KR102651118B1 - Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration - Google Patents
Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration Download PDFInfo
- Publication number
- KR102651118B1 KR102651118B1 KR1020210093801A KR20210093801A KR102651118B1 KR 102651118 B1 KR102651118 B1 KR 102651118B1 KR 1020210093801 A KR1020210093801 A KR 1020210093801A KR 20210093801 A KR20210093801 A KR 20210093801A KR 102651118 B1 KR102651118 B1 KR 102651118B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- brain
- damage
- srgn
- blood
- disease
- Prior art date
Links
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 title claims abstract description 78
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 23
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 title abstract description 86
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 title abstract description 86
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 title abstract description 34
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 title description 12
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 79
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims abstract description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 90
- 101150112740 Srgn gene Proteins 0.000 claims description 59
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 53
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 27
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 25
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 claims description 23
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 claims description 18
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 claims description 14
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 14
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 claims description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 10
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims description 9
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 claims description 9
- 208000027061 mild cognitive impairment Diseases 0.000 claims description 8
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 7
- 238000010171 animal model Methods 0.000 abstract description 23
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 7
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 101150054149 ANGPTL4 gene Proteins 0.000 description 53
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 24
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 19
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 17
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 15
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 230000009525 mild injury Effects 0.000 description 10
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 101000894525 Homo sapiens Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 Proteins 0.000 description 7
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 102100021398 Transforming growth factor-beta-induced protein ig-h3 Human genes 0.000 description 7
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 7
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 7
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 101100169460 Mus musculus Cst7 gene Proteins 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 4
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 239000000091 biomarker candidate Substances 0.000 description 3
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 3
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 208000007333 Brain Concussion Diseases 0.000 description 2
- 102100028188 Cystatin-F Human genes 0.000 description 2
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 102000015340 serglycin Human genes 0.000 description 2
- 108010050065 serglycin Proteins 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 1
- 102100025674 Angiopoietin-related protein 4 Human genes 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000003174 Brain Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102400001321 Cathepsin L Human genes 0.000 description 1
- 108090000624 Cathepsin L Proteins 0.000 description 1
- 101710169749 Cystatin-F Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000693076 Homo sapiens Angiopoietin-related protein 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000916688 Homo sapiens Cystatin-F Proteins 0.000 description 1
- 101000879840 Homo sapiens Serglycin Proteins 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102000003728 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000029 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 101710150593 Protein beta Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102100037344 Serglycin Human genes 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N azane;(2e)-3-ethyl-2-[(e)-(3-ethyl-6-sulfo-1,3-benzothiazol-2-ylidene)hydrazinylidene]-1,3-benzothiazole-6-sulfonic acid Chemical compound [NH4+].[NH4+].S/1C2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N(CC)C\1=N/N=C1/SC2=CC(S([O-])(=O)=O)=CC=C2N1CC OHDRQQURAXLVGJ-HLVWOLMTSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- UBAZGMLMVVQSCD-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;molecular oxygen Chemical group O=O.O=C=O UBAZGMLMVVQSCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000006999 cognitive decline Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009514 concussion Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000035194 endochondral ossification Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001146 hypoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012216 imaging agent Substances 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000003832 immune regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 238000002610 neuroimaging Methods 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920005990 polystyrene resin Polymers 0.000 description 1
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 1
- 230000004793 poor memory Effects 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010807 real-time PCR kit Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- YVSWPCCVTYEEHG-UHFFFAOYSA-N rhodamine B 5-isothiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=C(N=C=S)C=C1C(O)=O YVSWPCCVTYEEHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N silanamine Chemical compound [SiH3]N FZHAPNGMFPVSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 102000013498 tau Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010026424 tau Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 210000001578 tight junction Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011222 transcriptome analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012285 ultrasound imaging Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 210000001631 vena cava inferior Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/35—Animals modified by environmental factors, e.g. temperature, O2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
본 발명은 뇌미세혈관 손상 뇌질환 진단용 바이오 마커 조성물, 보다 상세하게는, MRI 영상 기반으로 뇌 국소영역을 정밀하게 구분하여 해당 국소 영역에서만 혈뇌장벽 변성을 유도하여, 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌질환 동물 모델을 제조하는 방법, 상기 동물 모델을 이용한 혈뇌장벽 변성으로 인한 뇌미세혈관 손상 뇌질환 진단용 바이오 마커를 스크리닝 하는 방법 및 혈뇌장벽 변성으로 인한 뇌미세혈관 손상 뇌질환 진단용 바이오 마커 조성물에 관한 것이다. The present invention is a biomarker composition for diagnosing brain diseases caused by brain microvascular damage. More specifically, the present invention is a biomarker composition for diagnosing brain diseases caused by brain microvascular damage, by precisely dividing local brain regions based on MRI images and inducing blood-brain barrier degeneration only in the local area, thereby preventing brain diseases caused by brain microvascular damage. It relates to a method of manufacturing an animal model, a method of screening biomarkers for diagnosing brain diseases caused by brain microvascular damage due to blood-brain barrier degeneration using the animal model, and a biomarker composition for diagnosing brain diseases caused by brain microvascular damage caused by blood-brain barrier degeneration.
Description
본 발명은 뇌미세혈관 손상 뇌질환 진단용 바이오 마커 조성물, 보다 상세하게는, MRI 영상 기반으로 뇌 국소영역을 정밀하게 구분하여 해당 국소 영역에서만 혈뇌장벽 변성을 유도하여, 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌질환 동물 모델을 제조하는 방법, 상기 동물 모델을 이용한 혈뇌장벽 변성으로 인한 뇌미세혈관 손상 뇌질환 진단용 바이오 마커를 스크리닝 하는 방법 및 혈뇌장벽 변성으로 인한 뇌미세혈관 손상 뇌질환 진단용 바이오 마커 조성물에 관한 것이다. The present invention is a biomarker composition for diagnosing brain diseases caused by brain microvascular damage. More specifically, the present invention is a biomarker composition for diagnosing brain diseases caused by brain microvascular damage, by precisely dividing local brain regions based on MRI images and inducing blood-brain barrier degeneration only in the local area, thereby preventing brain diseases caused by brain microvascular damage. It relates to a method of manufacturing an animal model, a method of screening biomarkers for diagnosing brain diseases caused by brain microvascular damage due to blood-brain barrier degeneration using the animal model, and a biomarker composition for diagnosing brain diseases caused by brain microvascular damage caused by blood-brain barrier degeneration.
혈뇌장벽은 뇌와 혈관 사이에 존재하는 장벽으로, 뇌에 외부 물질이 들어오는 것을 막는다. 혈뇌장벽은 뇌에 외부 물질이 들어오는 것을 막고, 대사에 필요한 물질을 받아들여 뇌를 보호하는 역할을 한다. 예를 들어 뇌에서 세균 또는 바이러스로의 침입을 막고, 포도당 공급과 산소-이산화탄소 교환을 원활하게 한다. 혈액은 혈뇌장벽을 통해 여과되며, 결과적으로 뇌에 다다르는 물질은 물이나 기체 분자, 포도당, 특정 지용성 등 극소수이다. 혈뇌장벽은 혈관을 뇌의 내피세포로 감싸는 모양을 띄며, 내피세포는 서로 밀착 연접(tight junction)되어 있기에 세포 사이로 물질이 지나가는 것이 불가능하다. 이 때문에 혈뇌장벽은 진단을 위한 다양한 영상제뿐 아니라, 종양, 알츠하이머, 파킨슨병 등 뇌에 질병이 생겼을 때 약물이 통과하는 것을 막아 뇌 관련 진단 및 치료 기술 개발에 저해가 되고 있다. The blood-brain barrier is a barrier that exists between the brain and blood vessels, preventing foreign substances from entering the brain. The blood-brain barrier prevents foreign substances from entering the brain and protects the brain by accepting substances necessary for metabolism. For example, it prevents the invasion of bacteria or viruses in the brain, and facilitates glucose supply and oxygen-carbon dioxide exchange. Blood is filtered through the blood-brain barrier, and as a result, very few substances reach the brain, such as water, gas molecules, glucose, and certain fat-soluble substances. The blood-brain barrier appears to surround blood vessels with brain endothelial cells, and because the endothelial cells are in tight junctions, it is impossible for substances to pass between the cells. For this reason, the blood-brain barrier prevents the passage of not only various imaging agents for diagnosis but also drugs in brain diseases such as tumors, Alzheimer's, and Parkinson's diseases, impeding the development of brain-related diagnostic and treatment technologies.
