KR102656519B1 - LAMP primer set for identification of Anguilla japonica and method for rapid and accurate identification of Anguilla japonica using the same - Google Patents
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Abstract
본 발명은 서열번호 1의 서열을 포함하는 정방향 프라이머(F3); 서열번호 2의 서열을 포함하는 역방향 프라이머(B3); 서열번호 3의 서열을 포함하는 정방향 내부 프라이머(FIP); 서열번호 4의 서열을 포함하는 역방향 내부 프라이머(BIP); 서열번호 5의 서열을 포함하는 정방향 루프 프라이머(LF); 및 서열번호 6의 서열을 포함하는 역방향 루프 프라이머(LB);를 포함하는 토종 뱀장어(Anguilla japonica) 식별용 LAMP 프라이머 세트, 이를 포함하는 토종 뱀장어(Anguilla japonica) 식별용 키트, 및 이를 이용한 토종 뱀장어(Anguilla japonica) 식별방법에 관한 것이다. 이에 의하여, 토종 뱀장어(Anguilla japonica)를 이와 형태학적으로 유사하여 구별하기 힘든 장어(Anguilla) 종으로 부터 현장에서 용이한 방법으로 신속하고 정확하게 식별할 수 있다.The present invention provides a forward primer (F3) comprising the sequence of SEQ ID NO: 1; Reverse primer (B3) containing the sequence of SEQ ID NO: 2; Forward internal primer (FIP) comprising the sequence of SEQ ID NO: 3; reverse internal primer (BIP) comprising the sequence of SEQ ID NO: 4; Forward loop primer (LF) comprising the sequence of SEQ ID NO: 5; and a reverse loop primer (LB) containing the sequence of SEQ ID NO: 6; a LAMP primer set for identifying native eels ( Anguilla japonica ) containing the same, a kit for identifying native eels ( Anguilla japonica ) containing the same, and native eels using the same ( Anguilla japonica ) It is about identification method. By this, native eels ( Anguilla japonica ) can be quickly and accurately identified in an easy way in the field from eel ( Anguilla ) species that are morphologically similar and thus difficult to distinguish.
Description
본 발명은 토종 뱀장어(Anguilla japonica)을 형태학적으로 유사한 다른 장어 종으로부터 용이하게 식별할 수 있는 기술에 관한 것이다.The present invention relates to a technology that can easily distinguish native eels ( Anguilla japonica ) from other morphologically similar eel species.
뱀장어 Anguilla japonica Temminck 및 Schlegel 1846은 동아시아에서 가장 상업적으로 중요한 장어 종 중 하나이다. 역사적으로 분포 지역 전체에 걸쳐 풍부한 A. japonica는 수산문화적으로 중요한 중요성을 갖고 있으며 많은 소비가 이루어지고 있는 종이다. 국제자연보전연맹(IUCN)이 지정한 멸종위기 상태는 최근 몇 년간 서식지 파괴와 어린 개체를 포함한 광범위한 포획으로 인해 발생하였다.The eel Anguilla japonica Temminck and Schlegel 1846 is one of the most commercially important eel species in East Asia. A. japonica , historically abundant throughout its distribution area, is a species of great fisheries and cultural importance and is widely consumed. The species' endangered status, designated by the International Union for Conservation of Nature (IUCN), has occurred in recent years due to habitat destruction and widespread hunting, including of young individuals.
뱀장어는 인공적인 번식이 불가능하기 때문에 양식장에서는 봄에 심해에서 담수로 이동하는 새끼 뱀장어(glass eels)와 같은 유생 단계의 개체를 포획하는 데에만 의존하고 있다. 장어 소비의 증가로 인해 토종 뱀장어(Anguilla japonica)가 아닌 장어 종의 수입이 증가했으며, 이로 인해 의도치 않게 이들 종의 뱀장어가 야생에 유입되거나 사기 거래가 조장되는 문제가 발생하고 있다. 토종 뱀장어가 아닌 타종의 뱀장어 유입은 토착 생태계에 심각한 위협을 가하므로, 다른 종의 뱀장어가 서식지에 정착하는 것을 방지하기 위해 이들 종을 조기 발견하기 위한 방법이 필요하다.Because eels cannot be artificially reproduced, farms rely solely on capturing larval-stage individuals, such as glass eels, which migrate from deep sea to fresh water in the spring. The increase in eel consumption has led to an increase in the import of non-native eel species ( Anguilla japonica ), which has led to the unintentional introduction of these species into the wild and the encouragement of fraudulent trade. The introduction of non-native eels poses a serious threat to the native ecosystem, so methods for early detection of other species of eels are needed to prevent them from settling in the habitat.
새끼 뱀장어(glass eels)를 식별하는 것은 투명한 형태적 특성으로 인해 어려움이 있다. 또한, 형태학적 특성을 기반으로 앵귈라(Anguilla) 종을 구별하는 것은 성체에서도 특성이 겹치기 때문에 여전히 어려움이 있다. 형태학적으로 유사한 장어 종은 뚜렷한 지리적 분포를 기준으로 구별할 수 있다고 알려져 있으나, 최근의 뱀장어의 활발한 상거래 및 도입으로 인해 지리적 기반 식별이 복잡해 식품 사기가 만연하게 되었다. 멸종 위기종을 보존하는 것 외에도 효과적인 양식업 관리를 위해서는 목표종을 식별하는 것이 필요하다. 고밀도 양식 환경에서 수많은 병원성 질병에 대한 뱀장어의 취약성은 적절한 관리 전략을 개발하기 위해 특정 병원체에 대한 숙주 특이성을 결정하는 것이 중요하다. 효과적인 관리를 위해서는 다른 숙주를 찾기 보다는 특정 병원체에 대한 적응을 나타내는 숙주 종에 초점을 맞추는 것이 바람직하다.Identifying glass eels is difficult due to their transparent morphological characteristics. Additionally, distinguishing Anguilla species based on morphological characteristics is still difficult because the characteristics overlap even in adults. It is known that morphologically similar eel species can be distinguished based on their distinct geographical distributions, but the recent active trade and introduction of eels has complicated geographically-based identification, leading to widespread food fraud. In addition to conserving endangered species, effective aquaculture management requires identification of target species. The vulnerability of eels to numerous pathogenic diseases in high-density aquaculture environments makes it important to determine host specificity for specific pathogens to develop appropriate management strategies. For effective management, it is advisable to focus on host species that exhibit adaptation to a specific pathogen rather than searching for alternative hosts.
형태학적 특성을 기반으로 한 뱀장어 종의 식별 문제를 해결하기 위해 종 간의 변이를 나타내는 분자 마커를 사용하는 대체 솔루션이 제안된 바 있다. 형태학적으로 구별할 수 없는 종을 식별하기 위해 널리 사용되는 DNA 바코드(Hebert and Gregory, 2005)를 사용하면 Sanger 또는 고처리량 시퀀싱 기술을 통해 DNA 서열을 검사할 수 있다. 그러나 이 방법은 상당한 시간과 분자생물학 전문 지식이 필요하다는 한계가 있어 전문지식을 가지지 않은 양식업계에서 접근하기 어려운 문제가 있다. 따라서 이러한 한계를 극복하면서 신속한 종 식별을 위한 기술이 요구되고 있다.To solve the problem of identification of eel species based on morphological characteristics, an alternative solution using molecular markers that indicate variation between species has been proposed. DNA barcoding, which is widely used to identify morphologically indistinguishable species (Hebert and Gregory, 2005), allows DNA sequences to be examined by Sanger or high-throughput sequencing techniques. However, this method has limitations in that it requires a considerable amount of time and molecular biology expertise, making it difficult for those in the aquaculture industry without specialized knowledge to access it. Therefore, technology for rapid species identification while overcoming these limitations is required.
