KR102668148B1 - 프로바이오틱스의 장내 생존율과 부착능을 향상시키기 위한 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화 조성물 - Google Patents

프로바이오틱스의 장내 생존율과 부착능을 향상시키기 위한 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화 조성물 Download PDF

Info

Publication number
KR102668148B1
KR102668148B1 KR1020210106214A KR20210106214A KR102668148B1 KR 102668148 B1 KR102668148 B1 KR 102668148B1 KR 1020210106214 A KR1020210106214 A KR 1020210106214A KR 20210106214 A KR20210106214 A KR 20210106214A KR 102668148 B1 KR102668148 B1 KR 102668148B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
freeze
probiotics
dried
composition
present disclosure
Prior art date
Application number
KR1020210106214A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20220105574A (ko
Inventor
김진학
김수진
김수정
지요셉
Original Assignee
코스맥스엔비티 주식회사
코스맥스엔에스 주식회사
주식회사 에이치이엠파마
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 코스맥스엔비티 주식회사, 코스맥스엔에스 주식회사, 주식회사 에이치이엠파마 filed Critical 코스맥스엔비티 주식회사
Priority to KR1020210106214A priority Critical patent/KR102668148B1/ko
Publication of KR20220105574A publication Critical patent/KR20220105574A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102668148B1 publication Critical patent/KR102668148B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/065—Microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/742—Spore-forming bacteria, e.g. Bacillus coagulans, Bacillus subtilis, clostridium or Lactobacillus sporogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 개시는 일 측면에 있어서, 동결 건조 프로바이오틱스를 재활성화하여 프로바이오틱스 세포 표면에 음전하의 제타 포텐셜을 부여하기 위한 조성물로서, 재활성화제로서 L-라이신, L-오르니틴, L-티로신 및 L-히스티딘으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 Zeta-bio 조성물에 관한 것이다. 본 개시는 동결 건조 프로바이오틱스를 활성화시킴으로써, 음전하의 제타 포텐셜을 나타내고, 동결 건조 프로바이오틱스의 장내 생존율 및 장 부착능을 향상시키며 동결 건조로 인한 세포 손상을 회복하는 효과를 나타낸다.