최근 연구에서, 알츠하이머 치매의 최초 신호는 혈뇌장벽의 누출이라는 결과가 나왔다. 미국 서던 캘리포니아대학 의대 신경유전자 연구소(Neurogenetic Institute) 소장 베리슬라프 즐로코비치 박사 연구팀에서는 치매는 주범으로 알려진 뇌 신경세포의 독성 단백질 베타 아밀로이드의 응집(plaque)과 타우 단백질의 엉킴(tangle)과 관계없이 혈뇌장벽 누출이 독립적인 위험요인이라는 연구결과를 발표하였다. 인지기능이 정상인 노인 161명을 대상으로 5년에 걸쳐 각종 테스트를 통해 인지기능을 평가하면서 뇌 영상 검사와 뇌 척수액 분석을 통해 혈뇌장벽의 투과성을 측정한 결과, 인지기능 저하와 혈뇌장벽 누출 사이에 밀접한 연관이 있었다. 특히 기억력이 많이 떨어지는 사람일수록 말초 혈관의 혈뇌장벽 누출이 가장 심한 것으로 나타났다. 치매뿐만 아니라 파킨슨 병 등 퇴행성 뇌질환과 혈뇌장벽 손상에 대한 연관성 연구도 많이 진행 중이다. 상기 연구를 위해 치매, 파킨슨병과 같이 퇴행성 뇌질환을 연구하기 위한, 혈뇌장벽 손상으로 인한 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌질환 동물모델이 필요하다. 그러나 기존에 뇌혈관장벽에 관한 모델로 널리 사용되는 동물 모델의 경우 실시간 관찰이 어려우며 개별 세포요소의 기능을 구별하기 어렵고, 동물실험에 대한 윤리적인 문제가 지속적으로 제기됨에 따라 대안적인 동물 연구 모델이 필요한 실정이다. A recent study found that the first sign of Alzheimer's disease is a leaky blood-brain barrier. The research team of Dr. Berislav Zlokovic, director of the Neurogenetic Institute at the University of Southern California School of Medicine, found that dementia is related to plaques of the toxic protein beta amyloid and tangles of tau protein in brain neurons, which are known to be the main culprits of dementia. Research results have been published showing that blood-brain barrier leakage is an independent risk factor. As a result of evaluating the cognitive function of 161 elderly people with normal cognitive function through various tests over 5 years and measuring the permeability of the blood-brain barrier through brain imaging and cerebrospinal fluid analysis, there was a significant difference between cognitive decline and blood-brain barrier leakage. There was a close connection. In particular, it was found that people with poor memory had the most severe blood-brain barrier leakage in peripheral blood vessels. In addition to dementia, many studies are being conducted on the relationship between degenerative brain diseases such as Parkinson's disease and blood-brain barrier damage. For the above research, an animal model of brain disease caused by brain microvascular damage due to damage to the blood-brain barrier is needed to study degenerative brain diseases such as dementia and Parkinson's disease. However, in the case of animal models that are widely used as models for the blood-brain barrier, real-time observation is difficult and it is difficult to distinguish the function of individual cellular elements, and as ethical issues regarding animal testing continue to be raised, alternative animal research models are needed. It is necessary.
이에 본 발명자들은 혈뇌장벽의 손상 동물 모델을 개발하기 위해 연구를 거듭한 결과, 마우스에 초음파 에너지를 조사하여 혈뇌장벽의 변성을 유도하여 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환 마우스 모델을 제작하였고, 상기 마우스 모델의 뇌 조직에서 분리한 단백질을 분석하여 혈뇌장벽의 변성으로 인한 뇌 미세혈관 손상 뇌질환과 관련된 바이오 마커를 스크리닝한 결과, Tgfbi, Cst7, Angptl4 또는 Srgn이 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌질환과 관련된 바이오 마커임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.Accordingly, the present inventors conducted repeated research to develop an animal model of blood-brain barrier damage. As a result, they irradiated ultrasound energy to mice to induce degeneration of the blood-brain barrier and created a mouse model of brain disease caused by cerebral microvascular damage. By analyzing proteins isolated from the brain tissue of the model and screening for biomarkers related to brain diseases caused by brain microvascular damage due to degeneration of the blood-brain barrier, Tgfbi, Cst7, Angptl4, or Srgn were found to be related to brain diseases caused by brain microvascular damage. By confirming that it was a biomarker, the present invention was completed.
본 발명의 목적은 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 포함하는, 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환 진단용 바이오 마커 조성물을 제공하는데 있다. The purpose of the present invention is to provide a biomarker composition for diagnosing brain diseases caused by brain microvascular damage, comprising at least one gene selected from the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn.
본 발명의 다른 목적은 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing brain diseases caused by cerebral microvascular damage, including an agent for measuring the mRNA expression or protein activity level of any one or more genes selected from the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn. It is done.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 서술한 조성물을 포함하는 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing brain diseases caused by brain microvascular damage, comprising the composition described above.
본 발명의 또 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 스크리닝 하는 방법을 제공하는데 있다. (a) 생물학적 샘플에 임의의 화합물을 처리하는 단계; (b) 상기 생물학적 샘플로부터 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준을 확인하는 단계; 및 (c) 상기 발현 수준을 임의의 화합물을 처리하지 않은 정상 대조군에서의 상기 유전자 또는 이의 발현 단백질의 수준과 또는 활성 수준을 비교하는 단계.Another object of the present invention is to provide a method for screening a pharmaceutical composition for preventing or treating brain diseases caused by brain microvascular damage, comprising the following steps. (a) treating a biological sample with any compound; (b) confirming the expression level or activity level of one or more genes or proteins thereof selected from the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn from the biological sample; and (c) comparing the expression level with the level or activity level of the gene or its expressed protein in a normal control group not treated with any compound.
본 발명의 다른 목적은 (a) 마우스에 집속 초음파를 0.25 내지 0.27 MPa로 10초 내지 230초 동안 처리는 단계를 포함하는 optimal BBB 변성 마우스 모델을 제작하는 방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a method of producing an optimal BBB degeneration mouse model including the step of (a) treating the mouse with focused ultrasound at 0.25 to 0.27 MPa for 10 to 230 seconds.
본 발명의 다른 목적은 (a) 마우스에 집속 초음파 0.42 내지 0.44 MPa로 10초 내지 230초 동안 처리하는 단계를 포함하는 mild damaged BBB 변성 마우스 모델을 제작하는 방법을 제공하는데 있다.Another object of the present invention is to provide a method of producing a mild damaged BBB degeneration mouse model, which includes the step of (a) treating the mouse with focused ultrasound waves of 0.42 to 0.44 MPa for 10 to 230 seconds.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 포함하는 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환 진단용 바이오 마커 조성물을 제공할 수 있다. In order to achieve the above object, the present invention provides a biomarker composition for diagnosing brain diseases caused by cerebral microvascular damage, comprising at least one gene selected from the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn. can do.
본 발명은 또한 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환 진단용 조성물을 제공할 수 있다. The present invention can also provide a composition for diagnosing brain diseases caused by cerebral microvascular damage, comprising an agent for measuring the mRNA expression or protein activity level of any one or more genes selected from the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn. there is.
상기 제제는 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브일 수 있다. The agent may be a primer or probe that specifically binds to one or more genes selected from the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn.
상기 제제는 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. The agent may be an antibody that specifically binds to the protein of one or more genes selected from the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn.
본 발명은 또한 상기 서술한 조성물을 포함하는 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환 진단용 키트를 제공할 수 있다. The present invention can also provide a kit for diagnosing brain diseases caused by brain microvascular damage, comprising the composition described above.
본 발명은 또한 생물학적 시료로부터 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성 수준을 측정하는 단계를 포함하는 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환 진단을 위한 정보제공방법을 제공할 수 있다. The present invention also provides a method for diagnosing brain diseases caused by brain microvascular damage, comprising measuring the mRNA expression or protein activity level of one or more genes selected from the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn from a biological sample. Information provision methods can be provided.
본 발명은 하기의 단계를 포함하는 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 스크리닝 하는 방법을 제공할 수 있다: (a) 생물학적 샘플에 임의의 화합물을 처리하는 단계; (b) 상기 생물학적 샘플로부터 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준을 확인하는 단계; 및 (c) 상기 발현 수준을 임의의 화합물을 처리하지 않은 정상대조군에서의 상기 유전자 또는 이의 발현 단백질의 수준과 또는 활성 수준을 비교하는 단계.The present invention can provide a method for screening a pharmaceutical composition for preventing or treating brain diseases caused by brain microvascular damage, comprising the following steps: (a) treating a biological sample with an optional compound; (b) confirming the expression level or activity level of one or more genes or proteins thereof selected from the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn from the biological sample; and (c) comparing the expression level with the level or activity level of the gene or its expressed protein in a normal control group not treated with any compound.
본 발명은 (a) 마우스에 집속 초음파를 0.25 내지 0.27 MPa로 10초 내지 230초 동안 처리는 단계를 포함하는 optimal BBB 변성 마우스 모델을 제작하는 방법을 제공할 수 있다. The present invention can provide a method of producing an optimal BBB degeneration mouse model including the step of (a) treating the mouse with focused ultrasound at 0.25 to 0.27 MPa for 10 to 230 seconds.
본 발명은 (a) 마우스에 집속 초음파 0.42 내지 0.44 MPa로 10초 내지 230초 동안 처리하는 단계를 포함하는 mild damaged BBB 변성 마우스 모델을 제작하는 방법을 제공할 수 있다. The present invention can provide a method of producing a mild damaged BBB degeneration mouse model, including the step of (a) treating the mouse with focused ultrasound waves of 0.42 to 0.44 MPa for 10 to 230 seconds.