토종 뱀장어(A. japonica)의 분자 식별 기술에는 DNA 바코드, 환경 DNA(eDNA) 및 정량적 PCR(qPCR) 방법이 포함될 수 있다. 상기 방법은 높은 신뢰성에도 불구하고 시험에 걸리는 시간 및 전문 지식 요구 사항에 있어 본질적인 한계가 있다.Molecular identification techniques for native eels ( A. japonica ) may include DNA barcoding, environmental DNA (eDNA), and quantitative PCR (qPCR) methods. Despite its high reliability, the method has inherent limitations in terms of testing time and expertise requirements.
본 발명의 목적은 토종 뱀장어(A. japonica)를 형태학적으로 유사한 다른 장어 종으로부터 간편한 방법으로 정확하고 신속하게 식별할 수 있는 토종 뱀장어(A. japonica) 식별용 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 프라이머 세트 및 이를 포함하는 토종 뱀장어(A. japonica) 식별용 키트를 제공하는 데 있다.The purpose of the present invention is to provide a set of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) primers for identifying native eels ( A. japonica ) that can accurately and quickly identify native eels ( A. japonica ) from other morphologically similar eel species in a simple manner. and to provide a kit for identifying native eels ( A. japonica ) including the same.
또한, 본 발명의 다른 목적은 위양성 확률이 극히 낮으며 65℃ 정도의 항온 수조만 마련되면 현장에서도 용이하게 적용할 수 있고, 짧은 시간 내에 토종 뱀장어(A. japonica)를 형태학적으로 유사한 다른 장어 종으로부터 육안으로 컬러 변화를 관찰하는 것만으로 정확하게 식별할 수 있는 루프 매개 등온 증폭(LAMP)를 이용한 토종 뱀장어(A. japonica)의 식별방법을 제공하는 데 있다.In addition, another object of the present invention is that the probability of false positives is extremely low, and it can be easily applied in the field as long as a constant temperature water tank of about 65 ° C is provided, and the native eel ( A. japonica ) can be converted to other morphologically similar eel species within a short period of time. The purpose is to provide an identification method for native eels ( A. japonica ) using loop-mediated isothermal amplification (LAMP), which can be accurately identified simply by observing color changes with the naked eye.
본 발명의 일 측면에 따르면,According to one aspect of the present invention,
서열번호 1의 서열을 포함하는 정방향 프라이머(F3); 서열번호 2의 서열을 포함하는 역방향 프라이머(B3); 서열번호 3의 서열을 포함하는 정방향 내부 프라이머(FIP); 서열번호 4의 서열을 포함하는 역방향 내부 프라이머(BIP); 서열번호 5의 서열을 포함하는 정방향 루프 프라이머(LF); 및 서열번호 6의 서열을 포함하는 역방향 루프 프라이머(LB);를 포함하는 토종 뱀장어(Anguilla japonica) 식별용 LAMP 프라이머 세트가 제공된다.Forward primer (F3) containing the sequence of SEQ ID NO: 1; Reverse primer (B3) containing the sequence of SEQ ID NO: 2; Forward internal primer (FIP) comprising the sequence of SEQ ID NO: 3; reverse internal primer (BIP) comprising the sequence of SEQ ID NO: 4; Forward loop primer (LF) comprising the sequence of SEQ ID NO: 5; and a reverse loop primer (LB) containing the sequence of SEQ ID NO: 6. A LAMP primer set for identification of native eel ( Anguilla japonica ) is provided.
상기 LAMP 프라이머 세트는 토종 뱀장어(Anguilla japonica)에서 서열번호 7의 서열을 포함하는 비코딩 미토콘드리아 제어 영역(non-coding mitochondrial control region, MCR)을 표적으로 할 수 있다.The LAMP primer set can target the non-coding mitochondrial control region (MCR) containing the sequence of SEQ ID NO: 7 in native eel ( Anguilla japonica ).
본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면,According to another aspect of the present invention,
상기 토종 뱀장어(Anguilla japonica) 식별용 LAMP 프라이머 세트를 포함할 수 있다.It may include a LAMP primer set for identification of the native eel ( Anguilla japonica ).
상기 토종 뱀장어(Anguilla japonica) 식별용 키트는 비색(colorimetric) 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 키트, 또는 형광 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 키트일 수 있다.The native eel ( Anguilla japonica ) identification kit may be a colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP) kit, or a fluorescent loop-mediated isothermal amplification (LAMP) kit.
상기 비색(colorimetric) 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 키트는 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 Tte UvrD 헬리카아제 중에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.The colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP) kit may further include one or more selected from dimethyl sulfoxide (DMSO) and Tte UvrD helicase.
상기 디메틸 설폭사이드(DMSO)는 총 반응물의 4.5 내지 5.5%(v/v)로 추가될 수 있다.The dimethyl sulfoxide (DMSO) may be added at 4.5 to 5.5% (v/v) of the total reactant.
본 발명의 다른 하나의 측면에 따르면,According to another aspect of the present invention,
상기 토종 뱀장어(Anguilla japonica) 식별용 키트를 이용한 토종 뱀장어(Anguilla japonica)의 식별방법이 제공된다.A method for identifying native eels ( Anguilla japonica ) using the native eel ( Anguilla japonica ) identification kit is provided.
상기 토종 뱀장어(Anguilla japonica)의 식별방법은 64 내지 66℃의 항온조건에서 수행될 수 있다.The identification method of the native eel ( Anguilla japonica ) can be performed under constant temperature conditions of 64 to 66°C.
상기 토종 뱀장어(Anguilla japonica)의 식별방법은 검출 한계(LOD)가 1 내지 1000 pg/㎕ 일 수 있다.The identification method of the native eel ( Anguilla japonica ) may have a limit of detection (LOD) of 1 to 1000 pg/㎕.
상기 토종 뱀장어(Anguilla japonica)의 식별방법은 루프 매개 등온 증폭(LAMP)을 20 내지 60분 동안 수행하여 식별할 수 있다.The native eel ( Anguilla japonica ) can be identified by performing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for 20 to 60 minutes.
본 발명의 토종 뱀장어(Anguilla japonica) 식별용 LAMP 프라이머 세트, 이를 포함하는 토종 뱀장어(Anguilla japonica) 식별용 키트는 짧은 시간 내 높은 민감도로 토종 뱀장어(Anguilla japonica)를 형태학적으로 유사한 다른 장어 종으로부터 식별이 가능하고, 특히 비색 검출 방법(colorimetric detection method)을 사용하면 값비싼 장비나 특별한 전문지식 없이도 현장 조건에서 육안으로 신속하고 정확하게 식별을 수행할 수 있다.The LAMP primer set for identification of native eels ( Anguilla japonica ) of the present invention, and the kit for identification of native eels ( Anguilla japonica ) containing the same, identify native eels ( Anguilla japonica ) from other morphologically similar eel species with high sensitivity in a short period of time. This is possible, and in particular, using a colorimetric detection method, identification can be performed quickly and accurately with the naked eye under field conditions without expensive equipment or special expertise.
도 1은 실험예 1의 토종 뱀장어(A. japonica) 검출을 위해 설계된 LAPM 프라이머의 개략도이다.
도 2는 실험예 2에 따른 다양한 온도에서 토종 뱀장어(A. japonica)의 미토콘드리아 제어 영역(MCR)에 대한 증폭 플롯 및 용융 피크를 나타낸 것이다.
도 3은 실험예 2에 따른 비색 LAMP 분석의 최적화 분석 결과이다.
도 4는 실험예 3 및 4에 따른 비색 LAMP 검출의 민감도와 특이성을 분석한 결과이다.
도 5는 실험예 5에 따른 최적화된 비색 LAMP 분석을 사용한 임상 시료 분석 결과이다.Figure 1 is a schematic diagram of LAPM primers designed for detection of native eel ( A. japonica ) in Experimental Example 1.
Figure 2 shows the amplification plot and melting peak for the mitochondrial control region (MCR) of native eel ( A. japonica ) at various temperatures according to Experimental Example 2.
Figure 3 shows the results of optimization analysis of colorimetric LAMP analysis according to Experimental Example 2.
