 있고, 제2 수용부(325)의 폭은 제1 수용부(323)의 폭보다 클 수 있다. 상기 파티션들(322)이 형성된 간격에 따라 제1 수용부(323) 및 제2 수용부(325)가 정의될 수 있다. 예를 들어, 상기 파티션들(322)이 제1 간격(g1)으로 형성되면 작은 크기의 제1 수용부(323)가 형성되고, 상기 파티션들(322)이 제2 간격(g2)으로 형성되면 상기 제1 수용부(323)보다 큰 크기의 제2 수용부(325)가 형성될 수 있다. 한편, 제1 수용부(323)의 폭은 마이크로-웰들(110) 각각의 폭과 상이할 수 있고, 제2 수용부(325)의 폭은 제1 수용부(323)의 폭보다 클 수 있다.
본 실시예에서, 파티션들(322) 각각의 높이는 마이크로-웰들(110) 각각의 높이보다 낮을 수 있다. 이에 따라, 매크로-웰들(320) 내에서 웰간 격리가 되지 않는다. 따라서, 매크로-웰(320)의 제2 수용부(325)에 제공된 시료는 파티션을 넘어 제1 수용부(323)에 도달될 수 있고, 제1 수용부(323)에서도 증폭 과정이 수행될 수 있다.
도 6은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이(400)를 설명하기 위한 단면도이다. 도 7은 도 6에 도시된 영역 C를 확대한 단면도이다. 특히, 매크로-웰(420) 영역으로 이용되는 제2 영역에서 PCR에 의한 증폭 과정을 설명하기 위한 단면도이다.
도 6 및 도 7을 참조하면, 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이(400)는 복수의 마이크로-웰들(110) 및 하나 이상의 매크로-웰(420)을 포함하고, 디지털 PCR 및 실시간 PCR을 하나의 카트리지에서 동시에 구현한다.
마이크로-웰들(110)은 실시간 디지털 PCR용 웰 영역으로 이용되는 제1 영역에 형성되고 제1 체적의 시료를 각각 수용하도록 구성된다. 마이크로-웰들(110)은 평면상에서 관찰할 때 사각형, 오각형, 육각형, 원형, 타원형 등과 다양한 형상을 가질 수 있다. 본 실시예에서, 마이크로-웰들(110)은 벌집 형상을 가질 수 있다. 마이크로-웰들(110)의 수는 수 천개 내지 수 만개일 수 있다.
본 실시예에서, 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이(400)는, 매크로-웰(420)의 중심 영역에 형성된 중심 채움부재(422)와, 매크로-웰(420)에서 중심 채움부재(422)를 둘러싸는 제1 수용부(423)를 형성하기 위해 균일하게 형성된 복수의 파티션들(424)을 더 포함할 수 있다. 중심 채움부재(422)의 높이는 파티션들(424)의 높이보다 낮으므로, 중심 채움부재(422)에 대응하여 제2 수용부(425)가 형성될 수 있다.
본 실시예에서, 매크로-웰(420)의 높이는 마이크로-웰들(110)의 높이보다 낮을 수 있다.
본 실시예에서, 제1 수용부(423)의 폭은 마이크로-웰들(110) 각각의 폭과 동일할 수 있고, 제2 수용부(425)의 폭은 제1 수용부(423)의 폭보다 클 수 있다. 한편, 제1 수용부(423)의 폭은 마이크로-웰들(110) 각각의 폭과 상이할 수 있고, 제2 수용부(425)의 폭은 제1 수용부(423)의 폭보다 클 수 있다.
상기 파티션들(424)이 형성된 간격에 따라 제1 수용부(423)가 정의될 수 있고, 중심 채움부재(422)의 높이 및 폭에 따라 제2 수용부(425)가 정의될 수 있다. 예를 들어, 파티션들(424)이 제1 간격(g1)으로 형성되면 작은 크기의 제1 수용부(423)가 형성될 수 있다. 또한 중심 채움부재(422)가 제2 폭(w2)과 일정 높이로 형성되면 제1 수용부(423)보다 큰 제2 수용부(425)가 형성될 수 있다.
본 실시예에서, 파티션들(424) 각각의 높이는 마이크로-웰들(110) 각각의 높이보다 낮을 수 있다. 이에 따라, 매크로-웰(420)들 내에서 웰간 격리가 되지 않는다. 따라서, 매크로-웰(420)의 제2 수용부(425)에 제공된 시료는 파티션을 넘어 제1 수용부(423)에 도달될 수 있고, 제1 수용부(423)에서도 증폭 과정이 수행될 수 있다.