Description

프로바이오틱스의 장내 생존율과 부착능을 향상시키기 위한 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화 조성물 {COMPOSITION FOR REACTIVATING FREEZE-DRIED PROBIOTICS TO IMPROVE INTESTINAL SURVIVABILITY AND ADHERENCE OF PROBIOTICS}
본 개시는 동결 건조 프로바이오틱스를 단시간 내에 재수화하여 활성화시키는 조성물 및 동결 건조 프로바이오틱스의 활성화 방법에 관한 것이다.
프로바이오틱스는 적절한 양으로 섭취되었을 때 숙주에게 건강상 유익한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 면역 장애의 완화, 염증성 장질환, 제2형 당뇨병, 동맥경화증 등의 다양한 방면에서 프로바이오틱스가 사람의 건강에 미치는 유익한 영향에 대한 과학적 증거는 계속하여 축적되고 있다. 프로바이오틱스를 높은 함량으로 복용하는 것이 권장되고 있지만, 프로바이오틱스 균주를 어느 정도의 양으로 복용해야 하는지나 해당 균주의 최소 생존가능 수치는 어느 정도인지 잘 알려져 있지 않다.
프로바이오틱스 특성을 갖는 균주는 요거트와 같은 발효 식품을 통해 "자연적으로" 얻어 질 수도 있지만, 최근에는 포(sachet) 또는 캡슐에 포장된 동결 건조 프로바이오틱스 분말이 시장에서 빠르게 확대되어 유통되고 있다. 시판되는 프로바이오틱스는 운송이 용이하고, 내재된 기능적 특성이 잘 유지될 수 있도록 상온에서 상하지 않는 농축물이어야 한다. 유제품이 아닌 프로바이오틱스 제품을 상용화하려면 동결 및 건조 공정과 같은 최종 처리 단계를 정확하게 최적화해야 한다.
동결 건조(freeze-drying, 또는 lyophilization) 공정 기술은 대부분의 프로바이오틱스의 유통기한을 보장하기 위해 적절한 것으로 여겨지지만, 살아있는 박테리아에 스트레스를 주는 것으로 알려져 있다. 동결 건조 공정은 실제로 프로바이오틱스 균주의 생존 능력에 대한 "도전"이나 다름없다. 그래서 프로바이오틱스의 유효량을 유지하기 위해서는, 대부분의 프로바이오틱스 제품 제조에 투입되는 박테리아 수는 제품 라벨에 기재된 수치에 비해 3 내지 10배 정도 높다.
프로바이오틱스는 동결 건조 공정에서 대부분 치명적 손상을 입게 되고, 이 상태로 사람의 위산 및 담즙에 노출될 시 치명적 스트레스로 인해 생존력이 더욱 감소할 수 밖에 없다. 장까지 살아남은 프로바이오틱스도 장에 효과적으로 부착되지 않는다면 프로바이오틱스의 기능성 효과를 충분히 발휘하기 어렵다. 따라서, 프로바이오틱스가 충분한 기능을 발휘하기 위해서는 위장에서 받는 스트레스 조건에서의 생존과 세포 부착능이 매우 중요하다. 결장 세포계는 프로바이오틱스 균주의 장부착성을 검토하기 위해 시험관내 모델로서 사용될 수 있다(비특허문헌 1). 박테리아 세포벽의 장부착성은 소수성, 세포외 중합체, 전하와 같은 표면 특성에 의해 결정된다. 동시에 박테리아 세포벽은 세포 항상성을 유지하고 세포내 기능을 유지하는데 중요한 역할을 한다. 박테리아는 주변 환경과 상호작용하는 동안 다양한 물리적 힘에 노출되는데, 이는 박테리아의 특정 표면 구조를 통해 세포에 전달된다. 그람 음성 박테리아의 막 표면에 있는 인지질(phospholipids), 지질다당류(lipopolysaccharides, LPS)와 같은 다양한 기능성 산성 및 염기 그룹과 표면 단백질, 그람 음성 박테리아의 세포 표면에 있는 리포테이코익산 및 테이코익산과 같은 탄화수소성 단백질은 환경에 대한 균주의 반응을 결정하게 된다(비특허문헌 2, 3).
프로바이오틱스가 효과적인 기능을 하는데 필요한 세포 생존율과 장부착능을 유지하는데 세포벽을 보존하는 것이 중요하다. 면역조절 및 대사기능을 촉진하고 내장의 장벽을 강화하는데 도움을 주며, 병원균의 부착을 경쟁적으로 억제하기 위해서는 프로바이오틱스가 위산에 노출되는 스트레스에도 살아남고, 장벽에 적절하게 부착되어야만 한다. 박테리아 세포의 장부착 인자는 대부분 지질산, 표면 단백질, 점액 결합 단백질과 같은 박테리아의 세포 표면을 중심으로 구성된다. 동결 건조 공정이 수분의 활동을 감소시켜 박테리아의 유통 기한을 유지할 수 있지만, 또한 이로 인해 세포벽이 원래 기능을 잃어 지장을 줄 수도 있다(비특허문헌 4). 세포벽이 온전히 회복되면 생존력과 장세포 부착능이 증가하여 프로바이오틱스의 기능을 재활성화하는데 도움이 될 수 있다.
세포 표면의 정전하는 기능성 기를 반영하는 것으로 여겨진다. 액체와 접촉할 때에 박테리아 세포의 표면 전하는 제타(zeta) 전위 또는 운동(electrokinetic) 전위로서 밀리볼트(millivolt) 단위로 측정될 수 있다. 세포 표면 구성 및 주변 매체의 특성(예를 들어, 전도도/이온 강도 및 pH)은 모두 세포의 제타 포텐셜을 결정한다.
최근, 박테리아 주변의 제타 포텐셜은 특히 생리학적 측면에서 박테리아의 생존성과 효능을 나타내는 중요한 지표로 부상하고 있다. 그러나, 동결 건조된 프로바이오틱스를 재수화하여 재활성화시키는데 제타 포텐셜을 활용하는 것에 대해서는 검토된 바가 없다.
Arellano K., Vazquez J., Park H., Lim J., Ji Y., Kang H., Cho D., Jeong H. W. and Holzapfel W. H. (2019) Safety evaluation and whole-genome annotation of Lactobacillus plantarum strains from different sources with special focus on isolates from green tea. Probiotics and Antimicrobial Proteins Dufrene, Y.F. and Persat, A. (2020). Mechanomicroiology: how bacteria sense the respond to forces. Nat. Rev. Microbiol. 18: 227-240 Boonaert, C. J. P. and Rouxhet, P. G. (2000). Surface of lactic acid bacteria: relationships between chemical composition and physicochemical properties. Appl. Environ. Microbiol. 66:2548-2554. Govender, M., Choonara, Y. E., Kumar, P., du Toit, L. C., van Vuuren, S., & Pillay, V. (2014). A review of the advancements in probiotic delivery: Conventional vs. non-conventional formulations for intestinal flora supplementation. Aaps PharmSciTech, 15(1), 29-43.
본 개시의 목적은 동결 건조 프로바이오틱스를 단시간 내에 활성화하여 적절한 음전하의 제타 포텐셜을 부여하고, 프로바이오틱스의 생존율 및 장 부착능을 향상시킴으로써 프로바이오틱스의 효능을 최대화할 수 있는 프로바이오틱스 재활성화 조성물 및 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화 방법을 제공하는데 있다.
또한 본 개시의 목적은 동결 건조 프로바이오틱스를 활성화하여, 동결 건조의 스트레스로 인한 프로바이오틱스 균주의 세포 손상을 회복할 수 있는 조성물을 제공하는데 있다.
추가적으로 본 개시의 목적은 동결 건조 프로바이오틱스의 세포 표면에 음전하의 제타포텐셜을 부여하는 물질을 선별하여 동결 건조 프로바이오틱스의 생존율 및 장 부착능을 향상시키기 위한 재활성화제로 사용하는 스크리닝(Screening) 방법을 제공하는데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 개시의 발명자는 동결 건조 프로바이오틱스를 단시간 내에 활성화시킬 수 있는 프로바이오틱스 재활성화 조성물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 놀랍게도 프로바이오틱스에 음전하의 제타 포텐셜(zeta-potential)을 부여하는 재활성화제가 동결 건조 프로바이오틱스를 활성화하여 장내 생존율 및 부착능을 향상시키며, 동결 건조에 의한 세포 손상을 회복하는 것을 확인하여 본 개시를 완성하였다. 또한, 세포벽을 보존하는 역할을 할 수 있는 탄수화물, 아미노산, 단백질 중에서 특히 L-라이신(Lysine), L-오르니틴(Ornithine), L-티로신(Tyrosine) 및 L-히스티딘(Histidine)으로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산이 다양한 동결 건조된 프로바이오틱스 균주에 대해 재활성화제로 사용되는 경우 동결 건조 프로바이오틱스의 세포 표면에 음전하의 제타 포텐셜(zeta-potential)을 부여하여 재활성화하는데 매우 효과적임을 놀랍게도 발견하여 본 개시를 완성하였다.