Figure 4 shows the results of analyzing the sensitivity and specificity of colorimetric LAMP detection according to Experimental Examples 3 and 4.
Figure 5 shows the results of clinical sample analysis using the optimized colorimetric LAMP assay according to Experimental Example 5.
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 설명한다. 이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하도록 한다. 그러나, 이하의 설명은 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다. 본원에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 출원에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.Below, various aspects and various embodiments of the present invention are described in more detail. Hereinafter, embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the attached drawings so that those skilled in the art can easily implement the present invention. However, the following description is not intended to limit the present invention to specific embodiments, and in describing the present invention, if it is determined that a detailed description of related known technology may obscure the gist of the present invention, the detailed description will be omitted. . The terminology used herein is only used to describe specific embodiments and is not intended to limit the invention. Singular expressions include plural expressions unless the context clearly dictates otherwise. In this application, terms such as “comprise” or “have” are intended to designate the presence of features, numbers, steps, operations, components, or a combination thereof described in the specification, but are not intended to indicate the presence of one or more other features or It should be understood that this does not exclude in advance the possibility of the presence or addition of numbers, steps, operations, components, or combinations thereof.
이하, 본 발명의 뱀장어(Anguilla japonica) 식별용 LAMP 프라이머 세트에 대해 설명하도록 한다.Hereinafter, the LAMP primer set for identification of eel ( Anguilla japonica ) of the present invention will be described.
본 발명의 토종 뱀장어(Anguilla japonica) 식별용 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 1의 서열을 포함하는 정방향 프라이머(F3); 서열번호 2의 서열을 포함하는 역방향 프라이머(B3); 서열번호 3의 서열을 포함하는 정방향 내부 프라이머(FIP); 서열번호 4의 서열을 포함하는 역방향 내부 프라이머(BIP); 서열번호 5의 서열을 포함하는 정방향 루프 프라이머(LF); 및 서열번호 6의 서열을 포함하는 역방향 루프 프라이머(LB);를 포함하는 것을 특징으로 한다.The LAMP primer set for identification of native eel ( Anguilla japonica ) of the present invention includes a forward primer (F3) containing the sequence of SEQ ID NO: 1; Reverse primer (B3) containing the sequence of SEQ ID NO: 2; Forward internal primer (FIP) comprising the sequence of SEQ ID NO: 3; reverse internal primer (BIP) comprising the sequence of SEQ ID NO: 4; Forward loop primer (LF) comprising the sequence of SEQ ID NO: 5; and a reverse loop primer (LB) comprising the sequence of SEQ ID NO: 6.
상기 LAMP 프라이머 세트는 토종 뱀장어(Anguilla japonica)에서 서열번호 7의 서열을 포함하는 비코딩 미토콘드리아 제어 영역(non-coding mitochondrial control region, MCR)을 표적으로 하는 것을 특징으로 한다.The LAMP primer set is characterized by targeting the non-coding mitochondrial control region (MCR) containing the sequence of SEQ ID NO: 7 in native eel ( Anguilla japonica ).
상기 서열번호 1 내지 7의 서열은 아래와 같다.The sequences of SEQ ID NOs: 1 to 7 are as follows.
[토종 뱀장어([Native eel( Anguilla japonicaAnguilla japonica ) 식별용 LAMP 프라이머 세트]) LAMP primer set for identification]
서열번호 1(5' -> 3'): AAGAAACCACCAACCAGCSEQ ID NO: 1 (5' -> 3'): AAGAAACCACCAACCAGC
서열번호 2(5' -> 3'): CCTTTAAGTTAATGCCCGG SEQ ID NO: 2 (5' -> 3'): CCTTTAAGTTAATGCCCGG
서열번호 3(5' -> 3'): GGAACCAAATGCCAGTAATAGTTCACAAGTGAATACGTTTATGATAGGTCSEQ ID NO: 3 (5' -> 3'): GGAACCAATGCCAGTAATAGTTCACAAGTGAATACGTTTATGATAGGTC
서열번호 4(5' -> 3'): CAGGTCCCCACATCAAGAAACACGAGTTTAATGTATTACACCATSEQ ID NO: 4 (5' -> 3'): CAGGTCCCCACATCAAGAAACACGAGTTTAATGTATTACACCAT
서열번호 5(5' -> 3'): ATGCCAATCTACAATTACTGTCCCTSEQ ID NO: 5 (5' -> 3'): ATGCCAATCTACAATTACTGTCCCT
서열번호 6(5' -> 3'): CCCCATAACCTGAATTGTGTCCGSEQ ID NO: 6 (5' -> 3'): CCCCATAACCTGAATTGTGTCCG
[토종 뱀장어([Native eel( Anguilla japonicaAnguilla japonica ) MCR])MCR]
서열번호 7(5' -> 3'):SEQ ID NO: 7 (5' -> 3'):
CGCAGTAAGAAACCACCAACCAGCACAAATCAAGTGAATACGTTTATGATAGGTCAGGGACAGTAATTGTAGATTGGCATAAAATGAACTATTACTGGCATTTGGTTCCTATTTCAGGTCCCCACATCAAGAAACCCCCATAACCTGAATTGTGTCCGGCATTTGATTAATGGTGTAATACATTAAACTCGTTACCCACCAAGCCGGGCATTAACTTAAAGGCATTTGCGCAGTAAGAAACCACCAACCAGCACAAATCAAGTGAATACGTTTATGATAGGTCAGGGACAGTAATTGTAGATTGGCATAAAATGAACTATTACTGGCATTTGGTTTCCTATTTCAGGTCCCCACATCAAGAAACCCCCATAACCTGAATTGTGTCCGGCATTTGATTAATGTGTAATACATTAAACTCGTTACCCACCAAGCCGGGCATTAACTTAAAGGCATTTG
또한, 본 발명은 상기 토종 뱀장어(Anguilla japonica) 식별용 LAMP 프라이머 세트를 포함하는 토종 뱀장어(Anguilla japonica) 식별용 키트를 제공한다.In addition, the present invention provides a kit for identifying native eels ( Anguilla japonica ), including the LAMP primer set for identifying the native eels ( Anguilla japonica ).
상기 토종 뱀장어(Anguilla japonica) 식별용 키트는 비색(colorimetric) 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 키트, 또는 형광 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 키트일 수 있으나, 육안으로 쉽게 판단이 가능한 비색(colorimetric) 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 키트인 것이 더욱 바람직하다.The kit for identifying the native eel ( Anguilla japonica ) may be a colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP) kit or a fluorescent loop-mediated isothermal amplification (LAMP) kit, but the kit may be a colorimetric loop-mediated amplification kit that can be easily determined with the naked eye. More preferably, it is an isothermal amplification (LAMP) kit.
상기 비색(colorimetric) 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 키트는 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 Tte UvrD 헬리카아제 중에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 상기 디메틸 설폭사이드(DMSO)는 총 반응물의 4.5 내지 5.5%(v/v)로 추가되는 것이 바람직하다. 이에 따라, 위양성 비율이 현저히 줄어들 수 있다.The colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP) kit preferably further includes at least one selected from dimethyl sulfoxide (DMSO) and Tte UvrD helicase. The dimethyl sulfoxide (DMSO) is preferably added at 4.5 to 5.5% (v/v) of the total reactant. Accordingly, the false positive rate can be significantly reduced.
또한, 본 발명은 상기 토종 뱀장어(Anguilla japonica) 식별용 키트를 이용한 토종 뱀장어(Anguilla japonica)의 식별방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for identifying native eels ( Anguilla japonica ) using the native eel ( Anguilla japonica ) identification kit.
상기 토종 뱀장어(Anguilla japonica)의 식별방법은 64 내지 66℃의 항온조건에서 수행되는 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 64.5 내지 65℃에서 수행될 수 있다. 이와 같은 온도 범위에서 루프 매개 등온 증폭(LAMP)을 수행할 때 비특이적 증폭을 방지하여 식별의 특이성을 향상시킬 수 있다.The identification method of the native eel ( Anguilla japonica ) is preferably performed under constant temperature conditions of 64 to 66°C, and more preferably at 64.5 to 65°C. When loop-mediated isothermal amplification (LAMP) is performed in this temperature range, the specificity of identification can be improved by preventing non-specific amplification.
