KR102669998B1 - 디에틸스틸베스트롤을 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
디에틸스틸베스트롤을 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 디에틸스틸베스트롤을 유효성분으로 함유하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 디에틸스틸베스트롤을 포함하는 약학적 조성물은 ANO1의 발현을 억제하여 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용한 효과가 있다. 또한, 본 발명의 디에틸스틸베스트롤을 포함하는 약학적 조성물은 PC9 세포의 생존과 이동을 억제하고 세포 자멸을 유도하는 한편, 간세포의 생존에는 영향을 미치지 않아 폐암 발달 및 전이 억제용 약학적 조성물로 유용한 효과가 있다.
Description
본 발명은 디에틸스틸베스트롤(DES;diethylstilbestrol)을 유효성분으로 함유하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
폐암은 비소세포폐암(NSCLC)과 소세포폐암(SCLC)의 두 종류로 분류된다. 이 중 NSCLC는 암 사망의 가장 두드러진 원인이며, 폐암의 80% 이상을 차지한다. 따라서 표적 치료나 면역요법을 통해 폐암을 치료하기 위해 분자 또는 면역학적 방법을 사용하여 치료 효율을 높이려는 시도가 여러 차례 있었다. 일부 치료법은 다양한 치료 대상으로 EGFR-TKI와 PD-1을 목표로 하고 있으며, 다른 치료법은 PI3K/AKT/mTOR 경로, RAS/BRAF/MAPK 경로, JAK/STAT 경로를 포함한 비정상적인 신호를 억제하는 것이다.
그러나 비소세포폐암(NSCLC)에서 병리학적 기전이 불분명하게 남아 있고, 치료 타겟에 대한 변이와 치료 약물에 대한 내성으로 인해 비소세포폐암 치료에 대한 한계가 두드러지고 있다. 그 결과 비소세포폐암을 치료하기 위한 새로운 치료제의 개발과 새로운 치료 타겟을 찾는 노력이 요구되고 있다.
다양한 암종의 치료 타겟으로 간주되는 음이온 채널 중 하나인 염소이온채널(CaCC)은 칼슘에 의해 활성화 되며, 상피세포 분비와 세포의 부피를 조절하는 것으로 알려져 있다. 최근 주요 CaCC인 ANO1(Anoctamin1)이 위장, 전립선, 두경부, 유방과 대장 등의 암세포에서 과다 발현된 것으로 알려졌다(비특허문헌, Britschgi A, et al., Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. 2013, 110, E1026-E1034). ANO1은 폐암 치료의 주요 타겟인 EGFR 및 CAMK 경로와 같은 종양 유발 신호를 촉진하여 암 발생에 관여한다. 특히 ANO1과 EGFR은 두경부암의 암 발병을 촉진하는 기능 복합체를 형성하여 암 발달에 관여한다.
ANO1은 다양한 암의 치료에 중요한 타겟이 될 수 있지만, 비소세포폐암에서는 ANO1의 병리학적 기전이 정확하게 규명되지 않았다. 비소세포폐암의 다양한 치료제 개발은 지속되고 있으며, 비소세포폐암 치료를 위해 ANO1을 억제하는 기전의 항암제 후보가 개발되지 않은 상황이다.
본 발명자들은 디에틸스틸베스트롤이 ANO1 특이적 억제제라는 사실을 발견하고, 추가 연구를 통해서 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 폐암, 그 중에서도 비소세포폐암(NSCLC)의 예방 또는 치료제를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 폐암, 그 중에서도 비소세포폐암(NSCLC)의 전이 억제제를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 디에틸스틸베스트롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 디에틸스틸베스트롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 폐암의 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
다른 측면에서, 본 발명은 디에틸스틸베스트롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 ANO1 발현 저해용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 디에틸스틸베스트롤을 포함하는 약학적 조성물은 ANO1을 억제하면서 폐암 세포의 증식을 억제하여, 폐암에 대한 항암 활성이 우수하고, 또한 폐암의 전이를 억제하는 효과가 있다.
도 1a는 ANO1을 발현하는 HEK293T 세포에서 ANO1 유도 전류를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 1b는 ANO1을 발현하는 HEK293T 세포에서 ANO1 유도 전류의 밀도를 나타낸 도면이다.