도 8은 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이를 설명하기 위한 평면도이다. 도 9a는 도 8에 도시된 라인 III-III'으로 절단한 단면도이고, 도 9b는 도 8에 도시된 라인 IV-IV'으로 절단한 단면도이다.
도 8, 도 9a 및 도 9b를 참조하면, 본 발명의 또 다른 실시예에 따른 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이(500)는 복수의 마이크로-웰들(110) 및 하나 이상의 매크로-웰(520)을 포함하고, 디지털 PCR 및 실시간 PCR이 하나의 카트리지에서 동시에 구현될 수 있다.
본 실시예에서, 매크로-웰들(520)은 4개로 구성되고 2행 2열 구조로 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이(500)의 코너 부위에 형성된다.
도 8, 도 9a 및 도 9b에 도시된 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이(500)는 도 1a 및 도 1b에 도시된 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이(100)와 비교할 때, 매크로-웰들(520)의 개수 및 위치만 상이할 뿐 나머지는 동일하므로, 그 상세한 설명은 생략한다.
이상에서 설명된 바와 같이, 본 실시예들에 따르면, 실시간 디지털 PCR용 웰과 분리된 실시간 PCR 용 웰을 동일한 웰 구조물에 구성함으로써, 디지털 PCR에서의 포지티브 콘트롤로 사용이 가능하다. 또한 분리된 개별 웰 내에 각각 다른 타겟의 프라이머 및 프로브(Primer & Probe)를 고정시켜서, 형광 채널을 증가시키지 않아도 여러 타겟을 검출할 수 있다. 여기서, 상기한 프라이머 및 프로브의 고정 위치는 마이크로-웰들이나 매크로-웰과 같은 웰 위에 놓여지는 LID 부, 상기한 웰 아래에 놓여지는 센서부 및 상기한 웰의 내벽을 포함한 구조물 등 다양한 위치일 수 있다.
상기한 프라이머 및 프로브 고정을 위한 면의 형태는 평평한 면, 요철명, 그루브, 볼록한 댐(dam) 내부일 수 있다.
또한 분리된 개별 웰에서의 다중과 기능을 통해 개별 타겟의 음성 및 양성을 분리하게 되면, 디지털 PCR 웰 영역에서의 반응으로 실시간 PCR에서의 양성 타겟에 대한 실시간 정량 분석 결과를 추출할 수 있다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이를 이용한 PCR 분석 방법을 설명하기 위한 흐름도이다.
도 10을 참조하면, 제1 영역에 형성되고 제1 체적의 시료를 각각 수용하도록 구성된 복수의 마이크로-웰들과, 제2 영역에 형성되고 제2 체적의 시료를 각각 수용하도록 구성된 복수의 매크로-웰들을 포함하는 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이를 준비한다(단계 S110). 상기한 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이는 도 1 내지 도 9b에서 설명된 바와 같이 다양한 형태 및 형상으로 구현될 수 있다.
이어, 디지털 PCR 및 실시간 PCR에 적합한 개별 혹은 일체의 검사 시약을 준비한다(단계 S120).
이어, PCR 혼합물을 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이의 주입구에 주입한다(단계 S130). 상기 PCR 혼합물은 동시에 주입될 수도 있고 개별로 주입될 수도 있다.
이어, PCR 리더기에 검체 정보를 입력한다(단계 S140).
이어, 상기 PCR 리더기에 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이를 로딩한다(단계 S150).
이어, 주입된 유효 웰을 인식한다(단계 S160).
이어, P상기 CR 리더기에서 히트 사이클 동작을 수행한다(단계 S170).
이어, 개별 히트 사이클 완료 후 각 웰에서의 형광 신호를 표시한다(단계 S180).
모든 히트 사이클 완료 후 분석 결과 보고서를 생성하고, 사용자에게 다양한 데이터 시각화를 보여주는 디스플레이를 위한 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)를 통해 표시한다(단계 S190). GUI는 칩 상에서 수행된 실험으로부터 데이터 시각화를 사용자에게 제공하고 그래서 사용자는 데이터를 검토할 수 있다. 여기에서 설명되는 다양한 실시예에 의하면, 품질에 기반하여 추가적 분석을 위한 데이터를 사용자가 식별하는 것을 도와주기 위해, 예를 들어, 여러 다른 데이터 시각화가 사용자에게 디스플레이하도록 프로세서에 의해 생성될 수 있다. 다양한 실시예에 의하면, 데이터는 복수의 반응 부위의 각각으로부터의 검출된 형광 데이터를 포함한다. GUI는 그 데이터를 사용자가 보기를 바라는 칩을 사용자가 선택하게 할 수 있다. GUI는 적어도 하나의 실험으로부터의 데이터를 디스플레이할 수 있다.