상기 토종 뱀장어(Anguilla japonica)의 식별방법은 검출 한계(LOD)가 1 내지 1000 pg/㎕ 일 수 있고, 더욱 바람직하게는 1 내지 500 pg/㎕, 더욱 더 바람직하게는 1 내지 100 pg/㎕ 일 수 있다. 이와 같이 본 발명의 qLAMP 진단방법은 검출 한계(LOD)가 피코그램(picogram, 10-12g) 수준으로 미량의 표적 DNA로도 정확한 검출이 가능하다.The identification method of the native eel ( Anguilla japonica ) may have a limit of detection (LOD) of 1 to 1000 pg/μl, more preferably 1 to 500 pg/μl, and even more preferably 1 to 100 pg/μl. You can. As such, the qLAMP diagnostic method of the present invention has a limit of detection (LOD) at the picogram level (10 -12 g), enabling accurate detection even with a trace amount of target DNA.
상기 토종 뱀장어(Anguilla japonica)의 식별방법은 루프 매개 등온 증폭(LAMP)을 20 내지 60분 동안 수행하여 식별할 수 있따.The native eel ( Anguilla japonica ) can be identified by performing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for 20 to 60 minutes.
따라서, 본 발명의 토종 뱀장어(Anguilla japonica)의 식별방법은 상기 온도를 유지할 수 항온조건만 마련되면 LAMP 진단 키트를 이용하여 짧은 시간 내에 간편하게 토종 뱀장어(Anguilla japonica)에 해당하는 종을 신속하고 정확하게 식별할 수 있으므로 뱀장어를 양식하는 현장에서 쉽게 사용할 수 있어 뱀장어 개체 관리 유용하다.Therefore, the identification method of the native eel ( Anguilla japonica ) of the present invention can quickly and accurately identify the species corresponding to the native eel ( Anguilla japonica ) within a short period of time using the LAMP diagnostic kit as long as the constant temperature conditions that can maintain the above temperature are provided. Since it can be easily used in eel farming fields, it is useful for managing eel populations.
이하에서는 본 발명에 따른 실시예를 들어 구체적으로 설명하도록 한다. Hereinafter, the present invention will be described in detail through examples.
[실험예][Experimental example]
실험방법Experiment method
(1) 샘플 준비(1) Sample preparation
토종 뱀장어(A. japonica) 개체 31 마리는 대한민국 당진(N = 28, 충청남도)과 군산(N = 3, 전라북도)에 위치한 두 장어 양식장에서 수집하였다. 또한 경기도 수원시에서 토종 뱀장어(A. japonica) 야생 개체 1마리를 수집하였다.Thirty-one native eel ( A. japonica ) individuals were collected from two eel farms located in Dangjin (N = 28, Chungcheongnam-do) and Gunsan (N = 3, Jeollabuk-do), South Korea. Additionally, one wild individual of native eel ( A. japonica ) was collected from Suwon-si, Gyeonggi-do.
종을 동정하기 위해 샘플에서 DNA를 추출하고 특정 프라이머를 사용하여 뱀장어 미토콘드리아 시토크롬 b 유전자좌(mitochondrial cytochrome b locus)를 표적으로 하는 PCR 증폭을 수행하였다(CB-UF: GATGCCCTAGTGGATCTACC, CB-UR: TATGGGTGTTCTACTGGTAT; PCR conditions followed Han et al., 2012).To identify the species, DNA was extracted from the samples and PCR amplification targeting the eel mitochondrial cytochrome b locus was performed using specific primers (CB-UF: GATGCCCTAGTGGATCTACC, CB-UR: TATGGGTGTTCTACTGGTAT; PCR conditions followed Han et al., 2012).
PCR 산물은 Macrogen Company(대한민국 서울)에서 서열 분석하였다. 얻은 서열은 Geneious Prime 2023.1.2를 사용하여 분석하고 BLAST 분석을 통해 종을 동정하였다.PCR products were sequenced by Macrogen Company (Seoul, Korea). The obtained sequences were analyzed using Geneious Prime 2023.1.2, and the species was identified through BLAST analysis.
(2) LAMP 프라이머 디자인(2) LAMP primer design
토종 뱀장어(A. japonica)(accession number: AB038556)의 비코딩 미토콘드리아 제어 영역(non-coding mitochondrial control region, MCR)(MCR은 D-Loop라고도 함)을 표적으로 하는 LAMP 프라이머는 New England Biolabs(NEB)을 기본 매개변수로 사용하였다.LAMP primers targeting the non-coding mitochondrial control region (MCR) (MCR also known as D-Loop) of native eel ( A. japonica ) (accession number: AB038556) were from New England Biolabs (NEB). ) was used as the basic parameter.
디자인된 프라이머 세트는 하기 표 1에 정리된 바와 같이 내부 프라이머 2개(FIP 및 BIP), 루프 프라이머 2개(LF 및 LB), 외부 프라이머 2개(F3 및 B3)로 구성된다. NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 웹 소프트웨어 Primer-BLAST를 사용하여 프라이머 특이성을 확인하였다.The designed primer set consists of two internal primers (FIP and BIP), two loop primers (LF and LB), and two external primers (F3 and B3), as summarized in Table 1 below. Primer specificity was confirmed using Primer-BLAST, a web software from the National Center for Biotechnology Information (NCBI).
(3) 뱀장어 속((3) Eel genus ( AnguillaAnguilla genus genus )) 속의 주형 구축 Building a mold within
토종 뱀장어(A. japonica)(228 bp)와 다른 3종의 인도쇼트핀장어(A. bicolor pacifica)(227 bp), 유럽장어(A. Anguilla)(228 bp) 및 미국장어(A. rostrate)(228 bp)의 MCR(non-coding mitochondrial control region) DNA 단편을 Macrogen(서울, 한국)의 시설을 사용하여 맞춤 합성하였다. 이어서, 이들 합성된 단편(S1)을 pMG-Amp 벡터(Macrogen, South Korea)에 클로닝하였다. 토종 뱀장어(A. japonica)의 MCR DNA 단편을 포함하는 플라스미드는 LAMP 분석의 표준 주형으로 사용되었으며 특이성 평가를 위하여 다른 3종의 플라스미드를 사용하였다.Native eel ( A. japonica ) (228 bp) and three other species of Indian shortfin eel ( A. bicolor pacifica ) (227 bp), European eel ( A. Anguilla ) (228 bp) and American eel ( A. rostrate ). (228 bp) non-coding mitochondrial control region (MCR) DNA fragment was custom synthesized using the facilities of Macrogen (Seoul, Korea). Subsequently, these synthesized fragments (S1) were cloned into pMG-Amp vector (Macrogen, South Korea). A plasmid containing the MCR DNA fragment of native eel ( A. japonica ) was used as a standard template for the LAMP assay, and three other plasmids were used to evaluate specificity.
하기 표 2에 상기 4종 장어의 MCR DNA 단편의 서열을 정리하였다.Table 2 below summarizes the sequences of the MCR DNA fragments of the four species of eel.
(4) LAMP 분석(4) LAMP analysis
LAMP 분석은 NEB사(Ipswich, MA, USA)에서 개발한 WarmStart® 형광 LAMP 키트와 WarmStart® 비색(colorimetric) LAMP 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 25㎕ 반응량으로 수행하였다. 형광 반응을 위해 혼합물에는 dNTP, MgSO4 및 Bst 2.0 WarmStart DNA 폴리머라제로 구성된 WarmStart LAMP 2 x Master Mix 12.5㎕와 pH 지시약, F3 및 B3 프라이머 0.2μM, FIP 및 BIP 프라이머 1.6μM, LF 및 LB 프라이머 0.4 μM, 50 x 형광 염료 0.5 ㎕, 1 ㎕의 주형 DNA 및 PCR 등급 물을 사용하여 총 부피를 25 ㎕로 구성하였다.LAMP analysis was performed using the WarmStart® fluorescent LAMP kit and WarmStart® colorimetric LAMP kit developed by NEB (Ipswich, MA, USA) in a 25 μl reaction volume according to the manufacturer's protocol. For the fluorescence reaction, the mixture contained 12.5 μl of WarmStart LAMP 2 A total volume of 25 μl was made up using 0.5 μl of 50 μM, 50×fluorescent dye, 1 μl of template DNA, and PCR grade water.
형광 LAMP 반응은 CFX Maestro Dx SE Software™를 사용하여 65℃에서 30초 동안 60회 주기로 구성된 온도 프로그램을 사용하여 Bio-Rad CFX Opus 96 Real-Time PCR 검출 시스템에서 수행되었다. FAM 형광단 채널의 형광 신호는 인큐베이션 중 각 주기마다 기록되어 실시간 증폭 곡선을 생성하였다. 임계시간(Tt)은 정량값으로 결정하였다. 추가적으로, 65℃부터 95℃까지 0.5℃씩 5초 마다 증가시키면서 용융곡선 분석을 수행하였고, 5초마다 형광을 측정하여 양성(positive) 결과와 음성(negative) 결과를 구별하였다.Fluorescence LAMP reactions were performed on a Bio-Rad CFX Opus 96 Real-Time PCR detection system using CFX Maestro Dx SE Software™ using a temperature program consisting of 60 cycles at 65°C for 30 seconds. The fluorescence signal of the FAM fluorophore channel was recorded at each cycle during incubation to generate a real-time amplification curve. The critical time (Tt) was determined as a quantitative value. Additionally, melting curve analysis was performed from 65°C to 95°C with an increase of 0.5°C every 5 seconds, and fluorescence was measured every 5 seconds to distinguish between positive and negative results.
또한, LAMP 생성물은 아가로스 젤 전기영동(TAE 완충액 중 1.5% 아가로스)을 하였고, 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)로 염색되었으며, UV 트랜스일루미네이터를 사용하여 시각화되었다. 비색 LAMP 반응은 Applied Biosystems MiniAmp Thermal Cycler(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA)로 65℃에서 30분 동안 수행되었다.Additionally, the LAMP product was subjected to agarose gel electrophoresis (1.5% agarose in TAE buffer), stained with ethidium bromide, and visualized using a UV transilluminator. The colorimetric LAMP reaction was performed at 65°C for 30 min with an Applied Biosystems MiniAmp Thermal Cycler (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA).
(5) LAMP 최적화(5) LAMP optimization
최적의 반응 온도를 결정하기 위해 형광 LAMP 분석을 수행하였다. 55℃, 58℃, 60.9℃, 64.5℃, 67.5℃ 및 70℃의 온도로 55 내지 70℃ 범위의 다양한 등온 온도를 평가하여 최적화하였다. 토종 뱀장어(A. japonica)의 MCR(non-coding mitochondrial control region) DNA 단편을 함유한 플라스미드(10ng/㎕)를 LAMP 반응의 주형으로 사용하였다.Fluorescence LAMP analysis was performed to determine the optimal reaction temperature. Various isothermal temperatures ranging from 55 to 70°C were evaluated and optimized with temperatures of 55°C, 58°C, 60.9°C, 64.5°C, 67.5°C and 70°C. A plasmid (10 ng/μl) containing a non-coding mitochondrial control region (MCR) DNA fragment from native eel ( A. japonica ) was used as a template for the LAMP reaction.
이어서, 비색(colorimetric) LAMP 분석을 사용하여 최적화 프로세스를 수행하였다. 여기에는 디메틸 설폭사이드(DMSO)와 Tte UvrD Helicase(NEB, USA)를 비색 반응에 통합하여 LAMP 반응을 최적화하였다. LAMP 반응은 5%, 6% 및 7.5%(v/v) DMSO 1.25㎕를 추가하여 시험하였다. 또한 제조업체에서 권장하는 바에 따라 0.5㎕의 Tte UvrD Helicase(10ng/㎕)를 사용하였다. 마지막으로, LAMP 분석법은 상기 비색법을 사용하여 5% DMSO로 최적화하였다. 모든 실험예에서 분석은 상기와 같은 최적화된 조건에 따라 수행하였다.The optimization process was then performed using colorimetric LAMP analysis. Here, the LAMP reaction was optimized by incorporating dimethyl sulfoxide (DMSO) and Tte UvrD Helicase (NEB, USA) into the colorimetric reaction. The LAMP reaction was tested by adding 1.25 μl of 5%, 6%, and 7.5% (v/v) DMSO. Additionally, 0.5 μl of Tte UvrD Helicase (10 ng/μl) was used as recommended by the manufacturer. Finally, the LAMP assay was optimized with 5% DMSO using the colorimetric method described above. In all experimental examples, analysis was performed according to the optimized conditions described above.
육안으로 볼 수 있는 시약의 색상 변화가 분홍색에서 노란색으로 변하는 경우를 관찰하여 양성(positive) LAMP 결과를 확인하였다. 사진은 Nikon SPEEDLIGHT SB-5000 조명 조건에서 Nikon D90과 AF-S DX Micro NIKKOR 40mm f/2.8G 렌즈를 사용하여 촬영하였다.A positive LAMP result was confirmed by observing the color change of the reagent visible to the naked eye from pink to yellow. The photo was taken using a Nikon D90 and AF-S DX Micro NIKKOR 40mm f/2.8G lens under Nikon SPEEDLIGHT SB-5000 lighting conditions.
(6) 민감도(Sensitivity) 평가(6) Sensitivity evaluation
LAMP 분석의 검출 한계(LOD)를 평가하기 위해 10배 연속 희석 시리즈(10ng/㎕ ~ 1fg/㎕ 범위)를 사용하여 토종 뱀장어(A. japonica)의 MCR에 대한 맞춤형 합성 플라스미드로 LAMP 반응을 증폭시켰다. 모든 반응은 최적화된 LAMP 분석을 사용하여 수행하였다. 맞춤형 합성 플라스미드의 복제수는 하기 식 1에 따라 계산되었다:To evaluate the limit of detection (LOD) of the LAMP assay, the LAMP reaction was amplified with a custom synthetic plasmid against the MCR of native eel ( A. japonica ) using a 10-fold serial dilution series (ranging from 10 ng/μl to 1 fg/μl). . All reactions were performed using the optimized LAMP assay. The copy number of the custom synthetic plasmid was calculated according to Equation 1:
[식 1][Equation 1]
복제 수 = (DNA양 [ng] x 6.022 x 1023) / (염기쌍의 수 Х 109 Х 650)Number of copies = (DNA amount [ng] x 6.022 x 10 23 ) / (number of base pairs Х 10 9 Х 650)
(7) 특이성(Specificity) 평가(7) Specificity evaluation
2개의 LAMP 외부 프라이머(F3 및 B3)의 특이성을 평가하기 위해 Design with Existing option을 사용하여 Geneious Prime 2023.1.2에 통합된 Primer3 2.3.7 소프트웨어(Untergasser et al., 2012)의 수정된 버전을 사용하여 In silico PCR을 수행하였다. 목표하지 않는 종들의 데이터베이스는 MitoFish 및 NCBI에서 얻은 Actinopteri, Chondrichthyes, Myxini 및 Hyperoartia 과(class)의 619개 대표 종을 포함하였다. LAMP 프라이머에 대한 추가 검증은 Geneious Prime 2023.1.2를 사용하여 다중 서열 정렬을 통해 실행되었으며, 앵귈라(Anguilla) 속 내 17개 종의 서열을 분석하였다.To assess the specificity of the two LAMP external primers (F3 and B3), we used a modified version of Primer3 2.3.7 software ( Untergasser et al., 2012 ) integrated into Geneious Prime 2023.1.2 using the Design with Existing option. In silico PCR was performed. The database of non-target species included 619 representative species of the classes Actinopteri, Chondrichthyes, Myxini , and Hyperoartia obtained from MitoFish and NCBI. Additional validation of the LAMP primers was performed through multiple sequence alignment using Geneious Prime 2023.1.2, and the sequences of 17 species within the genus Anguilla were analyzed.