도 2a는 랫드의 갑상선 세포인 FRT, FRT-hANO1(ANO1을 인위적으로 과발현시킨 세포), 폐암 세포주인 A549, H1993, HCC827, H1975, PC9 세포에서 ANO1의 발현 수준을 나타낸 도면이다.
도 2b는 FRT, FRT-hANO1, 폐암 세포주인 A549, H1993, HCC827, H1975, PC9 세포에서 상대적인 ANO1 단백질 수준을 나타낸 도면이다.
도 2c는 폐암 세포주인 PC9 세포에서 Eact, Ani9, 및 디에틸스틸베스트롤에 의한 ANO1의 발현 수준을 나타낸 도면이다.
도 2d는 폐암 세포주인 PC9 세포에서 Eact, Ani9, 및 디에틸스틸베스트롤에 의한 ANO1의 발현 수준을 베타-액틴으로 정규화하여 나타낸 도면이다.
도 3a는 폐암 세포주인 H1975 세포에서 Eact, Ani9, 및 디에틸스틸베스트롤에 의한 세포 생존율을 나타낸 도면이다.
도 3b는 폐암 세포주인 PC9 세포에서 Eact, Ani9, 및 디에틸스틸베스트롤에 의한 세포 생존율을 나타낸 도면이다.
도 3c는 폐암 세포주인 PC9 세포에 디에틸스틸베스트롤을 처리하여 세포 이동 분석(migration assay)을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3d는 폐암 세포주인 PC9 세포에 디에틸스틸베스트롤 및 Ani9를 처리하여 세포 이동 (cell migration) 억제 효과 정도를 나타낸 도면이다.
도 4a는 Eact, Ani9, 및 디에틸스틸베스트롤을 처리한 폐암 세포주인 PC9 세포에서 Caspase3의 활성을 나타낸 도면이다.
도 4b는 Eact, Ani9, 및 디에틸스틸베스트롤을 처리한 폐암 세포주인 PC9 세포에서 Cleaved PARP-1의 활성을 나타낸 도면이다.
도 4c는 HepG2 (hepatocyte) 간세포에서 Eact, Ani9, 및 디에틸스틸베스트롤에 의한 세포 생존율을 나타낸 도면이다.
도 1b는 ANO1을 발현하는 HEK293T 세포에서 ANO1 유도 전류의 밀도를 나타낸 도면이다.
도 2a는 랫드의 갑상선 세포인 FRT, FRT-hANO1(ANO1을 인위적으로 과발현시킨 세포), 폐암 세포주인 A549, H1993, HCC827, H1975, PC9 세포에서 ANO1의 발현 수준을 나타낸 도면이다.
도 2b는 FRT, FRT-hANO1, 폐암 세포주인 A549, H1993, HCC827, H1975, PC9 세포에서 상대적인 ANO1 단백질 수준을 나타낸 도면이다.
도 2c는 폐암 세포주인 PC9 세포에서 Eact, Ani9, 및 디에틸스틸베스트롤에 의한 ANO1의 발현 수준을 나타낸 도면이다.
도 2d는 폐암 세포주인 PC9 세포에서 Eact, Ani9, 및 디에틸스틸베스트롤에 의한 ANO1의 발현 수준을 베타-액틴으로 정규화하여 나타낸 도면이다.
도 3a는 폐암 세포주인 H1975 세포에서 Eact, Ani9, 및 디에틸스틸베스트롤에 의한 세포 생존율을 나타낸 도면이다.
도 3b는 폐암 세포주인 PC9 세포에서 Eact, Ani9, 및 디에틸스틸베스트롤에 의한 세포 생존율을 나타낸 도면이다.
도 3c는 폐암 세포주인 PC9 세포에 디에틸스틸베스트롤을 처리하여 세포 이동 분석(migration assay)을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3d는 폐암 세포주인 PC9 세포에 디에틸스틸베스트롤 및 Ani9를 처리하여 세포 이동 (cell migration) 억제 효과 정도를 나타낸 도면이다.
도 4a는 Eact, Ani9, 및 디에틸스틸베스트롤을 처리한 폐암 세포주인 PC9 세포에서 Caspase3의 활성을 나타낸 도면이다.