본 개시의 실시예 또는 일 측면들은 본 개시의 기술적 사상을 설명하기 위한 목적으로 예시된 것이다. 본 개시에 따른 권리범위가 이하에 제시되는 실시예 또는 일 측면들이나 이들에 대한 구체적 설명으로 한정되는 것은 아니다.
본 개시에 사용되는 모든 기술적 용어들 및 과학적 용어들은, 달리 정의되지 않는 한, 본 개시가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 본 개시에 사용되는 모든 용어들은 본 개시를 더욱 명확히 설명하기 위한 목적으로 선택된 것이며 본 개시에 따른 권리범위를 제한하기 위해 선택된 것이 아니다.
본 개시에서 사용되는 "포함하는", "구비하는", "갖는" 등과 같은 표현은, 해당 표현이 포함되는 어구 또는 문장에서 달리 언급되지 않는 한, 다른 실시예를 포함할 가능성을 내포하는 개방형 용어(open-ended terms)로 이해되어야 한다.
본 개시에서 사용되는 해당 구성 "만으로 구성되는" 등과 같은 표현은, 해당 구성 외에 다른 구성을 포함할 가능성을 배제하는 폐쇄형 용어(closed-ended terms)로 이해되어야 한다.
본 개시에서 기술된 단수형의 표현은 달리 언급하지 않는 한 복수형의 의미를 포함할 수 있으며, 이는 청구범위에 기재된 단수형의 표현에도 마찬가지로 적용된다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 용어 "약"은 구체적 수치에 포함되는 제조 공정상의 오차나 본 개시의 기술적 사상의 범주에 들어가는 약간의 수치 조정을 포함하는 의도로 사용되었다. 예를 들어, 용어 "약"은 그것이 지칭하는 값의 ±10％, 일 측면에서 ±5％, 또 다른 측면에서 ±2％의 범위를 의미한다. 이 개시내용의 분야에 있어서, 값이 구체적으로 보다 좁은 범위를 요구하는 것으로 언급되지 않는다면 이 수준의 근사치가 적절하다.
이하에서는 본 개시의 일 측면에 따른, 조성물에 대해 상세하게 설명한다.
본 개시는 일 측면에 있어서, 동결 건조 프로바이오틱스를 재활성화하여 프로바이오틱스 세포 표면에 적절한 음전하의 제타 포텐셜(zeta-potential)을 부여하는 조성물에 관한 것일 수 있다. 본 개시의 조성물은 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화제로서, 단순히 동결 건조 프로바이오틱스를 재수화하는 것을 넘어, 재활성화하고 적절한 음전하의 제타 포텐셜을 부여하여 장내 생존율 및 부착능을 향상시킬 수 있다. 제타 포텐셜은 박테리아의 생존성을 나타내는 지표로 사용될 수 있고, 제타 포텐셜의 변화는 세포벽 손상 및 투과성의 변화를 반영할 수 있다. 제타 포텐셜의 탈극화는 손상되지 않은 세포벽을 나타낼 수 있으므로, 본 발명의 발명자들은 제타 포텐셜의 개념을 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화에 처음으로 사용하여 음전하의 제타 포텐셜로의 변화는 세포의 재활성화와 손상 회복, 생존력 증가를 시사할 수 있음을 발견하였다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 본 개시의 프로바이오틱스 재활성화 조성물은 재활성화제로서 L-라이신(Lysine), L-오르니틴(Ornithine), L-티로신(Tyrosine) 및 L-히스티딘(Histidine)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 조성물에 관한 것일 수 있고, 바람직하게는 재활성화제로서 L-라이신 및/또는 L-티로신, 보다 바람직하게는 L-라이신을 포함할 수 있다.
본 개시에서, L-라이신은 L-라이신 염산염(L-Lysine hydrochloride)일 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 본 개시의 조성물은 재활성화제를, 재활성화제가 용매에 용해되었을 때 약 0.01M 내지 약 0.15M, 약 0.01M 내지 약 0.1M, 약 0.02M 내지 약 0.07M, 약 0.02M 내지 약 0.05M, 또는 약 0.03M 내지 약 0.05M의 농도를 가지도록 포함할 수 있다. 재활성화제의 농도가 상기 하한 미만일 경우 동결 건조 프로바이오틱스를 충분히 활성화시키지 못할 수 있고, 함량이 상기 상한 초과일 경우 프로바이오틱스가 사멸할 수 있고, 고농도의 제품화를 실현하기에 어려움이 있으며, 본 개시의 조성물을 포함하는 제품의 맛이 떨어지는 문제가 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 본 개시의 프로바이오틱스 재활성화 조성물은 프럭토스(Fructose), 수크로스(Sucrose), 소르비톨(Sorbitol), 글루코스(Glucose), 말토오스(Maltose), 트레할로스(Trehalose) 및 프락토올리고당(Fructooligosaccharide)으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 탄수화물을 추가로 포함할 수 있고, 바람직하게는 프락토올리고당을 포함할 수 있다.
본 개시에서 프럭토스, 수크로스, 소르비톨, 글루코스, 말토오스, 트레할로스 및 프락토올리고당으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 탄수화물은 프로바이오틱스의 동결 건조시에 세포 손상을 막아줄 수 있을 뿐만 아니라, 동결 건조 프로바이오틱스의 재수화시에도 삼투압에 의한 세포벽의 손상을 막고, 장내 생존율을 증가시킬 수 있다. 본 개시에서, 재활성화제가 동결 건조 프로바이오틱스의 세포 표면에 음전하의 제타 포텐셜을 부여하는 것에 영향을 주지 않는 탄수화물을 사용하는 것이 바람직하다.
본 개시에서, 프락토올리고당은 기능성 올리고당으로서, 자당(cane sugar)과 비슷한 감미와 물성을 가지므로 본 개시의 조성물을 포함하는 제품의 맛의 향상시킬 수 있다. 프락토올리고당은 프리바이오틱스(prebiotics)로서 유통기한을 길게 유지할 수 있고, 열과 pH에 안정하며, 위장관을 통과하는 동안 산, 단백질 분해효소, 담즙산에 잘 견디는 특성을 가진다. 이에, 프락토올리고당은 위산의 스트레스에 저항함으로써 프로바이오틱스의 생존력을 향상시킬 수 있고, 단쇄 지방산(short chain fatty acids)의 생산을 통해 체중 증가와 장내 질병을 예방하는 유익한 건강 효과를 제공할 수 있다. 또한 프락토올리고당은 유해균은 감소시키고 유익한 비피더스 균 등이 현저히 증가되어 장내 균총을 건강한 상태로 조절할 수 있으며, 특히 프락토올리고당을 아미노산인 재활성화제와 조합하여 사용하는 경우 불균형한 삼투 조건에서도 프로바이오틱스의 저항성을 향상시킬 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 본 개시의 조성물은 탄수화물을 약 0.1g 내지 약 8 g, 약 0.2g 내지 약 6g, 약 0.3g 내지 약 5g, 약 0.5g 내지 약 4g 또는 약 1g 내지 약 4g으로 포함할 수 있다. 상기 탄수화물의 함량이 상기 하한 미만일 경우 동결 건조 프로바이오틱스의 재수화시 손상 세포벽 복원의 상승효과를 기대하기 어렵고, 장내 생존율과 부착능을 충분히 증가시키지 못할 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 본 개시의 조성물은 동결 건조 프로바이오틱스를 약 1×108 내지 약 1×1012 CFU/g의 농도로 포함할 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 조성물에 의해 재활성화될 수 있는 동결 건조 프로바이오틱스는 락토바실러스속(Lactobacillus sp.) 