이용가능한 칩 데이터는 사용자가 선택하도록 메뉴에 디스플레이될 수 있다. 사용자가 볼 칩을 선택할 때, 대응하는 데이터는 사용자가 복수의 반응 부위에서 양성 및 음성 반응을 식별할 수 있도록 다양한 방식으로 디스플레이될 수 있다. 환언하면, 반응 부위에서의 양성 반응(형광 검출됨)은 하나의 색상으로 디스플레이될 것인 한편 반응 부위에서의 음성 반응(형광 검출 안됨)은 제2 색상으로 디스플레이될 것이다.
더욱, 사용자가 양성 및 음성 반응의 표현 및 양성 및 음성 반응의 위치를 보는 것은 실험 내 또는 데이터 내 어떠한 에러 또는 수차라도 더 잘 식별할 수 있을 수 있다. 예를 들어, 칩의 일부 내 복수의 반응 부위에 시료의 불충분한 적재는 칩의 데이터 시각화로부터 명백할 수 있다. 양성 및 음성 반응을 유용하게 볼 수 있는, 칩내 많은 수의 반응 부위 때문에, 칩은 복수의 부분도로 시각화될 수 있다. 이러한 방식으로, 사용자는 양성 및 음성 반응의 디스플레이를 보기 쉽도록 더 작은 부분으로 볼 수 있을 수 있다.
도 11은 본 발명에 따라 디지털 PCR 및 실시간 PCR의 동시 진행에 따른 PCR 분석 결과 보고서의 일례를 설명하기 위한 도면이다. 특히, 포지티브 콘트롤 활용 예시가 도시된다.
도 11을 참조하면, 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)의 a1 영역에는 타겟 DNA 검출 웰에 대한 이미지가 표시되고, GUI의 a2 영역에는 실시간 PCR용 웰에 대한 이미지가 표시된다. 즉, GUI의 a2 영역에는 포지티브 콘트롤(Positive Control)이 포함될 수 있다.
GUI의 b1 영역에는 초록색으로 표시되는 양성 반응 웰, 빨란색으로 표시되는 포지티브 콘트롤 반응 영역, 노란색으로 표시되는 음성 반응 웰 영역이 표시된다.
도 12는 본 발명에 따라 디지털 PCR 및 실시간 PCR의 동시 진행에 따른 PCR 분석 결과 보고서의 일례를 설명하기 위한 도면이다. 특히, 디지털 PCR 및 실시간 PCR을 동시에 진행한 결과 분석 활용예를 설명하기 위한 도면이다.
도 12를 참조하면, 그래픽 사용자 인터페이스(GUI)의 a1 영역에는 타겟 DNA 검출 웰에 대한 이미지가 표시되고, GUI의 a2 영역에는 실시간 PCR용 웰에 대한 이미지가 표시된다. 즉, GUI의 a2 영역에는 포지티브 콘트롤(Positive Control)이 포함될 수 있다.
GUI의 b1 영역에는 초록색으로 표시되는 양성 반응 웰, 빨란색으로 표시되는 포지티브 콘트롤 반응 영역, 노란색으로 표시되는 음성 반응 웰 영역이 표시된다.
GUI의 b2 영역에는 실시간 PCR용 웰에서의 타겟 프라이머 및 프로브(Primer & Probe)에 따른 PCR 결과 및 사이클별 형광 검출 플롯이 표시된다.
GUI의 c 영역에는 기준 타겟 결과 관계 및 개별 실시간 PCR에서 확보된 임계 사이클값(CT)을 통해 분석된 상대 정량 카피 수 정보가 그래프 형태로 표시된다.