도 4b는 Eact, Ani9, 및 디에틸스틸베스트롤을 처리한 폐암 세포주인 PC9 세포에서 Cleaved PARP-1의 활성을 나타낸 도면이다.
도 4c는 HepG2 (hepatocyte) 간세포에서 Eact, Ani9, 및 디에틸스틸베스트롤에 의한 세포 생존율을 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 일측면에서 디에틸스틸베스트롤 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 다른 측면에서 디에틸스틸베스트롤 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 폐암의 전이 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 디에틸스틸베스트롤은 하기 화학식 1로 표시될 수 있다.
[화학식 1]
디에틸스틸베스트롤의 IUPAC 이름은 4,4`-(3E)-헥스-3-엔-3,4-디일디페놀이며, (E)-3,4-비스(4-히드록시페닐)-3-헥센으로도 불리며, 약칭으로 DES라고도 한다.
본 발명은 또 다른 측면에서, 디에틸스틸베스트롤 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 ANO1의 발현 억제 또는, ANO1의 활성 저해용 약학적 조성물을 제공한다.
디에틸스틸베스트롤 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 폐암 세포의 세포 자멸(apoptosis)을 유도하거나, 폐암 세포의 이동을 억제할 수 있다. 일례로서, 상기 폐암 세포는 ANO1의 과발현으로 인하여 발생한 폐암 세포일 수 있다.
본 발명에서 상기 폐암은 비소세포폐암이거나, ANO1 과발현으로 인하여 발생한 폐암일 수 있다.
디에틸스틸베스트롤은 Ca2+-활성 Cl- 채널(CaCC; Ca2+-activated Cl- channel)을 억제하고 세포 자멸을 유도한다. 구체적으로 디에틸스틸베스트롤은 ANO1을 억제하여 암 세포의 성장과 이동을 억제하고, 세포 자멸을 유도한다.
본 발명의 일 구체예에서, ANO1을 발현하는 HEK293T 세포에서 디에틸스틸베스트롤과 ANO1의 억제제로 알려진 Ani9이 ANO1 유도 전류를 억제하는 것이 확인되며(도 1a 및 도 1b 참조), 폐암 세포주 중 PC9 세포에서 ANO1이 과다 발현되고(도 2a 및 도 2b 참조), ANO1의 활성화제로 알려진 Eat 및 ANO1의 억제제로 알려진 Ani9와 비교할 때, 디에틸스틸베스트롤에 의해 ANO1 단백질 발현이 감소되는 것이 확인된다(도 2c 및 도 2d 참조).
본 발명의 다른 구체예에서, 폐암 세포주 중 ANO1이 적게 발현되는 H1975 세포에 Eact, Ani9, 및 디에틸스틸베스트롤을 처리하였을 때 세포 생존율에 거의 변화가 없음이 확인되며(도 3a 참조), 폐암 세포주 중 ANO1이 과다 발현되는 PC9 세포에 Eact나 Ani9과 달리, 디에틸스틸베스트롤을 처리하는 경우에만 세포 생존율이 감소되는 것이 확인된다(도 3b 참조). 또한, 세포 이동 분석을 통하여 디에틸스틸베스트롤에 의해 PC9 세포의 이동이 감소되는 것이 확인된다(도 3c 및 도 3d 참조).
본 발명의 또 다른 구체예에서, PC9 세포에서 Eact나 Ani9과 달리, 디에틸스틸베스트롤을 세포에 처리하였을 경우, Capase3과 Cleaved PARP-1 활성이 유의하게 증가하여 세포 자멸이 유도되는 것이 확인된다(도 4a 및 도 4b 참조). 또한, 디에틸스틸베스트롤이 HepG2 간세포의 세포 생존율에 영향이 없는 것이 확인된다(도 4c 참조).
따라서, 본 발명의 디에틸스틸베스트롤을 포함하는 약학적 조성물은 암 세포의 세포 자멸을 유도하는 한편, 간세포의 생존율을 약화시키지는 않고, 암 세포의 성장과 이동을 감소시키므로, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로 유용하다.