본 발명은 집속 초음파를 마우스에 조사하여 혈뇌장벽(blood-brain barrier; BBB)의 개통으로 인한 뇌 미세혈관 손상 뇌 질환 마우스 모델을 제작하였다. 또한 상기 집속 초음파의 세기를 조절하여 혈뇌장벽의 개통 정도를 조절 하였고, 상기 조절로 경도 손상(optimal damage) 및 중등 손상(mild damage)를 일으켜, optimal BBB 변성 마우스 모델 및 mild BBB 변성 마우스 모델을 제작 하였다. 상기 mild BBB 변성 마우스의 뇌를 가지고, 생물학적 분석 방법인 transcriptome sequencing analysis를 진행하여, BBB의 변성으로 인한 뇌질환 진단 마커를 발굴한 결과 Tgfbi, Cst7, Angptl4 또는 Srgn이 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환을 진단할 수 있다는 것을 확인하였다. 상기 시험결과를 바탕으로 optimal BBB 변성 동물 모델 및 mild BBB 변성 동물 모델의 혈액에서 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn의 발현 정도를 확인인한 결과 증가하는 것을 확인하였다. 상기의 결과를 토대로 Tgfbi, Cst7, Angptl4 또는 Srgn을 이용하여 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환, 예를 들어 치매, 뇌암, 파킨슨, 뇌진탕 (TBI) 또는 뇌졸중을 진단 할 수 있는 효과가 있다. The present invention irradiated focused ultrasound to mice to create a mouse model of brain disease in which brain microvascular damage occurs due to opening of the blood-brain barrier (BBB). In addition, the degree of patency of the blood-brain barrier was adjusted by adjusting the intensity of the focused ultrasound, and the adjustment caused optimal damage and mild damage, creating an optimal BBB degeneration mouse model and a mild BBB degeneration mouse model. did. Using the brain of the mouse with mild BBB degeneration, transcriptome sequencing analysis, a biological analysis method, was performed to discover diagnostic markers for brain diseases caused by BBB degeneration. As a result, Tgfbi, Cst7, Angptl4, or Srgn were detected in brain diseases caused by brain microvascular damage. It was confirmed that diagnosis can be made. Based on the above test results, the expression levels of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn were confirmed to be increased in the blood of optimal BBB degeneration animal model and mild BBB degeneration animal model. Based on the above results, it is possible to diagnose brain diseases caused by brain microvascular damage, such as dementia, brain cancer, Parkinson's, concussion (TBI), or stroke, using Tgfbi, Cst7, Angptl4, or Srgn.
도 1은 집속 초음파를 이용한 BBB 개통 동물모델을 제작하는 방법의 모식도이다.
도 2는 자기공명영상장치를 이용하여 집속 초음파를 이용한 BBB 동물모델의 BBB 변성 정도를 확인한 결과이다.
도 3은 유전체 분석을 통한 BBB 변성 뇌 조직에서 유전자 발현의 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 유전체 분석 결과를 바탕으로 혈액 바이오 마커 후보를 선정한 결과이다.
도 5는 BBB 동물모델의 혈에서 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn의 발현 정도를 각각 확인한 결과이다. Figure 1 is a schematic diagram of a method for producing a BBB opening animal model using focused ultrasound.
Figure 2 shows the results of confirming the degree of BBB degeneration in a BBB animal model using focused ultrasound using a magnetic resonance imaging device.
Figure 3 shows the results of confirming changes in gene expression in BBB degenerated brain tissue through genome analysis.
Figure 4 shows the results of selecting blood biomarker candidates based on the genome analysis results.
Figure 5 shows the results of confirming the expression levels of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn in the blood of a BBB animal model, respectively.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명은 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 포함하는 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환 진단용 바이오 마커 조성물을 제공할 수 있다. The present invention can provide a biomarker composition for diagnosing brain diseases caused by brain microvascular damage, including any one or more genes selected from the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn.
혈뇌장벽은 뇌와 혈관 사이에 존재하는 장벽으로, 뇌에 외부 물질이 들어오는 것을 막는다. 최근 연구에서 혈뇌장벽 누출이 독립적인 위험요인이라는 연구결과가 발표되었다. 따라서 치매, 파킨슨병과 같은 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌질환을 연구하기 위해, 혈뇌장벽 손상 동물모델이 필요하다. 그러나 기존에 뇌혈관장벽에 관한 모델로 널리 사용되는 동물 모델의 경우 실시간 관찰이 어려우며 개별 세포요소의 기능을 구별하기 어렵고, 동물실험에 대한 윤리적인 문제가 지속적으로 제기됨에 따라 대안적인 동물 연구 모델이 필요한 실정이다. 이에 본 발명자들은 집속 초음파를 마우스에 조사하여 혈뇌장벽(blood-brain barrier; BBB)의 개통 모델을 제작하였다. 특정 집속 초음파의 세기를 조절하여 혈뇌장벽의 개통 정도를 조절 하였고, 상기 조절로 경도 손상(optimal damage) 및 중등 손상(mild damage)을 일으켜, optimal BBB 변성 마우스 모델 및 mild BBB 변성 마우스 모델을 제작하였다. 상기 mild BBB 변성 마우스의 뇌를 가지고, 생물학적 분석 방법인 transciptome sequencing analysis를 진행하여, 뇌 미세혈관 손상으로 인한 뇌질환 진단 마커를 발굴하였다. BBB의 손상이 중반 정도로 예상할 수 있는 mild damage BBB 조건에서 RNA sequencing 분석 결과를 통해 시간에 따른 유전자 발현 변화를 control 그룹과 비교하였을 때, 48시간 째 약 518개의 유전자가 증가되었고 174개의 유전자가 감소되는 경향을 나타내었다 (도 3). 상기의 결과를 바탕으로 mild damage BBB 조건에서의 혈액 바이오 마커 후보군을 선정하였다. 518개의 유전자중 Control 대비 3배 이상 증가되고 혈액에서 검출할 수 있는 수용성의 단백질을 코딩하고 있는 4개(Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn)의 유전자를 후보군으로 선정하였다. 상기 유전자 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn의 경우에는 optimal BBB 변성 마우스 모델 및 mild BBB 변성 마우스 모델의 혈액에서 확인한 결과, Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn의 발현은 optimal condition과 mild damaged condition에서 BBB 개통 후 시간이 지남에 따라 점차 증가함을 알 수 있다. 이를 통해 뇌미세혈관 손상에 의한 뇌질환의 혈액 바이오 마커 발굴 가능성을 확인하였다 (도 5). The blood-brain barrier is a barrier that exists between the brain and blood vessels, preventing foreign substances from entering the brain. Recent research has shown that blood-brain barrier leakage is an independent risk factor. Therefore, to study brain diseases caused by brain microvascular damage, such as dementia and Parkinson's disease, an animal model of blood-brain barrier damage is needed. However, in the case of animal models that are widely used as models for the blood-brain barrier, real-time observation is difficult and it is difficult to distinguish the function of individual cellular elements, and as ethical issues regarding animal testing continue to be raised, alternative animal research models are needed. It is necessary. Accordingly, the present inventors created a model for opening the blood-brain barrier (BBB) by irradiating focused ultrasound to mice. The degree of patency of the blood-brain barrier was controlled by adjusting the intensity of a specific focused ultrasound, and the adjustment caused optimal damage and mild damage, creating an optimal BBB degeneration mouse model and a mild BBB degeneration mouse model. . Using the brain of the mild BBB degeneration mouse, transciptome sequencing analysis, a biological analysis method, was performed to discover diagnostic markers for brain disease caused by brain microvascular damage. When comparing gene expression changes over time with the control group through RNA sequencing analysis results under mild damage BBB conditions, where BBB damage can be expected to be moderate, about 518 genes were increased and 174 genes were decreased at 48 hours. showed a tendency to become (Figure 3). Based on the above results, blood biomarker candidates under mild damage BBB conditions were selected. Among the 518 genes, four genes (Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn), which were increased more than 3 times compared to the control and encoded water-soluble proteins that could be detected in blood, were selected as candidates. In the case of the genes Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn, the results were confirmed in the blood of an optimal BBB degeneration mouse model and a mild BBB degeneration mouse model. As a result, the expression of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn was determined at the time after BBB opening under optimal and mild damaged conditions. It can be seen that it gradually increases over time. Through this, the possibility of discovering blood biomarkers for brain diseases caused by brain microvascular damage was confirmed (Figure 5).
본 발명에 있어서, TGFBI(Transforming growth factor beta induced)는, 단백질은 세포-콜라겐 상호 작용에 역할을 하며 연골 내 골 형성에 관여하는 것으로 알려져있으나, 상기 유전자의 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환의 상관관계에 대해서는 전혀 개시되어 있지않다. 본 발명의 TGFBI의 정보는 예를 들어 NCBI gene ID NM_000358.3(Human), NM_009369.5(Mouse)에 개시된 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, TGFBI (Transforming growth factor beta induced) is a protein that plays a role in cell-collagen interaction and is known to be involved in endochondral bone formation. However, the gene is implicated in brain diseases caused by brain microvascular damage. The relationship is not disclosed at all. Information on TGFBI of the present invention is preferably disclosed in, for example, NCBI gene ID NM_000358.3 (Human), NM_009369.5 (Mouse), but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, Cst7(Cystatin-F)은 파파인(papain)과 카텝신 L(cathepsin L)을 억제하는 것으로 알려져있으며, 조혈계에서 표적을 억제하여 면역 조절에 관여하는 것으로 알려져있으나, 상기 유전자의 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환의 상관관계에 대해서는 전혀 알려진 바 없다. 본 발명의 Cst7의 정보는 예를 들어 NCBI gene ID NM_003650.4(Mouse ,Human)에 개시된 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the present invention, Cst7 (Cystatin-F) is known to inhibit papain and cathepsin L, and is known to be involved in immune regulation by suppressing targets in the hematopoietic system. There is absolutely nothing known about the correlation between brain diseases caused by brain microvascular damage. Information on Cst7 of the present invention is preferably disclosed in, for example, NCBI gene ID NM_003650.4 (Mouse, Human), but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, Angptl4 (Angiopoietin like 4)은 다양한 세포의 저산소 조건에서 유도되며 Peroxisome proliferator-activated receptor의 표적이 된다. 그러나 상기 유전자의 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환의 상관관계에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않다. 본 발명의 Angptl4의 정보는 예를 들어 NCBI ID NM_001039667.3(Human), NM_016109, NM_139314.3(Human) 또는 NM_020581.2(Mouse)에 개시된 것이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, Angptl4 (Angiopoietin like 4) is induced under hypoxic conditions in various cells and is a target of peroxisome proliferator-activated receptor. However, there is no disclosure at all about the correlation between the above genes and brain diseases caused by damage to cerebral microcirculation. Information on Angptl4 of the present invention is preferably disclosed in, for example, NCBI ID NM_001039667.3 (Human), NM_016109, NM_139314.3 (Human), or NM_020581.2 (Mouse), but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, Srgn (Serglycin)은 조혈 프로테오글리칸 코어 단백질 또는 분비 과립 프로테오글리칸 코어 단백질로도 알려져 있으며, 이는 주로 조혈 세포와 내피 세포에서 발현되는 세포 내 프로테오글리칸으로 알려져 있다. 그러나 상기 유전자의 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환의 상관관계에 대해서는 전혀 개시되어 있지 않다. 본 발명의 Srgn의 정보는 예를 들어 NCBI gene ID NM_002727.4(Human), NM_001321053.2(Human), NM_001321054.1(Human), NM_001358965.1(Mouse) 또는 NM_011157.3(Mouse)에 개시된 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. In the present invention, Srgn (Serglycin) is also known as hematopoietic proteoglycan core protein or secretory granule proteoglycan core protein, and is known as an intracellular proteoglycan mainly expressed in hematopoietic cells and endothelial cells. However, there is no disclosure at all about the correlation between the above genes and brain diseases caused by damage to cerebral microcirculation. Information on Srgn of the present invention is, for example, disclosed in NCBI gene ID NM_002727.4 (Human), NM_001321053.2 (Human), NM_001321054.1 (Human), NM_001358965.1 (Mouse) or NM_011157.3 (Mouse). It is desirable, but not limited thereto.