상기 기준 타겟 결과는 (임계 사이클값(CT) - X0, 절대 정량 카피 수 - Y0)의 관계로 표시된다. 상기 상대 정량 카피 수 정보는 (임계 사이클값(CT) - X1~Xn, 상대 정량 카피 수 - Y1~Yn)의 관계로 표시된다. 여기서, X0은 임의의 매크로-웰에서의 타겟에 대해 분석 확인된 기준 임계 사이클값(CT)(Reference Ct)이고, Y0은 임의의 매크로-웰의 임의의 타겟과 동일한 타겟에 의한 마이크로-웰에서 확인된 정량 카피 수(기준 카피 수)이다. 또한 X1, X2, …, Xn은 나머지 매크로-웰에서의 개별 타겟에 대해 확인된 임계 사이클값(CT)이다. 또한 Y1, Y2, …, Yn은 X0 및 Y0의 Ct - 정량 카피 수 관계 및 측정 분석된 개별 웰의 임계 사이클값(CT)(X1, X2, …, Xn)을 통해 예측 가능한 상대적인 정량 카피 수이다.
일반적으로 디지털 PCR은, 통계적 기법으로 타겟의 절대 정량화를 얻기 위해, 포아송(Poisson) 확률 분포의 원리, 타겟 유전자의 물리적 규모에 상관된 PCR의 상대적 최소 부피 원리 및 실시간 PCR 원리를 근거하여 분석하게 되는데, 이를 위해서는 개별적으로 분리된 일정 수 이상의 웰 구조가 필요하게 된다.
실시간 PCR의 경우, 하나의 웰에서 하나 혹은 여러 형광 채널을 이용하여 다중 기법을 통해, 하나 혹은 여러가지 타겟을 검출할 수도 있다. 다만, 디지털 PCR과 달리, 절대적인 정량화된 검출 결과가 아니기 때문에, 표준물질과 비교를 통해 반응된 템플릿 DNA 양을 측정할 수 있다.
매크로-웰은 유전자 검사만이 아니라, 다른 바이오 물질의 검사를 위한 구조물로도 동시에 사용 가능하다.
하나의 반응 구조물에서는 검출하고자 하는 타겟 수 이상의 형광 수광을 위한 형광 채널이 필요하게 되지만, 본 발명에서는 동일한 칩 내에 평면상으로 분리된 영역 형성으로 형광 채널을 동등하게 증가 없이도 개별 타겟에 대한 검출을 할 수 있는 구조물이다.
매크로-웰이 형성된 실시간 PCR 영역은 개별 타겟 반응을 위한 각각의 프라이머 및 프로브(Primer & Probe)가 타겟 웰 별로 웰 내부 혹은 별도의 추가 구조에 의해서 고정될 수 있다.
매크로-웰이 형성된 실시간 PCR 영역에서 동일한 타겟 검출 목적의 웰 내에 프라이머 및 프로브를 고정시키기 위해, 임의의 필요한 면적에 해당하는 웰 크기가 혼합 구성될 수도 있다. 또한, 임의 필요한 면적에 해당하는 웰은 관통형이 아닌, 홈(또는 그루브(Groove)) 형태의 구조도 가능하다.
이상에서 설명된 바와 같이, 본 발명에 따르면, 유전자나 단백질 등의 바이오 물질 검사를 위한 디지털 PCR 및 실시간 PCR을 하나의 카트리지에서 동시에 수행할 수 있도록 구성함으로써, 형광 채널을 늘리지 않고도 다양한 종류의 바이오 물질 검출을 개별 분리된 웰들에서 동시에 실시간 및 정량 검출을 할 수 있다.
이상에서는 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
100, 200, 300, 400 : 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이
110 : 마이크로-웰 120, 220, 320, 420 : 매크로-웰
323 : 제1 수용부 325 : 제2 수용부
322, 422 : 파티션 422 : 중심 채움부재

Claims (19)

  1. 제1 영역에 형성되고 제1 체적의 시료를 각각 수용하도록 구성된 복수의 마이크로-웰 및 제2 영역에 형성되고 제2 체적의 시료를 각각 수용하도록 구성된 복수의 매크로-웰을 포함하는 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이; 및
    상면에 상기 하이브리드 PCR 카트리지용 웰 어레이가 배치되는 CMOS 포토센서를 포함하고,
    상기 제1 영역은 실시간 디지털 PCR용 웰 영역이고, 상기 제2 영역은 실시간 PCR용 웰 영역이며,
    상기 제2 영역의 상기 복수의 매크로-웰은 n개로 마련되어 n개의 타겟 반응이 개별적으로 일어나고, 상기 n개의 타겟 반응 중 임의로 선택된 하나의 타겟 반응을 기준 타겟 반응으로 하고,
    상기 복수의 마이크로-웰에는 상기 기준 타겟 반응과 동일한 타겟 반응이 일어나며,
    상기 기준 타겟 반응이 일어난 매크로-웰에서 측정된 데이터로부터 임계 사이클값(CT) X0를 획득하고, 상기 복수의 마이크로-웰에서 측정된 데이터로 산출된 절대 정량 카피 수 Y0를 획득하고,
    상기 복수의 매크로-웰 중에서 상기 기준 타겟 반응이 일어나지 않은 다른 하나의 매크로-웰에서 측정된 데이터에서 임계 사이클 값 Xn을 획득하며,
    상기 X0와 Y0의 관계를 근거로, 상기 Xn에 대한 상대 정량 카피 수 Yn을 예측하는 것인 하이브리드 PCR 카트리지.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 제2 영역은 상기 제1 영역의 주변 영역에 형성된 것을 특징으로 하는 하이브리드 PCR 카트리지.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제2 영역은 상기 제1 영역을 기준으로 양측에 형성된 것을 특징으로 하는 하이브리드 PCR 카트리지.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제2 영역은 상기 웰 어레이의 코너에 형성된 것을 특징으로 하는 하이브리드 PCR 카트리지.