LAMP 분석의 특이성(specificity)은 토종 뱀장어(A. japonica)와 형태학적 유사성이 있는 것으로 알려진 앵귈라(Anguilla) 속에 속하는 다른 3종의 인도쇼트핀장어(A. bicolor pacifica), 유럽장어(A. Anguilla) 및 미국장어(A. rostrate)를 이용하여 분석하였다. 최적화된 비색 LAMP 분석은 상기 3종의 MCR에 대해 맞춤 합성 플라스미드를 사용하여 수행하였다.The specificity of the LAMP analysis lies in the ability of three other species of the Anguilla genus known to have morphological similarities to the native eel ( A. japonica ), the Indian shortfin eel ( A. bicolor pacifica ), and the European eel ( A. Anguilla ) and American eel ( A. rostrate ) were used for analysis. The optimized colorimetric LAMP assay was performed using custom synthetic plasmids for the three MCRs.
[실험예][Experimental example]
실험예 1: MCR의 표적 DNA 서열 내에서 상동성 분석Experimental Example 1: Homology analysis within the target DNA sequence of MCR
선택된 MCR 서열 영역은 설계된 LAMP 외부 프라이머(F3 및 B3)에 초점을 맞춘 포괄적인 생물정보학 평가를 거쳤다. 이 분석에는 619개 대표적인 종의 미토콘드리아 게놈(mitochondrial genome) 스펙트럼이 포함되었다. 이에 따른 평가 결과는 설계된 프라이머가 이들 미토콘드리아 게놈 중 어느 것에도 증폭을 나타내지 않는 것으로 나타났다.Selected MCR sequence regions underwent comprehensive bioinformatics evaluation focusing on the designed LAMP external primers (F3 and B3). This analysis included mitochondrial genome spectra from 619 representative species. The results of this evaluation showed that the designed primers did not show amplification in any of these mitochondrial genomes.
토종 뱀장어(A. japonica) 검출을 위해 설계된 LAPM 프라이머의 개략도를 도 1에 나타내었다. 여기서, (A)는 앵귈라 속의 미토콘드리아 제어 영역(MCR) 내 표적 영역의 다중 서열의 정렬을 나타낸 것이고, 종 이름과 GenBank 접근 번호는 각 서열의 시작 부분에 표시하였으며, 서열 위의 문자는 뉴클레오티드의 빈도를 나타낸다. 색상으로 강조된 뉴클레오티드는 토종 뱀장어(A. japonica) 서열과 다른 염기를 나타낸다. (B)는 본 발명에서 사용된 LAMP 프라이머의 개략도이다. FIP(Forward Inner Primer)는 F1c와 F2로 구성되고, BIP(Backward Inner Primer)는 B2와 B1c로 구성된다.A schematic diagram of LAPM primers designed for detection of native eel ( A. japonica ) is shown in Figure 1. Here, (A) shows the alignment of multiple sequences of the target region within the mitochondrial control region (MCR) of the genus Anguilla, the species name and GenBank accession number are indicated at the beginning of each sequence, and the letters above the sequence indicate the nucleotides. Indicates frequency. Nucleotides highlighted in color represent bases that differ from the native eel ( A. japonica ) sequence. (B) is a schematic diagram of the LAMP primer used in the present invention. FIP (Forward Inner Primer) is composed of F1c and F2, and BIP (Backward Inner Primer) is composed of B2 and B1c.
또한, 토종 뱀장어(A. japonica)의 MCR 서열 단편에 대한 자세한 조사가 앵귈라(Anguilla) 속의 다른 16개 종과 비교하여 수행되었다. 구체적으로 역방향 내부 프라이머(BIP)의 B1 영역과 B3 프라이머는 각각 73.9%와 55%로 상당한 서열 차이를 나타내었다.Additionally, a detailed investigation of the MCR sequence fragments of the native eel ( A. japonica ) was performed in comparison with 16 other species of the genus Anguilla. Specifically, the B1 region and B3 primer of the reverse internal primer (BIP) showed significant sequence differences of 73.9% and 55%, respectively.
실험예 2: LAMP 분석의 최적화Experimental Example 2: Optimization of LAMP analysis
LAMP 분석의 최적화 과정에는 형광 LAMP 분석을 사용하여 다양한 온도를 탐색하는 작업을 포함시켰다. 다양한 온도(55℃, 58℃, 60.9℃, 64.5℃, 67.5℃, 70℃)에서 토종 뱀장어(A. japonica)의 미토콘드리아 제어영역(MCR)에 대한 증폭 플롯 및 용융 피크를 도 2에 나타내었다. (A)는 표준 MCR 주형에 대한 증폭 플롯 및 용융 피크를 나타낸 것이고, (B)는 비주형(non-template) 대조군(NTC)에 대한 증폭 플롯 및 용융 피크를 나타낸 것이고, (C)는 MCR 및 NTC에 대한 1.5% 아가로스 젤 전기 영동 이미지이다. 여기서, 적용된 다양한 온도는 각 밴드 위에 표시하였고. 100bp 분자 마커(M)를 그림의 양쪽에 표시하였다. The optimization process for the LAMP assay included exploring various temperatures using the fluorescent LAMP assay. Amplification plots and melting peaks for the mitochondrial control region (MCR) of native eel ( A. japonica ) at various temperatures (55°C, 58°C, 60.9°C, 64.5°C, 67.5°C, 70°C) are shown in Figure 2 . (A) shows the amplification plot and melting peak for the standard MCR template, (B) shows the amplification plot and melting peak for the non-template control (NTC), and (C) shows the MCR and This is a 1.5% agarose gel electrophoresis image for NTC. Here, the various temperatures applied are indicated above each band. A 100bp molecular marker (M) is indicated on both sides of the picture.
이에 따르면, 가장 낮은 임계시간(Tt) 값을 가지는 가장 효율적인 증폭은 64.5℃ 샘플에서 나타났으며, 이는 70℃에서 더 긴 임계시간(Tt) 값과 대조적인 것을 알 수 있다(도 2의 A). 특히 55.0℃, 58.0℃, 60.9℃, 67.5℃에서는 NTC에서 비특이적 증폭이 일어났으나 64.5℃와 70.0℃에서는 나타나지 않았다(도 2의 B). 이와 같은 결과는 아가로스 젤 전기영동 결과와 같았다(도 2의 C). 결과적으로, 이와 같은 결과를 통해 65℃가 LAMP 분석을 위한 최적의 온도인 것을 알 수 있다.According to this, the most efficient amplification with the lowest threshold time (Tt) value was seen in the 64.5°C sample, which contrasts with the longer threshold time (Tt) value at 70°C (Figure 2A). . In particular, non-specific amplification occurred in NTC at 55.0°C, 58.0°C, 60.9°C, and 67.5°C, but did not occur at 64.5°C and 70.0°C (Figure 2B). These results were the same as the results of agarose gel electrophoresis (C in Figure 2). As a result, these results show that 65°C is the optimal temperature for LAMP analysis.
도 3은 비색 LAMP 분석의 최적화 분석 결과이다. (A)의 첫 번째 행은 토종 뱀장어(AJ-MCR)의 MCR 증폭에 대한 LAMP 분석 결과를 표시한 것이고, NTC에서도 양성 반응이 나타났다. (B), (C), (D)의 두 번째부터 네 번째 행은 각각 5%, 6% 및 7.5% 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 추가하여 얻은 LAMP 분석 결과이다. (E)의 마지막 행은 Tte UvrD Helicase 추가 후 LAMP 분석 결과이다. 이에 따르면, 65℃에서의 비색 LAMP 분석은 적절한 MCR 증폭을 나타냈으며, 이는 분홍색에서 노란색으로의 색상 변화에서 분명하게 나타났다. 그러나 NTC에서는 비특이적 증폭이 관찰되었다(도 3의 A). LAMP 반응에 5%(도 3의 B), 6%(도 3의 C) 및 7.5%(도 3의 D) 농도의 DMSO를 첨가하면 5% DMSO 조건에서만 토종 뱀장어 AJ-MCR가 양성 반응을 나타내었다. 또한, LAMP 반응에 Tte UvrD Helicase를 포함시키는 경우, MCR 주형과 NTC 모두에 대한 색상 변화가 나타났다. 이러한 평가를 바탕으로 최적화된 LAMP 반응 조건은 5% DMSO를 사용한 비색 LAMP 반응으로 결정하였다.Figure 3 shows the results of optimization analysis of colorimetric LAMP analysis. The first row in (A) shows the results of LAMP analysis for MCR amplification of native eel (AJ-MCR), and a positive reaction was also found in NTC. The second to fourth rows of (B), (C), and (D) are the LAMP assay results obtained by adding 5%, 6%, and 7.5% dimethyl sulfoxide (DMSO), respectively. The last row in (E) is the result of LAMP analysis after addition of Tte UvrD Helicase. Accordingly, the colorimetric LAMP assay at 65°C showed adequate MCR amplification, which was evident in the color change from pink to yellow. However, non-specific amplification was observed in NTC (Figure 3A). When DMSO was added at concentrations of 5% (B in Figure 3), 6% (C in Figure 3), and 7.5% (D in Figure 3) to the LAMP reaction, native eel AJ-MCR showed a positive reaction only under 5% DMSO conditions. It was. Additionally, when Tte UvrD Helicase was included in the LAMP reaction, a color change was observed for both the MCR template and NTC. Based on this evaluation, the optimized LAMP reaction conditions were determined as a colorimetric LAMP reaction using 5% DMSO.
실험예 3: 검출 한계를 결정하기 위한 민감도(Sensitivity) 평가Experimental Example 3: Sensitivity evaluation to determine detection limit
비색 LAMP 검출의 민감도와 특이성를 분석한 결과를 도 4에 나타내었다. 여기서, (A)의 LAMP 분석 결과는 비주형 대조군(NTC)과 함께 10ng/㎕ 내지 1fg/㎕ 범위의 토종 뱀장어(A. japonica) MCR의 연속 희석된 표준 주형을 표시한다. (B)의 LAMP 분석 결과는 4개의 NTC 샘플과 함께 토종 뱀장어(A. japonica)(AJ), 미국장어(A. rostrate)(AR), 인도쇼트핀장어(A. bicolor pacifica)(ABP) 및 유럽장어(A. Anguilla)(AA) 4종에 대한 것이다.The results of analyzing the sensitivity and specificity of colorimetric LAMP detection are shown in Figure 4. Here, the LAMP assay results in (A) display serially diluted standard templates of native eel ( A. japonica ) MCR ranging from 10 ng/μl to 1 fg/μl along with a non-template control (NTC). LAMP analysis results in (B), along with four NTC samples: native eel ( A. japonica ) (AJ), American eel ( A. rostrate ) (AR), Indian shortfin eel ( A. bicolor pacifica ) (ABP), and This is for four species of European eel ( A. Anguilla ) (AA).
검출 한계(LOD)를 결정하기 위해 토종 뱀장어(A. japonica) MCR의 연속 희석 표준 주형 DNA를 사용하여 LAMP 분석을 수행하였다. 이에 따른 결과는 분홍색에서 노란색으로, 10ng/㎕에서 최대 1pg/㎕까지 관찰되는 색상 변화를 나타냈으며, 다른 희석 샘플은 NTC와 유사한 분홍색을 나타내었다(도 4의 A). 이와 같은 결과로부터 토종 뱀장어(A. japonica)의 검출 한계(LOD)는 1 pg/㎕(3.153 x 105 복제수/㎕)로 결정되었다.To determine the limit of detection (LOD), a LAMP assay was performed using serially diluted standard template DNA from native eel ( A. japonica ) MCR. The results showed a color change observed from pink to yellow, from 10 ng/μl up to 1 pg/μl, and other diluted samples showed a pink color similar to NTC (Figure 4A). From these results, the limit of detection (LOD) of native eel ( A. japonica ) was determined to be 1 pg/μl (3.153 x 10 5 copies/μl).
실험예 4: 형태학적으로 유사한 앵귈라(Experimental Example 4: Morphologically similar Anguilla ( Anguilla)Anguilla) 종 간의 특이성 평가 Assessment of specificity between species
특이성(specificity) 평가를 위해 토종 뱀장어(A. japonica)와 앵귈라 속 내 형태학적 유사성을 공유하고 밀접하게 관련된 다른 미국장어(A. rostrate)(AR), 인도쇼트핀장어(A. bicolor pacifica)(ABP) 및 유럽장어(A. Anguilla)(AA) 3종에 대해 비색 LAMP 분석을 수행하고, 그 결과를 도 5의 (B)에 나타내었다.To assess specificity, we compared the native eel ( A. japonica ) with other closely related American eels ( A. rostrate ) (AR) and Indian shortfin eels ( A. bicolor pacifica ) that share morphological similarities within the Anguilla genus. Colorimetric LAMP analysis was performed on three species (ABP) and European eel ( A. Anguilla ) (AA), and the results are shown in Figure 5 (B).
이에 따르면, 토종 뱀장어(A. japonica)에서 종 특이적 증폭을 성공적으로 감지하였으나 미국장어(A. rostrate)(AR), 인도쇼트핀장어(A. bicolor pacifica)(ABP) 및 유럽장어(A. Anguilla)(AA) 종에서는 감지되지 않았다. 유럽장어(AA)는 분홍색에서 밝은 분홍색으로 색상 변화를 보였지만, 분홍색에서 노란색으로 눈에 띄는 변화를 보인 토종 뱀장어(A. japonica)와 구별되는 컬러를 나타내었다.According to this, species-specific amplification was successfully detected in native eel ( A. japonica ), but not in American eel ( A. rostrate ) (AR), Indian shortfin eel ( A. bicolor pacifica ) (ABP), and European eel ( A. Anguilla )(AA) species was not detected. The European eel (AA) showed a color change from pink to light pink, but was distinct from the native eel ( A. japonica ), which showed a noticeable change from pink to yellow.
실험예 5: 임상 시료 분석Experimental Example 5: Clinical sample analysis
최적화된 비색 LAMP 분석은 토종 뱀장어(A. japonica)가 서식하는 것으로 알려진 2곳의 서로 다른 농장에서 수집한 31개의 장어 샘플. 야생 샘플 1개를 분석하여 평가하였다. 이에 따른 최적화된 비색 LAMP 분석을 사용한 임상 시료 분석 결과를 도 5에 나타내었다. 충청남도 당진의 장어 양식장에서 채취한 장어 시료 28개(1~28), 전라북도 군산 장어 양식장에서 채취한 시료 3개(29~31), 경기도 수원에서 채취한 야생 장어 시료 1개(32)에 대한 LAMP 분석 결과. 각 샘플 세트는 비주형 대조군(NTC)과 비교하여 평가하였다.The optimized colorimetric LAMP assay was performed on 31 eel samples collected from two different farms known to harbor native eels ( A. japonica ). One wild sample was analyzed and evaluated. The results of clinical sample analysis using the optimized colorimetric LAMP analysis are shown in Figure 5. LAMP for 28 eel samples (1-28) collected from an eel farm in Dangjin, Chungcheongnam-do, 3 samples (29-31) collected from an eel farm in Gunsan, Jeollabuk-do, and 1 wild eel sample (32) collected from Suwon, Gyeonggi-do. Analysis. Each sample set was evaluated compared to a non-template control (NTC).
이에 따르면, 1개 샘플(3번)를 제외한 모든 샘플에서 분홍색에서 노란색으로 뚜렷한 색상 변화를 나타냈다. 이와 같은 결과는 LAMP 분석이 토종 뱀장어(A. japonica)를 효율적으로 검출할 수 있음을 알려준다.According to this, all samples except one sample (No. 3) showed a clear color change from pink to yellow. These results show that LAMP analysis can efficiently detect native eels (A. japonica).
이상, 본 발명의 실시예들에 대하여 설명하였으나, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.Although the embodiments of the present invention have been described above, those skilled in the art can add, change, delete or add components without departing from the spirit of the present invention as set forth in the patent claims. The present invention may be modified and changed in various ways, and this will also be included within the scope of rights of the present invention.
Claims (10)
서열번호 2의 서열을 포함하는 역방향 프라이머(B3);
서열번호 3의 서열을 포함하는 정방향 내부 프라이머(FIP);
서열번호 4의 서열을 포함하는 역방향 내부 프라이머(BIP);
서열번호 5의 서열을 포함하는 정방향 루프 프라이머(LF); 및
서열번호 6의 서열을 포함하는 역방향 루프 프라이머(LB);를 포함하는 토종 뱀장어(Anguilla japonica) 식별용 LAMP 프라이머 세트.Forward primer (F3) containing the sequence of SEQ ID NO: 1;
Reverse primer (B3) containing the sequence of SEQ ID NO: 2;
Forward internal primer (FIP) comprising the sequence of SEQ ID NO: 3;
reverse internal primer (BIP) comprising the sequence of SEQ ID NO: 4;
Forward loop primer (LF) comprising the sequence of SEQ ID NO: 5; and
A LAMP primer set for identification of native eels ( Anguilla japonica ), including a reverse loop primer (LB) containing the sequence of SEQ ID NO: 6.
상기 LAMP 프라이머 세트는 토종 뱀장어(Anguilla japonica)에서 서열번호 7의 서열을 포함하는 비코딩 미토콘드리아 제어 영역(non-coding mitochondrial control region, MCR)을 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 토종 뱀장어(Anguilla japonica) 식별용 LAMP 프라이머 세트.According to paragraph 1,
The LAMP primer set is characterized in that it targets the non-coding mitochondrial control region (MCR) containing the sequence of SEQ ID NO: 7 in native eel ( Anguilla japonica ) Identification For LAMP primer set.
상기 토종 뱀장어(Anguilla japonica) 식별용 키트는 비색(colorimetric) 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 키트, 또는 형광 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 키트인 것을 특징으로 하는 토종 뱀장어(Anguilla japonica) 식별용 키트.According to paragraph 3,
The native eel ( Anguilla japonica ) identification kit is a colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP) kit, or a fluorescent loop-mediated isothermal amplification (LAMP) kit.
상기 비색(colorimetric) 루프 매개 등온 증폭(LAMP) 키트는 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 Tte UvrD 헬리카아제 중에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 토종 뱀장어(Anguilla japonica) 식별용 키트.According to clause 4,
The colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP) kit is a kit for identification of native eel ( Anguilla japonica ), characterized in that it further comprises one or more types selected from dimethyl sulfoxide (DMSO) and Tte UvrD helicase.
상기 디메틸 설폭사이드(DMSO)는 총 반응물의 4.5 내지 5.5%(v/v)로 추가되는 것을 특징으로 하는 토종 뱀장어(Anguilla japonica) 식별용 키트.According to clause 5,
A kit for identifying native eels ( Anguilla japonica ), characterized in that the dimethyl sulfoxide (DMSO) is added at 4.5 to 5.5% (v/v) of the total reactant.
상기 토종 뱀장어(Anguilla japonica)의 식별방법은 64 내지 66℃의 항온조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 토종 뱀장어(Anguilla japonica)의 식별방법.In clause 7,
An identification method of native eels ( Anguilla japonica ), characterized in that the identification method of native eels ( Anguilla japonica ) is carried out under constant temperature conditions of 64 to 66°C.
상기 토종 뱀장어(Anguilla japonica)의 식별방법은 검출 한계(LOD)가 1 내지 1000 pg/㎕인 것을 특징으로 하는 토종 뱀장어(Anguilla japonica)의 식별방법.In clause 7,
The identification method of the native eel ( Anguilla japonica ) is characterized in that the limit of detection (LOD) is 1 to 1000 pg/㎕.
상기 토종 뱀장어(Anguilla japonica)의 식별방법은 루프 매개 등온 증폭(LAMP)을 20 내지 60분 동안 수행하여 식별하는 것을 특징으로 하는 토종 뱀장어(Anguilla japonica)의 식별방법.According to clause 8,
The identification method of the native eel ( Anguilla japonica ) is characterized in that identification is performed by performing loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for 20 to 60 minutes.
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Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11276179A (en) * | 1998-03-30 | 1999-10-12 | Shizuoka Institute Of Science And Technology | Nucleic acid primer for apprasing eel speces and method for apprasing eel species using the same |
| JP2004135649A (en) * | 2002-10-16 | 2004-05-13 | Mitsuo Takano | Method for classifying young eel |
| KR20100138208A (en) * | 2009-06-24 | 2010-12-31 | 대한민국(관리부서:국립수산과학원) | Dna markers for identification of anguilla eel species |
| KR20140010617A (en) * | 2012-07-16 | 2014-01-27 | 순천향대학교 산학협력단 | Primers for distinguishing misgurnus mizolepis and method using the same |
| JP2016140289A (en) * | 2015-01-30 | 2016-08-08 | 株式会社光コーポレーション | Identification assisting method of species of eel |
| KR101720483B1 (en) * | 2016-01-11 | 2017-03-28 | 대한민국 | Peptide nucleic acids set for identifying Anguilliformes species and identifying method of Anguilliformes species using the same |
| KR102098773B1 (en) * | 2019-04-25 | 2020-04-08 | 티엔에스(주) | Primers for distinguishing Anguilla japonica from other species such as A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla and A. marmorata and detection method using Real-time PCR |
| KR20220056542A (en) | 2020-10-28 | 2022-05-06 | 임경해 | Marketing system based on indoor positioning system |
| KR102403326B1 (en) * | 2022-03-14 | 2022-05-31 | 대한민국 | Genetic markers for identify individual of Anguilla japonica and method using the same |
-
2024
- 2024-02-07 KR KR1020240018798A patent/KR102656519B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH11276179A (en) * | 1998-03-30 | 1999-10-12 | Shizuoka Institute Of Science And Technology | Nucleic acid primer for apprasing eel speces and method for apprasing eel species using the same |
| JP2004135649A (en) * | 2002-10-16 | 2004-05-13 | Mitsuo Takano | Method for classifying young eel |
| KR20100138208A (en) * | 2009-06-24 | 2010-12-31 | 대한민국(관리부서:국립수산과학원) | Dna markers for identification of anguilla eel species |
| KR20140010617A (en) * | 2012-07-16 | 2014-01-27 | 순천향대학교 산학협력단 | Primers for distinguishing misgurnus mizolepis and method using the same |
| JP2016140289A (en) * | 2015-01-30 | 2016-08-08 | 株式会社光コーポレーション | Identification assisting method of species of eel |
| KR101720483B1 (en) * | 2016-01-11 | 2017-03-28 | 대한민국 | Peptide nucleic acids set for identifying Anguilliformes species and identifying method of Anguilliformes species using the same |
| KR102098773B1 (en) * | 2019-04-25 | 2020-04-08 | 티엔에스(주) | Primers for distinguishing Anguilla japonica from other species such as A. bicolor, A. rostrata, A. anguilla and A. marmorata and detection method using Real-time PCR |
| KR20220056542A (en) | 2020-10-28 | 2022-05-06 | 임경해 | Marketing system based on indoor positioning system |
| KR102403326B1 (en) * | 2022-03-14 | 2022-05-31 | 대한민국 | Genetic markers for identify individual of Anguilla japonica and method using the same |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Spielmann, G. et al., Food Control (2019) 101:156-162 * |
| Watanabe, S. et al., Mar. Biotechnol. (2004) 6:566-574 * |
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