본 발명에 있어서, '진단'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단이란 뇌 미세혈관의 손상으로 인한 뇌질환의 발병 여부를 확인하는 것이다. 상기 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환은 바람직하게는 치매, 알츠하이머, 파킨슨 경도인지장애 ( mild cognitive impairment) 및 경도의 외상성뇌질환 (MTBI, mild traumatic brain injury)이 포함될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 뇌미세혈관 손상은 뇌혈관장벽의 개통 또는 누출로 발생하는 것일 수 있다. In the present invention, 'diagnosis' means confirming the presence or characteristics of a pathological condition. For the purpose of the present invention, diagnosis refers to confirming the occurrence of brain disease due to damage to brain microcirculation. Brain diseases caused by damage to the cerebral microvessels preferably include, but are not limited to, dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, mild cognitive impairment, and mild traumatic brain injury (MTBI). Additionally, the brain microvascular damage may be caused by opening or leakage of the blood-brain barrier.
본 발명에 있어서, '바이오 마커'란 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환을 진단할 수 있는 물질, 즉 생물학적 시료에서 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌질환의 발생 여부를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 개체와 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌질환 개체 간의 유의적인 차이를 보이는 폴리펩타이드, 핵산 (예:mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상 바이오 마커는 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 mild BBB 변성 마우스 모델에서 시간이 경과함에 따라 증가하는 바, Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 증가된 발현 정도가 뇌미세혈관 손상으로 인한 뇌 질환의 발병을 뒷받침한다. In the present invention, a 'biomarker' is a substance that can diagnose brain disease caused by brain microvascular damage, that is, a substance that can diagnose the occurrence of brain disease caused by brain microvascular damage in a biological sample. Organic organisms such as polypeptides, nucleic acids (e.g. mRNA, etc.), lipids, glycolipids, glycoproteins, sugars (monosaccharides, disaccharides, oligosaccharides, etc.) that show significant differences between normal subjects and those with brain disease caused by brain microvascular damage. Includes molecules, etc. For the purpose of the present invention, a biomarker is one or more genes selected from the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn, which increase over time in a mouse model of mild BBB degeneration. An increased expression level of any one or more genes selected from the group supports the development of brain disease due to brain microvascular damage.
본 발명의 목적상 바이오 마커는 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자로, mild BBB 변성 동물모델에서 시간에 따라서 발현이 증가된 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 증가된 발현 정도가 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환의 발병을 뒷받침한다.For the purpose of the present invention, a biomarker is one or more genes selected from the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn, the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn, the expression of which increased over time in an animal model of mild BBB degeneration. The increased expression level of one or more genes selected from supports the development of brain disease due to damage to cerebral microvasculature.
본 발명은 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성 수준을 측정하는 제제를 포함하는 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환 진단용 조성물을 제공할 수 있다. The present invention can provide a composition for diagnosing brain diseases caused by damage to cerebral microvasculature, including an agent for measuring the mRNA expression or protein activity level of any one or more genes selected from the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn. there is.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자는 건강한 정상인에 비하여 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환 모델에서 유의하게 증가하는 바, 이의 유전자 mRNA 발현 또는 이의 단백질 수준을 측정함으로써 퇴행성 뇌질환의 진단이 가능하다. According to one embodiment of the present invention, any one or more genes selected from the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn of the present invention are significantly increased in a brain disease model caused by damage to cerebral microvasculature compared to healthy normal people. , it is possible to diagnose degenerative brain disease by measuring its gene mRNA expression or its protein level.
본 발명에 있어서, Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 수준의 측정은 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환의 진단을 위하여 생물학적 시료에서 바이오 마커 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 표적 유전자부터 전사된 mRNA의 수준을 측정하는 방법에 사용되는 제제를 이용해 mRNA의 양을 측정한다. 구체적으로 본 발명에서 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브이며, Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 염기 서열이 유전자 은행에 등록되어 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 디자인 할 수 있다. In the present invention, the measurement of the mRNA expression level of one or more genes selected from the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn is used to determine the presence of a biomarker gene in a biological sample for the diagnosis of brain diseases caused by damage to cerebral microvasculature. As a process to check the presence and expression level, the amount of mRNA is measured using an agent used to measure the level of mRNA transcribed from the target gene. Specifically, in the present invention, the agent for measuring the mRNA level of any one or more genes selected from the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn is preferably an antisense oligonucleotide, a primer pair, or a probe, and Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn. Since the base sequence of one or more genes selected from the group consisting of is registered in the gene bank, a person skilled in the art can design an antisense oligonucleotide, primer pair, or probe that specifically amplifies a specific region of these genes based on the sequence. there is.
본 발명에 있어서, Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 단백질 활성 수준 측정은 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환의 진단을 위하여 생물학적 시료에서 바이오 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용해 단백질의 양을 확인할 수 있다. In the present invention, measuring the protein activity level of one or more genes selected from the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn is used to determine the presence of a biomarker protein in a biological sample for the purpose of diagnosing brain diseases caused by damage to cerebral microvasculature. In the process of confirming the level of expression, the amount of protein can preferably be confirmed using an antibody that specifically binds to the protein of one or more genes selected from the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn.
상기 항체는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 지칭하는 것으로, 본 발명의 목적상 항체는 Tgfbi, Cst7, Angptl4 또는 Srgn에 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어 질 수 있는 부분 펩티드도 포함된다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수항체도 포함된다. The antibody is a term known in the art and refers to a specific protein molecule directed to an antigenic site. For the purposes of the present invention, an antibody refers to an antibody that specifically binds to Tgfbi, Cst7, Angptl4 or Srgn. , these antibodies can be produced by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method to obtain a protein encoded by the gene, and from the obtained protein by a conventional method. This also includes partial peptides that can be made from the above proteins. The form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and as long as it is a polyclonal antibody, monoclonal antibody, or has antigen binding properties, a portion thereof is also included in the antibody of the present invention, and all immunoglobulin antibodies are included. Furthermore, the antibodies of the present invention also include special antibodies such as humanized antibodies.
본 발명은 상기 서술한 조성물을 포함하는 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환 진단용 키트를 제공할 수 있다. The present invention can provide a kit for diagnosing brain diseases caused by damage to cerebral microcirculation, including the composition described above.
본 발명의 키트에는 Tgfbi, Cst7, Angptl4 또는 Srgn 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성 수준을 측정하는 제제 외에, 분석방법에 적합한 한 종류 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있으며, 어떠한 형태로든 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. In addition to the agent for measuring the mRNA expression or protein activity level of the Tgfbi, Cst7, Angptl4 or Srgn genes, the kit of the present invention may include one or more other component compositions, solutions or devices suitable for the analysis method, and may be used in any form. It does not limit the scope of the present invention.
구체적인 일례로서, 본 발명에서 상기 Tgfbi, Cst7, Angptl4 또는 Srgn 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(우센), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. As a specific example, in the present invention, the kit for measuring the mRNA expression level of the Tgfbi, Cst7, Angptl4, or Srgn genes may be a kit containing the essential elements required to perform RT-PCR. The RT-PCR kit contains test tubes or other suitable containers, reaction buffer, deoxynucleotides (Ussen), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNase inhibitors, DEPC-, in addition to a specific primer pair for the marker gene. It may include water (DEPC-water), sterilized water, etc.