  7. 제1항에 있어서, 상기 복수의 매크로-웰의 높이와 상기 복수의 마이크로-웰들 각각의 높이는 동일한 것을 특징으로 하는 하이브리드 PCR 카트리지.
  8. 제1항에 있어서, 상기 복수의 매크로-웰에 제1 수용부를 형성하기 위해 균일하게 형성된 복수의 파티션들을 더 포함하고,
    상기 제1 수용부의 폭은 상기 복수의 마이크로-웰들 각각의 폭과 동일한 것을 특징으로 하는 하이브리드 PCR 카트리지.
  9. 제1항에 있어서, 상기 복수의 매크로-웰에 제1 수용부를 형성하기 위해 균일하게 형성된 복수의 파티션들을 더 포함하고,
    상기 제1 수용부의 폭은 상기 복수의 마이크로-웰들 각각의 폭과 상이한 것을 특징으로 하는 하이브리드 PCR 카트리지.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 파티션들 각각의 높이는 상기 복수의 마이크로-웰들 각각의 높이보다 낮은 것을 특징으로 하는 하이브리드 PCR 카트리지.
  11. 제1항에 있어서, 상기 복수의 매크로-웰에 제1 수용부 및 제2 수용부를 형성하기 위해 국부적으로 형성된 복수의 파티션들을 더 포함하고,
    상기 제1 수용부의 폭은 상기 복수의 마이크로-웰들 각각의 폭과 동일하고,
    상기 제2 수용부의 폭은 상기 제1 수용부의 폭보다 큰 것을 특징으로 하는 하이브리드 PCR 카트리지.
  12. 제1항에 있어서, 상기 복수의 매크로-웰에 제1 수용부 및 제2 수용부를 형성하기 위해 국부적으로 형성된 복수의 파티션들을 더 포함하고,
    상기 제1 수용부의 폭은 상기 복수의 마이크로-웰들 각각의 폭과 상이하고,
    상기 제2 수용부의 폭은 상기 제1 수용부의 폭보다 큰 것을 특징으로 하는 하이브리드 PCR 카트리지.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 복수의 매크로-웰의 높이는 상기 복수의 마이크로-웰들의 높이보다 낮은 것을 특징으로 하는 하이브리드 PCR 카트리지.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 복수의 매크로-웰의 중심 영역에 형성된 중심 채움부재; 및
    상기 복수의 매크로-웰에서 상기 중심 채움부재를 둘러싸는 제1 수용부를 형성하기 위해 균일하게 형성된 복수의 파티션들을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 하이브리드 PCR 카트리지.
  15. 제14항에 있어서, 상기 제1 수용부의 폭은 상기 복수의 마이크로-웰들 각각의 폭과 동일한 것을 특징으로 하는 하이브리드 PCR 카트리지.
  16. 제14항에 있어서, 상기 제1 수용부의 폭은 상기 복수의 마이크로-웰들 각각의 폭과 상이한 것을 특징으로 하는 하이브리드 PCR 카트리지.
  17. 제14항에 있어서, 상기 복수의 매크로-웰의 높이는 상기 복수의 마이크로-웰들의 높이보다 낮은 것을 특징으로 하는 하이브리드 PCR 카트리지.
  18. 제14항에 있어서, 상기 중심 채움부재의 높이는 상기 파티션들의 높이보다 낮은 것을 특징으로 하는 하이브리드 PCR 카트리지.
  19. 삭제
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