락토코커스속(Lactococcus sp.), 엔테로코커스속(Enterococcus sp.), 비피도박테리움속(Bifidobacterium sp.), 페디오코커스속(Pediococcus sp.), 스트렙토코커스속(Streptococcus sp.) 또는 이들의 조합일 수 있다. 구체적으로, 본 개시의 동결 건조 프로바이오틱스는 프로바이오틱스는 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 비피도박테리움 애니말리스(Bifidobacterium animalis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 락티스(Bifidobacterium lactis), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 엔테로코코스 패시움(Enterococcus faecium), 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus), 락토바실러스 헬벡티커스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 퍼맨텀(Lactobacillus fermentum), 락토바실러스 파라카세이(Lactobacillus paracasei), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis), 엔테로코커스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum) 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 섭취 전에 조성물을 용매에 용해하거나, 조성물의 섭취 전후에 용매를 섭취하여 동결 건조 프로바이오틱스를 재활성화시키는 것일 수 있다. 본 개시에서 동결 건조 프로바이오틱스를 재활성화하는 경우, 프로바이오틱스 세포 표면의 제타 포텐셜이 음전하일 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 동결 건조 프로바이오틱스는 동결 건조 분말일 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 본 개시의 조성물은 동결 건조 프로바이오틱스의 세포벽을 복원하여 생존율을 증가시킬 수 있는 L-글루탐산(Glutamic acid), L-세린(Serine), L-트레오닌(Threonine), L-트립토판(Tryptophan), L-페닐알라닌(Phenylalanine) 등의 아미노산 성분, 베타인(Betaine), 타우린(Taurine), 리보플라빈(Riboflavin), 티아민(Thiamine) 등의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 위 성분을 추가로 포함하는 조성물은 용매에 용해될 때, 0.01M 내지 0.15M 농도를 갖도록 위 성분을 포함한다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 본 개시의 조성물을 섭취 전 용매에 용해하여, 동결 건조 프로바이오틱스를 재활성화하고 세포 표면에 음전하의 제타 포텐셜을 부여하는 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화 방법에 관한 것일 수 있다. 본 개시의 재활성화 방법은, 본 개시의 조성물을 섭취한 후에 용매를 섭취하거나, 용매를 섭취한 후에 본 개시의 조성물을 섭취하는 방법에 의해 동결 건조 프로바이오틱스를 재활성화할 수 있고, 본 개시의 조성물과 동결 건조 프로바이오틱스가 함께 재수화되는 방법이라면 제한되지 않고 적용될 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 동결 건조 프로바이오틱스를 L-라이신, L-오르니틴, L-티로신 및 L-히스티딘으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 포함하는 재활성화제와 접촉시키는 단계를 포함하는 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화 방법에 관한 것일 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 용매는 음용가능한 용매이면 가능하고 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 물을 사용할 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 본 개시의 조성물은 용매에 용해되어, 약 30분, 약 10분, 약 5분, 약 1분, 약 30초 또는 수초 내에 프로바이오틱스를 활성화시키는 방법에 관한 것일 수 있다. 동결 건조된 프로바이오틱스가 단시간 내에 활성화되었는지 여부는, 동결 건조 프로바이오틱스를 포함하는 본 개시의 조성물에 pH 변화에 따라 색상이 변화하는 식용 색소를 첨가하여 확인할 수 있다.
본 개시의 일 측면에 있어서, 본 개시의 조성물은 조성물의 중량당 0.1 내지 20배 용량, 바람직하게는 0.5 내지 15배, 1 내지 10배의 용매와 혼합된다. 예를 들어, 이들 조성물 10 g당 용매의 양은 1 내지 200 ml, 5 내지 150 ml 또는 10 내지 100 ml 일 수 있다.
본 개시는 일 측면에 있어서, 본 개시의 조성물을 포함하는 프로바이오틱스 제품일 수 있다. 본 개시의 일 측면에 있어서, 본 개시의 조성물을 포함하는 프로바이오틱스 제품은 동결 건조 프로바이오틱스와 나머지 성분이 개별 포장으로 제공될 수 있고, 모두 혼합된 형태로 제공될 수도 있다. 본 개시의 조성물을 포함하는 프로바이오틱스 제품은 포 또는 캡슐 등의 형태로 제공될 수 있다. 본 개시의 일 측면에 있어서, 본 개시의 조성물은 섭취 전에 용매에 용해하여 동결 건조 프로바이오틱스를 재활성화한 후 섭취하거나, 섭취 전후에 용매를 섭취하여 동결 건조 프로바이오틱스를 재활성화할 수 있도록 적절한 방법에 의해 지시된다.
본 개시는 일 측면에 있어서, 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화 기능을 갖는 물질을 스크리닝하는 방법으로서 동결 건조 프로바이오틱스의 세포 표면에 음전하의 제타 포텐셜을 부여하는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 방법에 관한 것일 수 있다. 동결 건조 프로바이오틱스의 세포 표면에 음전하의 제타 포텐셜을 부여하는 물질은 동결 건조 프로바이오틱스를 재활성화하여 장내 생존율 및 장 부착능을 증가시키고, 세포벽의 손상 회복을 도울 수 있다.
본 개시의 일 측면에 따른 조성물 및 방법은 동결 건조 프로바이오틱스의 세포 표면에 적절한 음전하의 제타 포텐셜을 부여함으로써 재활성화하고, 프로바이오틱스의 기능성을 증진시키는 효과를 나타낼 수 있다.
이러한 효과로 인해 본 개시의 조성물 및 방법은 동결 건조 프로바이오틱스의 생존율과 장 부착능을 향상시키고, 프로바이오틱스의 세포벽 손상을 회복할 수 있다.
또한 이러한 효과로 인해 본 개시의 조성물 및 방법은 대량의 동결 건조 프로바이오틱스 투입을 통해 효능을 보장 해왔던 프로바이오틱스 시장에서 원가 절감 및 더 우수한 효능을 제공할 수 있다.
도 1은 동결 건조된 Lactobacillus plantarum HACO3에 9가지의 아미노산 성분을 각각 첨가하였을 경우의 제타 포텐셜 값을 나타내는 그래프이다.
도 2의 A 내지 D는 각각 Lactobacillus casei Lc-11, Bifidobacterium longum Bl-05, Lactobacillus plantarum Lp-115 및 7-strain mix(400B)의 생균, 동결 건조 프로바이오틱스, L-라이신에 의해 활성화된 동결 건조 프로바이오틱스, 프롤린과 혼합된 동결 건조 프로바이오틱스의 장부착능 평가 결과 부착된 박테리아 수를 나타내는 그래프이고, E 내지 H는 각각 Lactobacillus casei Lc-11, Bifidobacterium longum Bl-05, Lactobacillus plantarum Lp-115 및 7-strain mix(400B)의 생균, 동결 건조 프로바이오틱스, L-라이신에 의해 활성화된 동결 건조 프로바이오틱스, 프롤린과 혼합된 동결 건조 프로바이오틱스의 상대 부착 비율(%)(대조군의 부착된 박테리아 수에 대한 실험군의 부착된 박테리아 수)을 나타내는 그래프이다.