또한, 본 발명의 키트는 마이크로어레이 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 마이크로어레이 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있으며, 본 발명의 마커를 이용 하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 마이크로어레이 칩을 제작하기 위해서, 상기 탐색된 마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-Llysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.Additionally, the kit of the present invention may be a kit containing essential elements required to operate a microarray chip. The microarray chip kit includes a substrate to which a cDNA corresponding to a gene or a fragment thereof is attached as a probe, and the substrate may include a cDNA corresponding to a quantitative control gene or a fragment thereof, using the marker of the present invention. It can be easily manufactured by a manufacturing method commonly used in the industry. In order to manufacture a microarray chip, the searched marker is used as a probe DNA molecule and immobilized on the substrate of the DNA chip using a micropipetting method using a piezoelectric method or pin type. It is preferable to use a method using a spotter, but it is not limited to this. The substrate of the microarray chip is preferably coated with an active group selected from the group consisting of amino-silane, poly-Llysine, and aldehyde, but is not limited thereto. . In addition, the substrate is preferably selected from the group consisting of slide glass, plastic, metal, silicon, nylon membrane, and nitrocellulose membrane, but is not limited thereto.
또한, 본 발명에서 상기 Tgfbi, Cst7, Angptl4 또는 Srgn 단백질 활성 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충 용액, 발색 효소 또는 형광 물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.In addition, in the present invention, the kit for measuring the level of Tgfbi, Cst7, Angptl4 or Srgn protein activity includes a substrate, an appropriate buffer solution, a secondary antibody labeled with a chromogenic enzyme or a fluorescent substance, and a chromogenic substrate for immunological detection of the antibody. It may include etc. In the above, the substrate may be a nitrocellulose membrane, a 96-well plate synthesized from polyvinyl resin, a 96-well plate synthesized from polystyrene resin, and a glass slide glass, and the coloring enzyme may be peroxidase or alkaline phosphatase. Fatase (alkaline phosphatase), etc. can be used, the fluorescent substance can be FITC, RITC, etc., and the coloring substrate solution is ABTS (2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphate). Ponic acid)), OPD (o-phenylenediamine), or TMB (tetramethyl benzidine) may be used, but are not limited thereto.
본 발명은 또한 생물학적 시료로부터 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환 진단을 위한 정보제공방법을 제공할 수 있다. The present invention also provides a diagnosis of brain disease caused by damage to cerebral microvasculature, comprising the step of measuring the mRNA expression or protein activity level of one or more genes selected from the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn from a biological sample. A method of providing information can be provided.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 집속초음파 조사에 따른 BBB 개통후 시간에 따른 생물학적 반응을 확인하기 위해서 시간에 따라 (1시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간) mild BBB 변성 뇌조직을 획득한 후, RNA sequencing 분석 결과를 통해 시간에 따른 유전자 발현 변화를 control 그룹과 비교하였을 때, 48시간 째 약 518개의 유전자가 증가되었고 174개의 유전자가 감소되는 경향을 나태었고, 518개의 유전자중 Control 대비 3배 이상 증가되고 혈액에서 검출할 수 있는 soluble form의 단백질을 coding 하고 있는 4개(Tgfbi, Cst7, Angptl4 또는 Srgn)의 유전자를 선정한 바, 생물학적 시료에서 Tgfbi, Cst7, Angptl4 또는 Srgn의 발현 비교 분석을 통해 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환의 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다. According to one embodiment of the present invention, mild BBB degenerated brain tissue was examined over time (1 hour, 6 hours, 12 hours, 24 hours, 48 hours) to confirm the biological response over time after BBB opening following focused ultrasound irradiation. After obtaining, when comparing gene expression changes over time with the control group through RNA sequencing analysis results, about 518 genes showed an increase and 174 genes showed a tendency to decrease at 48 hours, and among the 518 genes, Four genes (Tgfbi, Cst7, Angptl4 or Srgn) were selected that encode proteins in soluble form that are increased more than 3 times compared to the control and can be detected in blood. Expression of Tgfbi, Cst7, Angptl4 or Srgn in biological samples Comparative analysis can provide information for the diagnosis of brain diseases caused by damage to cerebral microcirculation.
본 발명에 있어서, 진단을 위한 정보제공방법은 진단을 위한 예비적 단계로써 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환의 진단을 위하여 필요한 객관적인 기초정보를 제공하는 것이며 의사의 임상학적 판단 또는 소견은 제외된다. In the present invention, the method of providing information for diagnosis is a preliminary step for diagnosis and provides objective basic information necessary for diagnosis of brain disease caused by damage to cerebral microcirculation, excluding the doctor's clinical judgment or opinion. .
본 발명에 있어서, '생물학적 시료'란 개체로부터 분리되어 목적 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 직접적인 대상을 의미하고, 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 시료란 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환 의심 개체에서 뇌 질환의 발병 여부를 진단하기 위한 시료로서, 바람직하게는 혈액일 수 있다. In the present invention, 'biological sample' refers to a direct object isolated from an individual and measuring the expression level of a target gene or protein, and includes samples such as tissue, cells, whole blood, serum, plasma, saliva, or urine. . For example, the sample of the present invention is a sample for diagnosing the onset of a brain disease in an individual suspected of having a brain disease due to damage to cerebral microcirculation, and is preferably blood.
본 발명에 있어서, 'mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 분석 방법'에는 중합효소반응(PCR), 역전사 중합효소반응 (RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Realtime RT-PCR), RNase 보호분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), 또는 DNA 마이크로어레이 분석법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the 'analysis method for measuring the level of mRNA expression' includes polymerase reaction (PCR), reverse transcription polymerase reaction (RT-PCR), competitive reverse transcription polymerase reaction (Competitive RT-PCR), and real-time reverse transcription polymerase reaction. Examples include, but are not limited to, realtime RT-PCR, RNase protection assay (RPA), northern blotting, or DNA microarray analysis.
본 발명에 있어서, '단백질 활성 수준을 측정하기 위한 분석 방법'에는 웨스턴 블랏팅(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법 (Radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역 침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), 유세포분석법 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 또는 단백질 칩(protein chip) 분석법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. In the present invention, the 'analytical method for measuring the level of protein activity' includes Western blotting, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay, radioimmunodiffusion, and uctero. Ouchterlony immunodiffusion assay, Rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complete fixation assay, Fluorescence Activated Cell Sorter (FACS), or protein chip ( protein chip) analysis method, etc., but is not limited to this.
본 발명의 방법은 상기 측정된 Tgfbi, Cst7, Angptl4 또는 Srgn 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성 수준을 대조군에서 측정된 수준과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 대조군은 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환이 발명하지 않은 건강한 사람이다. 이에 따라 본 발명의 방법은 Tgfbi, Cst7, Angptl4 또는 Srgn 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성 수준이 대조군 보다 높을 경우, 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환이 진행 중이거나 이미 발병하였을 것으로 판단 할 수 있다. The method of the present invention may include comparing the measured mRNA expression or protein activity level of the Tgfbi, Cst7, Angptl4 or Srgn genes with the level measured in the control group. The control group was a healthy person who did not develop brain disease due to damage to cerebral microcirculation. Accordingly, in the method of the present invention, if the mRNA expression or protein activity level of the Tgfbi, Cst7, Angptl4 or Srgn genes is higher than the control group, it can be determined that brain disease due to damage to cerebral microvasculature is in progress or has already developed. .
(a) 생물학적 샘플에 임의의 화합물을 처리하는 단계; (b) 상기 생물학적 샘플로부터 Tgfbi, Cst7, Angptl4 및 Srgn으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준 또는 활성 수준을 확인하는 단계; 및 (c) 상기 발현 수준을 임의의 화합물을 처리하지 않은 정상대조군에서의 상기 유전자 또는 이의 발현 단백질의 수준과 또는 활성 수준을 비교하는 단계; 를 포함하는 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 스크리닝 하는 방법을 제공할 수 있다. (a) treating a biological sample with any compound; (b) confirming the expression level or activity level of one or more genes or proteins thereof selected from the group consisting of Tgfbi, Cst7, Angptl4, and Srgn from the biological sample; and (c) comparing the expression level with the level or activity level of the gene or its expressed protein in a normal control group not treated with any compound; It is possible to provide a method for screening a pharmaceutical composition for preventing or treating brain diseases caused by damage to cerebral microcirculation, including:
본 발명에 있어서, 스크리닝은 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환의 치료 효과를 가지는 물질을 선별하는 조작에 관한 것이다. In the present invention, screening relates to an operation to select a substance that has a therapeutic effect for brain diseases caused by damage to brain microcirculation.
본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 후보물질은 뇌 질환의 치료 활성을 테스트할 물질을 의미하며, 예컨대 추출물, 단백질, 올리고펩티드, 소형 유기 분자, 다당류, 폴리뉴클레오티드 및 광범위한 화합물 들의 임의 분자를 포함할 수 있다. 이러한 후보 물질은 천연물질뿐 아니라, 합성 물질도 포함한다. In the present invention, the candidate material in step (a) refers to a material to be tested for therapeutic activity in brain diseases, such as extracts, proteins, oligopeptides, small organic molecules, polysaccharides, polynucleotides, and any molecule of a wide range of compounds. It can be included. These candidates include natural as well as synthetic substances.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 Tgfbi, Cst7, Angptl4 또는 Srgn 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성 수준을 측정하는 단계는 시료에서 후보물질 처리에 의한 Tgfbi, Cst7, Angptl4 또는 Srgn을 암호화하는 핵산 또는 Tgfbi, Cst7, Angptl4 또는 Srgn 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정이다. In the present invention, the step of measuring the mRNA expression or protein activity level of the Tgfbi, Cst7, Angptl4 or Srgn gene in step (b) is a nucleic acid encoding Tgfbi, Cst7, Angptl4 or Srgn by treating the candidate material in the sample. Alternatively, it is a process to check the presence and expression level of Tgfbi, Cst7, Angptl4, or Srgn proteins.
