KR102675379B1 - 닭가슴살 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 근력 개선, 항산화 또는 장내 미생물 환경 개선용 식품 조성물 - Google Patents
닭가슴살 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 근력 개선, 항산화 또는 장내 미생물 환경 개선용 식품 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
닭가슴살 단백질 가수분해물로서, 체외 및 동물실험을 통해 근 감소 완화, 항산화 및 장내 미생물 개선 효과가 검증된 닭가슴살 단백질 가수분해물 및 이를 유효성분으로 함유하는 식품 조성물이 개시된다. 본 발명은 닭가슴살을 알칼리 프로테아제(alkaline protease)로 1차 효소분해하고, 류신 아미노펩티데이즈(leucine aminopeptidase), 브로멜라인(bromelain) 및 파파인(papain)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 효소로 2차 효소분해하여 수득한 닭가슴살 단백질 가수분해물 및 이를 유효성분으로 함유하는 근 감소 완화, 항산화 또는 장내 미생물 개선용 식품 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 닭가슴살 단백질 가수분해물을 포함하는 식품 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 1차 및 2차 효소분해로 수득한 닭가슴살 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 근 감소 완화, 항산화 또는 장내 미생물 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
단백질은 아미노산을 기본단위로 구성된 고분자물로 인간에게 가장 중요한 다량 영양소로 여겨진다. 특히나 근육 및 면역체 형성에 필수성분으로 성장 발육기 및 노년기의 근 손실 예방 및 면역기능 저하 방지를 위해 필수아미노산 조성이 우수한 동물성 단백질 급원을 섭취해야 한다(비특허문헌 1 참조).
단백질은 주로 육류, 달걀과 두류 및 견과류에 다량 함유되어 있으며(비특허문헌 2 참조), 한국인 하루 평균 섭취량은 88.1 g으로 성인 남성 하루 필요량 65 g에 비해 기준량 이상을 섭취하고 있는 것으로 보이나, 2019년 대한민국 질병관리청 발표에 따르면 전체 인구의 19.4%는 이 기준량에 미치지 못하게 단백질을 섭취하고 있는 것으로 보고된 바 있다(비특허문헌 3 참조).
단백질의 주요 급원으로서 수조육류의 경우, 필수 아미노산의 필요량이 충분한 완전 단백질을 포함하고 있고, 예컨대, 100 g 가식 부위당 소고기는 19 g, 돼지고기는 17 g, 닭고기는 21 g 그리고 오리고기는 16 g의 단백질을 포함하며, 특히 닭고기의 아미노산 조성은 타 육류와 비교하여 라이신, 메티오닌, 트립토판 등 필수 아미노산 함량이 높다(비특허문헌 4 참조). 닭고기는 부위별로 조단백 함량의 차이가 큰데, 그중 가슴살 부위는 조단백량 및 필수아미노산 함량이 높은 반면, 지방 및 콜레스테롤 함량은 부위 중 가장 낮은 것으로 보고되어(비특허문헌 5 및 6 참조), 효율적인 단백질 급원의 역할뿐만 아니라 심혈관 질환자들의 단백질 급원으로서 유용한 식품 소재로 활용된다.
마이크로바이옴(Microbiome)이란 미생물 군집(microbiota)과 유전체(genome)의 합성어로, 특정 환경에 서식하는 모든 미생물의 총체적인 유전정보 내지 미생물군 자체를 의미한다. 인체에는 구강, 피부, 장 등 인체의 부위별로 특이적인 마이크로바이옴을 구성하고 있으며, 특히 장의 마이크로바이옴은 비만, 당뇨, 염증성 장 질환, 알츠하이머 등의 다양한 질환과 연관성이 있는 것으로 보고되고 있어, 장내 미생물을 조절하기 위한 프리바이오틱스 및 프로바이오틱스 성분이 세계적인 인기를 끌고 있다.
한편, 다이어트 목적으로 과도히 닭가슴살을 섭취할 경우, 장 환경에 영향을 미쳐 장내 유해균을 증가시켜 장 질환의 원인이 될 수 있다고 알려져 있는데, 우수한 단백질 공급원인 닭가슴살 섭취 시 장내 유익균은 증가시키고, 유해균은 감소시킬 수 있는 방법에 대한 연구가 요구되고 있다.
[비특허문헌]
1. Han JS, Kwon SM, Kim BY, Song EJ. Nutrition and food for health. Jigu Culture, Gyeonggi, Korea. 2014. p 36-43.
2. Jo SW, Yim EJ, Kim YS, Lo CS, Shin DH. Comparison of the chemical and amino acid compositions of breast meat of broiler and laying hens. Korean J Food Preserv. 2021. 28:297-302.
3. KDCA. Korea Health Statistics 2018: Korea National Health and Nutrition Examination Survey (KNHANES ⅦKorea Disease Control and Prevention Agency, Cheongju, Korea. 2019. p 2-27.
4. National Institute of Agricultural Sciences. Korean Food Composition Table. 9th revision. National Institute of Agricultural Sciences, Suwon, Korea. 2016. p 218-272.
5. Jo SW, Yim EJ, Kim YS, Lo CS, Shin DH. Comparison of the chemical and amino acid compositions of breast meat of broiler and laying hens. Korean J Food Preserv. 2021. 28:297-302.
6. Koh HY, Yu IJ. Nutritional analysis of chicken parts. J Korean Soc Food Sci Nutr. 2015. 44:1028-1034.
[특허문헌]
- 한국 공개특허 제10-2017-0033623호(2017.03.27.)
따라서, 본 발명은 1차 및 2차 효소분해로 수득한 닭가슴살 단백질 가수분해물 및 이를 유효성분으로 함유하는 근 감소 완화, 항산화 또는 장내 미생물 개선용 식품 조성물을 제공하고자 한다.
상기 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 닭가슴살을 알칼리 프로테아제(alkaline protease)로 1차 효소분해하고, 류신 아미노펩티데이즈(leucine aminopeptidase), 브로멜라인(bromelain) 및 파파인(papain)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 효소로 2차 효소분해하여 수득한 닭가슴살 단백질 가수분해물을 제공한다.
또한 상기 2차 효소분해는 류신 아미노펩티데이즈(leucine aminopeptidase), 브로멜라인(bromelain) 및 파파인(papain)이 사용되고, 상기 류신 아미노펩티데이즈(leucine aminopeptidase), 브로멜라인(bromelain) 및 파파인(papain)의 중량비는 1 내지 3 : 0.5 내지 1.5 : 1인 것을 특징으로 하는 닭가슴살 단백질 가수분해물을 제공한다.
상기 다른 과제를 해결하기 위하여 본 발명은 상기 닭가슴살 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 근 감소 완화용 식품 조성물을 제공한다.
또한 상기 닭가슴살 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 식품 조성물을 제공한다.
또한 상기 닭가슴살 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 장내 미생물 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한 상기 조성물은 장내 프로피오네이트(propionate) 및 이소발러레이트(isovalerate)의 생산량을 증가시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 장내 미생물 개선용 식품 조성물을 제공한다.
또한 상기 조성물은 Bacteroides, Muribaculaceae, Lactobacillus 및 Lachnoclostridium 속으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 장내 유익균의 생장을 촉진할 수 있고, 상기 조성물은 Enterorhabdus, Enterorhabdus, Streptococcus 및 Escherichia-Shigella 속으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 장내 유해균의 생장을 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 장내 미생물 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 닭가슴살을 1차 및 2차 효소분해하여 수득한 닭가슴살 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물로서, 근 감소 완화, 항산화 및 장내 미생물 개선 효과가 뛰어나고, 특히 장내 단쇄지방산 중 프로피오네이트(propionate) 및 이소발러레이트(isovalerate)의 생산량을 증가시킬 수 있고, 장내 유익균인 Lactobacillus, Bacteroides, Muribaculaceae, Lachnoclostridium 속의 생장은 촉진하고, 장내 유해균인 Streptococcus 및 Helicobacter 속의 생장은 억제할 수 있는 식품 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실험예에서 단백질 처리에 따른 C2C12 근육세포에서의 근대사 관련 유전자의 발현량을 Real-time PCR로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실험예에서 단백질 처리에 따른 C2C12 근육세포에서의 근대사 관련 단백질의 발현량을 Western blot으로 분석한 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 기간 동안의 각 군의 체중 변화를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 기간 동안의 각 군의 허벅지 두께 변화를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 인장력 변화를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 부위별 근육 중량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 앞정강근의 단백질 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 근육조직 내 지질함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 근육조직의 형태학적 관찰 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 근육조직에 대한 면역조직학적 분석 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 근육대사 관련 유전자의 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 근육대사 관련 단백질의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 기간 동안의 각 군의 공복혈당을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 경구 포도당 부하 검사를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 혈장, 간조직 및 근조직에 대한 혈당 관련 인자들의 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 당대사 관련 효소의 활성도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 당대사 관련 간조직 및 근조직 유전자의 발현도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 기간 동안의 각 군의 혈장 내 지질 수준을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 혈장 내 지질 수준을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 간조직 내 지질 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 21은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 간조직 지질대사 관련 효소의 활성도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 간조직에 대한 형태학적 변화를 관찰한 결과를 나타낸 사진이다.
도 23은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 지방조직에 대한 형태학적 변화를 관찰한 결과를 나타낸 사진이다.