도 3의 A 및 C는 Lactobacillus plantarum Lp-115 및 7-strain mix (400B)의 생균, 동결 건조 프로바이오틱스, 본 발명에 따른 Zeta-bio 조성물에 의해 활성화된 동결 건조 프로바이오틱스의 세포 부착능 평가 결과 부착된 박테리아 수를 나타내는 그래프이고, B 및 D는 Lactobacillus plantarum Lp-115 및 7-strain mix (400B)의 생균, 동결 건조 프로바이오틱스, 본 발명에 따른 Zeta-bio 조성물에 의해 활성화된 동결 건조 프로바이오틱스의 상대 부착 비율(%)(대조군의 부착된 박테리아 수에 대한 실험군의 부착된 박테리아 수)을 나타내는 그래프이다.
[실험예 1] 동결 건조 프로바이오틱스의 세포 표면에 음전하의 제타 포텐셜을 부여하여 동결 건조 프로바이오틱스를 재활성화할 수 있는 성분 스크리닝
본 실험예에서는 프로바이오틱스 균주로서 특허출원 제10-2017-0051574호의 Lactobacillus plantarum HACO3 (기탁번호: KCTC13242BP, 한국생명공학연구원)(이하 "HAC03") 균주를 사용하였다.
동결 건조된 HAC03 균주 분말은 1×109 CFU/g 농도로 50ml 튜브에 옮겨졌고, 최종농도가 0.1M이 되도록 아미노산에 해당하는 9가지 단일 성분(L-티로신(Tyrosine), L-오르니틴(Ornithine), 말산(Malic acid), L-라이신(Lysine), L-히스티딘(Histidine), L-아스파르트산(Aspartic acid), L-아스코르브산(Ascorbic acid), L-아르기닌(Arginine), 프롤린(Proline))과 각각 혼합되었다. 동결 건조 HAC03과 단일 성분의 혼합물에 1ml의 증류수를 첨가하였고, 1분 동안 재수화하였다. 그 후, 2ml의 pH 2.5의 증류수를 각 샘플에 첨가하고, HCl 0.1N을 사용하여 pH를 재조정하였으며, 800㎕의 샘플을 DTS1080 큐벳에 옮겼다. 2분의 평형 시간 후에, Zetasizer Nano ZEN 3600 (Malvern Panalytica 사, UK)를 사용하여 전기영동이동도(electrophoretic mobility)를 측정하였고, 스몰루호프스키 식(Smoluchowski equation)을 사용하여 데이터를 제타 포텐셜 값으로 변환하였다. 변환한 제타 포텐셜 값을 도 1에 나타내었다.
본 실험에서 사람의 위는 강한 산성 환경으로 박테리아의 생존성이 급격히 저하되는 초기 장애물 중 하나이므로, 동결 건조 프로바이오틱스의 제타 포텐셜은 이러한 환경을 고려하여 pH 2.5에서 측정되었다. 도 1에 나타나듯이, HAC03을 동결 건조한 후, 박테리아 세포의 제타 포텐셜은 배양된 생균(fresh)과 비교하여 현저하게 탈극화되었다. 여기에 9가지의 아미노산 성분을 각각 혼합한 경우, L-티로신, L-오르니틴, L-라이신 및 L-히스티딘 성분은 HAC03의 생균과 같이 제타 포텐셜을 음전하(negative)로 변화시켰다. 그러나, 나머지 5가지 성분인 L-아르기닌, L-아스파르트산, 말산, L-아스코르브산 및 프롤린은 탈극화된 제타포텐셜을 음전하로 변화시키지 못하고, 양전하(positive)의 제타 포텐셜 값을 나타내었다.
[실험예 2] 동결 건조 프로바이오틱스의 세포 표면에 음전하의 제타 포텐셜을 부여하는 성분에 의한 장내 생존율 증가 확인
HAC 03 균주 및 실험예 1에서 사용한 8종의 성분을 사용하여 Ji et al(Food control 31(2):467-473, 2013) 등의 방법을 변형한 in vitro Simulated Stomach Duodenum Passage(SSDP) 시험으로 프로바이오틱스의 생존율(내산성과 내담즙성)을 평가하였다. HAC03 균주에 각각의 단일 조성물을 상온에서 1mL의 증류수와 1분 동안 혼합하였고, 조성물은 1ml의 증류수에 용해되었을 때 최종 농도가 0.1 M로 포함하도록 제조하였다. 그 후, pH가 2.5로 조절된 증류수 9mL를 각 혼합물에 첨가하였고, 몇몇 단일 성분에 의해 pH가 증가된 경우에는 pH가 변하지 않도록 하기 위해(프로바이오틱스의 생존에 영향을 미치지 않도록 하기 위해) pH를 2.5로 다시 조절하였다. 튜브를 pH 2.5에서 37℃에서 1시간 동안 배양함으로써 낮은 pH를 갖는 위에서의 스트레스 조건을 적용시켰다. 그 후 4ml의 담즙염(10% 황소 담즙(oxgall)) 및 pH 6.0의 합성 담즙(6.4g/L NaHCO3, 0.239g/L KCl 및 1.28g/L NaCl) 17ml을 첨가하여 소장을 지나가는 조건을 재현하여 약 2시간 동안 배양시켰다. 위장관 분석 샘플을 배양 초기, 1시간 후, 3시간 후 얻었고(t=0, 1 및 2), 위산 및 담즙에서의 조건에 노출된 후의 프로바이오틱스 생존율 콜로니 수를 세어 각 샘플의 각 프로바이오틱스의 생존율을 측정하여 아래 표 1에 나타내었다.
샘플 초기 위 십이지장
log CFU/mL log CFU/mL 생존율 (%) log CFU/mL 생존율 (%)
생균 8.46±0.32 8.07±0.65 54.26 7.43±1.10 20.58
동결 건조 프로바이오틱스+증류수 8.34±0.34 7.16±0.60 8.03 6.79±0.60 3.40
L-아르기닌 6.88±0.04 4.00±0.00 0.13 3.73±0.34 0.08
L-아스코르브산 6.49±0.05 4.08±0.15 0.40 3.49±0.00 0.10
L-아스파르트산 7.84±0.07 7.06±0.56 29.95 5.80±0.64 1.86
L-히스티틴 8.09±0.05 7.83±0.11 56.61 7.52±0.08 27.20
L-라이신 염산염 7.94±0.04 7.87±0.07 85.17 7.62±0.09 48.35
말산 <4.99±0.00 <3.99±0.00 <0.01 <3.49±0.00 <0.003
L-오르니틴 7.97±0.04 7.75±0.02 60.53 7.57±0.03 40.14
L-티로신 8.12±0.03 7.98±0.04 73.52 7.65±0.01 33.89
상기 표 1로부터 알 수 있듯이, 음전하의 제타 포텐셜을 부여하는 4가지 성분(L-오르니틴, L-라이신, L-티로신, L-히스티딘)에서는 동결 건조 프로바이오틱스의 내산성과 내담즙성이 증가하여 생균보다 장내 생존율이 증가하였다. 반대로, 제타 포텐셜을 음전하로 변화시키지 못하는 4종 성분(아르기닌, 아스코르브산, 아스파르트산, 말산)에서는 장내 생존율이 동결 건조 프로바이오틱스에 증류수를 혼합한 경우(생존율 3.40%)에 훨씬 못 미치는 생존율을 나타내었다. 이로부터 동결 건조 프로바이오틱스의 세포 표면에 음전하의 제타 포텐셜을 부여하는 물질이, 동결 건조 프로바이오틱스의 장내 생존율 증가에도 유의미한 효과가 있는 것을 확인하였다.
[실험예 3] 동결 건조 프로바이오틱스를 재활성화할 수 있는 성분의 장 부착능 증가 효과 확인
실험예 2에서 동결 건조 프로바이오틱스에 음전하의 제타 포텐셜을 부여하고 장내 생존율을 증가시키는 4가지 성분 중 가장 높은 생존율 증가 효과를 보인 L-라이신으로 동결 건조 프로바이오틱스를 재활성화하여 장 부착능 증가 효과를 확인하였다. 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화 효과가 다양한 균주에도 적용될 수 있는 점을 확인하기 위하여 본 실험예에서는 동결 건조 Bifidobacterium longum Bl-05 (Dupont 사; 이하 "Bl-05"), Lactobacillus plantarum Lp-115 (Dupont 사; 이하 "Lp-115"), Lactobacillus casei Lc-11 (Dupont 사; 이하 "Lc-11") 및 7-strain mixture(400B)(Dupont 사; 이하 "MIX")균주를 L-라이신으로 재활성화시킨 후 인간 장세포 유사 Caco-2/TC-7 세포계에 대한 부착능을 확인하였다. 7-strain mix는 아래 표 2에 나타난 7가지 균주를 포함하는 혼합물을 의미한다. 본 실험예에서는 대조군으로 동결 건조 HAC03의 세포 표면에 양전하의 제타 포텐셜을 유지하는 프롤린을 사용하였다.
균주명 포함 균주
7-strain mixture (400B)