본 발명에 있어서, "치료"는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, "예방"은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에 있어서, “전이”는 종양 세포가 한 기관이나 부분으로부터 거리상으로 분리된 곳으로 옮겨가는 현상을 말하며, “전이 억제”는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 전이 현상의 발생을 원천적으로 차단 또는 전이 현상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 디에틸스틸베스트롤은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 음염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
상기 디에틸스틸베스트롤은 이로부터 제조될 수 있는 용매화물, 입체 이성질체, 수화물 등을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 단일제로도 사용할 수 있으며, 공인된 약물을 추가로 포함하여 복합제제로 제조하여 사용할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 희석제를 추가하여 약제학적 단위 투여형으로 제형화할 수 있다.
본 발명에 있어서, "약학적으로 허용가능한"이란 생물체를 상당히 자극하지 않고 투여 활성 물질의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 것을 의미한다.
본 발명에서 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물에서 디에틸스틸베스트롤은 약학적으로 유효한 양으로 포함될 수 있다. "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도 의 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명은 다른 측면에서, 약학적으로 유효한 양의 디에틸스틸베스트롤 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 개체에게 투여하여 폐암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명은, 약학적으로 유효한 양의 디에틸스틸베스트롤 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 개체에게 투여하여 폐암의 성장과 전이를 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은, 약학적으로 유효한 양의 디에틸스틸베스트롤 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 개체에게 투여하여 ANO1의 활성 또는 발현을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또 다른 측면에서, 폐암의 예방 또는 치료용 약제의 제조를 위한 디에틸스틸베스트롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 사용을 제공한다.
본 발명은, 폐암의 전이 억제용 약제의 제조를 위한 디에틸스틸베스트롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 사용을 제공한다.
본 발명은, ANO1의 활성 또는 발현 억제용 약제의 제조를 위한 디에틸스틸베스트롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 사용을 제공한다.
상기 방법 또는 사용에 있어서, 전술한 약학적 조성물에 대한 상세한 설명이 적용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<화합물 준비>
실험을 위하여 디에틸스틸베스트롤, ANO1의 알려진 일 활성화제, 및 ANO1의 알려진 일 억제제를 하기 표 1과 같이 준비하였다. 상세한 설명 또는 도면에서 ANO1의 알려진 활성화제를 'Eact', ANO1의 알려진 억제제를 'Ani9'로 표시하며, 디에틸스틸베스트롤은 DES로도 표시한다.
| 구분 | 화학구조 | 구입처 |
| DES | Sigma-Aldrich |
|
| Eact | Tocris Bioscience |
|
| Ani9 | Tocris Bioscience |
<실험 프로토콜(protocol)>
본 발명 실험예 1 내지 7을 수행하기 위한 구체적인 사항은 아래 1 내지 9의 프로토콜에 따른다.
1. 세포 배양(Cell culture)
ANO1 및 CFTR을 안정적으로 발현하는 피셔 랫드 갑상선(FRT;Fisher rat thyroid) 세포는 앨런 버크만(Alan Verkman, 캘리포니아 대학교, 캘리포니아 주 샌프란시스코)으로부터 제공받았다. FRT 세포는 10% 소 태아 혈청 (FBS), 2 mM L- 글루타민, 100 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토 마이신이 포함된, Coon의 변형된 F12 배지에서 배양되었다. HEK293T, A549, H1993, HCC827, H1975, PC9 세포는 대구경북첨단의료산업진흥재단 신약 개발 센터(DGMIF, 한국)에서 제공되었다. HEK293 세포는 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지(DMEM)에서 배양되었으며, 나머지 다른 세포들은 RPMI 1640 배지에서 배양되었고, 각각 10% FBS, 100 units/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토 마이신이 첨가되었다.
