KR102650819B1 - Diagnostic kit for skin comprising antibody specific for LDH1 of Lactobacillus plantarum - Google Patents
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 플란타룸의 LDH1 특이적인 항체 및 이를 포함하는 락토바실러스 플란타룸 검출용 또는 피부 상태 진단용 조성물 또는 키트에 관한 것이다. 본 발명에 따른 단일클론항체는 항원에 대한 반응성이 매우 높으며 특히, 서로 다른 CDR을 갖는 두 개의 항체를 포획 항체와 검출 항체로 조합하여 사용함으로써 낮은 농도에서도 신속하고 정확하게 항원을 검출할 수 있어 래피드 자가 진단 키트 등에 적용될 수 있는바, 이를 이용하여 피부 표면에서 락토바실러스 플란타룸의 증식 상태 등에 대해 직관적으로 확인할 수 있고 피부의 이상 상태를 진단하고, 관련 질병의 발생가능성 및 지속성을 예측할 수 있으며, 이후 치료 방법을 결정하는데 활용될 수 있다.The present invention relates to a LDH1-specific antibody of Lactobacillus plantarum and a composition or kit containing the same for detecting Lactobacillus plantarum or diagnosing skin conditions. The monoclonal antibody according to the present invention has very high reactivity to antigens, and in particular, by using two antibodies with different CDRs in combination as a capture antibody and a detection antibody, antigens can be detected quickly and accurately even at low concentrations, making it possible to detect antigens quickly and accurately even at low concentrations. It can be applied to diagnostic kits, etc., and using this, you can intuitively check the growth status of Lactobacillus Plantarum on the skin surface, diagnose abnormal skin conditions, and predict the possibility and persistence of related diseases. It can be used to determine treatment methods.
Description
본 발명은 락토바실러스 플란타룸의 LDH1 특이적인 항체 및 이를 포함하는 락토바실러스 플란타룸 검출용 또는 피부 상태 진단용 조성물 또는 키트에 관한 것이다. The present invention relates to a LDH1-specific antibody of Lactobacillus plantarum and a composition or kit containing the same for detecting Lactobacillus plantarum or diagnosing skin conditions.
최근에는 마이크로바이옴에 대한 연구가 활발히 이루어지면서 장내 마이크로바이옴 및 피부 마이크로바이옴에 대한 영역이 각광받고 있다. 이 중 피부 마이크로바이옴의 경우, NGS 및 유전자 검사 등을 이용하여 매우 세부적인 결과 및 데이터 확보가 가능하나 피부 상태에 대해 간편하게 확인할 수 있는 신속 진단 방법은 부재인 상황이다. Recently, as research on the microbiome has been actively conducted, the areas of the intestinal microbiome and skin microbiome have been in the spotlight. Among these, in the case of the skin microbiome, it is possible to obtain very detailed results and data using NGS and genetic testing, but there is no rapid diagnosis method that can easily check the skin condition.
한편, 최근 연구에서 나이가 들면서 피부 마이크로바이옴의 다양성이 증가하고 락토바실러스와 큐티박테리움의 풍부함이 감소하는 것으로 나타나 해당 피부 마이크로바이옴이 피부 노화에 관련이 있을 것으로 예상되었다. 이 중 유산균(LAB)은 일반적으로 프로바이오틱스로 알려져 있으며, 관련 인체 연구가 활발히 진행되고 있다. 유산균의 피부 적용은 경구 섭취와 비교하였을 때 아직 초기 단계이지만 피부에서의 여러가지 유익한 점이 밝혀지고 있다. 특히, 락토바실러스 플란타룸은 면역조절 효과로 성인의 아토피성 피부염 증상 완화에 관여한다고 알려져 있으며, 이 밖에도 건선, 여드름, 지루성 피부염 등에 효과가 있는 연구 결과가 있다. Meanwhile, a recent study showed that the diversity of the skin microbiome increases and the abundance of Lactobacillus and Cutibacterium decreases with age, suggesting that the skin microbiome may be related to skin aging. Among these, lactic acid bacteria (LAB) are generally known as probiotics, and related human research is actively underway. Although skin application of lactic acid bacteria is still in its infancy compared to oral intake, various beneficial effects on the skin are being revealed. In particular, Lactobacillus plantarum is known to be involved in relieving the symptoms of atopic dermatitis in adults through its immunomodulatory effect, and research results show that it is effective in psoriasis, acne, and seborrheic dermatitis.
이에 따라 본 발명자들은 피부 건강에 긍정적인 효과를 미칠 수 있는 락토바실러스 플란타룸을 검출하기 위한 키트를 개발하고자 노력하였다. 특히, COVID로 인한 신속 진단 키트에 대한 소비자 접근성이 매우 높아진 상태에서 락토바실러스 플란타룸의 주요 단백질인 LDH1의 피부 표면 농도를 측정하기 위한 신속 자가 진단 키트를 개발하고자 하였으며, 상기 LDH1에 대한 신규한 단일클론항체를 개발하고, 이의 최적 조합을 선별하여 빠르고 정확하게 락토바실러스 플란타룸을 검출할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the present inventors tried to develop a kit for detecting Lactobacillus plantarum, which can have a positive effect on skin health. In particular, as consumer accessibility to rapid diagnostic kits has greatly increased due to COVID-19, we sought to develop a rapid self-diagnosis kit to measure the skin surface concentration of LDH1, the main protein of Lactobacillus plantarum, and to develop a novel self-diagnosis kit for LDH1. The present invention was completed by developing a monoclonal antibody, selecting its optimal combination, and confirming that Lactobacillus plantarum can be detected quickly and accurately.
본 발명은 락토바실러스 플란타룸의 LDH1 단백질에 특이적인 항체 및 이를 포함하는 락토바실러스 플란타룸 검출용 조성물 또는 키트를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.The purpose of the present invention is to provide an antibody specific for the LDH1 protein of Lactobacillus plantarum and a composition or kit for detecting Lactobacillus plantarum containing the same.
본 발명의 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재들로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The technical problems of the present invention are not limited to the technical problems mentioned above, and other technical problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below.
본 발명의 실시예에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 락토바실러스 플란타룸의 LDH1 단백질에 특이적인 항체가 제공된다. According to an embodiment of the present invention, a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a heavy chain CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and a heavy chain CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 ; Lactobacillus planta, comprising a light chain variable region comprising light chain CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, light chain CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and light chain CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 Antibodies specific for the LDH1 protein of room are provided.
또한, 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 락토바실러스 플란타룸의 LDH1 단백질에 특이적인 항체가 제공된다. In addition, a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, a heavy chain CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and a heavy chain CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11; Lactobacillus planta, comprising a light chain variable region comprising light chain CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, light chain CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and light chain CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 Antibodies specific for the LDH1 protein of room are provided.
본 발명의 다른 실시예에 따라, 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. According to another embodiment of the present invention, a polynucleotide encoding the antibody is provided.
본 발명의 또 다른 실시예에 따라, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터가 제공된다. According to another embodiment of the present invention, an expression vector containing the polynucleotide is provided.
본 발명의 또 다른 실시예에 따라, 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주세포가 제공된다. According to another embodiment of the present invention, a host cell containing the expression vector is provided.
본 발명의 또 다른 실시예에 따라, 상기 항체를 포함하는 락토바실러스 플란타룸 검출용 조성물이 제공된다. According to another embodiment of the present invention, a composition for detecting Lactobacillus plantarum containing the antibody is provided.
본 발명의 또 다른 실시예에 따라, 상기 항체를 포함하는 락토바실러스 플란타룸 검출용 키트가 제공된다. According to another embodiment of the present invention, a kit for detecting Lactobacillus plantarum containing the above antibody is provided.
본 발명에 따른 단일클론항체는 락토바실러스 플란타룸의 LDH1 단백질에 대해 특이적인 신규한 항체로서, 항원에 대한 반응성이 매우 높다. 특히, 본 발명에 따른 단일클론항체는 서로 다른 CDR을 갖는 두 개의 항체를 포획 항체와 검출 항체로 조합하여 사용함으로써 낮은 농도에서도 신속하고 정확하게 검출할 수 있어 래피드 자가 진단 키트 등에 적용될 수 있다. 또한, 이를 이용하여 피부 표면에서 락토바실러스 플란타룸의 증식 상태 등에 대해 직관적으로 확인할 수 있는바, 피부 상태를 진단하고, 관련 질병의 발생가능성 및 지속성을 예측할 수 있으며, 이후 치료 방법을 결정하는데 활용될 수 있다. The monoclonal antibody according to the present invention is a novel antibody specific for the LDH1 protein of Lactobacillus plantarum, and has very high reactivity to the antigen. In particular, the monoclonal antibody according to the present invention can be quickly and accurately detected even at low concentrations by using a combination of two antibodies with different CDRs as a capture antibody and a detection antibody, so it can be applied to rapid self-diagnosis kits, etc. In addition, using this, you can intuitively check the growth status of Lactobacillus plantarum on the skin surface, so you can diagnose skin conditions, predict the likelihood of occurrence and persistence of related diseases, and use it to determine future treatment methods. It can be.
본 발명의 상세한 설명에서 인용되는 도면을 보다 충분히 이해하기 위하여 각 도면의 간단한 설명이 제공된다.
도 1은 정제된 단일클론항체를 확인한 SDS-PAGE 결과이다.
도 2는 선별된 단일클론항체와 상용화된 항체의 LDH1 항원에 대한 친화도를 indirect ELISA를 통해 비교한 결과이다(A: Biorbyt사(orb847579)).
도 3은 선별된 단일클론항체와 상용화된 항체의 LDH1 항원에 대한 친화도를 웨스턴 블랏을 통해 비교한 결과이다.
도 4는 래피드 키트 스트립 상에서 본 발명에 따른 단일클론항체 조합의 LDH1 항원에 대한 반응성을 관찰한 결과이다.
도 5는 본 발명에 따른 단일클론항체인 2H1과 3D5를 이용하여 래피드 키트 상에서 LDH1 항원에 대한 반응성을 관찰한 결과이다.
도 6은 실제 피부 검체를 본 발명에 따른 단일클론항체인 2H1과 3D5를 이용하여 제조한 래피드 키트에 적용하였을 때, 락토바실러스 플란타룸의 검출이 가능함을 확인한 결과이다.In order to more fully understand the drawings cited in the detailed description of the present invention, a brief description of each drawing is provided.
Figure 1 shows the SDS-PAGE results confirming the purified monoclonal antibody.
Figure 2 shows the results of comparing the affinity for the LDH1 antigen of selected monoclonal antibodies and commercially available antibodies through indirect ELISA (A: Biorbyt (orb847579)).
Figure 3 shows the results of comparing the affinity for the LDH1 antigen of selected monoclonal antibodies and commercially available antibodies through Western blot.
Figure 4 shows the results of observing the reactivity of the monoclonal antibody combination according to the present invention to the LDH1 antigen on a rapid kit strip.
Figure 5 shows the results of observing reactivity to the LDH1 antigen on a rapid kit using the monoclonal antibodies 2H1 and 3D5 according to the present invention.
Figure 6 shows the results confirming that detection of Lactobacillus plantarum is possible when an actual skin sample is applied to the rapid kit manufactured using the monoclonal antibodies 2H1 and 3D5 according to the present invention.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 또한, 본 발명의 실시예를 설명함에 있어, 관련된 공지 구성 또는 기능에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 실시예에 대한 이해를 방해한다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 이하에서 본 발명의 실시예들을 설명할 것이나, 본 발명의 기술적 사상은 이에 한정되거나 제한되지 않고 당업자에 의해 변형되어 다양하게 실시될 수 있다.Unless otherwise defined, all technical and scientific terms used in this specification have the same meaning as commonly understood by a person skilled in the art to which the present invention pertains. In general, the nomenclature used herein is well known and commonly used in the art. Additionally, when describing embodiments of the present invention, if detailed descriptions of related known configurations or functions are judged to impede understanding of the embodiments of the present invention, the detailed descriptions will be omitted. In addition, embodiments of the present invention will be described below, but the technical idea of the present invention is not limited or limited thereto and may be modified and implemented in various ways by those skilled in the art.
본 명세서에서 어떤 부분이 어떤 구성요소를 포함한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본 명세서에서, 및/또는 이라는 용어는 복수의 관련된 항목들의 조합 또는 복수의 관련된 항목들 중의 어느 하나의 항목을 포함한다.In this specification, when a part includes a certain element, this does not mean excluding other elements, but may further include other elements, unless specifically stated to the contrary. In this specification, the term and/or includes a combination of a plurality of related items or any one item among a plurality of related items.
본 발명의 실시예에 따라 락토바실러스 플란타룸의 LDH1 단백질에 특이적인 신규한 항체가 제공된다. According to an embodiment of the present invention, a novel antibody specific for the LDH1 protein of Lactobacillus plantarum is provided.
본 발명에 있어서, “항체”는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 수용체 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론항체, 단일클론항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. In the present invention, “antibody” refers to a protein molecule that acts as a receptor that specifically recognizes an antigen, including immunoglobulin molecules that are immunologically reactive with a specific antigen, including polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, Includes both whole antibodies and antibody fragments.
본 발명에 있어서, "단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.In the present invention, “monoclonal antibody” refers to an antibody molecule of single molecular composition obtained from a substantially identical antibody population, and such monoclonal antibody exhibits single binding specificity and affinity for a specific epitope.
본 발명의 목적상 상기 항체는 락토바실러스 플란타룸의 LDH1 단백질에 특이적으로 결합하는 단일클론항체일 수 있다.For the purpose of the present invention, the antibody may be a monoclonal antibody that specifically binds to the LDH1 protein of Lactobacillus plantarum.
본 발명에 있어서, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역 (complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각 각의 사슬의 CDR은 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.In the present invention, immunoglobulins have heavy and light chains, with each heavy and light chain comprising a constant region and a variable region (such regions are known as domains). The variable regions of the light and heavy chains include three variable regions called complementarity-determining regions (hereinafter referred to as “CDRs”) and four framework regions. The CDR mainly functions to bind to the epitope of the antigen. The CDRs of each chain are sequentially called CDR1, CDR2, and CDR3 starting from the N-terminus, and are identified by the chain on which a specific CDR is located.
본 발명의 일 실시예에 따라, 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 락토바실러스 플란타룸의 LDH1 단백질에 특이적인 항체가 제공되며, 이를 2H1으로 명명하였다. According to one embodiment of the present invention, a heavy chain variable comprising a heavy chain CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a heavy chain CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and a heavy chain CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 area; Lactobacillus planta, comprising a light chain variable region comprising light chain CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, light chain CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and light chain CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 An antibody specific to the LDH1 protein of Room was provided and was named 2H1.
상기 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하고, 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다. The antibody may include a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7, and a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
본 발명의 다른 실시예에 따라, 서열번호 9의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR1, 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR2, 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역; 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 락토바실러스 플란타룸의 LDH1 단백질에 특이적인 항체가 제공되며, 이를 3D5로 명명하였다. According to another embodiment of the present invention, a heavy chain variable comprising a heavy chain CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, a heavy chain CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and a heavy chain CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 area; Lactobacillus planta, comprising a light chain variable region comprising light chain CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, light chain CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and light chain CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 An antibody specific to the LDH1 protein of Room was provided and was named 3D5.
상기 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하고, 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있다. The antibody may include a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15, and a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
본 발명의 항체는 락토바실러스 플란타룸의 LDH1 단백질을 특이적으로 인식할 수 있는 범위 내에서 첨부한 서열목록에 기재된 아미노산 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 예를 들면, 항체의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 개선시키기 위하여 항체의 아미노산 서열에 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실, 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 이러한 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 가지며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 가진다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글자이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.The antibody of the present invention may include variants of the amino acid sequence described in the attached sequence list within the range that can specifically recognize the LDH1 protein of Lactobacillus plantarum. For example, changes can be made to the amino acid sequence of an antibody to improve its binding affinity and/or other biological properties. Such modifications include, for example, deletions, insertions and/or substitutions of amino acid sequence residues of the antibody. These amino acid mutations are made based on the relative similarity of amino acid side chain substitutions, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge, size, etc. Analysis of the size, shape and type of amino acid side chain substitutions shows that arginine, lysine and histidine are all positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; It can be seen that phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Therefore, based on these considerations, arginine, lysine and histidine; alanine, alanine and serine; And phenylalanine, tryptophan, and tyrosine can be said to be biologically equivalent in function.
변이를 도입하는데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스타인(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 쓰레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5). In introducing mutations, the hydrophobic index of the amino acid may be considered. Each amino acid is assigned a hydrophobicity index based on its hydrophobicity and charge: isoleucine (+4.5); Valine (+4.2); leucine (+3.8); phenylalanine (+2.8); cysteine/cysteine (+2.5); Methionine (+1.9); Alanine (+1.8); Glycine (-0.4); Threonine (-0.7); Serine (-0.8); tryptophan (-0.9); Tyrosine (-1.3); Proline (-1.6); histidine (-3.2); glutamate (-3.5); Glutamine (-3.5); Aspartate (-3.5); Asparagine (-3.5); Lysine (-3.9); and arginine (-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.The hydrophobic amino acid index is very important in imparting interactive biological functions to proteins. It is a known fact that similar biological activity can be maintained only when substituted with an amino acid having a similar hydrophobic index. When introducing a mutation with reference to the hydrophobicity index, substitution is made between amino acids showing a difference in hydrophobicity index of preferably within ±2, more preferably within ±1, and even more preferably within ±0.5.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있으며, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스팔테이트(+3.0 ± 1); 글루타메이트(+3.0 ± 1); 세린(+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 쓰레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5 ± 1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 아이소루이신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).On the other hand, it is also well known that substitutions between amino acids with similar hydrophilicity values result in proteins with equivalent biological activity, and the following hydrophilicity values are assigned to each amino acid residue: Arginine (+3.0) ; Lysine (+3.0); Asphaltate (+3.0 ± 1); glutamate (+3.0 ± 1); Serine (+0.3); Asparagine (+0.2); Glutamine (+0.2); Glycine (0); Threonine (-0.4); Proline (-0.5 ± 1); Alanine (-0.5); histidine (-0.5); Cysteine (-1.0); Methionine (-1.3); Valine (-1.5); leucine (-1.8); isoleucine (-1.8); Tyrosine (-2.3); Phenylalanine (-2.5); Tryptophan (-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ± 2 이내, 보다 바람직하게는 ± 1 이내, 보다 더 바람직하게는 ± 0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에서 치환을 한다.When introducing a mutation with reference to the hydrophilicity value, substitution is made between amino acids showing a difference in hydrophilicity value of preferably within ±2, more preferably within ±1, and even more preferably within ±0.5.
또한, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.Additionally, amino acid exchanges in proteins that do not overall alter the activity of the molecule are known in the art (H. Neurath, R.L. Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). The most common exchanges are amino acid residues Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/ It is an exchange between Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, and Asp/Gly.
따라서 본 발명에 따른 항체는 상술한 아미노산 서열과 80 내지 99% 상동성, 90 내지 99% 상동성, 95 내지 99% 상동성을 가질 수 있다. Therefore, the antibody according to the present invention may have 80 to 99% homology, 90 to 99% homology, and 95 to 99% homology with the above-mentioned amino acid sequence.
본 발명의 다른 실시예에 따라 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 당 또는 염기분위가 변형된 유사체(analogue)를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 변형될 수 있으며, 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함한다. According to another embodiment of the present invention, a polynucleotide encoding the antibody is provided. The polynucleotide includes not only natural nucleotides, but also analogues with modified sugars or bases. The polynucleotide may be modified, and the modification includes addition, deletion, or non-conservative or conservative substitution of nucleotides.
본 발명의 또 다른 실시예에 따라 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 숙주세포를 제공한다. According to another embodiment of the present invention, an expression vector containing the polynucleotide and a host cell containing the expression vector are provided.
본 발명에 있어서, “벡터”는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터 등을 포함한다. 본 발명의 벡터에서 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터와 작동 가능하게 결합된(operatively linked) 것일 수 있다. 상기 “작동 가능하게 결합된”은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명의 벡터 시스템은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있으며, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다.In the present invention, “vector” refers to a means for expressing a target gene in a host cell, including a plasmid vector; cosmid vector; and viral vectors such as bacteriophage vectors, adenovirus vectors, retroviral vectors, and adeno-associated virus vectors. In the vector of the present invention, the polynucleotide encoding the antibody may be operatively linked to the promoter. The term “operably linked” refers to a functional linkage between a nucleic acid expression control sequence (e.g., a promoter, or an array of transcriptional regulator binding sites) and another nucleic acid sequence, whereby the control sequence is linked to the other nucleic acid sequence. regulates transcription and/or translation. The vector system of the present invention can be constructed through various methods known in the art, and can typically be constructed as a vector for cloning or a vector for expression. Additionally, the vector of the present invention can be constructed using prokaryotic cells or eukaryotic cells as hosts.
한편, 본 발명의 발현 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있고, 상기 항생제 내성 유전자는 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린 중 선택된 하나 이상일 수 있다.Meanwhile, the expression vector of the present invention may include an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, and the antibiotic resistance gene is ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin, It may be one or more selected from neticin, neomycin, and tetracycline.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 숙주세포는 박테리아 또는 동물 세포일 수 있다. 상기 벡터로 형질전환된 세포는 본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포로, 당업계에 공지되어 있는 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있다. 예컨대, 상기 벡터의 적합한 진핵 세포 숙주 세포는 원숭이 신장 세포7(COS7: monkey kidney cells), NSO 세포, SP2/0, 차이니즈 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포, W138, 어린 햄스터 신장(BHK: baby hamster kidney) 세포, MDCK, 골수종 세포주, HuT 78 세포 및 HEK-293 세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.Additionally, in the present invention, the host cell may be a bacterial or animal cell. The cell transformed with the vector is a host cell capable of stably and continuously cloning and expressing the vector of the present invention, and any host cell known in the art can be used. For example, suitable eukaryotic host cells for the vector include monkey kidney cells (COS7), NSO cells, SP2/0, Chinese hamster ovary (CHO) cells, W138, baby hamster kidney (BHK: It may be, but is not limited to, baby hamster kidney) cells, MDCK, myeloma cell line, HuT 78 cells, and HEK-293 cells.
본 발명의 또 다른 실시예에 따라 상기 항체를 포함하는 락토바실러스 플란타룸 검출용 조성물 또는 키트를 제공한다. 상기 조성물 또는 키트는 피부 상태 진단용일 수 있다. According to another embodiment of the present invention, a composition or kit for detecting Lactobacillus plantarum containing the antibody is provided. The composition or kit may be for diagnosing skin conditions.
본 발명에 따른 조성물 또는 키트는 항원-항체 복합체의 검출에 의해 락토바실러스 플란타룸을 검출할 수 있으며, 상기 항원은 락토바실러스 플란타룸의 LDH1 단백질이나 균주 자체를 포함할 수 있다. 상기 항체는 검출 방식에 따라 하나 또는 둘 이상일 수 있으며, 예를 들어, 항체가 두개일 경우 하나의 항체는 포획(capture) 항체, 다른 하나의 항체는 검출(detection) 항체일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 2H1 항체를 포획 항체로 이용하고, 3D5 항체를 검출 항체로 이용하는 신속(래피드) 항원 진단 키트를 제조하였다.The composition or kit according to the present invention can detect Lactobacillus plantarum by detection of an antigen-antibody complex, and the antigen may include the LDH1 protein or the strain itself of Lactobacillus plantarum. The number of antibodies may be one or two or more depending on the detection method. For example, when there are two antibodies, one antibody may be a capture antibody and the other antibody may be a detection antibody. In one example of the present invention, a rapid antigen diagnostic kit was prepared using the 2H1 antibody as a capture antibody and the 3D5 antibody as a detection antibody.
본 발명에 있어서, 상기 "항원-항체 복합체"는 시료 중의 해당 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있으며, 구체적으로 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있으며, 웨스턴블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크레로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등의 방법을 사용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서는 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소 등을 포함하며, 콜로이드성 금 입자 또는 칼라 유리 또는 플라스틱(예: 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 라텍스 등) 비드(bead)를 포함하나 이에 제한되지 않는다.In the present invention, the “antigen-antibody complex” refers to a combination of a protein antigen in a sample and an antibody that recognizes it. Detection of the antigen-antibody complex can be done using methods known in the art, such as spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical, electrical, absorbance, chemical and other methods, and specific methods. colorimetric method, electrochemical method, fluorimetric method, luminometry, particle counting method, visual assessment, and scintillation counting method. It can be detected by any method selected from the group consisting of western blotting, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), radioimmunoassay, radioimmunodiffusion, and Ouchterlony immunity. Methods such as diffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complete fixation assay, FACS, protein chip, etc. can be used, but are not limited to these. . In the present invention, various labels can be used to detect antigen-antibody complexes. Specific examples include enzymes, fluorescent substances, ligands, luminescent substances, microparticles, radioactive isotopes, etc., and include colloidal gold particles or colored glass or plastic (e.g. polystyrene, polypropylene, latex, etc.) beads. However, it is not limited to this.
본 발명에 있어서, 키트는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트, 샌드위치 ELISA 키트, 단백질 칩 키트 또는 래피드(rapid) 키트일 수 있고, 구체적으로는 2개의 항체를 이용하는 샌드위치 ELISA 키트 또는 래피드 키트일 수 있으나, 이에 한정되지 않고 하나 이상의 항체를 이용하는 모든 키트에 적용 가능하다. In the present invention, the kit may be an ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) kit, a sandwich ELISA kit, a protein chip kit, or a rapid kit, and specifically, it may be a sandwich ELISA kit or a rapid kit using two antibodies. However, it is not limited to this and can be applied to all kits using one or more antibodies.
본 발명에 있어서 "ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)"는 효소면역 측정방법이라고도 하며, 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 복합체를 형성함으로써 이의 효소와 기질의 반응을 통해 흡광도를 이용하여 정량하는 방법이다. 상기 ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지 체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등을 포함한다.In the present invention, "ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)" is also called an enzyme-linked immunosorbent assay, and is a method of quantification using absorbance through the reaction between the enzyme and the substrate by binding an enzyme to an antibody to form an antigen-antibody complex. am. The ELISA includes direct ELISA using a labeled antibody that recognizes an antigen attached to a solid support, indirect ELISA using a labeled secondary antibody that recognizes a capture antibody in a complex of an antibody recognizing an antigen attached to a solid support, and a solid support. Direct sandwich ELISA uses another labeled antibody that recognizes an antigen in a complex of an antibody and an antigen attached to a solid support, and this antibody is recognized after reacting with another antibody that recognizes an antigen in a complex of an antibody and an antigen attached to a solid support. Indirect sandwich ELISA using labeled secondary antibodies, etc.
본 발명에 있어서, “래피드 키트”는 신속 진단 검사(Rapid diagnostic test, RDT) 또는 신속 항원 검사 또는 면역크로마토그래피 키트 분석이라고도 불린다. 래피드 키트 분석은, 제1 샘플 패드, 멤브레인, 흡수 패드를 포함하는 면역 크로마토그래피 스트립에 의한 분석방법으로서, 사용자가 생물학적 또는 화학적 샘플로부터 분석 물질을 특별한 기술이나 장비 없이 짧은 시간내에 간단하게 검출할 수 있다. 본 발명에 따른 항체는 상용화된 항체에 비해 항원과의 반응성이 우수하여 민감도 및 특이성이 우수한바, 짧은 시간 내에 항원 여부를 검출하는 래피드(신속) 키트에 적용 가능한 것을 특징으로 한다. 상기 래피드 키트는 예를 들어 60분 이내, 구체적으로는 30분 이내, 보다 더 구체적으로는 15분 이내에 검출이 가능할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.In the present invention, “rapid kit” is also called rapid diagnostic test (RDT), rapid antigen test, or immunochromatography kit analysis. Rapid kit analysis is an analysis method using an immunochromatographic strip including a first sample pad, a membrane, and an absorption pad, allowing the user to simply detect analytes from biological or chemical samples in a short time without special technology or equipment. there is. The antibody according to the present invention has superior reactivity with antigens compared to commercially available antibodies and thus has excellent sensitivity and specificity, and is therefore applicable to a rapid kit that detects the presence of an antigen within a short period of time. The rapid kit may be capable of detection within, for example, 60 minutes, specifically within 30 minutes, and more specifically within 15 minutes, but is not limited thereto.
상기 키트에 사용되는 검체(시료)는 조직, 전혈, 소변, 타액 등을 모두 포함할 수 있으나, 본 발명의 목적에 따라 구체적으로는 피부 조직일 수 있다. 예를 들어, 피부 조직의 표면을 스틱으로 긁어 버퍼 용액에 용해시키는 방식으로 검체를 제조할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 키트는 피부 표면, 즉 표피 조직을 직접적으로 이용함으로써 피부에 증식하고 있는 락토바실러스 플란타룸의 여부 및 이의 농도를 신속하고 간편하게 자가 진단하는데 사용될 수 있다. 더 구체적으로는 피부 노화를 방지하고 아토피 피부염을 비롯한 피부 질환의 증상 완화에 관여한다고 알려져있는 락토바실러스 플란타룸의 피부 표면 농도를 측정함으로써 피부 상태를 진단하고, 관련 질병의 발생가능성 및 지속성을 예측할 수 있으며, 이후 치료 방법을 결정하기 위한 신속 자가 진단 키트로 활용될 수 있다.The specimen (sample) used in the kit may include tissue, whole blood, urine, saliva, etc., but may specifically be skin tissue depending on the purpose of the present invention. For example, a sample can be prepared by scraping the surface of skin tissue with a stick and dissolving it in a buffer solution. Specifically, the kit according to the present invention can be used to quickly and conveniently self-diagnose the presence and concentration of Lactobacillus plantarum growing on the skin by directly using the skin surface, that is, epidermal tissue. More specifically, it is possible to diagnose skin conditions and predict the likelihood and persistence of related diseases by measuring the skin surface concentration of Lactobacillus plantarum, which is known to prevent skin aging and alleviate symptoms of skin diseases including atopic dermatitis. It can be used as a quick self-diagnosis kit to determine future treatment methods.
이하에서, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 실시예를 다음과 같이 나타내었으나, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.Below, examples are shown to further explain the present invention in more detail, but the present invention is not limited thereto.
실시예 1. 락토바실러스 플랜타룸 LDH1에 대한 단일클론항체의 제조Example 1. Preparation of monoclonal antibody against Lactobacillus plantarum LDH1
1-1. 쥐의 면역화 (Immunization of mice)1-1. Immunization of mice
150ug의 LDH1 단백질이 들어있는 PBS와 같은 부피의 Freund's adjuvant(Incomplete, Sigma)를 섞어 총 600μl가 되도록 만든 후, 6주령 암컷 BALB/c 마우스에 한 마리당 200μl씩 주입하여 1차 면역을 진행하였다. 2주 후에 150μg의 LDH1를 총 600μl가 되도록 PBS에 녹인 후 1차 면역이 진행된 마우스에 동일하게 한 마리당 200μl씩 주입하여 2차 면역을 진행하였다.PBS containing 150 μg of LDH1 protein and an equal volume of Freund's adjuvant (Incomplete, Sigma) were mixed to make a total of 600 μl, and then 200 μl per mouse was injected into 6-week-old female BALB/c mice for primary immunization. Two weeks later, 150 μg of LDH1 was dissolved in PBS to make a total of 600 μl, and then 200 μl per mouse was injected into the mice that had undergone the primary immunization to perform secondary immunization.
1-2. 세포 융합1-2. cell fusion
2차 면역 4일 후 마우스의 lymph node를 무균적으로 적출하고 DMEM 배지로 2번 세척하였다. 세척된 lymph node를 cell strainer (Falcon)를 이용하여 단일 세포 (single cell)로 만들어 준 후, 다시 DMEM으로 세척하고 DMEM에 부유시켰다. Lymph node 세포와 SP2/O 세포의 비율을 5:1의 비율이 되게끔 혼합하고, PEG (Polyethylene Glycol 1500, Sigma) 1ml을 2분간 천천히 첨가하며 세포융합을 유도하였다. 여기에 DMEM 배지를 첨가하고 37℃에서 15분간 정치시킨 후 1200rpm에서 원심분리하여 상층액을 제거하였다. HAT (0.1mM hypoxanthine, 0.4M aminopterin, 16uM thymidine, Sigma)와 20% FBS가 첨가된 DMEM에 1x106 cell/ml의 농도로 부유시킨 다음, 이 부유액 100μl를 96 웰 플레이트에 분주하고, 세포배양기에서 2주간 배양하여 융합된 세포를 선별하였다.Four days after the secondary immunization, the lymph nodes of the mice were removed aseptically and washed twice with DMEM medium. The washed lymph nodes were converted into single cells using a cell strainer (Falcon), then washed again with DMEM and suspended in DMEM. Lymph node cells and SP2/O cells were mixed at a ratio of 5:1, and 1 ml of PEG (Polyethylene Glycol 1500, Sigma) was slowly added for 2 minutes to induce cell fusion. DMEM medium was added thereto, left to stand at 37°C for 15 minutes, and then centrifuged at 1200 rpm to remove the supernatant. Suspended at a concentration of 1x10 6 cells/ml in DMEM supplemented with HAT (0.1mM hypoxanthine, 0.4M aminopterin, 16uM thymidine, Sigma) and 20% FBS, then dispensed 100μl of this suspension into a 96-well plate and incubated in a cell incubator. After culturing for 2 weeks, fused cells were selected.
1-3. 융합된 세포의 항체 형성 확인1-3. Confirmation of antibody formation in fused cells
융합된 세포의 항체 생성 여부는 면역항원과 융합된 세포 배양액을 이용하여 Indirect ELISA 방법으로 관찰하였다. 면역항원을 0.5μg/ml 농도로 희석하여 모든 웰에 50μl씩 넣은 후, 냉장에서 밤새 정치시켜 항원을 코팅한 후, 각 웰을 0.05% PBST로 3회 세척하였다. 1% BSA/PBS를 각 웰에 180μl씩 첨가하고 상온에서 1시간도안 반응하며 블로킹시켰다. 융합된 세포의 배양액을 각 웰에 50μl씩 첨가하고, 상온에서 1시간동안 반응한 후 0.05% PBST로 3회 세척하였다. 1:10000 비율로 HRP-conjugated anti mouse IgG antibody (Sigma)를 각 웰에 50μl씩 분주하여 상온에서 30분 반응한 후 0.05% PBST로 3회 세척하였다. TMB substrate (Surmodics)를 각 웰에 50μl씩 첨가한 후 차광하여 상온에서 15분간 반응하였다. 1N sulfuric acid를 각 웰에 50μl씩 첨가하여 반응을 멈추고 ELISA 리더기에서 OD (optical density)를 측정하였다.Whether the fused cells produced antibodies was observed using an indirect ELISA method using cell culture medium fused with the immune antigen. The immune antigen was diluted to a concentration of 0.5 μg/ml and 50 μl was added to each well, left in the refrigerator overnight to coat with the antigen, and then each well was washed three times with 0.05% PBST. 180 μl of 1% BSA/PBS was added to each well and blocked by reacting at room temperature for 1 hour. 50 μl of culture medium of fused cells was added to each well, reacted at room temperature for 1 hour, and then washed three times with 0.05% PBST. 50 μl of HRP-conjugated anti mouse IgG antibody (Sigma) was dispensed into each well at a ratio of 1:10000, reacted at room temperature for 30 minutes, and then washed three times with 0.05% PBST. 50 μl of TMB substrate (Surmodics) was added to each well, blocked from light, and reacted at room temperature for 15 minutes. The reaction was stopped by adding 50 μl of 1N sulfuric acid to each well, and the OD (optical density) was measured in an ELISA reader.
1-4. 항체의 정제1-4. purification of antibodies
항체를 생성하는 융합세포를 25T 플라스크로 옮겨서 대량 배양한 후, 얻어진 세포 상층액으로부터 Protein G 친화 컬럼을 사용하여 항체를 정제하였다. 총 8개의 항체를 분리한 후, 이를 정제 후 겔에 로딩하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. The fused cells producing antibodies were transferred to a 25T flask and mass cultured, and the antibodies were purified from the obtained cell supernatant using a Protein G affinity column. After separating a total of 8 antibodies, they were purified and loaded on a gel to perform SDS-PAGE. The results are shown in Figure 1.
도 1에 나타낸 바와 같이, 8개의 단일클론항체(1G9, 2H1, 3D5, 2A3, 3B10, 3E3, 4F7, 3D10)의 발현을 확인함으로써 잘 정제되었음을 확인하였다. As shown in Figure 1, it was confirmed that the antibody was well purified by confirming the expression of eight monoclonal antibodies (1G9, 2H1, 3D5, 2A3, 3B10, 3E3, 4F7, 3D10).
1-5. 단일클론항체의 후보군 선별1-5. Selection of candidate groups for monoclonal antibodies
Sandwich ELISA 방법으로 항원과 항체 반응성을 조사함으로써 항체를 선별하였다. Sandwich ELISA는 다음과 같이 진행되었다. 먼저 실시예 1-4에서 정제된 총 8개의 단일클론항체를 각각 carbonate buffer에 1μg/ml 농도로 희석한 후 각 웰에 100μl씩 첨가하고 냉장에서 밤새 정치시켜 항체를 코팅하였다. 각 웰을 0.05% PBST로 3회 세척한 후, 1% BSA/PBS를 모든 웰에 300μl씩 첨가하여 상온에서 1시간 반응하며 블로킹 시켰다. 면역항원을 1μg/ml, 0.1μg/ml, 0.01μg/ml의 농도로 희석하여 100μl씩 첨가하여 상온에서 1시간동안 반응시킨 후, 0.05% PBST로 3회 세척하였다. 각각의 biotinylated-항체를 1μg/ml농도로 희석하여 각 웰에 100μl씩 첨가한 후 상온에서 1시간동안 반응시켰다. 0.05% PBST로 3회 세척한 후, SA-HRP (Sigma)를 1:8000비율로 희석하여 각 웰에 100μl씩 첨가하여 상온에서 30분간 반응하였다. 위와 같은 방법으로 세척한 후 TMB (Surmodics)를 각 웰에 100μl씩 첨가한 후 차광하여 상온에서 15분간 반응시킨 후, 1N sulfuric acid를 각 웰에 50μl씩 첨가하여 반응을 멈추고 ELISA 리더기에서 OD (optical density)를 측정하였다. 상기와 같은 방식으로 항원과 항체의 농도반응을 통하여 단일클론항체 후보군을 선별하였다. 그 결과를 표 1에 나타내었다. Antibodies were selected by examining antigen and antibody reactivity using the Sandwich ELISA method. Sandwich ELISA was performed as follows. First, a total of eight monoclonal antibodies purified in Examples 1-4 were each diluted in carbonate buffer to a concentration of 1 μg/ml, and then 100 μl was added to each well and left in the refrigerator overnight to coat the antibodies. After washing each well three times with 0.05% PBST, 300 μl of 1% BSA/PBS was added to each well and incubated for 1 hour at room temperature for blocking. Immune antigens were diluted to concentrations of 1 μg/ml, 0.1 μg/ml, and 0.01 μg/ml, added at 100 μl each, reacted at room temperature for 1 hour, and then washed three times with 0.05% PBST. Each biotinylated-antibody was diluted to a concentration of 1 μg/ml, 100 μl was added to each well, and reacted at room temperature for 1 hour. After washing three times with 0.05% PBST, SA-HRP (Sigma) was diluted at a ratio of 1:8000, 100 μl was added to each well, and reacted at room temperature for 30 minutes. After washing in the same manner as above, 100 μl of TMB (Surmodics) was added to each well, blocked from light, and allowed to react at room temperature for 15 minutes. Then, 50 μl of 1N sulfuric acid was added to each well to stop the reaction, and the OD (optical) was measured using an ELISA reader. density) was measured. In the same manner as above, monoclonal antibody candidates were selected through the concentration reaction of antigen and antibody. The results are shown in Table 1.
표 1에 나타낸 바와 같이, 8개의 단일클론항체 중 2가지를 쌍으로 선별하여 Sandwich ELISA를 수행한 결과, 항원에 대해 높은 반응성을 나타냄을 확인하였으며, 그 중 2H1, 3B10, 3D5, 3D10, 4F7가 높은 OD값을 나타냄을 확인하였다. As shown in Table 1, two of the eight monoclonal antibodies were selected in pairs and Sandwich ELISA was performed, and it was confirmed that they showed high reactivity to the antigen, among which 2H1, 3B10, 3D5, 3D10, and 4F7. It was confirmed that it showed a high OD value.
실시예 2. 선별된 단일클론항체와 상용화된 항체의 LDH1 항원에 대한 친화도 비교Example 2. Comparison of affinity for LDH1 antigen between selected monoclonal antibodies and commercially available antibodies
2-1. Indirect ELISA 방법을 통한 비교2-1. Comparison through indirect ELISA method
LDH1 항원을 carbonate buffer에 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.313, 0.156ng/ml 농도로 단계 희석한 후 각 웰에 100μl씩 첨가하고 냉장에서 밤새 정치시켜 항원을 코팅하였다. 모든 웰을 0.05% PBST로 3회 세척한 후, 1% BSA/PBS를 각 웰에 300μl씩 첨가하여 상온에서 1시간동안 반응하며 블로킹 시켰다. 위와 같은 방법으로 0.05% PBST로 모든 웰을 3회 세척한 후, 상기 실시예 1-5에서 선별된 단일클론항체와 구입한 Biorbyt사(orb847579)의 항체를 1μg/ml의 농도가 되도록 1% BSA/PBS로 희석한 후, 각 웰에 100μl씩 첨가하여 상온에서 1시간동안 반응한 후 0.05% PBST로 3회 세척하였다. 1:10000 비율로 HRP-conjugated anti mouse IgG antibody (Sigma)를 각 웰에 100μl씩 분주하여 상온에서 30분간 반응한 후 0.05% PBST로 3회 세척하였다. TMB substrate (Surmodics)를 각 웰에 50μl씩 첨가한 후 차광하여 상온에서 15분간 반응하였다. 1N sulfuric acid를 각 웰에 50μl씩 첨가하여 반응을 멈추고 ELISA 리더기에서 OD (optical density)를 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다. The LDH1 antigen was serially diluted in carbonate buffer to concentrations of 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.313, and 0.156 ng/ml, and then 100 μl was added to each well and left in the refrigerator overnight to coat the antigen. After washing all wells three times with 0.05% PBST, 300 μl of 1% BSA/PBS was added to each well and incubated for 1 hour at room temperature for blocking. After washing all wells three times with 0.05% PBST in the same manner as above, the monoclonal antibodies selected in Example 1-5 and the purchased antibody from Biorbyt (orb847579) were mixed with 1% BSA to a concentration of 1 μg/ml. After diluting with /PBS, 100 μl was added to each well, reacted at room temperature for 1 hour, and then washed three times with 0.05% PBST. 100 μl of HRP-conjugated anti mouse IgG antibody (Sigma) was dispensed into each well at a ratio of 1:10000, reacted at room temperature for 30 minutes, and then washed three times with 0.05% PBST. 50 μl of TMB substrate (Surmodics) was added to each well, blocked from light, and reacted at room temperature for 15 minutes. The reaction was stopped by adding 50 μl of 1N sulfuric acid to each well, and the OD (optical density) was measured in an ELISA reader. The results are shown in Figure 2.
도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명을 통해 선별된 단일클론항체 2H1, 3B10, 3D5, 3D10, 4F7가 상용화된 항체에 비해 더욱 우수한 반응성을 나타내었으며, 특히 2H1과 3D5가 우수한 결과를 나타냄을 확인하였다. As shown in Figure 2, it was confirmed that the monoclonal antibodies 2H1, 3B10, 3D5, 3D10, and 4F7 selected through the present invention showed better reactivity than commercially available antibodies, and in particular, 2H1 and 3D5 showed excellent results. .
2-2. 웨스턴 블랏을 통한 비교2-2. Comparison through Western Blot
LDH1 항원 2μg을 SDS 샘플 버퍼에 첨가하여 95~100℃에서 10분간 가열시켜 준 후, 12% SDS-PAGE 겔에 샘플과 마커를 각 20μl씩 걸어주고 80~120V에서 2시간 전기영동 시켰다. 완료된 후, 겔을 떼어내서 흐르는 물에 씻어준 후 트랜스퍼용 플라스틱 패드 위에 3M paper-PVDF-gel-3M paper 순으로 올려주었다. Transfer chamber에 장착해 주고 185mA에서 2시간 정도 트랜스퍼하였다. 이후 5% skim milk로 블로킹 시킨 후, 1차 항체로 상기 실시예 1에서 선별된 단일클론항체와 구입한 Biorbyt사 (orb847579)의 항체를 1:1000의 비율로 냉장에서 밤새 반응시켰다. 이를 1x TBST로 5분씩 세 번 세척한 후, 2차 항체와 함께 1:4000의 비율로 1시간동안 상온에서 반응시키고, 1x TBST로 5분씩 세 번 세척하였다. ECL 버퍼를 멤브레인에 골고루 뿌려준 후, 검출하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. 2 μg of LDH1 antigen was added to the SDS sample buffer and heated at 95-100°C for 10 minutes, then 20 μl each of the sample and marker were placed on a 12% SDS-PAGE gel and electrophoresed at 80-120 V for 2 hours. After completion, the gel was removed, washed in running water, and placed on the transfer plastic pad in the following order: 3M paper-PVDF-gel-3M paper. It was mounted in a transfer chamber and transferred at 185mA for about 2 hours. After blocking with 5% skim milk, the monoclonal antibody selected in Example 1 as the primary antibody and the antibody purchased from Biorbyt (orb847579) were reacted overnight in a refrigerator at a ratio of 1:1000. This was washed three times with 1x TBST for 5 minutes each, reacted with secondary antibody at a ratio of 1:4000 for 1 hour at room temperature, and washed three times with 1x TBST for 5 minutes each. The ECL buffer was evenly sprinkled on the membrane and then detected. The results are shown in Figure 3.
도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명을 통해 선별된 단일클론항체 3D5 및 2H1이 상용화된 항체에 비해 더욱 우수한 반응성을 나타냄을 확인하였다(Size 35.3Kda). As shown in Figure 3, it was confirmed that the monoclonal antibodies 3D5 and 2H1 selected through the present invention exhibited better reactivity than commercially available antibodies (Size 35.3 Kda).
실시예 3. 신규한 단일클론항체를 이용한 래피드 진단 키트의 제작Example 3. Production of a rapid diagnostic kit using a novel monoclonal antibody
3-1. 래피드 키트 스트립을 이용한 항체 선별3-1. Antibody selection using rapid kit strips
실시예 2에서 선별된 단일클론항체를 포함하는 래피드 키트를 제작하여, LDH1에 대한 검출능을 확인하였다. 보다 구체적으로, 상기 ELISA 방법으로 선별된 단일클론항체 후보군들을 각 1mg/ml의 농도로 희석하여 니트로셀룰로오스 멤브레인 (nitrocellulose membrane)에 1μl씩 점적하였다. 또한 항체-금(gold) 나노입자 축합체를 LDH1 (1mg/ml) 또는 락토바실러스 균주와 섞은 후 점적 부위의 색상 변화 정도를 관찰하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. A rapid kit containing the monoclonal antibodies selected in Example 2 was manufactured and the detection ability for LDH1 was confirmed. More specifically, the monoclonal antibody candidates selected by the above ELISA method were each diluted to a concentration of 1 mg/ml and 1 μl each was spotted on a nitrocellulose membrane. Additionally, after mixing the antibody-gold nanoparticle condensate with LDH1 (1mg/ml) or Lactobacillus strain, the degree of color change at the drop site was observed. The results are shown in Figure 4.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 단일클론항체를 2가지씩 세트로 반응시킨 결과, Blank에는 결합하지 않고, LDH1와 락토바실러스 균주에 강하게 반응하는 것을 확인하였으며, 그 중 3번 세트인 2H1-3D5의 세트가 가장 우수한 결과를 나타냄을 확인하였다. As shown in Figure 4, as a result of reacting two sets of monoclonal antibodies according to the present invention, it was confirmed that they did not bind to Blank and reacted strongly to LDH1 and Lactobacillus strains. Among them, set number 3, 2H1- It was confirmed that the 3D5 set gave the best results.
3-2. 래피드 진단 키트 상에서 최종 선별 항체의 검출능 확인3-2. Confirmation of detection ability of final selection antibody on rapid diagnostic kit
래피드 키트를 이용해 상기 3-1에서 최종 선별된 단일클론항체인 2H1과 3D5의 LDH1 항원에 대한 검출능을 확인하였다. 구체적으로 2H1 항체를 포획 항체로 이용하고, 3D5 항체를 검출 항체로 이용하였다. 3D5 항체 (테스트 라인) 및 anti-Nus A 항체 (컨트롤 라인)를 니트로셀룰로오스 멤브레인 (nitrocellulose membrane)에 점적한 스트립을 27x300mm로 준비하였다. 그 다음 2H1 항체-금 나노입자 축합체와 Nus A Protein-금 나노입자를 컨주게이트 패드에 분주한 후 건조하여 준비하였다. 니트로셀룰로오스 멤브레인 하단에 컨주게이트 패드와 시료 패드를 부착하고 상단에는 흡수패드를 부착시켜 래피드 키트를 제조한 후, LDH1 단백질을 농도별로 준비한 시료를 검체 주입부에 넣고 테스트라인의 색상 변화 정도를 관찰하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다. The detection ability of 2H1 and 3D5, the monoclonal antibodies finally selected in 3-1 above, for LDH1 antigen was confirmed using a rapid kit. Specifically, the 2H1 antibody was used as a capture antibody, and the 3D5 antibody was used as a detection antibody. A strip of 27x300 mm was prepared in which 3D5 antibody (test line) and anti-Nus A antibody (control line) were spotted on a nitrocellulose membrane. Next, 2H1 antibody-gold nanoparticle condensate and Nus A Protein-gold nanoparticle were prepared by dispensing onto the conjugate pad and drying it. After manufacturing the rapid kit by attaching the conjugate pad and sample pad to the bottom of the nitrocellulose membrane and attaching the absorption pad to the top, samples prepared by concentration of LDH1 protein were placed in the sample injection section and the degree of color change in the test line was observed. . The results are shown in Figure 5.
도 5에 나타낸 바와 같이, 두 가지의 단일클론항체인 2H1과 3D5가 피부에서 락토바실러스 플란타룸을 검출하기 위한 신속 진단 키트에 적용될 수 있으며, 특히 약 0.032μg/ml의 수준까지 신속하고 정확하게 검출 가능함을 확인하였다.As shown in Figure 5, two monoclonal antibodies, 2H1 and 3D5, can be applied to a rapid diagnostic kit for detecting Lactobacillus plantarum on the skin, and in particular, can be detected quickly and accurately up to a level of about 0.032 μg/ml. It was confirmed that it was possible.
다음으로 락토바실러스 플란타룸이 존재하는 실제 피부 표피를 긁어 제조한 검체를 대상으로 상기에서 개발된 래피드 진단 키트를 이용하여 락토바실러스 플란타룸의 검출 가능 여부에 대한 실험을 수행하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다. Next, an experiment was conducted to determine whether Lactobacillus plantarum could be detected using the rapid diagnostic kit developed above on a sample prepared by scraping the actual skin epidermis where Lactobacillus plantarum exists. The results are shown in Figure 6.
도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 단일클론항체인 2H1과 3D5를 이용하여 실제 피부에서 락토바실러스 플란타룸의 신속 진단이 가능함을 확인하였다. As shown in Figure 6, it was confirmed that rapid diagnosis of Lactobacillus plantarum on actual skin was possible using the monoclonal antibodies 2H1 and 3D5 according to the present invention.
실시예 4. 신규한 단일클론항체인 2H1과 3D5의 서열분석Example 4. Sequence analysis of novel monoclonal antibodies 2H1 and 3D5
상기 실시예 3에서 효과를 확인한 단일클론항체 2H1과 3D5의 서열분석을 수행하였다. Sequence analysis of the monoclonal antibodies 2H1 and 3D5, whose effectiveness was confirmed in Example 3, was performed.
그 결과 단일클론항체 2H1은 서열번호 1 내지 3의 CDR 1 내지 3을 포함하고 있는 서열번호 7의 중쇄와 서열번호 4 내지 6의 CDR 1 내지 3을 포함하고 있는 서열번호 8의 경쇄로 이루어져 있음을 확인하였다. 또한, 단일클론항체 3D5는 서열번호 9 내지 11의 CDR 1 내지 3을 포함하고 있는 서열번호 15의 중쇄와 서열번호 12 내지 14의 CDR 1 내지 3을 포함하고 있는 서열번호 16의 경쇄로 이루어져 있음을 확인하였다.As a result, monoclonal antibody 2H1 was found to be composed of a heavy chain of SEQ ID NO: 7 containing CDRs 1 to 3 of SEQ ID NOs: 1 to 3 and a light chain of SEQ ID NO: 8 containing CDRs 1 to 3 of SEQ ID NOs: 4 to 6. Confirmed. In addition, monoclonal antibody 3D5 is composed of a heavy chain of SEQ ID NO: 15 containing CDRs 1 to 3 of SEQ ID NOs: 9 to 11 and a light chain of SEQ ID NO: 16 containing CDRs 1 to 3 of SEQ ID NOs: 12 to 14. Confirmed.
이상의 실험 결과를 통하여, 락토바실러스 플란타룸의 LDH1 단백질에 특이적으로 결합하는 신규한 단일클론항체 2H1과 3D5를 이용하여, 피부에서 직접적으로 락토바실러스 플란타룸의 존재 여부를 판단함으로써 피부 상태를 진단할 수 있는 래피드 진단 키트를 제조할 수 있음을 확인하였다. Through the above experimental results, the skin condition can be assessed by directly determining the presence of Lactobacillus plantarum on the skin using novel monoclonal antibodies 2H1 and 3D5 that specifically bind to the LDH1 protein of Lactobacillus plantarum. It was confirmed that a rapid diagnostic kit capable of diagnosis could be manufactured.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As the specific parts of the present invention have been described in detail above, those skilled in the art will understand that these specific techniques are merely preferred embodiments and do not limit the scope of the present invention. It will be obvious. Accordingly, the actual scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
Claims (14)
서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 락토바실러스 플란타룸의 LDH1 단백질에 특이적인 항체.A heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, a heavy chain CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and a heavy chain CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3;
Lactobacillus planta, comprising a light chain variable region comprising light chain CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, light chain CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, and light chain CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 Antibodies specific for the LDH1 protein of room.
상기 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체.According to claim 1,
The antibody is characterized in that it comprises a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7.
상기 항체는 서열번호 8의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체.According to claim 1,
The antibody is characterized in that it comprises a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8.
서열번호 12의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR1, 서열번호 13의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR2, 및 서열번호 14의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는, 락토바실러스 플란타룸의 LDH1 단백질에 특이적인 항체.A heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 9, a heavy chain CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10, and a heavy chain CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11;
Lactobacillus planta, comprising a light chain variable region comprising light chain CDR1 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 12, light chain CDR2 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13, and light chain CDR3 represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 Antibodies specific for the LDH1 protein of room.
상기 항체는 서열번호 15의 아미노산 서열로 표시되는 중쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체.According to claim 4,
The antibody is characterized in that it comprises a heavy chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15.
상기 항체는 서열번호 16의 아미노산 서열로 표시되는 경쇄 가변영역을 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체.According to claim 4,
The antibody is characterized in that it comprises a light chain variable region represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16.
상기 2종류의 항체 중 어느 한 종류의 항체는, 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 항체를 포함하고, 다른 한 종류의 항체는 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 항체이며,
상기 어느 한 종류의 항체가 포획 항체이면, 상기 다른 한 종류의 항체는 검출항체이고,
상기 어느 한 종류의 항체가 검출 항체이면, 상기 다른 한 종류의 항체는 포획 항체인 것인, 키트. The method of claim 11, wherein the kit includes two types of antibodies,
Among the two types of antibodies, one type of antibody includes the antibody of any one of claims 1 to 3, and the other type of antibody is the antibody of any one of claims 4 to 6,
If one type of antibody is a capture antibody, the other type of antibody is a detection antibody,
A kit wherein if the one type of antibody is a detection antibody, the other type of antibody is a capture antibody.
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| KR20170044773A (en) * | 2015-10-15 | 2017-04-26 | 서울대학교산학협력단 | Composition and screening method for identifying Lactobacillus sp. having anti-viral or immune enhancement activity |
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