 L. plantarum Lp-115
L. acidophilus La-14
L. casei Lc-11
Streptococcus thermophilus St-21
Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bl-04
B. longum Bl-05
B. breve Bb-03
3 가지 균주 및 7종 혼합 균주의 동결 건조물은 2×108 CFU/g으로 조절되었고, 0.03M의 L-라이신 또는 0.03M의 프롤린과 혼합되었다. 펠렛은 1×PBS로 3회 세척되고 10ml MEM 세포 배양 배지에서 20% FBS, 2mM 글루타민 및 1% 비필수 아미노산으로 재현탁되었다. 박테리아 부착능 분석은 Botes 등의 방법(Arch. Microbiol, 190 (2008), pp. 573-584)을 변형하여 진행되었다. 박테리아 세포 부착능을 평가하기 위해, 2mL 의 각 박테리아 현탁액으로 1×105 CFU/Caco-2/TC-7 단층을 37℃에서 5% CO2와 95% 공기하에서 1.5시간 동안 처리하였다. 세포를 차가운 PBS로 3회 세척하여 부착되지 않은 박테리아를 제거하고, 40ng의 트립신(Promega 사) 용액을 첨가하여 15분 동안 37℃에서 용균시켰다. Caco-2/TC-7 세포에 부착된 박테리아 수를 측정하기 위하여, 샘플을 연속적으로 희석시키고 MRS 한천 배지에서 48시간(37℃)배양한 후 박테리아 수 및 상대 부착 비율(대조군의 부착된 박테리아 수에 대한 실험군의 부착된 박테리아 수)을 측정하여 도 2에 나타내었다. 모든 실험은 3번 반복되었다.
도 2에 나타나듯이, Lc-11(도 2A 및 2E), Bl-05 (도 2B 및 도 2F) 및 Lp-115 (도 2C 및 2G) 의 동결 건조된 형태(FD)는 생균(fresh)에 비하여 Caco-2/TC-7 세포계에 대한 박테리아 세포의 부착능이 현저하게 낮았다. L-라이신으로 재활성화된 경우 동결 건조 형태에 비하여 박테리아 세포의 부착능이 상당히 증가하였고, 7-균주 혼합물(400B)로 실험한 경우에도 마찬가지 였다(도 2D 및 2H). 그러나, 동결 건조 프로바이오틱스의 세포 표면에 양전하의 제타 포텐셜을 부여하는 프롤린(대조군)을 혼합한 경우, 동결 건조 형태보다도 장 부착능이 현저히 낮거나(Lc-11, Bl-05, MIX), L-라이신에 의해 재활성화된 경우보다 장 부착능이 낮았다(Lp-115). 즉, L-라이신과 같이 동결 건조 프로바이오틱스의 세포 표면에 음전하의 제타포텐셜을 부여할 수 있는 물질에 의해 동결 건조 프로바이오틱스가 재활성화되어 장 부착능이 증가할 수 있는 반면, 그렇지 않은 물질(양전하의 제타포텐셜을 부여하는)은 장 부착능 증가 효과를 나타내지 않는다. 이로부터 세포 표면의 음전하의 제타 포텐셜이 장 부착능의 향상과 관계가 있음이 확인된다.
[실험예 4] 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화제와 함께 사용될 수 있는 추가 성분의 확인
동결 건조 프로바이오틱스의 세포 표면에 음전하의 제타포텐셜을 부여할 수 있는 재활성화제 성분과 함께 사용될 수 있는 성분을 확인하기 위한 실험을 하였다. 동결 건조된 HAC03 균주에 대해 아래 표 3의 11종의 탄수화물 성분을 각각 단독으로 혼합하여, 실시예 1과 동일한 방법으로 장내 생존율을 확인하였고 그 결과를 아래 표 3에 나타내었다.
샘플 초기 인공 위액 인공 담즙액
log CFU/mL log CFU/mL 생존율 (%) log CFU/mL 생존율(%)
생균 8.46±0.32 8.07±0.65 54.26 7.43±1.10 20.58
동결 건조 8.34±0.34 7.16±0.60 8.03 6.79±0.60 3.40
아라비노스 8.10±0.11 7.12±0.67 17.78 7.02±0.35 9.45
자일로스 8.08±0.15 7.50±0.25 27.36 6.97±0.49 8.47
람노스 8.27±0.09 7.87±0.10 40.75 7.53±0.08 18.25
프럭토스 8.05±0.17 7.67±0.37 46.18 7.27±0.48 20.73
만니톨 7.94±0.05 7.18±0.32 20.04 6.90±0.44 11.77
수크로스 8.08±0.13 7.99±0.13 80.90 7.71±0.13 42.99
소르비톨 8.08±0.08 8.00±0.05 82.06 7.69±0.09 40.46
글루코스 8.05±0.09 7.93±0.11 76.99 7.64±0.03 39.54
말토오스 8.09±0.05 8.02±0.05 85.43 7.61±0.13 33.79
트레할로스 7.91±0.10 7.65±0.05 54.75 7.36±0.03 28.10
프락토올리고당 8.20±0.12 7.99±0.05 62.47 7.57±0.11 23.52
상기 표 3으로부터 알 수 있듯이, 프럭토스, 수크로스, 소르비톨, 글루코스, 말토오스, 트레할로스 및 프락토올리고당의 7종 성분은 생균(fresh)의 생존율과 유사하거나 높은 생존율을 나타내었고, 특히 7종 성분은 생균의 내담즙성 보다 높은 내담즙성을 보이는 것으로 확인된다. 따라서, 이들 성분은 동결 건조 프로바이오틱스를 재활성화하여 장내 생존율을 증가시키기 위해 재활성화제와 함께 사용될 수 있다.
[실험예 5] 동결 건조된 프로바이오틱스를 본 발명의 조성물에 의해 재활성화시킨 후 생존율 증가 확인
본 발명의 조성물이 동결 건조 프로바이오틱스를 재활성화하는데 미치는 영향을 확인하기 위한 실험을 하였다. 우선 아래 표 4의 구성에 따라 L-라이신, 프락토올리고당(FOS) 및 미생물(프로바이오틱스)을 포함하는 본 발명의 조성물(이하 "Zeta-bio 조성물"이라 약칭한다)을 제조하였다. 프락토올리고당은 제타포텐셜이 0 mV에 가깝게 측정되어 본 발명의 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화제의 제타포텐셜에 영향을 주지 않는다. 동결 건조 프로바이오틱스로는 동결 건조된 Lp-115 및 MIX를 사용하였다.
성분 LP/Mix-1 LP/Mix-2 LP/Mix-3 LP/Mix-4 LP/Mix-5
L-라이신 염산염 0.183 g
(0.01 M)		 0.365 g
(0.02 M)		 0.548 g
(0.03 M)		 0.731 g
(0.04 M)		 0.913 g
(0.05 M)
프락토올리고당 3.5 g 3.5 g 3.5 g 3.5 g 3.5 g
균주 0.15 g
(2x1011 CFU/g)		 0.15 g
(2x1011 CFU/g)		 0.15 g
(2x1011 CFU/g)		 0.15 g
(2x1011 CFU/g)		 0.15 g
(2x1011 CFU/g)
덱스트린 6.167 g 5.985 g 5.802 g 5.619 g 5.437 g
총 합 10 g 10 g 10 g 10 g 10 g
표 4의 Zeta-bio 조성물을 사용하여 실험예 2에서 사용한 in vitro Simulated Stomach Duodenum Passage(SSDP) 시험으로 프로바이오틱스의 생존율(내산성과 내담즙성)을 평가하였다. 표 3의 Zeta-bio 조성물을 25℃에서 1mL의 증류수와 1분 동안 혼합하였고, Zeta-bio 조성물은 1ml의 증류수에 용해되었을 때 L-라이신을 0.01M, 0.02M, 0.03M, 0.04M 또는 0.05M로 포함하도록 제조하였다. 그 후, pH가 2.5로 조절된 증류수 9mL를 각 혼합물에 첨가하였고, 몇몇 단일 성분에 의해 pH가 증가된 경우에는 pH가 변하지 않도록 하기 위해(프로바이오틱스의 생존에 영향을 미치지 않도록 하기 위해) pH를 2.5로 다시 조절하였다. 튜브를 pH 2.5에서 37℃에서 1시간 동안 배양함으로써 낮은 pH를 갖는 위에서의 스트레스 조건을 적용시켰다. 그 후 4ml의 담즙염(10% 황소 담즙(oxgall)) 및 pH 6.0의 합성 담즙(6.4g/L NaHCO3, 0.239g/L KCl 및 1.28g/L NaCl) 17ml을 첨가하여 소장을 지나가는 조건을 재현하여 약 2시간 동안 배양시켰다. 위장관 분석 샘플을 배양 초기, 1시간 후, 3시간 후 얻었고(t=0, 1 및 2), 위산 및 담즙에서의 조건에 노출된 후의 프로바이오틱스 생존율 콜로니 수를 세어 각 샘플의 각 프로바이오틱스의 생존율을 측정하고, 그 결과를 아래 표 5에 나타내었다.
샘플 균주 라이신
농도 		초기 인공위액 인공담즙액
log CFU/mL log CFU/mL 생존율 (%) log CFU/mL 생존율(%)
생균 Lactobacilluss plantarum
Lp-115		 None 8.21±0.10 8.05±0.26 64.45 7.61±0.15 25.76
동결 건조 None 8.04±0.16 4.15±0.16 0.01 4.02±0.66 0.02
LP-1 0.01M 7.05±0.21 5.63±0.05 5.07 4.29±0.28 0.17
LP-2 0.02M 8.46±0.04 6.97±0.01 4.25 6.26±0.01 0.70
LP-3 0.03M 8.59±0.03 8.28±0.08 48.64 7.73±0.01 13.86
LP-4 0.04M 8.62±0.02 8.30±0.00 48.01 7.69±0.00 11.93
LP-5 0.05M 8.63±0.09 8.26±0.01 43.20 7.72±0.03 12.17
동결 건조 7 strain
mixture 8
(400B)		 None 8.75±0.02 7.52±0.05 6.01 4.96±0.07 0.02
Mix-1 0.01M 8.20±0.08 6.43±0.00 1.74 5.88±0.06 0.48
Mix-2 0.02M 8.42±0.01 7.79±0.01 23.02 7.69±0.04 18.70
Mix-3 0.03M 8.32±0.01 8.02±0.01 50.09 7.94±0.05 41.99
Mix-4 0.04M 8.33±0.03 7.95±0.03 41.93 7.90±0.01 37.65
Mix-5 0.05M 8.37±0.01 8.10±0.01 53.33 7.82±0.14 28.72
상기 표 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 동결 건조 형태의 Lp-115는 SSDP 후 배양된 생균 대조군(fresh)에 비해 상당히 생존율이 감소하였다(0.02%). 동결 건조된 Lp-115가, L-라이신의 농도가 0.03M 이상인 Zeta-bio 조성물로 재활성화된 경우에는 위산과 담즙의 조건에서 생균과 비슷하거나 생균보다도 높은 생존율을 모두 나타낸다. 동결 건조 7-균주 혼합물(400B)를 사용한 경우에도, L-라이신의 농도가 0.03M 이상인 Zeta-bio 조성물로 활성화되면 위산과 담즙의 조건에서 모두 높은 생존율을 보인다. 따라서, L-라이신의 농도가 0.03M 이상인 Zeta-bio 조성물이 동결 건조된 프로바이오틱스를 활성화하여, 동결 건조된 프로바이오틱스를 그대로 섭취하는 경우에 비해 위장관을 통과한 후에도 생존율이 증가하는 효과가 우수한 것을 확인할 수 있다.
[실험예 6] 동결 건조된 프로바이오틱스를 본 발명의 조성물에 의해 재활성화시킨 후 장 부착능 증가 확인
본 발명의 Zeta-bio 조성물이 동결 건조 프로바이오틱스의 장 부착능에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험을 하였다. 위 표 4의 Zeta-bio 조성물을 사용하여 실험예 3의 인간 장세포 유사 Caco-2/TC-7 세포계에 대한 부착능 확인 방법과 동일한 방법으로, 동결 건조된 LP-115 및 MIX의 장 부착능 증가를 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타나듯이, Lp-115(도 3a 및 3b)의 동결 건조된 형태(FD)는 생균(fresh)에 비하여 Caco-2/TC-7 세포계에 대한 박테리아 세포의 부착능이 현저하게 낮았다. 그러나, Zeta-bio 조성물(LP-3 내지 LP-5)로 재활성화된 경우 동결 건조 형태에 비하여 박테리아 세포의 부착능이 상당히 회복되었다. Lp-115는 시험된 L-라이신의 농도에서 동결 건조된 형태에 비하여 모두 높은 장 부착능을 보였다. 한편, 7-균주 혼합물(400B)로 실험한 경우에도 0.03M 및 0.04M의 L-라이신을 포함하는 MIX-3 및 MIX-4 조성물에 의해 재활성화된 경우에 모두 상당히 높은 부착능을 보여준다. 따라서, L-라이신을 포함하는 본 발명에 따른 조성물은 동결 건조된 프로바이오틱스를 재활성화하여 생존율뿐만 아니라 장 부착능도 증가시킬 수 있음이 확인되었다.
[실험예 7] 본 발명의 조성물에 의해 재활성화된 동결 건조된 프로바이오틱스의 L-라이신의 농도에 따른 생존율 증가 확인
0.01M 내지 0.05M의 L-라이신 농도를 갖는 표 4의 Zeta-bio 조성물 뿐만 아니라, 0.1M 이상의 L-라이신 농도를 갖는 Zeta-bio 조성물이 동결 건조된 프로바이오틱스를 재활성화하여 생존율 증가에 미치는 영향을 확인하기 위한 실험을 하였다. 본 실험예에서 사용된 Zeta-bio 조성물은 L-라이신 농도를 제외하고는 표 2의 Zeta-bio 조성물의 구성과 함량이 동일하고, 1ml의 증류수에 용해되었을 때 L-라이신을 0.1M, 0.15M, 0.3M, 1.5M 및 3M로 포함하도록 Zeta-bio 조성물을 각각 MIX-6, MIX-7, MIX-8. MIX-9 및 MIX-10으로 하였다.
위 Zeta-bio 조성물을 실험예 5와 동일한 in vitro Simulated Stomach Duodenum Passage(SSDP) 시험으로 프로바이오틱스의 생존율(내산성과 내담즙성)을 평가하여, 각 조성물의 생존율 측정 결과를 표 6에 나타내었다.
균주 라이신 농도 샘플 초기 인공 위액 인공 담즙액
log CFU/mL log CFU/mL 생존율 (%) log CFU/mL 생존율 (%)
7 strain mixture (400B) None 동결건조 8.75±0.02 7.52±0.05 6.01 4.96±0.07 0.02
0.03M MIX-3 8.32±0.01 8.02±0.01 50.09 7.96±0.01 41.31
0.1M MIX-6 8.44±0.04 8.20±0.01 57.08 7.51±0.00 11.54
0.15M MIX-7 8.47±0.01 8.34±0.05 75.53 7.75±0.02 19.12
0.3M MIX-8 8.69±0.05 8.36±0.05 47.06 3.49±0.00 0.0006
1.5 M MIX-9 9.01±0.02 7.69±0.04 4.83 3.49±0.00 0.0003
3M MIX-10 9.03±0.06 7.92±0.03 7.81 3.49±0.00 0.0003
상기 표 6으로부터 알 수 있듯이, L-라이신을 0.03M, 0.1M 및 0.15M로 포함하는 MIX-3, MIX-6 및 MIX-7의 조성물은 동결 건조 프로바이오틱스의 위산과 담즙의 조건에서 각각 57% 이상 및 11% 이상의 유의미한 생존율을 보인다. 따라서, 실험예 5 및 본 실험예의 결과로부터 L-라이신과 같은 재활성화제의 농도가 0.01 내지 0.15M인 Zeta-bio 조성물이 동결 건조된 프로바이오틱스의 세포 표면에 음전하의 제타 포텐셜을 부여하고, 이러한 재활성화 과정은 동결 건조된 프로바이오틱스를 그대로 섭취하는 경우에 비해 위장관을 통과한 후에도 생존율이 증가하는 효과가 우수한 것을 확인할 수 있다.
본 발명의 조성물에 의한 동결 건조 프로바이오틱스의 재수화는 음전하의 제타 포텐셜을 부여하여 세포를 재활성화함으로써 생존력을 증가시킨다. 본 발명의 조성물은 동결 건조에 의해 손상된 세포에 필요한 영양분과 세포 성분을 제공함으로써 손상된 세포를 회복하게 하는 역할을 하는 것으로 짐작된다. 게다가, 본 발명의 조성물에 의한 프로바이오틱스 세포의 생존력 향상과 제타 포텐셜의 변화는 장내 세포에 대한 프로바이오틱스의 부착 비율을 향상시킬 수 있다. 따라서, 동결 건조된 프로바이오틱스 제품에서 본 발명의 Zeta-bio 조성물에 의한 재활성화는 위산과 담즙에 노출된 이후에도 프로바이오틱스의 생존력을 향상시킬 수 있고, 장내 세포에 대한 부착 증가로 인해 프로바이오틱스의 유익한 효과를 회복할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 개시의 속하는 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시가 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 개시의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 개시의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (2)