도 24는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 혈장 면역 사이토카인 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 25는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 혈장 Myokine을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 26은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 혈장 및 적혈구 내 항산화 효소의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 27은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 혈장 GOT 및 GPT와 뇨중 BUN 및 Creatinine 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 28은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 분변 중 단쇄지방산의 양을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 29는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 분변 중 중성지질 및 콜레스테롤 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 30은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 분변 내 미생물의 상대적 풍부도를 역(Domain, d), 과(Family, f) 및 속(Genus, g) 수준으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 31은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 분변 내 유익균인 Lactobacillus, Bacteroides, Muribaculaceae 및 Lachnoclostridium 속의 상대적인 풍부도를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 32는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 분변 내 유해균인 Enterohavdus, Desulfovibrio, Streptococcus, Helicobacter 및 Eschericia-Sigella 속의 상대적인 풍부도를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 33은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 분변 내 마이크로바이옴에 대한 알파 다양성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 34는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 분변 내 마이크로바이옴에 대한 베타 다양성(beta diversity)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 일 실험예에서 단백질 처리에 따른 C2C12 근육세포에서의 근대사 관련 단백질의 발현량을 Western blot으로 분석한 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 기간 동안의 각 군의 체중 변화를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 기간 동안의 각 군의 허벅지 두께 변화를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 인장력 변화를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 부위별 근육 중량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 앞정강근의 단백질 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 근육조직 내 지질함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 근육조직의 형태학적 관찰 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 근육조직에 대한 면역조직학적 분석 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 근육대사 관련 유전자의 발현을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 근육대사 관련 단백질의 발현량을 측정한 결과를 나타낸 사진 및 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 기간 동안의 각 군의 공복혈당을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 경구 포도당 부하 검사를 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 혈장, 간조직 및 근조직에 대한 혈당 관련 인자들의 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 당대사 관련 효소의 활성도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 당대사 관련 간조직 및 근조직 유전자의 발현도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 18은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 기간 동안의 각 군의 혈장 내 지질 수준을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 19는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 혈장 내 지질 수준을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 20은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 간조직 내 지질 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 21은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 간조직 지질대사 관련 효소의 활성도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 22는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 간조직에 대한 형태학적 변화를 관찰한 결과를 나타낸 사진이다.
도 23은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 지방조직에 대한 형태학적 변화를 관찰한 결과를 나타낸 사진이다.
도 24는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 혈장 면역 사이토카인 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 25는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 혈장 Myokine을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 26은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 혈장 및 적혈구 내 항산화 효소의 활성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 27은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 혈장 GOT 및 GPT와 뇨중 BUN 및 Creatinine 농도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 28은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 분변 중 단쇄지방산의 양을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 29는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 분변 중 중성지질 및 콜레스테롤 함량을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 30은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 분변 내 미생물의 상대적 풍부도를 역(Domain, d), 과(Family, f) 및 속(Genus, g) 수준으로 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 31은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 분변 내 유익균인 Lactobacillus, Bacteroides, Muribaculaceae 및 Lachnoclostridium 속의 상대적인 풍부도를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 32는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 분변 내 유해균인 Enterohavdus, Desulfovibrio, Streptococcus, Helicobacter 및 Eschericia-Sigella 속의 상대적인 풍부도를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 33은 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 분변 내 마이크로바이옴에 대한 알파 다양성을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 34는 본 발명의 일 실험예에서 12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 분변 내 마이크로바이옴에 대한 베타 다양성(beta diversity)을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예의 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원 시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.
본 발명은 닭가슴살을 알칼리 프로테아제(alkaline protease)로 1차 효소분해하고, 류신 아미노펩티데이즈(Leucine amino peptidase), 브로멜라인(bromelain) 및 파파인(papain)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 효소로 2차 효소분해하여 수득한 닭가슴살 단백질 가수분해물을 개시한다.
본 발명에서 상기 알칼리 프로테아제(alkaline protease)는 중성 내지 알칼리성 pH 조건에서 최적의 단백질 가수분해 활성을 갖는 효소로서, 슬라이스 또는 분쇄된 닭가슴살에 1차적으로 처리되어 단백질을 폴리펩타이드로 분해시킬 수 있다.
본 발명에서 상기 알칼리 프로테아제는 상업적으로 구입하거나 동물, 식물 및 미생물에서 추출 또는 정제하여 사용될 수 있으며, 입수 방법에는 제한이 없으나, 바람직하게는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)에서 유래된 서브틸리신(subtilisin)이 사용될 수 있고, 이의 시판예는 40 내지 70℃에서 최적 활성을 나타내는 푸드프로 알칼리 프로테아제(FoodPro® Alkaline Protease)일 수 있다.
본 발명에서 상기 알칼리 프로테아제의 처리 시, 상기 닭가슴살 중량의 1 내지 5배의 물이 첨가될 수 있고, 상기 알칼리 프로테아제는 상기 닭가슴살 100 중량부 대비 0.01 내지 2 중량부 첨가될 수 있고, 바람직하게는 0.03 내지 1.0 중량부, 더욱 바람직하게는 0.08 내지 0.3 중량부 첨가될 수 있다.
본 발명에서 상기 류신 아미노펩티데이즈(Leucine amino peptidase)는 단백질의 N 말단에 위치한 류신 잔기에서의 가수분해 반응을 일으키는 엑소 펩티데이즈(Exo-peptidase)의 일종으로서, 그 입수 방법에는 제한이 없으나, 바람직하게는 아스페르질루스 오리자에(Aspergillus oryzae)의 배양물에서 얻어진 효소를 사용할 수 있고, 그 시판예는 프로자임 2000P(Prozyme 2000P)일 수 있다.
또한 상기 브로멜라인(bromelain)은 파인애플에서 추출되는 단백질 분해 효소로서, 고기의 육질을 연하게 하고 항염증 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 상기 파파인(papain)은 열대 과일 파파야의 열매 및 잎에서 추출되는 단백질 분해 효소로서, 우유단백질을 가수분해하여 철 결합 능력이 있는 펩타이드를 얻을 수 있다.
본 발명에서 상기 2차 효소분해는 상기 1차 효소분해 결과물을 대상으로 상기 류신 아미노펩티데이즈(Leucine amino peptidase), 상기 브로멜라인(bromelain) 및 상기 파파인(papain)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 효소가 사용될 수 있다.
상기 2차 효소분해에서 사용되는 상기 류신 아미노펩티데이즈, 상기 브로멜라인 또는 상기 파파인은 상기 닭가슴살 100 중량부 대비 0.01 내지 2 중량부로 각각 첨가될 수 있고, 바람직하게는 0.05 내지 1.2 중량부로 첨가될 수 있다.
또한 본 발명의 일 실시예에 따르면, 근 감소 완화, 항산화 및 장내 미생물 개선 효과의 극대화 관점에서, 상기 2차 효소분해는 상기 류신 아미노펩티데이즈, 상기 브로멜라인 및 상기 파파인이 함께 사용될 수 있고, 그 중량비는 1 내지 3 : 0.5 내지 1.5 : 1일 수 있고, 바람직하게는 1.5 내지 2.5 : 0.8 내지 1.2 : 1일 수 있으며, 가장 바람직하게는 2:1:1일 수 있다.
본 발명에 따른 상기 닭가슴살 단백질 가수분해물은 근 감소 완화 효과, 항산화 효과 및 장내 미생물 개선 효과를 구현하며, 예컨대, 노화 마우스에 대한 동물 실험으로서, 대조군 대비 허벅지 두께를 증가시키고, 간 조직 및 적혈구에서 항산화 효소의 활성을 증가시켰으며, 장내 항상성 유지에 중요한 것으로 알려진 단쇄지방산 중, 프로피오네이트(propionate) 및 이소발러레이트(isovalerate)의 생산량을 증가시키고, 장내 Lactobacillus, Muribaculaceae, Lachnoclostridium 및 Desulfovibrio 속의 생장은 촉진하고, Streptococcus 및 Helicobacter 속의 생장은 억제하는 것을 확인하였다.
본 발명에 따른 상기 닭가슴살 단백질 가수분해물은 식품 조성물의 형태로 제공될 수 있다.
상기 식품 조성물은 기능성 식품, 영양 보조제, 건강 식품, 식품 첨가제 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다.
예를 들면, 건강 식품으로는 상기 조성물 자체를 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다.
또한, 기능성 식품으로는 음료, 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레 이드 등), 어류, 육류, 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 닭가슴살 단백질 가수분해물을 첨가하여 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물 중 상기 닭가슴살 단백질 가수분해물의 바람직한 함량은 식품 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50% 일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 50%, 더욱 바람직하게는 1 내지 20% 범위로 함유될 수 있다.
이하, 구체적인 실험예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
실시예: 닭가슴살 단백질 가수분해물 제조
교촌에프앤비(주)(Osan, Korea)에서 제공하는 부분육인 닭가슴살을 사용하였고, 이하의 효소는 (주)비전바이오켐(Seongnanm, Korea)에서 구입하여 사용하였다.
상기 닭가슴살을 슬라이스하고 2 mm 초퍼(chopper)를 이용해 분쇄하여 효소분해를 위한 전처리를 하였다. 닭가슴살 분쇄물 100 중량부에 대하여 3배의 물을 첨가한 후, 푸드프로 알칼리 프로테아제(FoodPro® Alkaline Protease)를 0.1 중량부를 첨가하고 55℃에서 4시간 반응하였다. 그 후 프로자임 2000P(Prozyme 2000P) 0.1 중량부, 브로멜라인(bromelain) 0.05 중량부 및 파파인(papain) 0.05 중량부를 넣고 55℃에서 2시간 반응하였다. 효소반응이 끝난 후 남은 효소를 실활시키기 위해 90℃에서 30분 처리하였다. 그리고 규조토를 이용하여 여과 후 15 내지 20 brix까지 농축하여 95℃에서 살균 분무건조를 하여 닭가슴살 단백질 가수분해물을 완성하였다.
실험예 1: C2C12 마우스 골격근 세포의 근육대사 관련 mRNA 및 단백질 발현도 분석
[실험방법]
C2C12 세포를 well당 2.7*10 cells/mL로 overnight 배양하였다. Well당 약 90%의 세포가 성장했을 때 DMEM에 20% horse serum 및 1% P/S 시약이 첨가된 배지를 사용하였고, 3일 동안 하루에 한 번씩 배지를 교체하였다. 분화 4일차 및 5일차에는 각 well에 배지의 조성을 달리하여 처리하였는데, 상기 배지(CON 군), 상기 배지에 유청 단백질이 1 mg/mL의 농도로 첨가된 배지(Whey 처리군), 대두 단백질이 1 mg/mL의 농도로 첨가된 배지(Soy 처리군), 상기 실시예에 따른 닭가슴살 단백질 가수분해물이 1 mg/mL의 농도로 첨가된 배지(실험군 1 또는 Chicken1) 및 상기 실시예에 따른 닭가슴살 단백질 가수분해물이 2 mg/mL의 농도로 첨가된 배지(실험군 2 또는 Chicken2)를 준비하였고, 각각의 배지를 각 well에 처리하였다(Dimauro, Ivan et al. 2012). 이후 각 well의 세포를 채취하여 300 rpm에서 5분간 원심분리한 후, 후술하는 실험예 2에서의 실험방법에 따라 Real-time PCR 및 Western blot 분석을 수행하였다.
[실험결과]
(1) C2C12 근육세포에서 근대사 관련 유전자 발현도 분석
단백질 처리에 따른 C2C12 근육세포에서의 PGC-1a, PI3K, MyoD, Myogenin, FoxO3, Atrogin 및 Murf와 같은 근대사 관련 유전자의 발현량을 비교하기 위하여 Real-time PCR 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1을 참조하면, 근합성 관련 유전자인 PGC-1a는 실험군 1 및 실험군 2에서 Whey 처리군 대비 유의적으로 발현도가 증가하였고, 근육분화인자인 MyoD 유전자 또한 실험군 1 및 실험군 2에서 Whey 처리군 및 Soy 처리군 대비 유의적으로 발현도가 증가한 것을 확인할 수 있다.
Myogenin 유전자는 Whey 처리군, 실험군 1 및 실험군 2에서 CON 군 대비 유의적으로 발현도가 증가하였으며, 특히 고농도의 닭가슴살 단백질 가수분해물을 처리한 실험군 2에서 저농도 처리한 실험군 1 대비 유의적으로 발현도가 증가하였다.
한편, Atrogin 유전자 발현은 모든 단백질 처리군에서 CON 군 대비 유의적으로 감소한 것으로 확인되었다.
(2) C2C12 근육세포에서 근대사 관련 단백질 발현도 분석
단백질 처리에 따른 C2C12 근육세포에서의 PGC-1a, P-Akt/Akt, P-AMPK/AMPK, Myostatin 및 Atrogin과 같은 근대사 관련 단백질의 발현량을 비교하기 위하여 Western blot 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2를 참조하면, PGC-1a 단백질 발현은 실험군 1 및 실험군 2에서 CON 군 대비 유의적으로 증가하였고, 고농도의 닭가슴살 단백질 가수분해물을 처리한 실험군 2는 P-Akt/Akt 및 P-AMPK/AMPK 단백질의 발현이 Whey 처리군 및 Soy 처리군 대비 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있다.
한편, 근육에서 발현되어 단백질 분해를 촉진하는 것으로 알려진 Atrogin 단백질의 발현은 고농도 닭가슴살 단백질 가수분해물을 처리한 실험군 2에서 Soy 처리군 대비 유의적으로 감소한 것을 확인할 수 있다.
상기 결과를 통해, 본 발명의 실시예에 따른 닭가슴살 단백질 가수분해물이 근육세포의 근대사 관련 유전자 및 단백질의 발현을 증가시킴으로써, 상기 닭가슴살 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물이 근 감소 완화를 목적으로 활용될 수 있음이 확인되었다.
실험예 2: 닭가슴살 단백질 가수분해물의 효과를 검증하기 위한 동물실험
본 발명의 실시예에 따른 닭가슴살 단백질 가수분해물의 근 감소 완화, 당 대사 개선, 지질 대사 개선, 염증성 사이토카인 분비 억제, 항산화 효소 활성 증가, 단쇄지방산 생산량 증가 및 장내 미생물 개선 효과를 검증하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
[실험방법]
(1) 동물 사육
도 1은 동물 실험의 전체적인 실험 디자인을 나타내는 흐름도이다.
도 1을 참조하면, 8 주령 및 50 주령의 C57BL/6J 마우스를 중아바이오(수원, 대한민국)에서 구입하여 2주일 동안 Lab chow로 적응시킨 후, AIN-93G diet를 기본으로 하는 YC군(young control group, 8 주령), NC군(normal control group, 50 주령), AIN-93G diet에 상기 닭가슴살 단백질 가수분해물의 용량별로 카제인(casein)을 대체하여 급여한 LP군(low protein diet, AIN-93G + 20% 닭가슴살 단백질 가수분해물, 50 주령), HP군(high protein diet, AIN-93G + 30% 닭가슴살 단백질 가수분해물, 50 주령)으로 나누어 12주간 사육하였다.
총 4개의 군이 섭취하는 식이의 열량은 corn starch를 조절하여 모두 동일하게 맞추어 제공되었고, 각 군의 상세한 식이의 조성은 하기 표 1에 나타내었으며, 카제인 및 닭가슴살 단백질 가수분해물의 조성은 하기 표 2에 나타내었다.
(2) 체중 측정
상기 각 군의 마우스는 사육 기간 동안 매주 1회 체중을 측정하였다.
(3) 인장력 및 뒷다리 근육 두께 측정
인장력 측정은 digital force gauge(FGJN.FGP Series, JM Instruments Corp., South Korea)를 사용하여 악력을 측정하고, 측정된 악력의 평균값으로 인장력을 계산하였으며, 인장력의 측정은 5일 동안 진행되었다.
또한 실험기간 12주 동안 4주마다 Bluetec digital(BD500)(BLUETEC, South Korea) caliper를 사용하여 좌우 뒷다리의 두께를 측정하였다.
(4) 조직에 대한 생화학 분석
1) 혈장 지질 분석
혈장 총 콜레스테롤 정량은 Allain 등 (1974)의 효소법을 응용한 측정용 시액(아산제약 kit)을 사용하였다. 혈장 콜레스테롤은 cholesteryl ester(CE) 및 유리콜레스테롤 두 형태로 존재하므로, 이들 전체를 정량하기 위하여 CE를 cholesterol esterase에 의해 지방산과 유리 콜레스테롤로 전환시켰다. 이렇게 전환된 유리콜레스테롤은 cholesterol oxidase에 의해 H2O2와 △4-cholestenon으로 전환시키고, 이 중 H2O2를 peroxidase, phenol 및 4-amino-antiptrine과 혼합하여 적색으로 발색시킨 후, 500 nm에서 측정된 흡광도를 콜레스테롤 표준용액(300 mg/dL)과 비교하여 정량하였다.
혈장 중성지질은 McGowan 등 (1983)의 효소법을 이용한 발색법 원리에 따라 중성지방 측정용 시약(아산제약 kit)을 사용하여 측정하였다. 혈장 내 중성지질은 lipoprotein lipase(LPL)에 의해 글리세롤과 지방산으로 분해되는데, 이 중 글리세롤은 ATP와 glycerol kinase(GK)의 작용으로 L-α-glycerophosphate를 형성하며, 이것은 O2 및 glycerophosphooxidase(GPO)와 반응하여 H2O2를 발생시킨다. 여기에 peroxidase와 4-amino-antipyrin을 처리하여 적색으로 발색시킨 후, 550 nm에서 흡광도를 측정하여, 이를 글리세롤 표준곡선과 비교하여 정량하였다.
혈장 유리지방산은 효소법을 이용한 발색법 원리에 따라 유리지방산 측정용 시액(Free Fatty Acid Quantification Assay Kit, abcam, Cambridge, UK)을 사용하여 측정하였다. 우선 혈장을 Fatty Acid Assay Buffer로 희석하고 Acyl-CoA synthetase (ACS) Reagent를 넣어 Acyl-CoA, AMP 및 pyrophosphoric acid를 생성하고, 이를 Assay Buffer, Fatty Acid Probe, Enzyme Mix 및 Enhancer를 섞은 Reaction Mix를 넣어 반응시킨 후, 570 nm에서 측정된 흡광도를 유리지방산 표준곡선과 비교하여 정량하였다.
혈장 HDL-cholesterol(HDL-C)은 HDL-C 측정용 시액(Asan kit, Korea)을 사용하여 측정하였다. 혈장 100 μL로 처리하여 분리 시액 중 인텅스텐산과 마그네슘 양이온의 작용에 의한 dextransulfate-MgCl2 침전법(Warnick 등, 1982)으로 지단백질 중 apo B를 포함하는 LDL(low density lipoprotein)및 VLDL(very low density lipoprotein)을 침전시킨 후 원심 분리에 의해 분리된 HDL(high density lipoprotein) 중의 콜레스테롤을 총 콜레스테롤 정량과 동일한 방법으로 500 nm(VERSAmax, Molecular devices Co, USA)에서 흡광도를 측정하고, 콜레스테롤 표준용액(50 mg/dL)과 비교하여 정량하였다.
혈장 nonHDL-cholesterol은 혈장 총 콜레스테롤과 HDL-콜레스테롤의 차이를 계산하여 정량하였다.
간 조직의 유리지방산은 Folch 등 (1957)의 방법을 따라 추출하였고, 간 조직 콜레스테롤 및 중성지방 함량은 Sale등 (1984)에 의해 수정 보완된 방법을 이용하였다. 간 조직 0.1 g을 잘게 자른 후 2 mL phosphate buffer (pH 8.0) 용액으로 균질화시킨 후 chloroform:methanol(1:1) 용매로 추출하였다. 추출액을 37
에서 질소 가스로 휘발시켜 isopropanol로 희석한 후 지질 정량을 위해 효소 시액에 유화제로 3 mM cholicacid(sodium salt)와 발색 시 일어나는 탁도(turbidity)를 제거하기 위하여 0.5% TritonX-100을 혼합하여 지질 성분을 추출한 후 상기 혈장 중성지질, 콜레스테롤 및 유리지방산 정량법과 동일하게 정량하였다.
2) 분변 지질 분석
분변을 분쇄한 뒤, 0.3 g씩 튜브에 넣고 chloroform-ethanol (2:1)을 3 mL 가하였다. Vortexing 하여 4℃에서 24시간 overnight 시킨 뒤, 원심분리하여 상층액을 취하여, 질소가스로 건조시켰다. 1 mL의 chloroform-ethanol(2:1)을 가하고, sonication으로 지질을 용해시켜, 중성지질(Triglyceride, TG) 및 콜레스테롤(cholesterol) 함량은 혈장과 같은 kit를 사용하여 분석하였다.
3) 공복 혈당 변화 측정, 혈당량 및 내당능(glucose tolerance) 측정
전체 실험기간 12주 동안 4주 간격으로 12시간 절식 후 꼬리정맥을 통해 채혈한 후 glucose oxidase 방법으로 혈당량을 측정하였다.
12시간 절식 후 포도당 용액을 체중 ㎏당 0.5 g씩 복강 내로 투여한 후 각각 0, 30, 60, 120분 경과 후에 꼬리정맥을 통해 혈액을 수집하였다. 수집한 혈액은 glucose oxidase 방법으로 당 농도를 측정하여 내당능을 비교하였다.
혈장 Glucose 함량 측정을 위해 glucose 측정용 시액(Asan kit, Korea)을 사용하였다. Glucose는 Glucose oxidase의 작용에 의해 gluconic acid와 hydrogen peroxide가 되고, hydrogen peroxide는 peroxidase를 생성하고 phenol과 4-aminoantipyrine을 산화적으로 축합시켜 키논형 적색 색소를 생성한다. 이러한 원리를 이용하여 혈장 200 μL에 효소 시액 3 mL를 가하여 37℃에서 5분간 반응시킨 후 500 nm에서 생성된 키논형 적색 색소의 흡광도를 측정하여 glucose 표준용액과 비교하여 정량하였다.
4) 혈장 인슐린(Insulin), 글루카곤(Glucagon) 및 사이토카인(Cytokines) 측정
혈장 인슐린측정은 Mouse Insulin ElLISA Kit(ThermoFisher SCIENTIFIC, Massachusetts, USA)를 사용하였다. 혈장 글루카곤은 Glucagon Immunoassay Quantikine ELISA Kit(R&D systems, Minnesota, USA)을 사용하여 측정하였다. 혈장 면역사이토카인(IL-1b, IL-6, IL-10 및 TNF-a)과 마이토카인(FGF-21, Irisin, LIF 및 SPARC)은 Merck Millipore for analysis(MTH17MAG-47K, MMYOMAG-74K, Merck, USA)를 활용하여 측정하였다.
5) 간 및 근육조직 글리코겐(glycogen) 분석
간 조직과 근육조직은 30% KOH 용액을 4배 가하여, 100℃에서 30분간 반응시킨 후 95% 에탄올로 24시간 침전시켜 6100 rpm 4℃에서 15분간 원심분리 후 상층액을 제거하고 증류수로 녹여 Anthrone 시약을 가하고 100℃에서 20분간 반응시킨 후 620 nm에서 흡광도를 측정하였다.
6) 혈장 GOT, GPT 및 BUN 농도 측정
Glutamic oxaloacetic transaminase(GOT)와 Glutamic pyruvic transaminase(GPT) 활성도를 Reitman 등 (1957)의 비색 분석법에 준한 효소법을 응용하여 분광 광도계로 분석하였다. 혈청 GOT의 경우 L-aspartate와 α-ketoglutarate, GPT의 경우 D,L-alanine과 α-ketoglutarate를 첨가하면 혈장의 효소에 의해 기질이 pyruvate로 전환되며, 이 pyruvate를 2,4-dinitrophenlhydrazine과 반응시켜 0.4N NaOH를 가하면 비색반응으로 발색이 일어나고 이를 490 내지 530 nm에서 흡광도를 측정하여 pyruvic acid lithium의 표준곡선과 비교하여 활성도를 측정하였다. GOT 및 GPT용 기질액을 1 mL씩 취해 37℃에서 5분간 방치한 다음 혈장 200 μL를 넣어 GOT는 37℃에서 60분, GPT는 37℃에서 30분간 반응시킨 다음 dinitrophenyl hydrazine 발색 용액을 1 mL씩 가하여 실온에 다시 20분간 반응시켰다. 0.4N NaOH 용액 10 mL와 혼합하여 10분간 반응시킨 다음 흡광도를 측정하였다. 이때 표준곡선은 혈청 transaminase 측정용 시약(Asan kit, Korea) 중 검량선용 시약을 사용하였다.
7) 항산화 효소활성도 측정
SOD 활성도는 autoxidized pyrogallol 시약을 사용하여 Marklund 등의 방법에 따라 측정하였다. CAT 효소는 Aebi(Aebi, 1974) 등의 방법에 따라 H2O2를 H2와 O2로의 분해도를 측정하였다. Glutathione peroxidase 활성도는 Paglia and QValentine(Paglia & Valentine, 1967)의 방법을 일부 수정하여 측정하였다. GR 활성도는 Pinto(Pinto & Bartley, 1969)의 방법을 수정하여 NADPH가 감소된 정도를 측정하였다. PON 활성도는 Mackness 등의 방법에 따라 측정하였다.
8) 간 조직 Hydrogen Peroxide 및 Lipid Peroxide 측정
Hydrogen peroxide 농도는 Wolff's method를 활용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. Lipid peroxide 농도는 Ohkawa (1979)등의 방법을 활용하여 원심분리로 얻은 상층액의 흡광도를 532 nm에서 측정하였다.
9) 당 대사 관련 효소활성도 측정
Glucose-6-phosphatase(G6Pase)는 Alegre 등의 방법을 일부 수정하여 측정하였다. Glucokinase 효소활성도는 Bentle and Lardy 방법을 일부 수정하여 측정하였다. phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK) 활성도는 Newgard 등의 방법을 활용하여 측정하였다.
10) 간 조직 지질대사 관련 효소활성도 측정
Malic enzyme 활성도는 cytosol에서 NADPH 생성정도를 측정하였다. 0.4 M Trieathanolamine buffer 600 uL에 30 nM L-malate, 0.12 M MnCl 및 3.4 nM TPN 시약을 첨가하여 340 nm에서 흡광도를 측정하였다. FAS 활성도는 Nepokroeff 등의 방법을 활용하여 cytosol에서 측정하였고, PAP 활성도는 microsome에 Reagent A(0.05M Tris-HCl, 1.25mM EDTA, 1mM MgCl)와 reagent B(1.8M H2SO4, SDS, ascorbic acid)를 가하여 820 nm에서 흡광도를 측정하였다. CPT 활성도는 mitochondria에서 Markwell 등의 방법을 활용하여 측정하였다.
(5) Western blot
단백질 정량은 조직에서 단백질을 추출하여 Bradford 방법에 따라 측정하였다. 정량 샘플은 SDS-polyacrylamide gel에 넣어 2시간 동안 로딩 한 뒤, Tris-glycine electrophoresis buffer에 2시간 로딩하였다. Membrane에 Ponceau. S 시약을 넣고 단백이 gel을 통과하는지 확인한 뒤, TBS-T 로 세척하고 5% skim milk에 1시간 동안 반응시킨 뒤, 1차 항체를 4℃에서 overnight 시켰다. Overnight 후 1차 항체를 제거한 뒤, TBS-T로 30분 동안 세척하고 2차 항체를 1시간 동안 반응시킨 뒤, TBS-T로 30분간 다시 세척하여 ECL-kit를 사용하여 정색 반응을 시킨 뒤, G: box에서 촬영하여 밴드를 확인하였다. 사용된 1차 항체 및 2차 항체는 하기 표 3에 나타내었다.
|
1차 항체
(Primary antibody) |
2차 항체
(Secondary antibody) |
| GAPDH | Anti-rabbit 1gG |
| PGC1a | Anti-rabbit 1gG |
| IGF1 | Anti-rabbit 1gG |
| Akt | Anti-rabbit 1gG |
| P-Akt | Anti-rabbit 1gG |
| PI3K | Anti-rabbit 1gG |
| P-PI3K | Anti-rabbit 1gG |
| AMPK | Anti-rabbit 1gG |
| P-AMPK | Anti-rabbit 1gG |
| Myogenin | Anti-rabbit 1gG |
| Myostatin | Anti-rabbit 1gG |
| Atrogin | Anti-rabbit 1gG |
(6) Real-time PCR
세포 또는 조직의 Total RNA를 분리하고 total cDNA(complementary DNA)를 합성한 뒤, DEPC로 샘플을 희석하여 CFX96TM Real-Time Detection System(Bio-Rad, USA)의 TB Green® Premix EX TaqTMⅡ를 mRNA 발현 분석에 사용하였다. 사용된 프라이머(primer)는 하기 표 4 및 첨부한 서열목록 전자파일에 나타내었다. Ct(cycle threshold) 값은 GAPDH를 사용하여 정규화(normalized) 되었고 유전자발현은 2-△△Ct method로 계산하였다.
| 유전자 | Sequence (5’-3’) Primer | 서열 식별번호 |
| Aco | F: GCC CAA CTG TGA CTT CCA TT | 1 |
| R: GGC ATG TAA CCC GTA GCA CT | 2 | |
| AKT 2 | F: ACG TGG TGA ATA CAT CAA GAC C | 3 |
| R: GCT ACA GAG AAA TTG TTC AGG GG | 4 | |
| ASS | F: CAC TCT ACG AGG ACC GCT ATC T | 5 |
| R: CTC AAA GCG GAC CTG GTC ATT C | 6 | |
| ASL | F: GGC AGA GAC TAA AGG AGT GGC T | 7 |
| R: TCG ACA CTG GAT TTC GCT GTG C | 8 | |
| ALDOA | F: GTG GGA AGA AGG AGA ACC TG | 9 |
| R: CTG GAG TGT TGA TGG AGC AG | 10 | |
| Arg 1 | F: CAT TGG CTT GCG AGA CGT AGA C | 11 |
| R: GCT GAA GGT CTC TTC CAT CAC C | 12 | |
| Atrogin | F: AAC CGG GAG GCC AGC TAA AGA ACA | 13 |
| R: TGG GCC TAC AGA ACA GAC AGT GC | 14 | |
| CPS 1 | F: CAT GGA ACA TCC AGC CGA ATT GG | 15 |
| R: GAT GGC ACA TCC TCA GAG CCT T | 16 | |
| CRCT 2 | F: ATG AAC CCT AAC CCC CAA GAC | 17 |
| R: CGT TCT CCT CAA TAG CAG GGA | 18 | |
| CREB | F: GAA GAA GCA GCA CGG AAG AGA | 19 |
| R: TCT CTT GCT GCC TCC CTG TT | 20 | |
| Dlst | F: AGG TCT GCG TTC AGA ACA TCG G | 21 |
| R: AGG AAA GCA TCC TTG TGC CGA G | 22 | |
| Foxo3 | F: ATC GCC TCC TGG CGG GCT TA | 23 |
| R: ACG GCG GTG CTA GCC TGA GA | 24 | |
| GAPDH | F: TGC AGT GGC AAA GTG GAG AT | 25 |
| R: TTG AAT TTG CCG TGA GTG GA | 26 | |
| GLUT4 | F: CTG AGA ACT TAA CTG CTG AAG | 27 |
| R: AGG AGT TTG TTG GTG TAT TTA | 28 | |
| GPI1 | F: CGG AAA GGT CTG CAT CAC AA | 29 |
| R: CCT TCA TCA GGG CCT CAG TC | 30 | |
| GULT 2 | F: GTC AGA AGA CAA GAT CAC CGG A | 31 |
| R: AGG TGC ATT GAT CAC ACC GA | 32 | |
| G6pc | F: AGC CTC CGG AAG TAT TGT CTC A | 33 |
| R: TCC ACC CCT AGC CCT TTT AGT AG | 34 | |
| HK 2 | F: GAG AAC CGT GGA CTG GAC AA | 35 |
| R: CCA GGA AGG ACA CGT ACAC AT | 36 | |
| Idh 2 | F: GGC TGT CAA GTG TGC CAC AAT C | 37 |
| R: TTG GCT CTC TGA AGA CGG TTC C | 38 | |
| Mdh 1 | F: TTC TGG ACG GTG TCC TGA TGG A | 39 |
| R: TAG GAC AGC CAC ATC CAG GTC T | 40 | |
| Murf 1 | F: GAG AAC CTG GAG AAG CAG CT | 41 |
| R: CCG CGG TTG GTC CAG TAG | 42 | |
| MyoD | F: GCT TCT ATC GCC GCC ACT CC | 43 |
| R: CGC ACA TGC TCA TCC TCA CG | 44 | |
| Myogenin | F: CCT TGC TCA GCT CCC TCA | 45 |
| R: TGG GAG TTG CAT TCA CTG G | 46 | |
| MyHC Ⅰb | F: GAG GAA GAG TGA GCG GCG | 47 |
| R: GCC GCA GTA GGT TCT TCC TGT | 48 | |
| MyHC Ⅱa | F: TAC AAC CTC AAA GAG CGT TAT GCA | 49 |
| R: AAG GGT TGA CGG TGA CAC AGA | 50 | |
| MyHC Ⅱb | F: GAG ATC GAT GAT CTC GCT AGT AAC AT | 51 |
| R: GGG TGC GGC ACA TCT TC | 52 | |
| MyHC Ⅱx | F: ACA GAT CGG GAG AAC CAG TCT ATT | 53 |
| R: CGT TTC GTG TTC ACA GTC TTC C | 54 | |
| Ogdh | F: GGT GTC GTC AAT CAG CCT GAG T | 55 |
| R: ATC CAG CCA GTG CTT GAT GTG C | 56 | |
| OTC | F: ACA CTG TTT GCC TAG AAA GCC AG | 57 |
| R: CTT CTG GAG CAC AGG TGA GTA G | 58 | |
| PDHB | F: CAT CTC GTG ACT GTG GAA GGA G | 59 |
| R: A TCA GCA CCA GTG ACA CGC A | 60 | |
| PEPCK | F: TGC CTC TCT CCA CAC CAT TGC | 61 |
| R: TGC CTT CCA CGA ACT TCC TCA C | 62 | |
| PGC1 | F: AAG TGT GGA ACT CTC TGG AAC TG | 63 |
| R: GGG TTA TCT TGG TTG GCT TTA TG | 64 | |
| PI3K | F: GGG TTT TCT GTC CCC TCT GA | 65 |
| R: TGA TGT CTG GGT TCT CCC AA | 66 | |
| PKM | F: TTG ACT CTG CCC CCA TCA C | 67 |
| R: GCA GGC CCA ATG GTA CAA AT | 68 | |
| PRKAA 2 | F: CAG AAG ATT GGC AGT TTA GAT GTT GT | 69 |
| R: ACC TCC AGA CAC ATA TTC CAT TAC C | 70 | |
| PRKAB 1 | F: GTT GCT GTT GCT TGT TCC AA | 71 |
| R: ATA CTG TGC CTG CCT CTG CT | 72 | |
| PRKAG 1 | F: TCT CCG CCT TAC CTG TAG TGG A | 73 |
| R: GCA GGG CTT TTG TCA CAG ACA C | 74 | |
| Sdhc | F: TGC TCC TTT GGG AAC CAC AGC T | 75 |
| R: GCA AAC GGA CAG TGC CAT AGG A | 76 |
(7) Histological and immunohistochemistry analysis
각 조직은 10% formalin 용액에서 고정되었다. 고정된 샘플은 파라핀으로 고정되고, 5 um 조직을 준비하여 간 및 지방조직에서 hematoxylin-eosin(H&E)과 Masson's trichrome(MT)으로 염색하였다. H&E 및 Sirus red 염색은 근 조직에서 실시하였다. 또한 근조직은 면역학적 분석을 위해 IGF-1 및 Myostatin으로 염색하였다. 염색된 조직은 광학현미경을 사용하여 x200 배율로 조정하여 측정하였다.
(8) 분변에서의 단쇄지방산(Short-chain fatty acids, SCFAs) 분석
단쇄지방산은 마우스 분변 0.2 g에 1 mL의 dH2O를 가하여 추출하였다. Vortexing 하여 모든 샘플을 13,000 rpm에서 3분 동안 상온에서 원심분리하여, 원심분리된 상층액 150 μL를 GC buffer((NH4)2SO4, NaH2PO4, 및 2-ethylbutric acid) 150 μL가 들어 있는 screw cap vial에 옮겨 담았다. HSS-GC-FID 분석은 7697A headspace sampler와 FID(Agilent Technologies, USA)가 장착된 Agilent 7890B GC system으로 수행하였다. HP-innowax capillary column(30 m x 0.32 mm i.d. x 0.50 μL film thickness; Agilent) flow로 질소를 사용하였고 하기 작동 조건으로 진행되었으며, 데이터 수집 및 작업은 ChemStation software(Agilent Technologies, USA)가 사용되었고, 단쇄지방산은 표준물질을 활용하여 정성 및 정량되었다.
[작동 조건]
- oven temperature, 85℃;
- loop temperature, 90℃;
- transfer lines, 100℃;
- FID temperature, 250℃;
- column temperature를 초기 60℃에서 30 ℃/min의 승온 속도로 140℃까지 승온시킨 후, 30 ℃/min의 승온 속도로 170℃로 승온시키고, 최종적으로 40 ℃/min의 승온 속도로 180℃까지 승온시키고, 0.75분 동안 유지시킴.
(9) 분변 내 미생물 분석
분변 박테리아 DNA 추출은 Mag-Bind® Universal Pathogen Kit(Omega Bio-tek, Norcross, GA 30071, USA)가 사용되었다. 분변 샘플을 275 μL SLX-Mlus Buffer에 현탁하여 mixermill MM400(Retsch,Haan, Germany)로 추출, 세척 및 eluting 절차를 manufacturer's protocols에 따라 진행하였다. 16S rRNA 유전자의 variable V3-V4 영역의 시퀀싱(sequencing)을 위하여 Illumina Miseq System(Illumina, California, USA)를 사용하였다. 샘플 DNA는 HiAccuBead(AccuGene, South Korea)와 magnetic stand로 세척하였다. Index PCR은 Illumina Miseq System용 IDT indexing primer(Integrated DNA technologies, Iowa, USA), 2× KAPA HiFi HotStart ReadyMix 및 PCR grade water가 사용되었다. 세척 후, 라이브러리의 농도는 1× dsDNA HS assay solution(ThermoFisher Scientific, Massachusetts, USA) 및 Qubit 4.0(ThermoFisher Scientific, Massachusetts, USA)을 사용하여 확인하였으며, Illumina Miseq system을 사용하여 시퀀싱되었다. 판독은 각 PCR 제품에 대한 고유 바코드를 사용하여 정리되었고, 바코드, linker 및 primer sequence를 original sequencing reads에서 제거하였다. 시퀀싱 결과는 Qiime2 bioinformatics pipeline를 사용하여 분석되었고, taxonomic assignment는 Silva reference database를 활용하여 분석되었다.
(10) 통계 분석
모든 실험 결과는 SPSS package program(IBM spss statistics, Chicago, IL, USA)을 사용하여 산출되었다. 모든 결과는 mean ± S.E. 로 표시하고, YC군 및 NC군은 Student's-T Test로 분석되었다. 노화군 간 유의성 검증은 일원배치 분산분석(ANOVA) 및 Tukey-Test multiple range p < 0.05를 사용하여 분석하였다.
[실험결과]
(1) 닭가슴살 단백질 가수분해물의 보충이 노화 마우스의 근손실 개선에 미치는 영향
1) 체중 및 식이 섭취량 변화에 미치는 영향
상기 각 군의 마우스의 체중을 측정한 결과를 도 3 및 하기 표 5에 나타내었고, 각 군의 마우스의 식이 섭취량(Food intake), 에너지 섭취량(Energy intake) 및 식이효율(food efficiency ratio, FER)을 계산하여 하기 표 5에 나타내었는데, 상기 식이효율은 일일 체중 증가량을 일일 에너지 섭취량으로 나누어서 산출하였다.
도 3을 참조하면, 노화 마우스인 NC군은 어린 마우스인 YC군 대비 실험 개시 시점으로부터 실험 종료 시점까지 체중이 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있고, 상기 닭가슴살 단백질 가수분해물을 보충한 LP군 및 HP군의 경우 NP군과 체중의 유의적인 차이가 관찰되지 않았다.
상기 표 5를 참조하면, 실험 종료 시점의 체중 및 체중 증가량은 NC군에서 YC군 대비 증가하였으나, 노화 마우스로 구성된 NC군, LP군 및 HP군 간의 비교에서는 유의적인 차이가 없는 것으로 확인되었다.
또한 NC군의 식이 섭취량 및 에너지 섭취량이 YC군 대비 유의적으로 증가하였으며, 식이효율은 유의적으로 감소하였다. 노화마우스로 구성된 NC군, LP군 및 HP군 간 비교에서, 식이 섭취량 및 에너지 섭취량은 LP군 및 HP군에서 NC군 대비 증가하였지만, 식이효율은 군 간의 유의적 차이가 없는 것으로 확인되었다.
2) 허벅지 두께 변화 및 인장력에 미치는 영향
실험 식이 급여 후 4주마다 측정한 허벅지 두께에 대한 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4를 참조하면, 식이 섭취 4주차에 측정한 허벅지 두께는 실험을 진행한 군 간 유의미한 차이가 관찰되지 않았으나, 실험 식이 급여 12주차에 측정한 허벅지 두께 비교에서는 NC군이 YC군 대비 허벅지 두께가 유의적으로 감소하였고, 노화 마우스군 간의 비교에서 8주차 및 12주차에 측정한 LP군 및 HP군의 허벅지 두께가 NC군 대비 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있다.
실험 식이 종료 후 측정한 인장력의 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5를 참조하면, NC군의 인장력 측정 결과는 YC군 대비 유의적으로 감소하였고, 닭가슴살 단백질 가수분해물을 보충한 LP군 및 HP군에서 NC군 대비 유의적으로 인장력이 증가한 것을 확인할 수 있다.
3) 부위별 근육 중량에 미치는 영향
12주의 실험 식이 종료 후, 각 군의 부위별 근육 중량을 측정한 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6을 참조하면, NC군의 비복근(Gastrocnemius), 앞정강근(Tibialis anterior), 대퇴근(Quadriceps), 총 근육(Total Muscle) 중량이 YC군 대비 유의적으로 감소하였다. 근육 조직 중량의 노화 마우스 군 간 비교에서 LP군은 HP군 대비 총 근육 중량이 증가하는 경향을 나타내었으나, 유의적인 차이는 관찰되지 않았고, LP군의 경우 YC군과 유사한 근육 중량 수치를 나타내었다.
4) 앞정강근(tibialis anterior)의 단백질 수준에 미치는 영향
각 군의 앞정강근의 단백질 함량을 측정한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7을 참조하면, 앞정강근의 단백질 함량은 NC군에서 YC군 대비 유의적으로 감소하였으나, LP군 및 HP군 모두에서 NC군 대비 유의적으로 증가하였다.
5) 근육조직 지질함량에 미치는 영향
각 군의 근육조직 내 지질함량을 측정하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8을 참조하면, 근육조직에서의 콜레스테롤 및 중성지방의 함량은 YC군 및 NC군 간의 비교에서 유의적인 차이가 나타나지 않았으나, 노화 마우스 군 간의 비교에서는 닭가슴살 단백질 가수분해물을 보충한 LP군 및 HP군의 근육에서의 콜레스테롤, 중성지방 및 지방산의 함량은 NC군 대비 유의적으로 감소하였다.
6) 비복근의 형태학적 변화분석
각 군의 근육조직의 형태학적 관찰 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9를 참조하면, 비복근을 H&E(Hematoxylin and eosin) 염색하여 관찰한 결과, NC군에서 노화로 인하여 YC군 대비 줄어든 근 면적 CSA(cross-sectional area)가 LP군 및 HP군에서 닭가슴살 단백질 가수분해물의 급여에 의해 NC군 대비 유의적으로 증가한 것을 확인할 수 있다.
또한 가자미근조직의 콜라겐 형성 확인을 위하여 Sirius red 염색을 실시한 결과, NC군에서 섬유화가 YC군 대비 더욱 진행된 반면, LP군 및 HP군에서 닭가슴살 단백질 가수분해물의 급여에 의해 섬유화의 진행이 억제된 것을 확인할 수 있다.
7) 비복근의 면역조직학적 분석
비복근에서 근육합성 인자인 IGF-1(insulin-like growth factor 1)과 근육분해 인자인 Myostatin의 면역조직학적 분석을 실시하였고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10을 참조하면, 비복근조직 섬유에서 NC군의 IGF-1 발현은 YC군 대비 유의적으로 감소하였고, LP군의 IGF-1 발현은 NC군 대비 유의적으로 증가하였다.
또한 비복근조직 섬유에서 NC군의 Myostatin 발현은 YC군 대비 유의적으로 증가하였고, LP군 및 HP군의 Myostatin 발현은 NC군 대비 유의적으로 감소하였다.
8) 근육대사 관련 유전자 발현에 미치는 영향
각 군의 근육대사 관련 유전자의 발현을 측정한 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11을 참조하면, 근조직내 근 형성 및 섬유화 조절 인자인 PGC-1a 및 MyoD 유전자 발현은 NC군에서 YC군 대비 유의적으로 감소한 반면, LP군에서는 NC군 및 HP군 대비 유의적으로 증가하였다.
또한 근육분해와 관련된 Atrogin 및 FoxO3 유전자 발현의 경우, NC군이 YC군 대비 유의적으로 증가한 반면, LP군 및 HP군은 NC군 대비 유의적으로 감소하였다.
Murf1 발현은 NC 군이 YC군 대비 증가 경향을 보였으며, LP군은 NC군 대비 유의적으로 감소하였다.
근육수축 속도와 운동피로에 대한 저항정도를 결정하는 MyHC(myosin heavy chains) 유형 중 Type Ⅰb의 발현은 NC군에서 YC군 대비 유의적으로 감소하였으나, LP군에서는 NC군 대비 유의적으로 증가하였다.
9) 근육조직에서 근육대사 관련 단백질 발현에 미치는 영향
각 군의 근육조직에서 근육대사 관련 단백질의 발현량을 측정하였고, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12를 참조하면, 근조직에서 PGC-1a 및 IGF1 단백질 발현이 NC군에서 YC군 대비 유의적으로 감소한 반면, LP군 및 HP군은 NC군 대비 유의적으로 증가하였다.
또한 하위인자인 P-PI3K는 노화 마우스군 간 유의성은 나타나지 않았으나, P-Akt의 발현은 LP군 및 HP군에서 NC군 대비 유의적으로 증가하였다.
Myogenin 단백질 발현은 NC군에서 YC군 대비 유의적으로 감소한 반면, HP군에서는 NC군 대비 유의적으로 증가하였다.
한편, 근분해와 관련된 Atrogin 및 Myostatin 단백질 발현은 NC군에서 YC군 대비 유의적으로 증가하였으나, LP군 및 HP군에서는 NC군 대비 유의적으로 감소하였다.
(2) 닭가슴살 단백질 가수분해물 보충이 노화 마우스의 당대사에 미치는 영향
1) 닭가슴살 단백질 가수분해물 보충이 노화 마우스의 공복혈당 변화에 미치는 영향
각 군의 공복혈당을 4주 간격으로 측정하였고, 그 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13을 참조하면, 식이 섭취 4주, 8주 및 12주에 측정한 NC군의 공복혈당은 YC군 대비 현저히 증가하였고, 노화 마우스 군 간 비교에서, 닭가슴살 단백질 가수분해물 보충군 중 HP군에서 NC군 및 LP군에 비해 8주차에 유의적으로 감소하였다.
또한 NC군의 혈장 포도당 농도가 YC군 대비 유의적으로 증가하였고, 노화 마우스군 간 비교에서, 군 간의 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
2) 닭가슴살 단백질 가수분해물 보충이 노화 마우스의 경구 포도당 부하 검사에 미치는 영향
각 군의 경구 포도당 부하 검사를 수행하였고, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14를 참조하면, 모든 군에서 NC군 대비 유의적인 차이가 나타나지 않았는데, NC군의 경우 인슐린 저항성을 나타낼 만큼의 혈당 상승이 관찰되지 않았기 때문으로 사료된다.
3) 닭가슴살 단백질 가수분해물 보충이 노화 마우스의 혈당 및 글리코겐 수준에 미치는 영향
각 군의 혈장 포도당 농도, 혈장 인슐린 농도, 혈장 글루카곤 농도, 간조직 글리코겐 농도 및 근조직 글리코겐 농도를 측정하였고, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15를 참조하면, 혈장 포도당은 NC군이 YC군 대비 유의적으로 증가하였으며, 노화 마우스군 간 비교에서는 유의성이 나타나지 않았다.
혈장 인슐린 농도는 실험군 간 유의성이 나타나지 않았고, 혈장 글루카곤 농도는 NC군 및 YC군 간 유의성은 나타나지 않았으나, LP군 및 HP군에서 NC군 대비 유의적으로 감소하였다.
간조직 글리코겐 농도는 NC군이 YC군 대비 유의적으로 증가하였으나, LP군 및 HP군에서 NC군 대비 유의적으로 감소하였다.
또한 근조직 글리코겐 농도는 NC군이 YC군 대비 유의적으로 감소하였으나, HP군 및 NC군 간 비교에서는 유의적으로 증가하였다.
4) 닭가슴살 단백질 가수분해물 보충이 노화 마우스의 간조직 혈당관련 효소활성도에 미치는 영향
각 군의 간조직 당대사 관련 효소의 활성도를 측정하였고, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16을 참고하면, 간조직 당대사 관련 효소인 Glucokinase(GK), phosphoenolpyruvate carboxykinase(PEPCK) 및 glucose 6 phosphatase(G6pase) 활성도는 YC군에 비해 NC군에서 유의적으로 증가하였음.
PEPCK 활성도는 HP군에서 LP군 대비 유의적으로 증가하였으며, G6pase 활성도는 LP군에서 NC군 대비 유의적으로 감소하였다.
5) 닭가슴살 단백질 가수분해물 보충이 노화 마우스의 당대사 관련 간조직 및 근조직 유전자 발현도에 미치는 영향
각 군의 당대사 관련 간조직 및 근조직 유전자의 발현도를 측정하였고, 그 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17을 참조하면, 간조직에서 해당과정과 관련된 유전자인 glucose transporter 2(GLUT2), enzyme pyruvate kinase M2(PKM) 및 pyruvate dehydrogenase (lipoamide) beta(PDHB) 발현은 군 간 유의적인 차이를 나타내지 않은 반면, 당합성과 관련된 유전자인 glucose-6-phosphatase(G6PC), PEPCK, CREB regulated transcription coactivator 2(CRCT2) 및 cAMP response element-binding protein (CREB) 발현은 LP군 및 HP군에서 닭가슴살 단백질 가수분해물의 보충에 의하여 감소하였다.
근육조직에서 해당과정과 관련된 유전자인 glucose transporter 4(GLUT4) 및 hexokinase 2(HK2) 발현은 실험군 간 유의적인 차이를 나타내지 않았으나, glucose phosphate isomerase 1(GPI1), 6-phosphofructokinase, muscle type(PFKM) 및 PKM의 발현도는 NC군이 YC군 대비 유의적으로 감소하였다.
GPI1 발현은 LP군이 NC군 대비 유의적으로 증가하였으며, PKM 발현은 HP군이 NC군 대비 유의적으로 증가하였다.
또한 Glucose transporter 1(GLUT1) 및 aldolase A(ALDOA) 유전자 발현은 LP군 및 HP군 모두 NC군 대비 유의적으로 증가하였다.
(3) 닭가슴살 단백질 가수분해물의 보충이 노화 마우스의 지질 및 면역에 미치는 영향
1) 지방 조직 및 기관 중량 변화에 미치는 영향
각 군의 지방 조직 중량을 비교한 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
표 6을 참조하면, NC군의 신주위 백색지방(Perirenal WAT), 장간막 백색지방(Mesenteric WAT), 견갑골 백색지방(Interscapular WAT), 내장 백색지방(Visceral WAT), 총 백색지방(Total WAT)의 중량은 YC군 대비 유의적으로 증가하였고, 지방조직 중량에 대한 노화 마우스군 간 비교에서는 유의적인 차이가 나타나지 않았다.
또한 NC군의 간 중량은 YC군 대비 유의적으로 증가하였으나, 노화 마우스 군 간의 비교에서는 유의적인 차이가 나타나지 않았고, 신장 중량 비교에서는 실험 군간 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
2) 혈장 및 간조직 지질 농도에 미치는 영향
식이 급여 12주 동안 4주 간격으로 채혈하여 혈장 총 중성지방(total triglyceride, TG), 총 콜레스테롤(total cholesterol, TC) 및 유리 지방산(free fatty acid, FFA) 수준을 측정하였고, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18을 참조하면, 혈장 TG 농도는 NC군이 4주 및 12주차에서 YC군 대비 유의적으로 감소하였으나, 4주 및 12주차에서 HP군의 TG 농도가 NC군 대비 증가한 것을 확인할 수 있다.
4주, 8주 및 12주 식이 급여 기간 동안 NC군의 혈장 TC 농도는 YC군 대비 유의적으로 증가하였으며, LP군 및 HP군의 TC 농도는 NC군 대비 유의적으로 감소하였다.
12주 동안의 식이 급여를 종료하고, 채혈하여 혈장 TG, TC, FFA, 고밀도 콜레스테롤(HDL-C) 및 총 콜레스테롤 농도에서 고밀도 콜레스테롤 농도를 뺀 non HDL-C 농도를 측정하였고, 그 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19를 참조하면, 혈장에서의 중성지방 농도는 노화에 의한 유의적 차이는 나타나지 않았지만, 노화 마우스 군간 비교에서 NC군, LP군 대비 HP군의 혈장 중성지방 농도는 유의적으로 증가하였다.
또한 혈장 유리지방산, 고밀도 콜레스테롤(HDL-C) 농도는 노화 마우스 군 간 비교에서 모든 군에서 유의적인 차이를 보이지 않았으나, 총 콜레스테롤(TC) 농도에서 고밀도 콜레스테롤(HDL-C) 농도를 뺀 non HDL-C 농도는 YC군 대비 NC군에서 증가하였고, 노화 마우스 군 간 비교에서 LP군 및 HP군의 non HDL-C 농도가 NC군 대비 유의적으로 감소하였다.
12주 동안의 식이 급여를 종료하고, 각 군의 간조직 내 지질 농도를 측정하였으며, 그 결과를 도 20에 나타내었다.
도 20을 참조하면, 간조직 중성지방(TG)은 NC군이 YC군 대비 유의적으로 증가하였고, 간조직 콜레스테롤 함량은 HP군이 NC군 대비 유의적으로 감소하였다.
3) 간조직 지질대사 관련 효소 활성도에 미치는 영향
12주 동안의 식이 급여를 종료하고, 각 군의 간조직 지질대사 관련 효소의 활성도를 측정하였으며, 그 결과를 도 21에 나타내었다.
도 21을 참조하면, 간조직 fatty acid synthesis(FAS) 및 phosphatidate phosphohydrolase(PAP)의 활성도는 NC군이 YC군 대비 유의적으로 증가하였으나, malic enzyme(ME) 및 carnitine palmitoyl-CoA transferase(CPT)의 활성도는 유의성이 나타나지 않았고, 간조직 지질합성 효소인 FAS 활성도만이 LP군 및 HP군에서 NC군 대비 유의적으로 감소하였다.
4) 간 및 지방조직의 형태학적 변화에 미치는 영향
12주 동안의 식이 급여를 종료하고, 각 군의 간조직을 hematoxylin and eosin(H&E) 및 Masson's trichrome(MT)로 염색하여 형태학적 변화를 관찰하였고, 그 결과를 도 22에 나타내었다.
도 22를 참조하면, 간조직의 지방구 축적이 NC군이 YC군 대비 증가한 반면, LP군 및 HP군에서 NC군 대비 감소한 것을 확인할 수 있다.
또한 Masson's trichrome(MT) 염색 결과에서, NC군이 YC군 대비 섬유화가 증가하였으나, LP군 및 HP군에서 NC군 대비 섬유화가 개선되었다.
12주 동안의 식이 급여를 종료하고, 각 군의 지방조직을 hematoxylin and eosin(H&E) 및 Masson's trichrome(MT)로 염색하여 형태학적 변화를 관찰하였고, 그 결과를 도 23에 나타내었다.
도 23을 참조하면, NC군의 지방조직의 지방구 크기는 YC군 대비 증가하였으나, LP군 및 HP군의 지방구 크기는 NC군 대비 감소한 것을 확인할 수 있다.
또한 MT 염색 결과, NC 군은 YC 군 대비 푸른색으로 염색된 콜라겐이 증가하였으나, LP군 및 HP군은 NC군 대비 콜라겐이 감소하였다.
5) Inflammatory cytokine 변화에 미치는 영향
12주 동안의 식이 급여를 종료하고, 각 군의 혈장 면역 사이토카인 농도를 측정하였고, 그 결과를 도 24에 나타내었다.
도 24를 참조하면, tumor necrosis factor alpha(TNFa)는 NC군이 YC군 대비 유의적으로 증가하였고, LP군의 혈장 TNFa, IL-10 및 IL-6의 농도는 NC군 대비 감소한 것을 확인할 수 있다.
6) 혈장 Myokine 변화에 미치는 영향
12주 동안의 식이 급여를 종료하고, 각 군의 혈장 Myokine을 측정하였고, 그 결과를 도 25에 나타내었다.
도 25를 참조하면, fibroblast growth factor-21(FGF-21), leukemia Inhibitory factor(LIF) 및 ostonectin(SPARC)은 NC군이 YC군 대비 유의적으로 감소하였으나, FGF-21 수준은 LP군 및 HP군 모두 NC군 대비 유의적으로 증가하였으며, SPARC 수준의 경우 HP군만이 NC군 대비 유의적으로 증가하였다.
(4) 닭가슴살 단백질 가수분해물의 보충이 노화 마우스의 항산화에 미치는 영향
1) 간조직 및 적혈구 항산화 효소 활성도에 미치는 영향
항산화 효소의 활성은 유리 라디칼 생성에 의한 산화 스트레스에 대한 방어 기능을 수행할 수 있는 것으로 알려져 있다.
12주 동안의 식이 급여를 종료하고, 각 군의 간조직, 혈장 및 적혈구 내 항산화 효소의 활성을 측정하였고, 그 결과를 도 26에 나타내었다.
도 26을 참조하면, 혈장 SOD, 혈장 PON, 적혈구 GSH 및 간조직 GSH-px의 활성은 NC군이 YC군 대비 유의적으로 감소하였으며, 간조직 H2O2 및 지질과산화물인 TBARS 농도는 NC 군이 YC군 대비 유의적으로 증가하였다.
LP군의 경우, 간조직 SOD, CAT, GSH-px 및 GR 활성과 혈장 PON 및 적혈구 GSH 활성이 NC군 대비 유의적으로 증가하였으며, 적혈구 TBARS는 NC군 대비 유의적으로 감소하였다.
또한 HP군의 경우, 간조직 GSH 및 GR 활성과 혈장 SOD 활성이 NC군 대비 유의적으로 증가하였으며, 간조직 H2O2 및 적혈구 TBARS 농도는 NC군 대비 유의적으로 감소하였다.
2) 혈장 GOT 및 GPT와 뇨중 BUN 및 Creatinine 변화에 미치는 영향
12주 동안의 식이 급여를 종료하고, 각 군의 혈장 GOT 및 GPT와 뇨중 BUN 및 Creatinine 농도를 측정하였고, 그 결과를 도 27에 나타내었다.
도 27을 참조하면, 혈장 GOT 및 GPT 농도는 YC군 대비 NC군에서 유의적으로 증가하였고, 노화 마우스군 간 비교에서, LP군의 혈장 GOT 및 GPT농도가 NC군, HP군 대비 유의적으로 감소하였다.
(5) 닭가슴살 단백질 가수분해물의 보충이 노화 마우스의 단쇄지방산 생성 및 마이크로바이옴 변화에 미치는 영향
1) 단쇄지방산 생성에 미치는 영향
12주 동안의 식이 급여를 종료하고, 각 군의 분변 중 단쇄지방산의 양을 측정하였고, 그 결과를 도 28에 나타내었다.
도 28을 참조하면, Acetate 생산량은 NC군이 YC군 대비 유의적으로 감소하였고, LP군의 경우 HP군 대비 유의적으로 감소하였다.
Propionate 및 isovalerate 생산량은 LP군 및 HP군이 NC군 대비 유의적으로 증가하였다.
총 단쇄지방산(short chain fatty acid, SCFA) 생산량은 NC군이 YC군 대비 유의적으로 감소하였으나, LP군은 HP군 대비 총 단쇄지방산 생산량이 증가하였다.
2) 분변 지질함량 변화에 미치는 영향
12주 동안의 식이 급여를 종료하고, 각 군의 분변 중 중성지질 및 콜레스테롤 함량을 측정하였고, 그 결과를 도 29에 나타내었다.
도 29를 참조하면, 분변 중 중성지질 함량은 NC군이 YC군 대비 유의적으로 감소하였으나, 노화 마우스군 간 비교에서는 HP군의 중성지질 농도가 LP군 대비 유의적으로 높게 나타났고, 콜레스테롤의 경우 LP군이 NC군 대비 유의적으로 높게 나타났다.
3) 마이크로바이옴 변화에 미치는 영향
12주 동안의 식이 급여를 종료하고, 각 군의 분변 중 마이크로바이옴의 변화를 확인하였고, 그 결과를 도 30 내지 도 34에 나타내었다.
도 30 내지 도 32를 참조하면, 속 수준에서 NC군 대비 LP군의 Bacteroides 및 Muribaculaceae 속이 유의적으로 증가하였고, Lactobacillus, Enterohabdus, Lachnoclostridium, Streptococcus 및 Helicobacter 속이 유의적으로 감소하였다.
또한 NC군 대비 HP군의 Lactobacillus, Muribaculaceae, Lachnoclostridium 및 Desulfovibrio 속이 유의적으로 증가하였고, Streptococcus 및 Helicobacter 속이 유의적으로 감소하였다.
도 33을 참조하면, 미생물 종의 다양성을 나타내는 Shannon의 알파 다양성(Alpha diversity)은 NC군 대비 LP군 및 HP군에서 더 높게 나타났다.
한편, 도 34를 참조하면, YC군 및 NC군은 군 내 미생물 구성의 차이를 나타내는 베타 다양성(beta diversity)에서 유사한 패턴을 나타냈고, LP군 및 HP군의 베타 다양성(beta diversity)은 서로 유사한 패턴을 나타내었으나, NC군과는 상이한 패턴을 나타낸 것으로 확인되었다.
4) 근육에 대한 마이크로바이옴 상관관계 분석
LP군 및 HP군의 근육과 장내 미생물간 Pearson's correlation을 분석한 결과를 하기 표 7 및 표 8에 각각 나타내었다.
표 7을 참조하면, LP군의 근육과 장내 미생물의 상관관계를 통한 조성변화에서 유해균인 Enterorhabdus, Desulfovibrio, Streptococcus, Escherichia-Shigella 속과 유의미한 음의 상관관계를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
또한 표 8을 참조하면, HP군의 경우 유익균인 Bacteroides, Muribaculaceae, Lactobacillus 및 Lachnoclostridium 속과 유해균인 Enterorhabdus, Enterorhabdus, Streptococcus 및 Escherichia-Shigella 속과 유의미한 음의 상관관계를 나타내는 것을 확인할 수 있다.
상기 결과와 같이, 본 발명에 따른 닭가슴살 단백질 가수분해물 및 이를 유효성분으로 함유하는 식품 조성물은 근육대사 관련 유전자 및 단백질 발현을 증가시킬 수 있으므로, 근 감소 완화용 식품 조성물로 활용될 수 있고, 간조직 및 적혈구 항산화 효소의 활성도를 증가시킬 수 있으므로, 항산화용 식품 조성물로 활용될 수 있으며, 장내 단쇄지방산 중 프로피오네이트 및 이소발러레이트의 생산량을 증가시키고, 장내 유익균의 생장을 촉진하며, 유해균의 생장은 억제할 수 있으므로, 장내 미생물 개선용 식품 조성물로 활용될 수 있다.
이하에서는 본 발명에 따른 닭가슴살 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 식품 조성물의 적용예를 설명하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
적용예 1: 액상 조성물 제조
하기 표 9에서는 상술한 본 발명에 따라 제조되는 닭가슴살 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 액상 조성물의 조성을 예시하고 있다. 액상 조성물은 통상의 액상 조성물 제조방법에 따라 정제수에 각각의 하기 성분들을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 후 하기 성분들을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진 및 멸균시켜 제조될 수 있다.
| 성분 | 함량 |
| 닭가슴살 단백질 가수분해물 | 200 ㎎ |
| 이성화당 | 10 g |
| 만니톨 | 5 g |
| 정제수 | 적량 |
적용예 2: 건강기능식품 제조
하기 표 10에서는 상술한 본 발명에 따라 제조되는 닭가슴살 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품 조성을 나타내고 있다. 하기 조성에서 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 적용예로 혼합 조성한 것을 나타내고 있으나, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 각 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
| 성분 | 함량 | 성분 | 함량 |
| 닭가슴살 단백질 가수분해물 | 1000 ㎎ | 엽산 | 50 ㎍ |
| 비타민 혼합물 | 적량 | 판토텐산 칼슘 | 0.5 ㎎ |
| 비타민 A 아세테이트 | 70 ㎍ | 무기질 혼합물 | 적량 |
| 비타민 E | 1.0 ㎎ | 황산제1철 | 1.75 ㎎ |
| 비타민 B1 | 0.13 ㎎ | 산화아연 | 0.82 ㎎ |
| 비타민 B2 | 0.15 ㎎ | 탄산마그네슘 | 25.3 ㎎ |
| 비타민 B6 | 0.5 ㎎ | 제1인산칼륨 | 15 ㎎ |
| 비타민 B12 | 0.2 ㎍ | 제2인산칼륨 | 55 ㎎ |
| 비타민 C | 10 ㎎ | 구연산칼륨 | 90 ㎎ |
| 비오틴 | 10 ㎍ | 탄산칼슘 | 100 ㎎ |
| 니코틴산아미드 | 1.7 ㎎ | 염화마그네슘 | 24.8 ㎎ |
적용예 3: 건강 음료 제조
하기 표 11에서는 상술한 본 발명에 따라 제조되는 닭가슴살 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 기능성 건강 음료 조성을 나타내고 있다. 건강 음료 제조는 통상의 건강음료 제조방법에 따라 예컨대, 하기 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 후 냉장 보관하여 사용할 수 있다. 하기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였으나, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
| 성분 | 함량 |
| 닭가슴살 단백질 가수분해물 | 1000 ㎎ |
| 구연산 | 1000 ㎎ |
| 올리고당 | 100 g |
| 매실농축액 | 2 g |
| 타우린 | 1 g |
| 정제수 혼합 | 전체 900 mL |
이상에서 설명한 본 발명의 바람직한 실시예들은 기술적 과제를 해결하기 위해 개시된 것으로, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 사상 및 범위 안에서 다양한 수정, 변경, 부가 등이 가능할 것이며, 이러한 수정 변경 등은 이하의 특허청구범위에 속하는 것으로 보아야 할 것이다.
Claims (7)
- 닭가슴살을 알칼리 프로테아제(alkaline protease)로 1차 효소분해하고,
류신 아미노펩티데이즈(leucine aminopeptidase), 브로멜라인(bromelain) 및 파파인(papain)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 효소로 2차 효소분해하여 수득한 닭가슴살 단백질 가수분해물로서,
상기 2차 효소분해는 류신 아미노펩티데이즈(leucine aminopeptidase), 브로멜라인(bromelain) 및 파파인(papain)이 사용되고,
상기 류신 아미노펩티데이즈(leucine aminopeptidase), 브로멜라인(bromelain) 및 파파인(papain)의 중량비는 1.5 내지 2.5 : 0.8 내지 1.2 : 1인 것을 특징으로 하는 닭가슴살 단백질 가수분해물. - 삭제
- 제1항의 닭가슴살 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 근 감소 완화용 식품 조성물.
- 제1항의 닭가슴살 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 식품 조성물.
- 제1항의 닭가슴살 단백질 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 장내 미생물 개선용 식품 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 조성물은 장내 프로피오네이트(propionate) 및 이소발러레이트(isovalerate)의 생산량을 증가시킬 수 있는 것을 특징으로 하는 장내 미생물 개선용 식품 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 조성물은 Bacteroides, Muribaculaceae, Lactobacillus 및 Lachnoclostridium 속으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 장내 유익균의 생장을 촉진할 수 있고,
상기 조성물은 Enterorhabdus, Enterorhabdus, Streptococcus 및 Escherichia-Shigella 속으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 장내 유해균의 생장을 억제할 수 있는 것을 특징으로 하는 장내 미생물 개선용 식품 조성물.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR102675379B1 true KR102675379B1 (ko) | 2024-06-14 |
Family
ID=
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103820379B (zh) * | 2014-02-19 | 2016-04-06 | 青岛农业大学 | 肉类蛋白酶解物对酸奶中分离乳酸菌增殖作用的实验方法 |
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103820379B (zh) * | 2014-02-19 | 2016-04-06 | 青岛农业大学 | 肉类蛋白酶解物对酸奶中分离乳酸菌增殖作用的实验方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Setthaya, P., et al. Foods 10(12): 2994(2021.12.04.)* |
| 김은비 외 4명. 한국식품저장유통학회지 29(2): 276-291(2022.04.30.)* |
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