KR102673520B1 - 육계 추출물을 유효성분으로 포함하는 스타틴계 화합물에 의해 유도된 pcsk9 억제용 조성물 - Google Patents

육계 추출물을 유효성분으로 포함하는 스타틴계 화합물에 의해 유도된 pcsk9 억제용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 육계 추출물을 유효성분으로 포함하는 스타틴계 화합물에 의해 유도된 PCSK9 억제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 육계 추출물은 세포 독성이 거의 없으며, 스타틴계 화합물(로바스타틴) 또는 과당(fructose)에 의해 증가된 PCSK9의 발현을 억제할 뿐만 아니라, LDLR의 발현을 증가시키는 효과가 있으므로, 스타틴계 화합물과 병용투여하는 경우 효과적으로 고콜레스테롤 혈증을 감소시킬 수 있다.

Description

육계 추출물을 유효성분으로 포함하는 스타틴계 화합물에 의해 유도된 PCSK9 억제용 조성물{Composition for inhibiting PCSK9 induced by statin compound comprising Cinnamomum cassia extract as effective component}
본 발명은 육계 추출물을 유효성분으로 포함하는 스타틴계 화합물에 의해 유도된 PCSK9 억제용 조성물에 관한 것이다.
콜레스테롤은 동물 세포에 의해 제조되고 세포막을 구축하는데 사용되는 주요 지질이다. 콜레스테롤은 수용성이고, 지단백질 내에서 혈장으로 운반된다. 임의의 지단백질(예를 들어, 초저밀도 지단백질(VLDL), 저밀도 지단백질(LDL), 중간 밀도 지단백질(IDL) 및 고밀도 지단백질(HDL))이 콜레스테롤을 운반할 수 있지만, 비-HDL 콜레스테롤이 상승하면, 아테롬성경화증 및 관상 동맥 심장 질환에 걸릴 확률이 높아진다. 이러한 유형의 콜레스테롤이 상승된 고콜레스테롤혈증은 동맥벽에 플라크 침착을 유발할 수 있다.
PCSK9은 혈장 막에서 간 및 간 외 LDL 수용체(LDLR) 발현 둘 다를 조절함으로써 혈장 LDL 콜레스테롤 수준을 간접적으로 조절하는 세린 프로테아제이다. PCSK9 단백질의 감소된 발현은 LDLR 수용체의 발현을 증가시키고, 이에 따라 혈장 LDL 콜레스테롤, 그로 인한 고콜레스테롤혈증 및/또는 아테롬성경화증, 뿐만 아니라 그로부터 발생하는 합병증을 감소시킨다.
현재까지 혈중 지질 농도를 감소시키는 방법으로는 콜레스테롤이나 지방이 많이 함유되어 있는 음식물의 섭취를 줄이는 식이요법, 운동 요법 및 약물 요법 등이 사용되고 있다. 하지만, 식이 요법이나 운동 요법은 엄격한 관리 및 실시가 필요하며, 그 치료 효과에 있어서도 한계가 있다. 현재까지 개발된 지질 농도를 감소시키는 약물로는 담즙산 결합수지, 콜레스테롤 생합성에 있어서 중요한 효소인 HMG-CoA 환원효소 억제제(HMG-CoA reductase inhibitors)와 같이 콜레스테롤의 양을 낮추는 약물, 피브린산 유도체, 니코틴산 등의 중성지방을 낮추는 약제들이 개발되었다. 그 중에서 현재, 고지혈증 치료제로서 가장 흔히 사용되는 약물은 스타틴(statin) 계열의 화합물이다. 스타틴계 화합물은 세포 내 콜레스테롤 합성 과정의 속도를 조절하는 효소인 HMG-CoA 환원효소(reductase)의 활성을 억제하여 세포 내 콜레스테롤의 양을 감소시키고, 결과적으로 세포 내 콜레스테롤의 양을 감소시킴으로써 혈중으로 분비되는 콜레스테롤의 양이 줄어들어 혈중 콜레스테롤의 농도를 낮춘다. 스타틴계 화합물이 저밀도 지단백 수용체의 양을 증가시키는 것으로 알려져 있지만, 반대로 PCSK9 유전자의 발현을 전사 수준에서 증가시키는 작용도 한다. 즉, 스타틴계 화합물이 매우 효과적인 고콜레스테롤혈증의 약물이기는 하지만, 임상적으로 상기 스타틴계 화합물의 용량을 두 배 증가시켜도 용량에 비례하여 콜레스테롤을 감소시키지 못하고, 최초 용량에 의하여 감소된 정도에서 추가로 약 5~6% 더 감소하는 정도에 그친다. 그러한 이유가 스타틴계 화합물이 상기한 바와 같이 PCSK9을 증가시키기 때문이다.