  1. 동결 건조 프로바이오틱스를 재활성화제와 접촉시키는 단계를 포함하고,
    상기 재활성화제는 동결 건조 프로바이오틱스 세포 표면에 음전하의 제타 포텐셜(zeta-potential)을 부여하는 것인, 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화 방법.
  2. 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화 기능을 갖는 물질을 스크리닝하는 방법으로서, 동결 건조 프로바이오틱스의 세포 표면에 음전하의 제타 포텐셜을 부여하는 물질을 선별하는 단계를 포함하는 방법.
KR1020210106214A 2021-01-20 2021-08-11 프로바이오틱스의 장내 생존율과 부착능을 향상시키기 위한 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화 조성물 KR102668148B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210106214A KR102668148B1 (ko) 2021-01-20 2021-08-11 프로바이오틱스의 장내 생존율과 부착능을 향상시키기 위한 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화 조성물

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020210008188A KR102302336B1 (ko) 2021-01-20 2021-01-20 프로바이오틱스의 장내 생존율과 부착능을 향상시키기 위한 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화 조성물
KR1020210106214A KR102668148B1 (ko) 2021-01-20 2021-08-11 프로바이오틱스의 장내 생존율과 부착능을 향상시키기 위한 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화 조성물

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210008188A Division KR102302336B1 (ko) 2021-01-20 2021-01-20 프로바이오틱스의 장내 생존율과 부착능을 향상시키기 위한 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20220105574A KR20220105574A (ko) 2022-07-27
KR102668148B1 true KR102668148B1 (ko) 2024-05-23