2. 단일세포 패치 클램프 실험(Whole-cell patch clamp experiments)
인간 ANO1을 일시적으로 발현하는 HEK-293 세포에 대해 패치 클램프 기록을 수행하였다. 피펫 용액에는 150 mM N-메틸-D-글루카민-Cl(NMDG-Cl), 1 mM MgCl2, 3 mM MgATP, 5 mM HEPES, 10 mM 에틸렌 글리콜 테트라 아세트산(EGTA) 및 6.6 mM CaCl2 (pH 7.2) (300 nM Ca2+)이 포함되었다. 시험관 용액은 150 mM NMGD-Cl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 5 mM 포도당 및 10 mM HEPES(pH 7.4)로 구성되었다. 파이펫은 붕규산 유리를 사용하여 준비되었으며 불 다듬질(fire polishing) 후 3-5 MΩ의 저항을 가졌다. 씰 저항은 3 내지 10 GΩ였다. 펄스 프로토콜: 유지 전위, 0 mV; 램프 펄스, -100~100mV; 펄스 지속 시간, 1 초; 및 펄스 간격, 20 초. 레코딩은 Axopatch 200 B (Axon Instruments, San Jose, CA, USA)를 사용하여 실온 (RT)에서 수행되었다. 전류는 Digidata 1440A 변환기 (Axon Instruments)를 사용하여 디지털화되었고, 데이터는 5kHz에서 필터링되었으며 1kHz에서 샘플링되었다.
3. 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)
단백질 샘플은 4 % -20 % Mini-PROTEIN TGXTM Precast Gel을 사용하여 분리하고, Trans-Blot Turbo Blotting System (Bio-Rad)을 사용하여 니트로 셀룰로오스 멤브레인 (0.45 μm)으로 옮겼다. Blocking은 Everyblot 차단 버퍼 (Bio-Rad)를 사용하여 수행되었다. 이후, 멤브레인을 재조합 Anti-TMEM16A 항체 [SP31] (ab64085) (Abcam), Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) 항체 #9101 (Cell signaling), p44/42 MAPK (Erk1/2) 항체 #9102 (Cell signaling), Phospho-EGF 수용체 (Tyr1068) (D7A5) XP® Rabbit mAb #3777 (Cell signaling), Anti-EGFR 항체 (A-10) ｜SCBT - (Santa Cruz Biotechnology) 및 anti-β-액틴 (Santa Cruz Biotechnology)를 포함하는 1 차 항체와 함께 밤새 배양했다. 이후, 멤브레인을 HRP가 접합된 항-2차 IgG 항체 (Enzo Life Science)와 함께 실온에서 1 시간 동안 배양했다. 마지막으로 ChemiDoc (Bio-Rad)을 이용하여 ClarityTM Western ECL 기판을 통해 시각화를 수행했다.
4. 세포 생존율 측정 실험(Cell viability measurement)
Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Rockville, MD, USA)을 사용하여 세포 생존율 분석을 수행했다. PC9 및 H1975 세포 (2 x 103 세포/웰)를 96-웰 플레이트에 배양했다. 이어서 세포 배양액을 3일 동안 24시간마다 ~ 3 배로 희석한 7가지 농도의 화합물을 함유하는 배지 (2.5 % FBS)로 재배양하였다. 72 시간 후, CCK-8 용액을 첨가하고, 세포를 2시간 동안 추가로 배양하였다. 흡광도는 450 nm에서 마이크로 플레이트 리더 (SynergyTM Neo, BioTek)를 사용하여 측정했다.
5. 세포 이동 분석 (migration assay)
PC9 세포는 2 × 104 세포/웰의 밀도로 밤새 배양하여 96-웰 ImageLock 조직 배양 플레이트(Essen BioScience)에서 90-100% 혼합되도록 했다. 제조업체의 지침에 따라 단층에 상처를 입혔다. 세포를 PBS로 두 번 세척하여 분리된 세포를 제거한 다음, 지시된 농도의 화합물을 포함하는 배지(2.5 % FBS)와 함께 24시간마다 화합물을 1회 처리하고 2일 동안 배양했다. 그 다음 현미경을 사용하여 이미지를 촬영하였다. 세포의 이동 면적을 평가하여 데이터를 분석하고, ImageJ 소프트웨어를 사용하여 세포 이동 억제율을 계산했다.