한편, PCSK9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)은 세포막에 존재하는 저밀도 지단백 수용체(low density lipoprotein receptor; LDLR)의 EGF-A 도메인과 결합하여 세포 내로 이동한 후, 세포 내의 라이소좀(lysosome)에서 LDLR가 분해될 수 있도록 하는 단백질이다. PCSK9 유전자의 발현이 증가할 경우, LDLR이 감소하여 혈중 LDL 콜레스테롤의 농도가 급격히 증가하며, PCSK9 활성이 증가하는 획득 형질 돌연변이(gain-of-function mutation)가 있는 환자는 상염색체 우성 가족성 과콜레스테롤혈증(autosomal dominant familial hypercholesterolemia)이 발병하고, 반대로 PCSK9 유전자의 유전자 기능이 상실된 결실 기능 돌연변이(loss-of-function mutation)가 있는 사람에서 혈중 LDL-콜레스테롤의 농도가 정상인에 비하여 감소되어 있으며 관상동맥 질환의 발병 확률이 매우 낮은 사실이 보고되었다.
또한, PCSK9가 결실된 마우스에서 LDLR의 발현 증가가 나타나며, 혈중 LDL 콜레스테롤의 농도가 감소된다는 것이 알려져 있다. PCSK9 유전자의 발현을 억제할 경우 LDLR의 양을 증가시킬 수 있으며, 혈중 콜레스테롤 농도를 감소시키게 되어 관상동맥질환의 발병률을 현저히 낮출 수 있는 고콜레스테롤혈증의 새로운 치료 표적으로 밝혀지고 있다.
현재까지 PCSK9 유전자의 조절을 통하여 혈중 콜레스테롤 농도의 감소를 유도하는 방법으로는 siRNA를 이용하여 PCSK9 유전자의 합성을 억제하는 방법, PCSK9에 대한 항체를 이용하여 PCSK9 유전자의 양을 감소시키거나, PCSK9과 LDLR의 결합을 방해하는 펩티드를 이용하여 PCSK9 유전자의 활성을 억제하는 방법 및 저분자 화합물을 이용하여 PCSK9 유전자의 활성을 억제하거나 발현 양의 감소를 유도하는 방법이 개시된 바 있다. 저분자 화합물을 이용한 방법의 일례로는 베르베린, 케노데옥시콜린산(chenodeoxycholic acid) 및 FXR(farnesoid X receptor)이 PCSK9 유전자의 발현을 억제한다는 사실이 보고되었다.
한국등록특허 제1646757호에, 고지혈증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 기술이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1289018호에, 육계를 포함하는 항비만 조성물 및 이를 포함하는 식품에 관한 기술이 개시되어 있으나, 아직까지 본 발명의 육계 추출물을 유효성분으로 포함하는 스타틴계 화합물에 의해 유도된 PCSK9 억제용 조성물에 대해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 육계 추출물을 유효성분으로 포함하는 스타틴계 화합물에 의해 유도된 PCSK9 억제용 조성물을 제공하고, 본 발명의 유효성분인 육계 추출물이 세포독성이 거의 없으며, 스타틴계 화합물(로바스타틴) 또는 과당(fructose)에 의해 증가된 PCSK9의 발현을 억제할 뿐만 아니라, LDLR의 발현을 증가시키는 효과가 있으므로, 스타틴계 화합물과 병용투여하는 경우 효과적으로 고콜레스테롤혈증을 감소시킬 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 육계 추출물을 유효성분으로 포함하는 PCSK9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) 유전자의 과발현에 의한 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 육계 추출물 및 스타틴계 화합물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 육계 추출물 및 스타틴계 화합물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 육계 추출물을 유효성분으로 포함하는 스타틴계 화합물에 의해 유도된 PCSK9 억제용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 육계 추출물은 세포 독성이 거의 없으며, 스타틴계 화합물(로바스타틴) 또는 과당(fructose)에 의해 증가된 PCSK9의 발현을 억제할 뿐만 아니라, LDLR의 발현을 증가시키는 효과가 있다. 따라서 스타틴계 화합물과 병용투여하는 경우 효과적으로 고콜레스테롤 혈증을 감소시킬 수 있는 것이다.