Family

ID=77793519

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210008188A KR102302336B1 (ko) 2021-01-20 2021-01-20 프로바이오틱스의 장내 생존율과 부착능을 향상시키기 위한 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화 조성물
KR1020210106214A KR102668148B1 (ko) 2021-01-20 2021-08-11 프로바이오틱스의 장내 생존율과 부착능을 향상시키기 위한 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화 조성물

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020210008188A KR102302336B1 (ko) 2021-01-20 2021-01-20 프로바이오틱스의 장내 생존율과 부착능을 향상시키기 위한 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (2) KR102302336B1 (ko)
WO (1) WO2022158642A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115305225B (zh) * 2022-09-16 2024-07-02 微康益生菌(苏州)股份有限公司 一种能够产酸的菌种组合、包含其的冻干菌粉及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101605516B1 (ko) 2015-06-11 2016-03-23 주식회사 종근당바이오 유산균의 생존율, 저장안정성, 내산성 또는 내담즙성을 증가시키는 방법
JP2017093441A (ja) 2010-08-19 2017-06-01 株式会社明治 乳酸菌および／またはビフィズス菌の生残性向上剤
KR102009732B1 (ko) 2019-04-15 2019-08-12 주식회사 쎌바이오텍 세포 농축 방법에 의한 이중코팅 유산균의 제조방법

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2018209083B2 (en) * 2017-01-19 2024-05-16 International N&H Denmark Aps Dried microorganism with excipient
KR102447791B1 (ko) * 2018-10-30 2022-10-04 씨제이웰케어 주식회사 유산균의 동결 보호를 위한 시스테인 또는 이의 염의 용도

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2017093441A (ja) 2010-08-19 2017-06-01 株式会社明治 乳酸菌および／またはビフィズス菌の生残性向上剤
KR101605516B1 (ko) 2015-06-11 2016-03-23 주식회사 종근당바이오 유산균의 생존율, 저장안정성, 내산성 또는 내담즙성을 증가시키는 방법
WO2016200048A1 (ko) 2015-06-11 2016-12-15 주식회사 종근당바이오 유산균의 생존율, 저장안정성, 내산성 또는 내담즙성을 증가시키는 방법
KR102009732B1 (ko) 2019-04-15 2019-08-12 주식회사 쎌바이오텍 세포 농축 방법에 의한 이중코팅 유산균의 제조방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
이윤정, 건국대학교, 축산식품생명공학과, 석사학위논문(2019.08.)*

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022158642A1 (ko) 2022-07-28
KR102302336B1 (ko) 2021-09-15
KR20220105574A (ko) 2022-07-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Vasiljevic et al. Probiotics—from Metchnikoff to bioactives
CN115287226B (zh) 适于保护微生物的组合物
Sanders Probiotics: considerations for human health
Hoesl et al. The probiotic approach: an alternative treatment option in urology
EP2270133B1 (en) Method for obtaining a novel strain of bifidobacterium bifidum with activity against infection by helicobacter pylori
PT2236598E (pt) Microrganismos para melhorar o estado de saúde de indivíduos com distúrbios relacionados com a ingestão de glúten
Agaliya et al. Screening of Lactobacillus plantarum isolated from fermented idli batter for probiotic properties
CN102272287B (zh) 冷冻干燥粉末状菌体及其制造方法
Saran et al. Comparing adhesion attributes of two isolates of Lactobacillus acidophilus for assessment of prebiotics, honey and inulin
Upadrasta et al. Improving the stress tolerance of probiotic cultures: recent trends and future directions
Kalliomäki et al. Positive interactions with the microbiota: probiotics
KR102668148B1 (ko) 프로바이오틱스의 장내 생존율과 부착능을 향상시키기 위한 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화 조성물
Anandharaj et al. Production of high‐quality probiotics by fermentation
Bustos et al. Recent Advances in the Understanding of Stress Resistance Mechanisms in Probiotics: Relevance for the Design of Functional Food Systems
Arellano et al. Improving the viability of freeze-dried probiotics using a lysine-based rehydration mixture
Kantachote et al. Characterization of the antiyeast compound and probiotic properties of a starter Lactobacillus plantarum DW3 for possible use in fermented plant beverages
US20230346853A1 (en) Probiotic Lyophilizate Reactivation Composition for Improving Intestinal Survivability and Adhesion of Probiotics
Zhang et al. Safety assessment of Lactobacillus salivarius REN, a probiotic strain isolated from centenarian feces
KR20230036888A (ko) 프로바이오틱스의 장내 생존율과 부착능을 향상시키기 위한 동결 건조 프로바이오틱스의 재활성화 조성물
Crittenden An update on probiotic bifidobacteria
EP2509450B1 (en) Prebiotic
JP5980785B2 (ja) 新規ビフィズス菌及びその利用
Lee et al. Improvement of Lyophilized Probiotics Viability Using a Histidine-based Rehydration Formula
Anand et al. In vitro screening of putative probiotic strains and prebiotics for effective anti-diarrheal synbiotics formulation
KR20230071305A (ko) 셀레늄을 이용한 유산균 코팅 공법

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right