6. Caspase-3/CPP32 색도 분석(Caspase-3/CPP32 Colorimetric assay)
Caspase-3 활성은 제조자의 지시에 따라 측정되었다(# K106, Biovison, Milpitas, CA, USA). PC9 세포는 80% 웰 면적에 도달할 때까지 6x-웰 플레이트에서 배양되었다. 디에틸스틸베스트롤, Eact 및 Ani9를 세포에 24시간 동안 처리하고, 5x106 세포를 얼음에서 10분 동안 세포 용해 완충액을 사용하여 용해시켰다. 세포를 4℃에서 5분 동안 원심 분리한 후, 상층액을 분리하였다. 100 μg 단백질/50 μL 완충액을 10 mM DTT를 함유하는 2x 반응 완충액으로 각 웰에 부었다. Caspase3 활성을 측정하기 위해 5μL DEVD-pNA 기질을 주입하고 37℃에서 1시간 동안 배양했다. 광학 밀도는 마이크로 플레이트 리더 (SynergyTM Neo, BioTek)를 사용하여 400 nm에서 측정되었다.
7. 인간 Cleaved PARP-1 활성화 분석(Human Cleaved PARP-1 activity assay)
Cleaved PARP-1 활성은 제조업체의 지침(# ab174441, Abcam, UK)에 따라 측정되었다. PC9 세포는 70% 웰면적에 도달 할 때까지 6x웰 플레이트에서 배양되었다. 디에틸스틸베스트롤, Eact 및 Ani9를 세포에 처리하고 24시간 후, 5x107 세포를 얼음에서 20분 동안 세포 추출 완충액을 사용하여 용해시켰다. 세포를 4℃에서 20분 동안 원심 분리한 후 상층액을 분리하였다. 그 다음, 100 μg 단백질/50 μL 완충액을 포획 항체 및 검출 항체를 포함하는 항체 칵테일(antibody cocktail)과 함께 각 웰에 붓고 1시간 동안 배양했다. 웰을 1x 세척 완충액으로 세척한 다음 TMB development 용액을 10분 동안 첨가했다. 마지막으로, 정지 용액(stop solution)을 추가하고 마이크로 플레이트 리더(SynergyTM Neo, BioTek)를 사용하여 450 nm에서 광학 밀도를 측정했다.
8. 간세포 독성 측정(Hepatocytotoxicity measurement)
HepG2 세포는 배지(10% (v/v) FBS, 100 μg/mL 페니실린 및 스트렙토 마이신이 포함된 DMEM 고포도당 배지)의 검은색 및 투명한 바닥 96-웰 플레이트에 배양되고 세포가 약 70-80 %에 면적에 도달할 때까지 5% CO2로 37℃에서 배양되었다. 시험 화합물은 0.2% (v/v) DMSO 용매 0.01, 0.1, 1, 10 및 100 μM의 농도로 분석 배지를 사용하여 희석되었다. 0.2% (v/v) DMSO와 Triton X-100은 각각 "세포 사멸 없음" 및 "총 세포 사멸"대조군 실험으로 간주되었고, 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 20 % (v/v) resazurin 시약 (#G8080, Promega, USA)을 화합물 처리된 세포에 첨가하고 2-3 시간 동안 배양했다. 레소루핀(resorufin)의 상대적인 양은 590 nm에서 형광 강도를 측정하여 정량화되었다. 마지막으로, 데이터를 대조군 실험으로 정규화하고 다음과 같이 "정규화된 % 생존율"로 변환했다: (실험 데이터-총 세포 사멸) / (세포 사멸 없음-총 세포 사멸) × 100.
9. 통계분석(Statistical analysis)
모든 실험은 적어도 세 번 독립적으로 수행되었다. 여러 시험에 대한 결과는 평균 ± S.D로 표시된다. 통계적 분석은 Student's t- 검정 또는 분산 분석을 사용하여 적절하게 수행되었다. 통계적 유의성은 P<0.05로 설정되었다. GraphPad Prism 소프트웨어는 선량-반응 곡선을 그리고 IC50 값을 계산하는 데 사용되었다.
<실험예 1> ANO1 유도 전류의 측정
DES가 단일 세포에서도 ANO1 채널 기능을 억제하는지 확인하기 위해 상기 실험 프로토콜 2와 같이 단일세포 패치 클램프 실험을 수행하였다. 인간 ANO1을 일시적으로 발현하는 HEK293 세포에서 ANO1 전류를 측정하였고, 그 결과를 도 1a 및 도 1b에 나타내었다.