도 1은 육계 추출물의 처리에 따른 세포독성(A); 및 과당 및 육계 추출물의 처리에 따른 세포독성(B)을 확인한 것이다.
도 2는 로바스타틴(A), 과당(B) 또는 로바스타틴+과당(C)을 처리한 조건에서 본 발명의 육계 추출물을 처리한 후의 PCSK9의 발현량을 확인한 real time PCR 결과이다. **, ***은 아무것도 처리하지 않은 정상군(-) 대비 로바스타틴, 과당 또는 로바스타틴+과당을 처리한 군의 PCSK9 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, **은 p<0.01이고, ***은 p<0.001이다. #, ##, ###은 로바스타틴, 과당 또는 로바스타틴+과당을 처리한 군 대비 본 발명의 육계 추출물을 처리한 군에서의 PCSK9 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, #은 p<0.05이며, ##은 p<0.01이고, ###은 p<0.001이다.
도 3은 과당(A) 또는 로바스타틴+과당(B)을 처리한 조건에서 본 발명의 육계 추출물을 처리한 후의 LDLR의 발현량을 확인한 실시간 중합효소 연쇄반응(real time PCR) 결과이다. **은 아무것도 처리하지 않은 정상군 대비 과당 또는 로바스타틴+과당을 처리한 대조군의 LDLR 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로 p<0.01이다. ##, ###은 대조군 대비 본 발명의 육계 추출물을 처리한 실험군의 LDLR 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로 ##은 p<0.01이고, ###은 p<0.001이다.
도 4는 로바스타틴(A), 과당(B) 또는 로바스타틴+과당(C)을 처리한 조건에서, 본 발명의 육계 추출물을 처리한 후의 PCSK9 및 LDLR의 단백질 발현량을 확인한 웨스턴블랏 결과이다.
본 발명은 육계 추출물을 유효성분으로 포함하는 PCSK9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) 유전자의 과발현에 의한 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 건강기능식품 조성물에서, 스타틴계 화합물 또는 과당(fructose)에 의해 상기 PCSK9의 유전자 또는 단백질 발현이 증가된 것이 특징이며, 상기 스타틴계 화합물은 로바스타틴(lovastatin), 심바스타틴(simvastatin), 프라바스타틴(pravastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 아토바스타틴(atorvastatin), 로수바스타틴(rosuvastatin), 이타바스타틴(itavastatin), 세리바스타틴(cerivastatin), 피타바스타틴(pitavastatin), 메바스타틴(mevastatin) 및 리바스타틴(rivastatin) 중에서 선택되는 하나 이상인 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 육계 추출물은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
(1) 건조한 육계에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
(2) 단계 (1) 이후에, 추출물을 원심분리하는 단계; 및
(3) 단계 (2) 이후에, 원심분리한 추출물을 건조하는 단계.
상기 단계 (1)에서 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물 중에서 선택하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 물이지만 이에 한정하지 않는다. 상기 제조방법에 있어서, 추출방법은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 당 업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 추출용매는 육계 중량의 1~20배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 5~15배 첨가하는 것이고, 더욱더 바람직하게는 10배 첨가하는 것이다. 추출온도는 20~110℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 15~150분인 것이 바람직하며, 80~130분이 더욱 바람직하고, 120분이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 단계 (3)에서, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 동결건조이나 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 육계 추출물 및 스타틴계 화합물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 고콜레스테롤혈증은 PCSK9 유전자의 과발현에 의한 고콜레스테롤혈증인 것을 특징으로 한다.
상기 건강기능식품 조성물은 스타틴계 화합물에 의해 증가된 PCSK9 발현을 감소시키며, 저밀도 지단백 수용체(Low-Density Lipoprotein Receptor, LDLR)의 발현을 증가시키는 것이 특징이다.
상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 건강기능식품 조성물은 유효성분을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 제조될 수 있다. 상기 육계 추출물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 캐러멜, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 중에서 선택된 어느 하나의 형태일 수 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다. 즉, 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 및 천연 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 상기의 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 단당류, 말토스, 슈크로스와 같은 이당류, 덱스트린, 사이클로 덱스트린과 같은 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당 알코올이다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 크게 중요하지 않지만, 본 발명의 조성물 100g에 대하여, 0.01~0.04g인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.02~0.03g을 포함하는 것이지만 이에 한정하지 않는다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 육계 추출물 및 스타틴계 화합물을 유효성분으로 포함하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 고콜레스테롤혈증은 PCSK9 유전자의 과발현에 의한 고콜레스테롤혈증인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 계면활성제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여 방식으로 적용된다. 본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 육계 추출물 제조
육계(Cinnamomi Cortex; Cinnamomum cassia Presl)는 원산지가 베트남산이며, 옴니허브로부터 구매하였다.
(1) 육계 열수 추출물
육계 열수 추출물의 제조는 환류 추출법을 이용하였다. 먼저 시료를 믹서로 분쇄한 후, 시료 무게 대비 10배의 증류수를 넣고 100℃에서 2시간 환류추출을 2번 하고 추출액을 와트만 여과지 No. 2으로 여과한 후, 여과한 액을 40℃에서 감압농축하고 이를 동결건조한 다음 균질화하여 최종 추출물을 획득하였다.
(2) 육계 에탄올 추출물
육계 에탄올 추출물은 침윤법을 이용하여 획득하였다. 먼저 시료를 믹서로 분쇄한 후 시료 무게 대비 10배의 70%(v/v) 에탄올을 넣고 상온에서 1시간 초음파 추출하는 과정을 2회 반복하였다. 추출액은 와트만 여과지 No. 2으로 여과한 후, 여과한 액을 40℃에서 감압농축하고 이를 동결건조한 다음 균질화하여 최종 추출물을 획득하였다.
실시예 2. 세포배양
HepG2 세포는 ATCC(Seoul, Korea)에서 분양받았다. 2일마다 고함량의 글루코스를 포함하는 DMEM 배지(25mM 글루코스, 10% FBS, 1% antibiotics 포함)을 이용하여 계대하여 현상을 유지하였으며, 6웰 플레이트에 1×106개의 HepG2 세포를 분주하여 24시간 동안 부착시킨 후, 저함량의 글루코스, low FBS DMEM 배지(5.5mM 글루코스, 1% FBS, 1% 항생제 포함)에서 2시간 전배양을 수행하였다. 이후 20mM 과당(fructose)가 부과된 저함량의 글루코스를 포함하는 low FBS DMEM 배지에 육계 열수 추출물을 처리하여 효능을 확인하였다.
실시예 3. 세포생존율 측정
육계 열수추출물의 농도별 세포생존율에 대한 효과를 평가하기 위하여, 고함량의 글루코스를 포함하는 DMEM 배지; 및 과당(fructose)이 첨가된 저함량의 글루코스의 low FBS DMEM 배지에서, 육계 열수 추출물을 농도별로 HepG2 세포에 처리한 후 48시간 동안 배양하였다. 이후 CCK8 용액을 각 웰에 처리하여 살아있는 세포에서 미토콘드리아와의 반응을 유도하기 위하여 1시간을 더 배양한 후 ELISA 리더를 사용하여 570nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과 도 1A에 개시한 바와 같이, 400㎍/㎖의 농도까지 세포독성을 확인하였으며, 상기 농도 범위에서는 세포독성이 나타나지 않았다. 또한, 20mM의 과당(fructose)가 포함된 배지에서 72시간 배양한 후 세포독성을 확인한 결과, 600㎍/㎖의 농도에서도 80% 이상의 세포생존율을 확인하였다(도 1B).
실시예 4. 유전자 발현 분석
세포에서의 RNA 추출은 Easy spin RNA 추출키트(iNtRON, Seongnam, Korea)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 추출하였다. Nanodrop DS-11 스펙트로미터(DeNovix, Wilmington, DE USA)로 농도를 측정하여 정량한 다음 cDNA는 iScipt cDNA 합성키트(Bio-rad, USA)를 이용하여 합성하였으며, q-PCR은 SsoAdvanced™ Universal SYBR®Green Supermix (Bio-rad)를 이용하여 측정하였다. 증폭된 유전자의 발현정도를 정량화하기 위해 qPCR 반응은 Rotor Gene SYBR Green PCR 키트를 이용하여 혼합한 다음, 실시간 중효소연쇄반응 시스템(Bio-rad, USA)을 이용하여 수행하였다. 실시간 중효소연쇄반응(Real time PCR)의 조건은 40 사이클로 증폭시켜 반응을 진행하였다 (95℃, 30초; 58℃, 30초; 72℃에서 30초). 내부 표준물질로 GAPDH 또는 18S rRNA를 사용하여 타겟 그룹의 qPCR로 계산하여 정량화하였다. 사용된 프라이머 정보는 표 1에 표시하였다.
유전자 발현량 분석을 위한 프라이머 서열
유전자 방향 서열(5'->3') 서열번호
PCSK9 정방향 AGTTGCCCCATGTCGACTAC 1
역방향 CACATTCTCGAAGTCGGTGA 2
LDLR 정방향 ACGGCGTCTCTTCCTATGACA 3
역방향 CCCTTGGT-ATCCGCAACAGA 4
GAPDH 정방향 GTCAGTGGTGGACCTGACCT 5
역방향 TGCTGTAGCCAAATTCGTTG 6
그 결과, 도 2 및 도 3에 개시한 바와 같이 본 발명의 육계 추출물은 PCSK9 유전자의 발현량을 감소시키며, LDLR의 발현량을 증가시키는 효과가 있다는 것을 확인하였다.
실시예 5. 웨스턴 블랏
육계 물 추출물의 PCSK9 단백질 발현 변화를 확인하기 위하여, HepG2 세포를 6웰 플레이트에 농도로 세포 배양에서 제시한 방법에 따라 육계 물 추출물과 20mM의 과당(fructose), 5uM의 로바스타틴(lovastatin) 등을 처리하였다. 72시간을 배양한 후 2번의 인산염 완충액 (PBS) 세척 후에 세포를 수득하였다. 세포의 전단백질(whole cell lysate)은 RIPA 분해 완충용액을 이용해 수득하였고, SDS-PAGE 전기영동을 통해 단백질을 분리하고 각각의 1, 2차 항체 면역반응을 통해 각 단백질의 발현을 분석하였다. ChemiDocTM Touch 이미징 시스템(Bio-Rad)을 사용하여 단백질 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 4 개시한 바와 같이 본 발명의 육계 추출물은 PCSK9 단백질의 발현량을 감소시키고, LDLR의 발현량을 증가시키는 효과가 있다는 것을 확인하였다.
[통계처리]
실험 결과의 통계처리는 Excel 프로그램의 t-test를 이용하여 수행하였으며, p<0.05 수준에서 유의성을 확인하였다.
<110> Korea Institute of Oriental Medicine <120> Composition for inhibiting PCSK9 induced by statin compound comprising Cinnamomum cassia extract as effective component <130> PN21125 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCSK9-F <400> 1 agttgcccca tgtcgactac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCSK9-R <400> 2 cacattctcg aagtcggtga 20 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LDLR-F <400> 3 acggcgtctc ttcctatgac a 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LDLR-R <400> 4 cccttggtat ccgcaacaga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-F <400> 5 gtcagtggtg gacctgacct 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH-R <400> 6 tgctgtagcc aaattcgttg 20

Claims (8)

  1. 육계(Cinnamomum cassia) 추출물 및 스타틴계 화합물을 유효성분으로 포함하는 PCSK9(Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9) 유전자의 과발현에 의한 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PCSK9 유전자의 과발현은 스타틴계 화합물 또는 과당(fructose)에 의해 유도된 것을 특징으로 하는 PCSK9 유전자의 과발현에 의한 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 스타틴계 화합물은 로바스타틴(lovastatin), 심바스타틴(simvastatin), 프라바스타틴(pravastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 아토바스타틴(atorvastatin), 로수바스타틴(rosuvastatin), 이타바스타틴(itavastatin), 세리바스타틴(cerivastatin), 피타바스타틴(pitavastatin), 메바스타틴(mevastatin) 및 리바스타틴(rivastatin) 중에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 PCSK9 유전자의 과발현에 의한 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 육계 추출물의 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 PCSK9 유전자의 과발현에 의한 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 스타틴계 화합물에 의해 증가된 PCSK9 발현을 감소시키며, 저밀도 지단백 수용체(Low-Density Lipoprotein Receptor, LDLR)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 고콜레스테롤혈증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 삭제
  8. 삭제
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