본 발명의 스크리닝 방법은 (c) 상기 (b) 단계에서 측정한 Tgfbi, Cst7, Angptl4 또는 Srgn 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 활성이 상기 후보물질을 처리하지 않은 대조군의 Tgfbi, Cst7, Angptl4 또는 Srgn 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질의 활성보다 낮은 경우, 후보물질을 뇌 질환의 치료제로 판단하는 단계를 추가로 더 포함할 수 있다. 다시 말해, 후보물질의 처리에 의해 Tgfbi, Cst7, Angptl4 또는 Srgn 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질의 활성이 후보물질 비처리군의 Tgfbi, Cst7, Angptl4 또는 Srgn의 mRNA 발현 또는 이의 단백질의 활성보다 낮아지는 경우 상기 후보물질을 뇌 질환 치료제로 판단할 수 있고, 그와 반대로 Tgfbi, Cst7, Angptl4 또는 Srgn 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질의 활성이 후보물질 비처리군의 Tgfbi, Cst7, Angptl4 또는 Srgn 유전자의 mRNA 발현 또는 이의 단백질 활성량과 비슷하거나 보다 높아지는 경우 뇌미세혈관의 손상으로 인한 뇌 질환 치료제로 사용할 수 없다 판단 할 수 있다. The screening method of the present invention is (c) the activity of the mRNA or protein thereof of the Tgfbi, Cst7, Angptl4 or Srgn gene measured in step (b) above is determined by the Tgfbi, Cst7, Angptl4 or Srgn gene of the control group not treated with the candidate substance. If the mRNA expression or activity of its protein is lower, a step of determining the candidate substance as a treatment for brain disease may be further included. In other words, treatment of the candidate material causes the mRNA expression or protein activity of the Tgfbi, Cst7, Angptl4 or Srgn genes to be lower than the mRNA expression or protein activity of Tgfbi, Cst7, Angptl4 or Srgn in the group not treated with the candidate material. In this case, the candidate substance can be judged as a treatment for brain disease, and on the contrary, the mRNA expression of the Tgfbi, Cst7, Angptl4 or Srgn gene or the protein activity thereof can be determined by the mRNA expression of the Tgfbi, Cst7, Angptl4 or Srgn gene in the group not treated with the candidate substance. If the expression or protein activity level is similar to or higher than that, it can be judged that it cannot be used as a treatment for brain diseases caused by damage to brain microcirculation.
(a) 마우스에 집속 초음파를 0.25 내지 0.27 MPa로 10초 내지 230초 동안 처리는 단계를 포함하는 optimal BBB 변성 마우스 모델을 제작하는 방법을 제공할 수 있다. A method of producing an optimal BBB degeneration mouse model can be provided, which includes the step of (a) treating the mouse with focused ultrasound at 0.25 to 0.27 MPa for 10 to 230 seconds.
본 발명은 (a) 마우스에 집속 초음파 0.42 내지 0.44 MPa로 10초 내지 230초 동안 처리하는 단계를 포함하는 mild BBB 변성 마우스 모델을 제작하는 방법을 제공할 수 있다. The present invention can provide a method of producing a mild BBB degeneration mouse model, which includes the step of (a) treating the mouse with focused ultrasound waves of 0.42 to 0.44 MPa for 10 to 230 seconds.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.Redundant content is omitted in consideration of the complexity of the present specification, and terms not otherwise defined in the present specification have meanings commonly used in the field to which the present invention pertains.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시 예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, the following examples are only for illustrating the content of the present invention and are not intended to limit the present invention.
BBB변성 모델의 제작 Construction of BBB degeneration model
만성 퇴행성 뇌질환은 대부분의 경우 BBB의 손상으로 인해 그 결합이 느슨해져 있다. 이에 본 연구진들은 집속 초음파를 이용하여 BBB의 개통 유도하였다. 뇌질환의 BBB 변성 정도를 조절하여, 퇴행성 뇌질환 모델의 초기 BBB 손상 정도의 동물 모델과 퇴행성 뇌질환 모델의 중기 BBB 손상 정도의 동물 모델을 제작하였다. 8주령의 ICR mice를 이용하여 집속 초음파 유도 BBB 개통 동물 모델을 제작하였다. MRgFUS 기기를 이용한 초음파 처리는 FUS 기기(RK-100)를 사용하였으며, 도 1에 기기 구성의 개략도가 나타나 있다. MR 영상유도 집중초음파 시스템은 도 1에 개략도가 나타나 있다. 시스템은 초음파 컨트롤 시스템과 초음파 조사 시스템 (MR 환경 호환)으로 이루어져 있다. 구체적으로 초음파 컨트롤 시스템은 초음파 변환기에 RF 파워를 전달할 수 있는 fuction generator와 RF amplifier로 이루어져 있으며 초음파 변환기에 전달되는 power를 실시간으로 측정할 수 있는 power meter로 구성되어 있다. 초음파 조사 시스템은 초음파 변환기, 초음파 변환기를 3차원으로 정밀 제어 할 수 있는 3축 제어부, water tank로 구성되어 MRI 장비 환경 내에서도 구동가능하게 설계되어 있다. MR 영상유도 집중초음파 시스템은 Bruker 9.4T MRI (BioSpec 94/20 USR - 9.4T, Bruker, MA, USA) 시스템과 연동되어 있다. 구체적인 실험 프로토콜은 초음파 영상 진단용 조영제인 미소기포(DEFINITY®)를 생리식염수에 1:50의 비율로 희석하여 0.012ml/s의 속도로 동물의 정맥에 주입한다. 희석된 미소기포를 주입하는 동안 1s에 10ms의 burst length를 가지는 집속 초음파를 MR영상 기반으로 원하는 뇌 지역에 2분간 조사하였다. MR 영상을 통해 MR 조영제 주입 전과 주입 후 영상을 비교하여 BBB 개폐를 확인할 수 있다. 뇌질환의 BBB 변성 정도에 따른 바이오 마커를 발굴하기 위해 optimal damage (0.25~0.27 MPa) 조건과 mild damage BBBD (0.42-0.44 MPa)조건의 초음파 에너지를 ICR mice의 뇌의 thalmus 부위에 조사하여 BBB 변성을 유도하였다. 초음파 조사조건은 중심주파수 1.1 MHz를 이용하여 RFP는 1Hz, 120초동안 조사하였다 (도 1). optimal damage (0.25~0.27 MPa) 조건과 mild damage BBBD (0.42-0.44 MPa)조건의 마우스의 MR영상을 확인하였다 (도 2). MR image는 BBB 개통후 조영제를 투여하고, 시간에 따른 enhancement 정도를 확인하였으며, 관상면(coronal), 축상면(axial) 그리고 시상면 (sagittal) 방향으로 이미지를 획득하였다. MR 조영제 투과정도에 따른 intensity 측정을 통해 optimal(~50%) 및 mild (~100%) BBB 조건으로 실험을 진행하였다. 집속초음파 조사에 따른 BBB 개통후 시간에 따른 생물학적 반응을 확인하기 위해서 시간에 따라 (1시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간) BBB 변성 뇌조직을 획득하였으며, 각 그룹의 mouse에서 혈액을 약 1ml 채취하여 혈청을 분리하였다. In most cases of chronic degenerative brain disease, the bond is loosened due to damage to the BBB. Therefore, our researchers induced the opening of the BBB using focused ultrasound. By controlling the degree of BBB degeneration in the brain disease, an animal model showing the initial BBB damage in the degenerative brain disease model and an animal model showing the mid-stage BBB damage in the degenerative brain disease model were created. An animal model of focused ultrasound-induced BBB opening was created using 8-week-old ICR mice. Ultrasonic treatment using the MRgFUS device used a FUS device (RK-100), and a schematic diagram of the device configuration is shown in Figure 1. The MR image-guided focused ultrasound system is schematically shown in Figure 1. The system consists of an ultrasonic control system and an ultrasonic irradiation system (compatible with MR environment). Specifically, the ultrasonic control system consists of a fuction generator and RF amplifier that can transmit RF power to the ultrasonic transducer, and a power meter that can measure the power transmitted to the ultrasonic transducer in real time. The ultrasonic irradiation system consists of an ultrasonic transducer, a 3-axis control unit that can precisely control the ultrasonic transducer in three dimensions, and a water tank, and is designed to be operable even within an MRI equipment environment. The MR image-guided focused ultrasound system is linked to the Bruker 9.4T MRI (BioSpec 94/20 USR - 9.4T, Bruker, MA, USA) system. In the specific experimental protocol, microbubbles (DEFINITY®), a contrast agent for ultrasound imaging, are diluted in physiological saline at a ratio of 1:50 and injected into the animal's vein at a rate of 0.012ml/s. While injecting the diluted microbubbles, focused ultrasound with a burst length of 10 ms per second was irradiated to the desired brain region for 2 minutes based on MR imaging. Through MR imaging, BBB opening and closing can be confirmed by comparing images before and after injection of MR contrast agent. In order to discover biomarkers according to the degree of BBB degeneration in brain disease, ultrasound energy under optimal damage (0.25-0.27 MPa) and mild damage BBBD (0.42-0.44 MPa) conditions was irradiated to the thalmus area of the brain of ICR mice to determine BBB degeneration. was derived. Ultrasonic irradiation conditions used a center frequency of 1.1 MHz, and RFP was irradiated at 1 Hz for 120 seconds (Figure 1). MR images of mice under optimal damage (0.25-0.27 MPa) and mild damage BBBD (0.42-0.44 MPa) conditions were confirmed (Figure 2). For MR images, contrast agent was administered after BBB opening, the degree of enhancement over time was confirmed, and images were acquired in the coronal, axial, and sagittal directions. Experiments were conducted under optimal (~50%) and mild (~100%) BBB conditions by measuring intensity according to the degree of MR contrast agent penetration. To confirm the biological response over time after BBB opening following focused ultrasound irradiation, BBB degenerated brain tissue was obtained over time (1 hour, 6 hours, 12 hours, 24 hours, 48 hours), and blood samples were collected from mice in each group. About 1ml was collected and serum was separated.