도 1a 및 도 1b를 보면, Ani9(ANO1 채널 억제제)와 디에틸스틸베스트롤은 각각 1μM과 10μM에서 ANO1 유도 전류를 77.7 ± 12.5%, 54.8 ± 16.7% 유의하게 억제하였다. 이로부터 디에틸스틸베스트롤은 ANO1의 활성을 억제하는 것을 알 수 있다.
<실험예 2> 다양한 폐암 세포주의 ANO1 발현량 측정
다양한 폐암 세포주에서 ANO1의 발현도를 측정하기 위해, 상기 실험 프로토콜 3과 같이, FRT, FRT-hANO1, A549, H1993, HCC827, H1975, 및 PC9 세포에 대하여 ANO1 단백질에 대한 웨스턴 블롯을 수행하였고, 그 결과를 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.
도 2a 및 도 2b를 보면, 다른 폐암 세포주와 달리, PC9 세포는 ANO1을 인위적으로 과발현시킨 FRT-hANO1 세포와 비교하였을 때 약 2배 이상 ANO1이 더 강하게 발현되는 것이 확인된다.
<실험예 3> PC9 세포에서 ANO1 단백질 감소 효과 분석
ANO1이 과발현되는 PC9 세포에 ANO1 활성화제로 알려진 Eact, ANO1 억제제로 알려진 Ani9, 및 디에틸스틸베스트롤을 72시간 동안 처리하였을 때 ANO1 단백질 발현 수준이 감소되는 효과를 분석하였으며, 상기 실험 프로토콜 3을 수행한 결과를 도 2c 및 도 2d에 나타내었다.
도 2c 및 도 2d를 보면, Eact와 Ani9를 처리하는 경우에는 ANO1 단백질의 발현 수준에 변화가 없는 반면, 3, 10 μM의 디에틸스틸베스트롤을 처리하는 경우, ANO1 단백질의 발현 수준이 각각 ~ 48.5%, ~97% 감소하는 것이 확인된다.
이로부터 디에틸스틸베스트롤은 ANO1의 활성을 억제할 뿐만 아니라, ANO1 단백질 발현도 감소시킨다는 것을 알 수 있다.
<실험예 4> H1975 및 PC9 세포에서 세포의 생존율 측정
상기 실험 프로토콜 4와 같이, ANO1이 거의 발현되지 않는 H1975 세포와, ANO1이 과발현되는 PC9 세포에 대하여, Eact, Ani9, 및 디에틸스틸베스트롤을 처리하였을 때 각 세포의 생존율을 측정하였고, 그 결과를 도 3a 및 도 3b에 나타내었다.
도 3a 및 도 3b를 보면, Eact 및 Ani9를 처리하는 경우에는 H1975 세포와 PC9 세포 모두 세포 생존율에 변화가 없었다. 반면, H1975에 3, 5, 10 μM 디에틸스틸베스트롤을 처리하였을 때, 세포 생존성이 각각 16.1, 17.0, 28.5% 감소하였고, PC9에 3, 5, 10 μM 디에틸스틸베스트롤을 처리하였을 때, 세포 생존율이 각각 15.8, 51.8, 85.2% 감소하는 것이 확인된다.
이로부터 디에틸스틸베스롤은 ANO1이 과발현된 폐암세포에 대해서 선택적으로 항암 활성을 나타내는 것을 알 수 있으며, 디에틸스틸베스트롤이 폐암, 특히 ANO1이 과발현된 폐암, 또는 ANO1 과발현으로 인한 폐암에 특히 유효한 항암제로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
<실험예 5> PC9 세포에 대한 이동 억제 분석(migration assay)
디에틸스틸베스트롤이 PC9 세포의 이동을 저해하는지 확인하기 위하여, 상기 실험 프로토콜 5와 같이, PC9 세포에 디에틸스틸베스트롤 3, 10 μM 및 Ani9 10 μM 을 처리하여 세포 이동 억제율 분석을 수행하였고, 그 결과를 도 3c 및 도 3d에 나타내었다.
도 3c 및 도 3d를 보면, PC9 세포에 Ani9 10 μM 을 처리하는 경우와 비교하여, 디에틸스틸베스트롤 3, 10 μM을 처리하는 경우에 세포 이동이 감소하는 것이 확인된다. 디에틸스틸베스트롤이 폐암 세포, 특히 ANO1이 과발현된 폐암 세포의 이동을 억제하는 것을 통하여, 디에틸베스트롤은 폐암에 대한 항암제뿐만 아니라, 전이억제제로서도 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
<실험예 6> 디에틸스틸베스트롤의 PC9 세포에 대한 세포 자멸(apoptosis) 효과 분석
디에틸스틸베스트롤이 어떤 메커니즘을 통하여 항암 활성을 나타내는지를 살펴보았다. PC9 세포의 세포 자멸을 어느 정도 유도하는지 확인하기 위하여, 상기 실험 프로토콜 6 및 7과 같이, PC9 세포에 Eact, Ani9, 및 디에틸스틸베스트롤을 처리하여 세포 자멸의 마커로 알려진 caspase3 및 cleaved PARP-1의 활성화 정도를 측정하였고, 그 결과를 도 4a 및 도 4b에 나타내었다.
도 4a 및 도 4b를 보면, PC9 세포에 Eact 및 Ani9를 처리하는 경우에는 caspase-3 및 cleaved PARP-1의 활성화 정도에 변화가 없었다. 반면, 디에틸스틸베스트롤을 3, 5, 10 μM 처리하는 경우에는 caspase-3의 활성화 정도가 각각 2, 4, 6배 증가하였으며, cleaved PARP-1의 활성화 정도가 증가하는 것이 확인된다.
이로부터 디에틸스틸베스트롤은 ANO1의 발현을 억제하고, 이를 통해서 세포 자멸(apoptosis)를 유도하여 항암 활성을 나타낸다는 점을 알 수 있다.
<실험예 7> 디에틸스틸베스트롤의 간세포에 대한 세포 생존율 분석
디에틸스틸베스트롤이 폐암에 대한 치료제로서의 개발 가능성을 확인하기 위하여, 상기 실험 프로토콜 8과 같이 디에틸스틸베스트롤의 간세포에 대한 독성을 확인하였다. 간세포(HepG2)에 Eact, Ani9 및 디에틸스틸베스트롤을 처리하여 세포 생존율을 측정하였고, 그 결과를 도 4c에 나타내었다.
도 4c를 보면, 간세포에 Eact, Ani9를 처리하는 경우와 비교할 때, 디에틸스틸베스트롤을 처리하는 경우 10 μM까지 간세포의 세포 생존율이 감소되지 않는 것이 확인된다.
이를 통해서, 디에틸스틸베스트롤은 폐암에 대해서는 항암 활성을 갖지만, 정상 간세포에 대해서는 높은 농도까지도 독성을 나타내지 않음으로써, 폐암에 대한 항암제로서 유용할 것으로 기대된다.
Claims (10)
- 디에틸스틸베스트롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, ANO1 과발현을 하는 비소세포폐암(NSCLC)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 ANO1의 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는,
약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 폐암은 ANO1이 과발현된 것을 특징으로 하는,
약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 ANO1의 발현을 저해하여 세포 자멸을 유도하는 것을 특징으로 하는,
약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 폐암은 비소세포폐암인,
약학적 조성물. - 디에틸스틸베스트롤 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는, ANO1 과발현을 하는 비소세포폐암 전이 억제용 약학적 조성물.
- 제6항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 ANO1의 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는,
약학적 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 폐암은 ANO1이 과발현된 것을 특징으로 하는,
약학적 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 약학적 조성물은 ANO1의 발현을 저해하여 세포 자멸을 유도하는 것을 특징으로 하는,
약학적 조성물. - 제6항에 있어서,
상기 폐암은 비소세포폐암인,
약학적 조성물.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020210082098A KR102669998B1 (ko) | 2021-06-24 | 디에틸스틸베스트롤을 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
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|---|---|---|---|
| KR1020210082098A KR102669998B1 (ko) | 2021-06-24 | 디에틸스틸베스트롤을 포함하는 폐암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230000108A KR20230000108A (ko) | 2023-01-02 |
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Family
ID=
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| - Clin Transl Med. 10(2) e47(2020.6.5.) 1부.* |
| - Journal of the National Cancer Institute, 88(13), 908-917 (1996.7.3.) 1부.* |
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