Transcriptome analysis (전사체 분석)Transcriptome analysis
실시예 1의 방법으로 제작된 optimal damage BBB 동물 모델 및 mild damage BBB 동물모델에 집속 초음파를 조사한 뇌 부분의 조직을 액체 질소에 급속 냉동시킨 후, RNA isolation kit (Qiagen)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 총 RNA를 Dnase를 처리하여 DNA 오염을 방지하고, library 제작을 위해 random fragmentation을 제작하였다. RNA fragment를 역전사 효소로 반응시켜 cDNA를 제작하고 만들어 cDNA 양쪽 끝에 adpator를 붙여 sequencing을 수행하였다. sequencing을 통해 얻어진 raw data의 quality를 분석하고 각 샘플의 transcript quantification을 통해 발현량을 FPKM(Fragments per kilobase of transcript per milion mapped reads)값으로 추출하였다 (도 3). 퇴행성 뇌질환의 초기단계로 예상할 수 있는 optimal BBBD 조건에서 RNA sequencing 분석을 통해 시간에 따른 유전자의 발현 변화를 control과 비교하였을 때, 약 20,000개의 유전자중 BBBD에 의해 증가 또는 감소되는 유전자의 발현차이가 약 30개에서 70개 정도로 control과 크게 차이가 없음을 확인 하였다. BBB의 손상이 중반 정도로 예상할 수 있는 mild damage BBBD 조건에서 RNA sequencing 분석 결과를 통해 시간에 따른 유전자 발현 변화를 control 그룹과 비교하였을 때, 48시간 째 약 518개의 유전자가 증가되었고 174개의 유전자가 감소되는 경향을 나타내었다 (도 3). 상기의 결과를 바탕으로 mild damage BBBD 조건에서의 혈액이나 뇌 조직 바이오 마커 후보군을 선정하였다. 518개의 유전자중 Control 대비 3배 이상 증가되고 혈액에서 검출할 수 있는 soluble form의 단백질을 coding 하고 있는 4개의 유전자를 선정하여 후보군으로 선정하였다 (도 4). The brain tissue irradiated with focused ultrasound in the optimal damage BBB animal model and the mild damage BBB animal model produced by the method of Example 1 was rapidly frozen in liquid nitrogen, and then RNA was isolated using an RNA isolation kit (Qiagen). . Total RNA was treated with Dnase to prevent DNA contamination, and random fragmentation was performed for library production. The RNA fragment was reacted with reverse transcriptase to produce cDNA, and sequencing was performed by attaching adpators to both ends of the cDNA. The quality of raw data obtained through sequencing was analyzed, and the expression level was extracted as FPKM (Fragments per kilobase of transcript per million mapped reads) value through transcript quantification of each sample (Figure 3). When comparing changes in gene expression over time with control through RNA sequencing analysis under optimal BBBD conditions, which can be expected to be the early stage of degenerative brain disease, differences in expression of genes that are increased or decreased by BBBD among about 20,000 genes It was confirmed that there was no significant difference from the control, ranging from about 30 to 70. When comparing gene expression changes over time with the control group through RNA sequencing analysis results under mild damage BBBD conditions, where BBB damage can be expected to be moderate, about 518 genes increased and 174 genes decreased at 48 hours. showed a tendency to become (Figure 3). Based on the above results, blood or brain tissue biomarker candidates under mild damage BBBD conditions were selected. Among the 518 genes, four genes were selected as candidates, which were increased more than 3 times compared to the control and encoded a soluble form of protein that could be detected in blood (Figure 4).
유전체 분석 결과와 유전자 발현량의 상관관계 검증Verification of correlation between genome analysis results and gene expression level
상기 실시예3의 후보 유전자의 sequencing 결과가 유의한지 확인하기 위해 real time PCR실험기법으로 후보군유전자 발현을 확인하여 상관관계를 확인하였다. 실시예 1의 방법으로 제작된 optimal damage BBB 동물 모델 및 mild damage BBB 동물모델에 집속 초음파를 조사한 뇌 부분의 조직을 액체 질소에 급속 냉동시킨 후, Quiagne RNA isolation kit (Quiagen)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 총 RNA를 Dnase를 처리하여 DNA 오염을 방지하고, library 제작을 위해 random fragmentation을 제작하였다. RNA fragment를 역전사 효소로 반응시켜 cDNA를 제작하였다. SYBR® 그린 마스터 PCR 믹스 10 μL, 포워드 및 리버스 프라이머 각 5 pmol, 희석된 cDNA 주형 1 μL 및 적절한 양의 멸균 증류수를 함유한 20 μL 반응물 부피에서 SYBR® 그린 리얼-타임 PCR 키트를 사용하여 qRT-PCR을 수행했다. 유전자 증폭 조건은 다음과 같았다. 3 분 간 95 ℃에서 초기 변성; 15 초간 95 ℃에서 변성, 60 초간 60 ℃에서 아닐링 및 60 초간 72 ℃에서 신장 40 사이클; 및 5 분간 72 ℃에서 마지막 신장하였다. ABI 스텝 원 플러스 리얼-타임 PCR 시스템에서 qRT-PCR을 수행했다. 모든 정량은 내부 표준으로 U6과 함께 수행되었다. PCR 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다. 그 결과 시간에 따른 유전자의 sequencing결과와 qRT-PCR결과가 유사하다는 것을 확인하였다 (도 4). In order to confirm whether the sequencing results of the candidate genes in Example 3 were significant, the expression of the candidate genes was confirmed using a real-time PCR experiment technique to confirm the correlation. The brain tissue irradiated with focused ultrasound in the optimal damage BBB animal model and the mild damage BBB animal model produced by the method of Example 1 was rapidly frozen in liquid nitrogen, and then RNA was isolated using the Quiagne RNA isolation kit (Quiagen). did. Total RNA was treated with Dnase to prevent DNA contamination, and random fragmentation was performed for library production. cDNA was produced by reacting the RNA fragment with reverse transcriptase. qRT- PCR using the SYBR® Green Real-Time PCR Kit in a 20 μL reaction volume containing 10 μL of SYBR® Green Master PCR Mix, 5 pmol each of forward and reverse primers, 1 μL of diluted cDNA template, and an appropriate amount of sterile distilled water. PCR was performed. Gene amplification conditions were as follows. Initial denaturation at 95 °C for 3 min; 40 cycles of denaturation at 95 °C for 15 s, annealing at 60 °C for 60 s, and extension at 72 °C for 60 s; and a final extension at 72°C for 5 minutes. qRT-PCR was performed on an ABI Step One Plus real-time PCR system. All quantifications were performed with U6 as an internal standard. PCR primer sequences are shown in Table 1 below. As a result, it was confirmed that the sequencing results and qRT-PCR results of genes over time were similar (Figure 4).
프라이머TGFBI
primer
프라이머Cst7
primer
프라이머Angptl4
primer
프라이머Srgn
primer
ELISAELISA
집속초음파를 이용한 BBB 개통을 유도한 동물모델을 시간에 따라 sacrifice하고, 하대정맥에서 혈액을 약 1ml 정도 취하여, 상온에서 약 30분 혈액을 응고시킨 후, 6000rpm에서 30분간 원심 분리하여 상층액만을 분리하여 serum을 획득하였다. TGFBI Abcam 社 (ca. ab206987), CST7 R&D system 社 (ca. MSCTC0), Angptl4 LSBio 社 (Ca. LS-F6608), Srgn LSBio 社 (Ca. LS-F55170) ELISA kit를 이용하여 실험을 수행하기 위해서 serum을 50배와 10배로 blocking buffer에 희석 한 후에 ELISA plate에 100 ul씩 분주하였다. 상온에서 2시간동안 incubation후에 wash buffer로 5분씩 세 번 세척하였다. Biotin이 labelling되어 있는 antibody solution을 100ul씩 분주하고 37 ℃, 1시간동안 incubation하고, wash buffer로 5분씩 3번 세척하였다. ABC solution을 100ul씩 분주하고 37 ℃에서 30분 동안 incubation하고 wash buffer로 세척 후에 TMB substrate solution 90ul를 첨가하여 37 ℃에서 30분 동안 incubation후에 100ul의 stop solution을 첨가하고 plate reader (Tecan 社)를 이용하여 450nm 파장에서 흡광도를 측정하여 결과를 분석하였다. 혈액에서 Tgfbi의 발현은 0.42MPa에서 48시간째 두배 이상 증가되었다. Cst7의 발현은 0.25MPa 과 0.42MPa조건에서 24시간째 증가됨을 확인하였다. 혈액 내 Angpt14의 발현은 0.25MPa과 0.42MPa 조건에서 BBB 개통 후 1시간 이후부터 48시간까지 발현이 증가됨을 확인하였다. Srgn은 0.25MPa에서 12시간째 발현이 감소되었다가 48시간째 정상 수준으로 회복되었으며, 0.42MPa 조건에서는 24시간째 약 1.2배정도 증가됨을 확인하였다. 이를 통해 뇌미세혈관 손상에 의한 혈액 바이오 마커 발굴 가능성을 확인하였다. An animal model in which BBB opening was induced using focused ultrasound was sacrificed over time, approximately 1ml of blood was taken from the inferior vena cava, the blood was coagulated for approximately 30 minutes at room temperature, and then centrifuged at 6000rpm for 30 minutes to separate only the supernatant. Then, serum was obtained. To conduct experiments using ELISA kits from TGFBI Abcam (ca. ab206987), CST7 R&D system (ca. MSCTC0), Angptl4 LSBio (Ca. LS-F6608), and Srgn LSBio (Ca. LS-F55170). After diluting the serum 50-fold and 10-fold in blocking buffer, 100 ul each was dispensed onto the ELISA plate. After incubation at room temperature for 2 hours, the cells were washed three times for 5 minutes each with wash buffer. 100ul of biotin-labeled antibody solution was dispensed, incubated at 37°C for 1 hour, and washed three times for 5 minutes each with wash buffer. Dispense 100ul of ABC solution, incubate at 37°C for 30 minutes, wash with wash buffer, add 90ul of TMB substrate solution, incubate at 37°C for 30 minutes, add 100ul of stop solution, and use plate reader (Tecan) The absorbance was measured at a wavelength of 450 nm and the results were analyzed. The expression of Tgfbi in blood more than doubled at 0.42 MPa at 48 hours. The expression of Cst7 was confirmed to increase at 24 hours under 0.25 MPa and 0.42 MPa conditions. The expression of Angpt14 in blood was confirmed to increase from 1 hour to 48 hours after BBB opening under 0.25MPa and 0.42MPa conditions. The expression of Srgn decreased at 12 hours at 0.25 MPa, but recovered to normal levels at 48 hours, and was confirmed to increase about 1.2-fold at 24 hours at 0.42 MPa. Through this, the possibility of discovering blood biomarkers caused by brain microvascular damage was confirmed.
<110> Daegu-Gyeongbuk Medical Innovation Foundation <120> Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration <130> 1069339 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGFBI primer 1 <400> 1 tggatgtcct gaagggagac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGFBI primer 2 <400> 2 ggcatttgcc aagagtttgt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cst7 primer 1 <400> 3 atgcatcacc aactggacaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cst7 primer 2 <400> 4 cagaggagaa caggcacctc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Angptl4 primer 1 <400> 5 actgccagga actcttccaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Angptl4 primer 2 <400> 6 atcactgtcc agcctccatc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Srgn primer 1 <400> 7 ttttgatgga aggaccctca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Srgn primer 2 <400> 8 tgttggctgg tattcccatt 20 <110> Daegu-Gyeongbuk Medical Innovation Foundation <120> Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration <130> 1069339 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGFBI primer 1 <400> 1 tggatgtcct gaagggagac 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TGFBI primer 2 <400> 2 ggcatttgcc aagagtttgt 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cst7 primer 1 <400> 3 atgcatcacc aactggacaa 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cst7 primer 2 <400> 4 cagaggagaa caggcacctc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Angptl4 primer 1 <400> 5 actgccagga actcttccaa 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Angptl4 primer 2 <400> 6 atcactgtcc agcctccatc 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Srgn primer 1 <400> 7 ttttgatgga aggaccctca 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Srgn primer 2 <400> 8 tgttggctgg tattcccatt 20
Claims (9)
상기 Srgn의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브인, 뇌미세혈관의 손상으로 인한 치매, 알츠하이머, 파킨슨 및 경도인지장애 (mild cognitive impairment)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 뇌 질환 진단용 조성물. According to clause 2,
A composition for diagnosing any one brain disease selected from the group consisting of dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and mild cognitive impairment caused by damage to brain microvasculature, which is a primer or probe that specifically binds to the Srgn gene.
상기 제제는 Srgn의 유전자에 특이적으로 결합하는 항체인, 뇌미세혈관의 손상으로 인한 치매, 알츠하이머, 파킨슨 및 경도인지장애 (mild cognitive impairment)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 뇌 질환 진단용 조성물. According to clause 2,
The agent is an antibody that specifically binds to the Srgn gene, and is a composition for diagnosing any one brain disease selected from the group consisting of dementia, Alzheimer's, Parkinson's, and mild cognitive impairment caused by damage to brain microvasculature.
(b) 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 활성 수준을 정상대조군과 비교하는 단계; 및
(c) 단계(a) 에서 측정된 발현 수준 또는 활성 수준이 정상대조군 보다 높은 경우, 뇌미세혈관의 손상으로 인한 치매, 알츠하이머, 파킨슨 또는 경도인지장애 (mild cognitive impairment) 의심환자로 진단하는 단계를 포함하는, 뇌미세혈관의 손상으로 인한 치매, 알츠하이머, 파킨슨 및 경도인지장애 (mild cognitive impairment)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 뇌 질환 진단을 위한 정보제공방법.(a) measuring the mRNA expression or protein activity level of the Srgn gene from a biological sample isolated from the subject;
(b) comparing the expression level of the gene or the activity level of the protein with a normal control group; and
(c) If the expression level or activity level measured in step (a) is higher than that of the normal control, the step of diagnosing the patient as suspected of dementia, Alzheimer's, Parkinson's, or mild cognitive impairment due to damage to cerebral microcirculation. A method of providing information for diagnosing any one brain disease selected from the group consisting of dementia, Alzheimer's disease, Parkinson's disease, and mild cognitive impairment caused by damage to cerebral microcirculation, including:
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020210093801A KR102651118B1 (en) | 2021-07-16 | 2021-07-16 | Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration |
PCT/KR2022/095112 WO2023287269A1 (en) | 2021-07-16 | 2022-07-18 | Bio-marker composition for diagnosing brain disease due to brain microvascular damage |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020210093801A KR102651118B1 (en) | 2021-07-16 | 2021-07-16 | Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20230012927A KR20230012927A (en) | 2023-01-26 |
KR102651118B1 true KR102651118B1 (en) | 2024-03-22 |
Family
ID=85110580
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020210093801A KR102651118B1 (en) | 2021-07-16 | 2021-07-16 | Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR102651118B1 (en) |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016160742A1 (en) * | 2015-03-27 | 2016-10-06 | The Translational Genomics Research Institute | Biomarkers and methods of diagnosing and prognosing mild traumatic brain injuries |
JP2018151276A (en) | 2017-03-14 | 2018-09-27 | 国立大学法人大阪大学 | Aging biomarker |
US20200113943A1 (en) | 2017-06-05 | 2020-04-16 | The Regents Of The University Of California | Methods for enhanced production and isolation of cell-derived vesicles and treatment of inflammation and neurological damage |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20220252618A1 (en) * | 2019-06-10 | 2022-08-11 | Industry-Academic Coop. Foundation, Yonsei Univ. | Biomarker for diagnosis of cerebral nervous system diseases |
KR20210000252A (en) * | 2019-12-16 | 2021-01-04 | 재단법인 대구경북첨단의료산업진흥재단 | Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration |
-
2021
- 2021-07-16 KR KR1020210093801A patent/KR102651118B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016160742A1 (en) * | 2015-03-27 | 2016-10-06 | The Translational Genomics Research Institute | Biomarkers and methods of diagnosing and prognosing mild traumatic brain injuries |
US10809271B2 (en) | 2015-03-27 | 2020-10-20 | The Translational Genomics Research Institute | Biomarkers and methods of diagnosing and prognosing mild traumatic brain injuries |
JP2018151276A (en) | 2017-03-14 | 2018-09-27 | 国立大学法人大阪大学 | Aging biomarker |
US20200113943A1 (en) | 2017-06-05 | 2020-04-16 | The Regents Of The University Of California | Methods for enhanced production and isolation of cell-derived vesicles and treatment of inflammation and neurological damage |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. vol. 79, no. 5, 474-483(2020)* |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20230012927A (en) | 2023-01-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102100588B1 (en) | Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration | |
KR20210056313A (en) | Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration | |
JP2021043216A (en) | Composition for diagnosis of diseases | |
KR20210057716A (en) | Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration | |
KR101515700B1 (en) | Diagnostic composition for sepsis using TGFBI and pharmaceutical composition for preventing or treating of sepsis using the same and screening method thereof | |
KR102651118B1 (en) | Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration | |
KR102635835B1 (en) | Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration | |
KR102635834B1 (en) | Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration | |
KR102651116B1 (en) | Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration | |
CN104962657B (en) | Application of the YAP1 genes in Alzheimer disease diagnosis and treatment | |
KR102108176B1 (en) | Peptide biomarker for the diagnosis of Alzheimer’s Dementia | |
KR102347836B1 (en) | Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration | |
KR102347835B1 (en) | Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration | |
KR102207699B1 (en) | Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration | |
KR102207698B1 (en) | Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration | |
KR102207697B1 (en) | Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration | |
KR102207696B1 (en) | Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration | |
WO2023287269A1 (en) | Bio-marker composition for diagnosing brain disease due to brain microvascular damage | |
CN105018484B (en) | CRTAP genes and its expression product as Alzheimer disease diagnosis and treatment target | |
KR20210000257A (en) | Biomarker composition for diagnosis of brain diseases due to blood-brain barrier degeneration | |
WO2020262937A1 (en) | Bio-marker composition for diagnosis of brain disease caused by brain microvascular damage | |
WO2020262939A1 (en) | Biomarker composition for diagnosing brain disease due to brain microvascular damage | |
WO2020262935A1 (en) | Bio-marker composition for diagnosis of brain disease caused by brain microvascular damage | |
KR20200001068A (en) | Biomaker composition for diagnosing atrophy | |
KR102533728B1 (en) | Markers specific for brain derived ectosome and non-invasive method for diagnosing dementia |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant |