KR102647687B1

KR102647687B1 - 유리화 동결을 위한 보존 용기

Info

Publication number: KR102647687B1
Application number: KR1020210090755A
Authority: KR
Inventors: 현창섭; 허용수; 양성호
Original assignee: 의료법인마리아의료재단; 현창섭; 허용수; 양성호
Priority date: 2021-02-10
Filing date: 2021-07-12
Publication date: 2024-03-13
Also published as: KR20220115496A; KR102278277B1

Abstract

본 발명은 냉동보존에 이용되는 유리화 용기에 관한 것으로, 세포를 냉동하고 해동하는 작업 시 핸들링부와 세포를 부착(loading)하는 부위를 구분지어 표시함으로써 바이알(vial)에 넣고 보관 시 세포가 유실 될 가능성이 현저히 저하 될 뿐만 아니라, 이동 시 편리하고, 제1흡수부 또는 제2흡수부가 더 포함되어 세포의 얼음 결빙을 최소화하여 세포의 생존율을 증진시킬 수 있는 장점이 있다.

Description

유리화 동결을 위한 보존 용기{THE DEVELOPMENT OF VITRIFICATION CONTAINER FOR CRYOPRESERVATION}

본 발명은 냉동보존에 이용되는 유리화 용기에 관한 것으로, 구체적으로는 인간 또는 동물의 생식세포 냉동보존에 적용되는 유리화 동결을 위한 보존 용기 및 유리화 방법에 관한 것이다.

일반적으로, 보조생식술 (Assisted Reproductive Technology, ART) 에서 난자 또는 배아와 같은 생식세포의 냉동보관은 난임 환자에게 더 많은 임신의 기회를 제공해주는 기술로 알려져 있다.

이러한 생식세포의 냉동보관 기술은 크게 완만 동결법과 유리화 동결법으로 나눌 수 있다.

먼저, 완만 동결법은 세포질 내 수분의 일부분과 동결 억제제를 삼투압 원리를 이용하여 세포질 내의 수분 일부와 투과동결억제제(permeable cryoprotectant)를 치환하여 평형시킨 후 세포동결기에 의해 세포 외부의 수분을 천천히 동결시키는 과정을 통해 세포 외부의 동결억제제의 농도를 올려 삼투압을 발생시키고, 이 힘을 이용하여 세포 내에 남아있는 물을 천천히 제거시켜 최소한의 수분만을 남겨 세포 내에 남아 있는 수분의 얼음 결정을 최소화하는 기술로 알려져 있다.

하지만 이 방법은 비교적 고가의 장비와 많은 시간의 소요 및 많은 양의 액체질소가 필요하며, 특히 얼음 결정(ice crystal) 현상으로 인해 해동 후 생식세포의 생존율 및 회수율에 치명적 단점을 가지고 있다.

이에 반해 유리화 동결법(vitrification method)은 생식세포의 동결 시 투과율이 높고 독성이 적은 동결 억제제 또는 투과성과 비투과성 동결억제제 조합을 이용하여 상대적 농도 변화 없이 절대적인 농도를 낮추고, 세포에 독성을 감소시키며, 해동 후 동결된 생식세포 효율성을 증진시켜 주는 기술로 알려져 있다.

또한, 공정이 간편하고 신속하기 때문에 동결 보존을 위한 조작 시간이 단축되고, 온도 제어 장치가 필요하지 않다는 이점을 가지고 있다.

이러한 유리화 동결법은 다양한 세포 또는 조직의 동결 보존에 적용되고 있으며, 많은 난임 시험관 시술 센터와 동물 생식세포 연구소에서도 폭 넓게 이용하고 있는 실정이다.

그러나 현재 사용하고 있는 크라이오 탑(cryo-top), 크라이오 루프(cryo-loop), 크라이오파이펫(cryo-pipet), 크라이오팁(cryo-tip), 이엠그리드(EM-grid) 등과 같은 유리화 운반체(vitrification carrier) 또는 유리화 용기(vitrification container)는 시중에서 고가로 제공되어 난임 시술비용과 동물 연구의 비용을 증가시킬 뿐만 아니라, 생식세포 냉동 후 해동 시 검체 튜브 또는 스트로우 캐니스터의 폭발 또는 생식세포 부착으로 인한 생식세포의 손실률이 높은 단점을 가지고 있다.

이러한 문제점을 보완하기 위한 배경기술을 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 제10-1962052호(이하 ‘문헌 1’)의 “세포 또는 조직의 동결 보존용 지그 및 동결 보존 방법”에서, 세포 또는 조직을 올려놓는 재치부의 최표면에 수용성 고분자 화합물을 함유하는 표면층의 전체 또는 일부가 융해액 중에 용해되어 세포 또는 조직이 동결 보존용 지그의 재치부에 고착되지 않아, 용이하게 박리, 회수될 수 있는 장점이 있다.

그러나 문헌 1의 세포로서 배아 또는 난자를 포함하는 생식세포가 적용될 경우, 생식세포는 일반세포 또는 암세포보다 크기가 크기 때문에 얼음결정이 형성되어 쉽게 손상될 수 있는 단점이 있다.

다른 배경기술을 살펴보면, 대한민국 공개특허공보 제10-2020-0005582호(이하 ‘문헌 2’)의 “세포 또는 조직의 동결 보존용 지그”에서, 재치부 표면이 세포 또는 조직을 유지하는 볼록부와 보존액을 저류시키는 오목부를 갖는 세포 또는 조직의 동결 보존용 지그에 대해 개시하고 있다.

문헌 2의 발명을 이용할 경우, 볼록부와 오목부에 의해 세포 또는 조직 주변에 남아있는 보존액을 제거하는데 용이한 장점이 있으나, 오목부와 볼록부의 형상에 의해 세포가 손상될 수 있는 단점이 있다.

다른 배경기술을 살펴보면, 일본 공개특허공보 특개 2020-103224호(이하 ‘문헌 3’)의 “동결보존용 지그”에서, 광투과성 지지체 상에 접착층과 접착층에 저장액 흡수층이 적층된 보존액 흡수체를 갖는 동결보존용 지그에 대해 개시하고 있다.

문헌 3의 발명을 이용할 경우, 세포 또는 조직의 동결작업 시 보존액의 국소적인 포화를 방지하고 불필요한 보존액을 신속하게 제거할 수 있는 장점이 있으나, 지지체 상측에 흡수층이 형성되어 해동 시 얼음결정 형성으로 인해 세포의 손상을 유발할 수 있는 단점이 있다.

다른 배경기술을 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 제10-1988140호(이하 ‘문헌 4’)의 “세포 또는 조직의 유리화 동결 보존용 지그”에서, 지지체 상에 접착층과 유리화액 흡수층이 형성된 유리화액 흡수체를 갖고, 유리화액 흡수층의 세포 또는 조직을 올려놓는 부분과 지지체 사이에 접착층이 존재하지 않는 부분을 갖는 것을 특징으로 하는 세포 또는 조직의 유리화 동결 보존용 지그에 대해 개시하고 있다.

문헌 4의 발명을 이용할 경우, 여분의 유리화액을 유리화액 흡수체가 흡수시킴으로써, 여분의 유리화액을 제거시키기 위한 별도의 공정이 수행되지 않아 간편한 장점이 있지만, 유리화액 흡수층과 지지체 상측에 형성된 접착층 등이 좁은 용기 내에 위치되어 구조적으로 복잡하고 제작비용 상승에 원인이 되는 단점이 있다.

<배경기술문헌>

대한민국 등록특허공보 제10-1962052호

대한민국 공개특허공보 제10-2020-0005582호

일본 공개특허공보 특개 2020-103224호

대한민국 등록특허공보 제10-1988140호

본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 종래에 세포 냉동보존을 위해 적용되는 크라이오 탑(cryo-top), 크라이오 루프(cryo-loop), 크라이오파이펫(cryo-pipet), 크라이오팁(cryo-tip), 이엠그리드(EM-grid) 등과 같은 유리화 운반체(vitrification carrier) 또는 유리화 용기(vitrification container)는 시중에서 고가로 제공되어 난임 시술비용과 동물 연구의 비용을 증가시킬 뿐만 아니라, 세포 냉동 후 해동 시 검체 튜브 또는 스트로우 캡슐의 폭발로 인해 세포의 손실율이 높은 단점을 보완 할 수 있는 유리화 동결을 위한 보존 용기 및 이를 이용한 유리화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

더욱이, EM-grid는 금속으로 형성되어 전자현미경에서 시료를 현미경으로 관찰하기 위해 고정시키기 위한 용도로 개발된 것으로, 냉동보존에 적용될 경우, 세포의 유기 고분자와 금속 간의 친화성으로 인해 세포의 냉동 또는 해동 시 금속에 세포가 달라붙게 되어 해동 후 세포가 폐사하는 단점을 최소화시킬 수 있는 유리화 동결을 위한 보존 용기 및 이를 이용한 유리화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 냉동된 세포의 폐사와 손실 가능성을 줄일 뿐만 아니라, 제1용기에 절곡 형성된 핸들링부에 별도의 표시가 적용되어 냉동된 세포 위치와 혼돈을 최소화하고, 세포의 이동 또는 보관 과정에서 유실될 가능성을 낮출 수 있는 유리화 동결을 위한 보존 용기 및 이를 이용한 유리화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

나아가, 수용부, 제1흡수부 또는 제2흡수부를 선택적으로 더 포함시켜 보다 적은 양의 유리화 냉동액으로 세포를 냉동 보존하여 얼음결정을 최소화하고 생존율을 증진시킬 수 있는 유리화 동결을 위한 보존 용기 및 이를 이용한 유리화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은, 상측에 세포(10)를 수용할 수 있도록 판 형태로 형성된 제1용기(100)를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 제1용기(100)는 집게를 포함하는 기구에 의해 파지되는 것을 특징으로 한다.

더욱이, 세포(10)는 시험관아기 시술에 적용되는 정자, 난자 또는 배아를 포함하는 생식세포인 것을 특징으로 한다.

또한, 제1용기(100)는 합성수지로 형성된 것을 특징으로 한다,

더욱이, 제1용기(100)는 PET(polyethyleneterephthalate), PCTFE(Poly-Chloro-Tri-Fluoro Ethylene), PTFE(Polytetrafluoroethylene) 또는 PFA(perfluoroalkoxy) 중 선택되는 어느 하나 이상으로 형성된 것을 특징으로 한다.

또한, 제1용기(100)는 단부가 상측방향으로 절곡 형성된 핸들링부(110)를 포함하는 것을 특징으로 한다.

더욱이, 제1용기(100) 단부에 이동 또는 사용의 편의성을 위해 세포(10)가 수용되는 부분의 마주보는 측에 제1표시부(111)가 형성된 것을 특징으로 한다.

또한, 제1용기(100)는 세포(10)와 인접한 위치에 길이 방향으로 연장 형성되며, 내측에 홈이 형성된 수용부(200)를 포함하는 것을 특징으로 한다.

더욱이, 제1용기(100)의 세포(10)와 인접한 위치에 형성된 제1흡수부(300)를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 제1용기(100)의 단부 하측에 외측방향으로 돌출 형성된 제2흡수부(400)를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 종래에 세포 냉동보존을 위해 적용되는 EM grid와 같은 냉동보존을 위한 기구 또는 용기들은 금속으로 형성되어 전자현미경에서 시료를 현미경으로 관찰하기 위해 고정시키기 위한 용도로 개발된 것으로, 냉동보존에 적용될 경우, 세포의 유기 고분자와 금속 간의 친화성으로 인해 세포의 냉동 또는 해동 시 금속에 세포가 달라붙게 됨에 따라, 해동 후 세포가 폐사하는 단점을 최소화시키고 사용 용도에 맞지 않는 기구를 사용하지 않는 장점이 있다.

또한, 제1용기에 절곡 형성된 핸들링부가 형성되어 세포를 냉동 또는 해동 시 손쉽게 바이알(vial)에 넣어 보관하고 이동 할 수 있도록 형성되어, 세포를 냉동하고 해동하는 작업 시 핸들링부와 세포를 부착(loading)하는 부위를 구분지어 표시함으로써 바이알에 넣고 보관 시 세포가 유실 될 가능성이 현저히 저하 될 뿐만 아니라, 이동 시 편리한 장점이 있다.

더욱이, 제1용기에 수용부, 제1흡수부 또는 제2흡수부가 선택적으로 더 포함되어 보존액인 유리화 냉동액의 양을 적게 적용시키면서 얼음결정으로 인한 세포의 얼음 결빙을 최소화하여 폐사 또는 손실을 저하시켜줌으로써, 세포의 생존율을 증진시킬 수 있는 장점이 있다.

나아가, 제1용기에 세포를 수용할 수 있는 부분이 종래에 적용되는 EM-grid 보다 크게 형성되어 사용자 또는 외부 자극에 따른 세포의 손실이 현저히 저하될 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명에 따른 냉동보존에 이용되는 유리화 용기의 사시도이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 사시도이다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 단면도이다.
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 사시도이다.
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 단면도이다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 단면도이다.
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 사시도이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 사시도이다.
도 9는 본 발명의 실시예에 따른 사시도이다.
도 10은 본 발명의 실시예에 따른 사시도이다.
도 11은 실험예 1의 결과 값이다.
도 12는 실험예 1의 결과 값이다.
도 13은 실험예 1의 결과 값이다.
도 14는 실험예 1의 결과 값이다.
도 15는 실험예 2의 결과 값이다.
도 16은 본 발명의 실시예에 따른 단면도이다.
도 17은 본 발명의 실시예에 따른 단면도이다.
<부호의 설명>
10: 세포, 20: 바닥면
100: 제1용기, 110: 핸들링부, 111: 제1표시부
200: 수용부, 210: 수용로
300: 제1흡수부
400: 제2흡수부

이하, 실시예들을 통하여 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명의 목적, 특징, 장점은 이하의 실시예들을 통해 쉽게 이해될 것이다.

본 발명은 여기에서 개시되는 실시예들에 한정되지 않고, 다른 형태로 구체화될 수 있다. 여기에서 개시되는 실시예들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 사람에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위하여 제공되는 것이고, 본 발명의 기술적 사상 및 기술적 범위에 포함되는 모든 변환, 균등물 또는 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

따라서 이하의 실시예들에 의하여 본 발명이 제한되어서는 안 되며, 본 발명의 기술적 사상 및 기술적 범위에 포함되는 모든 변환이 포함되는 것으로 이해되어야 한다. 즉, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 사람이라면 청구범위에 기재된 본 발명의 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서, 구성 요소의 부가, 변경, 삭제 또는 추가 등에 의해 본 발명을 다양하게 수정 또는 변경시킬 수 있을 것이며, 이 또한 본 발명의 권리범위 내에 포함된다고 할 것이다.

본 발명은 다양한 변환이 가해질 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세하게 설명한다. 도면들에서 요소의 크기 또는 요소들 사이의 상대적인 크기는 본 발명에 대한 명확한 이해를 위해서 다소 과장되게 도시될 수 있다. 또한, 도면들에 도시된 요소의 형상이 제조 공정상의 변이 등에 의해서 다소 변경될 수 있다.

따라서 본 명세서에서 개시된 실시예들은 특별한 언급이 없는 한 도면에 도시된 형상으로 한정되어서는 안 되며, 어느 정도의 변형을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

한편, 본 발명의 여러 가지 실시예들은 명확한 반대의 지적이 없는 한 그 외의 어떤 다른 실시예들과 결합될 수 있다. 특히 바람직하거나 유리하다고 지시하는 어떤 특징도 바람직하거나 유리하다고 지시한 그 외의 어떤 특징 및 특징들과 결합될 수 있다. 즉, 본 발명의 다양한 양상들, 특징들, 실시예들 또는 구현예들은 단독으로 또는 다양한 조합들로 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어는 특정의 실시예를 기술하기 위한 것일 뿐 청구범위에 의해서 한정하려는 것은 아님을 이해하여야 하고, 본 명세서에 사용되는 모든 기술용어 및 과학용어는 다른 언급이 없는 한 통상의 기술을 가진 사람에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다.

본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

<실시예 1>

본 발명에 따른 냉동보존에 이용되는 유리화 용기(이하, 설명의 편의를 위해 ‘용기’라 함)는 도 1에 도시된 바와 같이, 세포(10) 및 제1용기(100)를 포함하여 형성될 수 있다.

더욱 자세히 설명하면, 본 발명에 따른 용기는 상측에 세포(10)를 수용할 수 있도록 판 형태로 형성된 제1용기(100)를 포함하여 형성될 수 있다.

이때, 세포(10)는 보존액 내에 보존되고 있는 세포(10)로서, 시험관아기 시술에 적용되는 정자, 난자, 배아 또는 착상되기 전 상태의 배아인 배반포 등과 같은 생식세포가 적용될 수 있다.

바람직하게 세포(10)는 정자, 난자 또는 배아 등과 같은 생식세포가 적용될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.

이와 같이, 세포(10)가 보존액에 보존되어 제1용기(100)에 이동 시 세포가 손상되거나 유실되지 않도록 형성될 수 있다.

다음으로, 제1용기(100)는 상측에 세포(10)를 수용할 수 있도록 판 형태로 형성될 수 있다.

이때, 도 1에 도시된 바와 같이, 제1용기(100)의 일측 단부 상측에 세포(10)가 안정적으로 위치(loading)됨으로써, 세포(10)가 안정적으로 위치될 뿐만 아니라, 세포(10)가 제1용기(100)에 달라붙지 않는 장점이 있다.

이를 위해, 제1용기(100)는 세포(10)를 안정적으로 지지하기 위해 합성수지로 형성될 수 있으며, 바람직하게는 PET(polyethyleneterephthalate), PCTFE(Poly-Chloro-Tri-Fluoro Ethylene), PTFE(Polytetrafluoroethylene) 또는 PFA(perfluoroalkoxy) 중 선택되는 어느 하나 이상으로 형성될 수 있다.

가장 바람직하게, 강성, 전기적 성질, 내유성, 내약품성, 항장력, 내열성, 투명성이 뛰어나다고 알려져 있는 PET 또는 PCTFE 중 선택되는 어느 하나 이상의 소재로 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.

선택적으로, 세포(10)의 시인성을 높이기 위해, 제1용기(100)는 투명한 재질로 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.

더욱이, 제1용기(100)는 판상으로 형성되어 상측에 위치되는 세포(10)를 안정적으로 지지할 수 있도록 형성될 수 있다.

이를 위해, 제1용기(100)의 길이는 50mm이하로 형성될 수 있으나, 바람직하게 20~30mm로 형성되어 작업자가 제1용기(100)를 용이하게 이동시킬 수 있을 뿐만 아니라, 세포(10)를 수용할 수 있는 충분한 길이를 제공할 수 있는 장점이 있다.

더욱 바람직하게는 25mm으로 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.

나아가, 제1용기(100)의 폭은 0.5~5mm의 폭으로 형성될 수 있으며, 바람직하게는 1~3mm의 폭으로 형성될 수 있고, 가장 바람직하게는 2mm로 형성될 수 있다.

만약, 제1용기(100)의 폭이 0.5mm이하로 형성될 경우, 제1용기(100)의 폭에 의해 세포(10) 뿐만 아니라, 보존액이 제1용기(100) 외측으로 이탈되어 세포(10)에 손상이 가해질 가능성이 높은 단점이 있고, 5mm 이상으로 형성될 경우, 넓은 폭에 의해 제조단가가 높아지는 단점이 있다.

또한, 제1용기(100)는 집게를 포함하는 기구에 의해 파지되도록 형성될 수 있다.

더욱 자세히 설명하면, 제1용기(100)를 파지하기 위한 기구에 의해 제1용기(100)에서 세포(10)의 위치와 마주보는 측의 단부가 파지되어 사용자가 원하는 위치에 이동될 수 있는 것이다.

이를 위해, 제1용기(100)를 파지하기 위한 기구는 집게가 적용될 수 있으며, 바람직하게는 핀셋이 적용될 수 있고, 가장 바람직하게는 의료용 포셉(forcep)이 적용될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.

<실험예 1>

1) 생쥐 배아 배양

1-1) 6주령의 B6D2 F1 생쥐에 PMSG(pregnant mare serum gonadotropin) 7.5IU을 주사하고, 48시간 후에 hCG 7.5IU을 주사하여 과배란을 유도 하였다.

1-2) 체내 수정을 유도하기 위하여 동일 계통의 수컷 생쥐와 교미 시켰다.

1-3) hCG 주사 20시간 후에 암컷 생쥐의 plug을 검사하여 교미 여부를 확인하고 생쥐의 경추를 탈골하여 도살하였다.

1-4) 도살한 생쥐로 부터 난소만을 떼어 낸 다음, MTF(mouse tubal fluid)배양액이 들어있는 접시로 옮겼다.

1-5) 해부 현미경 하에서 37℃ 로 유지된 MTF 배양액이 담긴 주사기를 난관 한쪽 끝에 넣어서, 조심스럽게 배양액을 난관에 넣어주면서 배아가 반대편 끝으로 나오도록 유도하였다.

1-6) 난구세포괴를 Hyaluronidase를 포함한 배양액에 넣고 난구 세포를 제거하였다.

1-7) 생쥐 배아를 회수하여 2차례 신선한 배양액으로 세척한 후에 배양기에서 배양하였다.

1-8) 체외에서 48시간 배양하여 얻은 6~8세포기의 배아를 3종류의 냉동 보관 용기(EM grid, cryotop, TPS)에 나누어 각각 100여 개 가량의 배아를 유리화 동결하였다.

이때, TPS는 본 발명에 따른 유리화 동결을 위한 보존 용기가 적용되었다.

1-9) 체외에서 96시간 배양하여 얻은 배반포 배아를 3종류의 냉동 보관 용기(EM grid, Cryotop, TPS)에 나누어 각각 100여 개 가량의 배아를 유리화 동결하였다.

1-10) 120시간 이상 배양한 탈각 중 이거나 탈각한 배반포 배아를 2종류의 냉동 보관 용기(EM grid, TPS)에 나누어 각각 80여 개 가량을 유리화 동결하였다.

2) 생쥐배아 냉동

2-1) 7.5% ethylene glycol, 7.5% DMSO(Dimethyl sulfoxide), 20% SSS(serum substitute supplement) in D-PBS로 형성된 유리화용액 1(Vitrification solution 1)을 제조하였다.

2-2) 15% ethylene glycol, 15% DMSO(Dimethyl sulfoxide), 10μg/ml의 Ficoll, 0.65M의 sucrose, 20% SSS(serum substitute supplement) in D-PBS로 형성된 유리화용액 2(Vitrification solution 2)를 제조하였다.

2-3) 배아를 유리화용액 1에 2분간 정치시킨 다음, 유리화용액 2에 45초간 정치시킨 후, 유리화 용액 2에 노출된 배아는 EM grid, cryotop, TPS에 빠르게 옮겼다.

3) 생쥐배아 해동

3-1) 0.25M sucrose, 20% SSS in D-PBS로 형성된 해동 용액 1(warming solution 1)을 제조하였다.

3-2) 0.125M sucrose, 20% SSS in D-PBS로 형성된 해동용액 2(warming solution 2)를 제조하였다.

3-3) EM grid, Cryotop, TPS를 해동 용액 1에 2분간 정치시킨다.

3-4) 해동 용액 2에 3분간 정치시켰다.

3-5) 3회 세척한 후 배양하였다.

4) 생쥐배아 냉동 및 해동 후 세포 사멸 검사

4-1) 생쥐배아를 4% paraformaldehyde에 30분간 실온에 정치시켰다.

4-2) 0.3% polyvinylalcohol에 3차례 세척하였다.

4-3) 4℃에서 10분간 0.1% Triton X-100을 투과시킨 후 0.3% polyvinylalcohol로 3차례 세척하였다.

4-4) 암소(暗所)에서 1시간 동안 37℃에서 TUNEL 반응액으로 배양하였다.

4-5) 슬라이드에 4,6-diamidino-2-phenyldole로 고정하였다.

4-6) 슬라이드 커버를 씌우고 형광현미경으로 관찰하였으며, 전체 세포 수는 파란색으로 나타나고 사멸한 세포는 녹색으로 관찰되었다.

도 11에 도시된 바와 같이, EM grid, Cryotop, TPS를 이용하여 분열기 배아를 냉동 후 해동하였을 때 배아의 생존율(Survived embryos), 배반포 발생률(produced blastocysts) 및 세포 사멸률(Apoptotic cells)을 살펴보았을 때 세 그룹간의 차이는 유의한 차이는 관찰되지 않았다.

이때, 도 11에 도시된 값은 숫자(%) 또는 평균±SD로 표시되었으며, 열 내에서 다른 위첨자가 있는 값은 ρ>0.05에서 유의미한 차이는 없는 것으로 판단되었다.

더욱이, Survived embryos, produced blastocysts and hatching-stage blastocysts는 각각 카이제곱테스트(chi-square test)에 의한 값이고, No. of total cells, No. of apoptotic cells는 분산분석(Tukey’s test)에 의한 값이다.

또한, produced blastocysts는 가온 후 배아를 48시간 동안 시험관 내에서 배양하고, 배반포 단계에 도달하는 속도를 평가하였다.

더욱이, hatching-stage blastocysts는 가온 후 배아를 72시간 동안 시험관 내에서 배양하고 배아의 부화율을 평가하였다.

또한, 도 12에 도시된 바와 같이, 부화 중인 생쥐 배반포를 사용하여 냉동 후 해동하였을 때 TPS 와 EM grid 간에 재확장율(Re-expanded blastocysts)과 부화율(Hatched blastocysts)은 크게 차이가 나타나지 않았다.

그러나 배아의 생존율은 TPS을 사용했을 때 EM grid 보다 배아의 생존율(Survived embryos)이 유의하게 높게 관찰되었다(ρ<0.05).

이때, 도 12에 도시된 값은 숫자(%)로 표시되었으며, Re-expanded blastocysts는 가온 후 배아를 체외에서 3시간 동안 배양하고 배아의 재 팽창률을 평가한 것이고, Hatched blastocysts는 가온 후 배아를 24시간 동안 시험관 내에서 배양하고 부화 단계에 도달하는 속도를 평가한 것이다.

더욱이, 도 13에 도시된 바와 같이, 완전히 부화된 배반포를 냉동 후 해동하였을 때 TPS와 EM grid 간의 생존율(Surviving embryos) 차이는 관찰되지 않았으나, 재확장율(Re-expanded blastocysts)은 TPS를 사용한 경우에 EM grid를 사용한 경우보다 유의하게 높게 관찰되었다(ρ<0.05).

이때, 도 13에 도시된 값은 숫자(%)로 표시되었으며, Re-expanded blastocysts는 가온 후 배아를 3시간 동안 in vitro 배양하여 배아의 재 팽창률을 평가한 것이다.

다음으로, 도 14에 도시된 바와 같이, 생쥐 배반포 배아를 냉동 후 해동하였을 때 EM grid, Cryotop, TPS간에 생존율(surviving embryos)을 살펴보았을 때 Cryotop 과 TPS의 생존율이 EM grid를 사용한 경우보다 유의하게 높게 나타났다.

이때, 생존한 생쥐 배반포의 재확장율(re-expanded blastocysts)의 차이는 세 그룹 간에 유의한 차이는 관찰되지 않았다.

그러나 재확장 후 부화 단계까지 도달한 배아의 수(hatching-stage blastocysts), 배반포 세포수(Total No. of cells), 사멸된 세포수(No. of apoptotic cells) 간의 차이는 EM grid를 사용하였을 때 유의하게 낮은 것을 관찰 할 수 있었다(ρ<0.05).

그러므로 TPS는 기존에 사용되고 있는 EM grid 보다 냉동 및 해동 과정에서 보다 높은 배아의 생존율을 보이고 해동 후 배아가 사멸하지 않고 지속적으로 발생하는 경향도 높으며 해동 후 사멸되는 세포 수도 적은 것을 알 수 있었다.

즉, TPS가 냉동 운반체로써 기존에 사용되고 있는 EM grid 보다 월등하게 양호한 결과를 보이고, 해외에서 수입해 사용하고 있는 Cryotop 과는 대등한 결과를 보인다는 점에서 새로운 냉동 운반체로써의 가치를 충분히 지니고 있다는 것을 유추할 수 있었다.

이때, 도 14에 도시된 값은 숫자(%) 또는 평균±SD로 표시되었으며, Survived embryos, produced blastocysts and hatching-stage blastocysts는 각각 카이제곱테스트(chi-square test)에 의한 값이고, No. of total cells, No. of apoptotic cells는 분산분석(Tukey’s test)에 의한 값이다.

더욱이, No. (%) of re-expanded blastocysts는 가온 후 배아를 체외에서 3시간 동안 배양하고 배아의 재 팽창률을 평가한 것이고, No. (%) of hatching-stage blastocysts는 가온 후 배아를 체외에서 24시간 동안 배양하고 배아의 부화율을 평한 것이다.

<실험예 2>

1) 인간 분열기 혹은 포배기 배아 동결 및 해동

1-1) vitrification basic media는 PBS, 20% SSS로 형성되며, vitrification solution 1은 20% Ethylene glycol, vitrification basic media로 형성되고, vitrification solution 2는 40% Ethylene glycol, 18% Ficoll, 0.3M sucrose, vitrification basic media로 형성된 냉동용 배양액을 준비하였다.

1-2) Thawing solution 1은 vitrification basic media로 형성되고, Thawing solution 2는 0.5M sucrose, vitrification basic media로 형성된 해동용 배양액을 준비하였다.

2) 인간 분열기 혹은 포배기 배아 유리화 동결 과정

2-1) 동결하고자 하는 배아를 배양기에서 내어 현미경하에서 관찰하여 냉동배아 개수와 배아의 질, 동결 횟수 등을 판단하고 기록하였다.

2-2) 동결할 배반포를 배양기에서 내어 29-G insulin syringe를 이용하여 shrink시켰으며, 분열기 배아는 이 과정을 생략하였다.

2-3) Shrink가 완벽히 되었는지를 확인 후 냉동할 배아가 들어있는 배양접시를 배아 냉동실로 이동시켰다.

2-4) 배아를 vitrification basic media로 옮기고 30초 동안 실온에 정치시켰다.

2-5) Vitrification solution 1에 배아를 옮기고 50초 동안 실온에서 정치시켰다.

2-6) EM-grid 혹은 TPS를 준비하고 cane, cryovial을 액체 질소에 담가 준비하였다.

2-7) 배아를 vitrification solution 2로 옮긴 후 20초 동안 실온에 정치시켰다.

2-8) Vitrification solution 2 처리가 완료되면 배아를 현미경 하에서 TPS 혹은 EM grid에 올렸다.

2-9) TPS 혹은 EM grid를 액체질소에 미리 냉각된 cryovial에 넣고 동결보존 tank(LN2 tank)에 넣어 보관하였다.

3) 인간 분열기 혹은 포배기 배아 해동

3-1) 해동용 dish에 해동 배양액을 각 0.5ml씩 넣어 준비하였다.

3-2) 해동할 배아가 보관된 액체질소 통에서 cane, cryovial을 꺼내어 이동용 질소탱크에 넣어두었다.

3-3) Cryovial 내 TPS 혹은 EM grid를 건져 내어 thawing solution 2에 담근 후 5분 동안 실온에 정치시켰다.

3-4) 배아를 thawing solution 1로 옮긴 후 5분 동안 실온에 정치시켰다.

3-5) 해동과정이 끝난 배아를 배양접시로 옮겨 여러 번 세척 후 배양용 dish에 옮겨 배양하였다.

3-6) 해동한 배아의 생존 가능성 여부 및 배아의 질을 관찰하였다.

이때, 배아의 배양은 배아의 배양은 CO₂:O₂:N₂의 비가 6:5:89의 환경 하에서 수행될 수 있다.

또한, 분열기 배아는 채취 후 3일째에 냉동을 실시하였고 8세포기를 기준으로 할구 분열이 빠르거나 느린 정도 그리고 할구의 균일 정도에 따라 배아의 질을 평가하였다.

더욱이, 배반포는 팽창 정도, 내세포괴의 질, 영양 상피세포 외관의 품질에 따라 A, B, C 등급으로 배반포를 등급화 시켰다.

정상적인 배란환자를 기준으로, 월경 2주 후 10mg의 에스트로겐을 투여하고, 자궁내막 두께가 8mm 이상일 때 프로게스테론을 투여한 다음, 배아 이식을 수행하였다.

배아 이식 14일 후에 혈청 hCG농도를 측정하여 임신여부를 확인하였다.

도 15에 도시된 바와 같이, 분열기 배아와 배반포를 각각 TPS 와 EM grid를 이용하여 냉동 및 해동을 수행했을 때 배아의 생존율과 이식 배아의 평균수는 크게 차이나지 않았다.

그러나 TPS 와 EM grid를 이용하여 냉동 및 해동을 수행했을 때 임상 임신율은 분열기 배아와 배반포에서 TPS를 사용했을 때 EM grid를 사용했을 때 보다 높게 나타났다.

이와 같이, 본 발명은 종래에 세포 냉동보존을 위해 적용되는 EM grid와 같은 냉동보존을 위한 기구 또는 용기들은 금속으로 형성되어 세포(10)의 냉동 또는 해동 시 금속에 세포(10)가 달라붙게 됨에 따라, 해동 후 세포(10)가 폐사하는 단점을 최소화시키고 사용 용도에 맞지 않는 기구를 사용하지 않는 장점이 있다.

나아가, 제1용기(100)에 세포(10)를 수용할 수 있는 부분이 종래에 적용되는 EM-grid 보다 크게 형성되어 사용자 또는 외부 자극에 따른 세포의 손실이 현저히 저하될 수 있는 장점이 있다.

<실시예 2>

도 2 및 도 3에 도시된 바와 같이, 제1용기(100)는 단부가 상측방향으로 절곡 형성된 핸들링부(110)가 더 포함될 수 있다.

바람직하게, 핸들링부(110)는 세포(10)가 수용되는 위치와 마주보는 측의 단부에 상측방향으로 절곡 형성될 수 있다.

핸들링부(110)가 형성됨으로써, 작업자는 세포(10)가 수용될 수 있는 위치를 용이하게 파악할 수 있다.

나아가, 핸들링부(110)가 바닥면(20)을 기준으로 상측방향으로 절곡 형성됨으로써, 제1용기(100)를 파지하기 위한 집게에 의해 제1용기(100)가 오염되지 않고 청결을 유지함과 동시에, 파지가 용이한 장점이 있다.

이를 위해, 핸들링부(110)는 바닥면(20)을 기준으로 θ만큼 절곡 형성될 수 있다.

이때, θ는 바닥면(20)을 기준으로 1~90° 각도로 형성될 수 있으며, 바람직하게는 10~45° 각도로 형성될 수 있다.

만약, θ가 바닥면(20)을 기준으로 1° 이하로 형성될 경우, 낮은 각도에 의해 집게로 핸들링부(110)를 용이하게 파지하지 못하고, 세포(10)가 수용되는 위치와 혼동되어 작업자가 핸들링부(110)에 세포를 위치시키는 오류를 범할 수 있는 단점이 있고, 90° 이상으로 형성될 경우, 작업자가 제1용기(100) 상측에 세포(10)를 위치시킨 다음, 집게에 의해 핸들링부(110) 파지 시 세포(10) 손상을 유도할 수 있는 단점이 있다.

선택적으로, 제1용기(100) 단부에 이동 또는 사용의 편의성을 위해 세포(10)가 수용되는 부분의 마주보는 측에 제1표시부(111)가 형성될 수 있다.

더욱 자세히 설명하면, 제1표시부(111)는 세포(10)가 수용되는 부분의 마주보는 단부에 형성됨으로써, 사용자가 집게 등에 의해 파지할 수 있는 부분과 세포(10)를 위치시킬 수 있는 부분을 한 눈에 식별할 수 있는 장점이 있다.

이를 위해, 제1표시부(111)는 제1용기(100)로부터 대비되는 색으로 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.

예를 들어, 제1용기(100)가 투명하게 형성될 경우, 제1표시부(111)는 유색으로 형성될 수 있는 것이다.

이로 인해, 제1용기(100)가 작업자의 부주의로 인해 유실될 경우, 제1표시부(111)에 의해 쉽게 발견할 수 있는 장점이 있다.

또한, 제1용기(100)에 절곡 형성된 핸들링부(110)가 형성되어 세포(10)를 냉동 또는 해동 시 손쉽게 바이알(vial)에 넣어 보관하고 이동 할 수 있도록 형성되어, 세포(10)를 냉동하고 해동하는 작업 시 핸들링부(110)와 세포를 부착(loading)하는 부위를 구분지어 표시함으로써 바이알에 넣고 보관 시 세포(10)가 유실 될 가능성이 현저히 저하 될 뿐만 아니라, 이동 시 편리한 장점이 있다.

<실시예 3>

도 4, 도 5 및 도 16에 도시된 바와 같이, 제1용기(100)는 세포(10)와 인접한 위치에 길이 방향으로 연장 형성되며, 내측에 홈이 형성된 수용부(200)를 포함하여 형성될 수 있다.

더욱 자세히 설명하면, 수용부(200)는 세포(10)와 인접한 위치에 파여 있거나, 함몰 또는 관통 형성되어 제1용기(100) 상측에 세포(10)와 함께 수용되는 보존액을 수용할 수 있도록 형성될 수 있다.

바람직하게, 도 16에 도시된 바와 같이, 수용부(200)는 세포(10)와 인접한 위치에 관통 형성되어 수용액이 용이하게 외부로 배출되거나 수용될 수 있도록 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.

이때, 수용부(200)에 보존액이 모세관 현상에 의해 수용될 수 있는 것이다.

이로 인해, 제1용기(100) 상측에 세포(10)와 적정량의 보존액이 존재됨으로써, 세포(10)의 냉동보존 시 보존액에 의한 얼음결정이 형성되는 것을 최소화 시킬 수 있는 장점이 있다.

즉, 제1용기(100) 상측에는 세포(10)와 수용부(200)에 의해 수용되거나 외부로 배출되어 제거된 잉여분의 보존액이 존재될 수 있는 것이다.

이를 위해, 수용부(200)는 세포(10)가 수용되는 위치와 일정간격 이격 형성됨으로써, 제1용기(100)와 세포(10)가 함께 동결될 경우, 수용부(200) 내에 유입된 보존액의 동결에 의해 세포(10)가 손상되는 것을 예방할 수 있도록 형성될 수 있다.

선택적으로, 도 6 및 도 17에 도시된 바와 같이, 수용부(200) 단부에 길이방향으로 연장 형성된 수용로(210)가 더 포함될 수 있다.

자세하게 수용로(210)는 수용부(200) 단부로부터 세포(10)가 위치되는 방향으로 연장 형성될 수 있다.

이때, 수용로(210)는 수용부(200) 단부로부터 상측 방향으로 경사지도록 형성됨으로써, 세포(10)가 제1용기(100)에 위치됨과 동시에 보존액이 수용로(210)의 경사에 의해 수용부(200) 내측으로 안정적으로 흘러 들어갈 수 있도록 형성될 수 있다.

이를 위해, 세포(10)와 인접한 위치의 수용로(210) 단부 지름은 5mm 이하로 형성되며, 세포(10)와 마주보는 측의 단부는 수용부(200)와 같거나 작게 형성될 수 있다.

이로 인해, 수용로(210)의 지름에 의해 세포(10)가 수용부(200)에 수용되지 않고 보존액을 선택적으로 수용부(200)에 유입시킬 수 있도록 형성될 수 있다.

이때, 수용로(210)의 길이는 길이방향으로 충분히 연장 형성되어, 수용부(200)에 보존액을 선택적으로 충분히 수용시켜, 제1용기(100)와 세포(10)가 함께 동결될 경우, 수용부(200) 내에 유입된 보존액의 동결에 의해 세포(10)가 손상되는 것을 예방할 수 있도록 형성될 수 있다.

<실시예 4>

도 7에 도시된 바와 같이, 제1용기(100)의 세포(10)와 인접한 위치에 형성된 제1흡수부(300)를 포함하여 형성될 수 있다.

더욱 자세히 설명하면, 도 7에 도시된 바와 같이, 제1용기(100) 상측에 위치되는 세포(10)와 일정거리 이격되어 제1용기(100) 상측에 제1흡수부(300)가 형성될 수 있다.

제1흡수부(300)가 형성됨으로써, 세포(10)와 함께 제1용기(100) 상측에 위치되는 보존액이 제1흡수부(300)에 흡수되어, 세포(10)와 적정량의 보존액이 제1용기(100) 상측에 위치됨과 동시에 냉동보존이 수행될 수 있는 것이다.

이를 위해, 제1흡수부(300)는 제1용기(100)로부터 착탈 가능하도록 형성될 수 있다.

자세하게는, 제1흡수부(300) 하측면은 점착층으로 형성되어, 일정양의 보존액을 흡수하고 난 다음, 작업자가 집게에 의해 간단하게 제1흡수부(300)를 박리하여 제거할 수 있도록 형성될 수 있다.

바람직하게, 제1흡수부(300)는 제1용기(100)의 폭과 작거나 크게 형성되어, 제1용기(100)로부터 집게에 의해 용이하게 박리될 수 있도록 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.

이로 인해, 제1용기(100) 상측에 세포(10)와 적정량의 보존액이 존재됨과 동시에, 냉동보존 시 보존액의 얼음결정 형성에 의해 세포(10)가 손상되는 것을 최소화 할 수 있는 장점이 있다.

이와 같이 형성된 제1흡수부(300)는 보존액을 용이하게 흡수시키기 위해 와트만지(whatman paper) 또는 한지 등을 포함하는 보존액을 흡수시킬 수 있는 섬유로 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

선택적으로, 도 8 내지 도 10에 도시된 바와 같이, 제1용기(100)의 단부 하측에 외측방향으로 돌출 형성된 제2흡수부(400)가 포함될 수 있다.

제2흡수부(400)는 제1용기(100) 단부 하측에 외측방향으로 돌출 형성되어, 세포(10) 수용 후 형성되는 잉여보존액 제거를 위해 세포(10)를 길게 펼치고 제2흡수부(400) 말단과 접촉하게 하여 잉여보존액이 용이하게 흡수 제거될 수 있는 장점이 있다.

이를 위해, 제2흡수부(400)는 세포(10)가 수용되는 측의 제1용기(100) 단부 하측으로부터 길이 또는 폭 방향 중 선택되는 어느 하나 이상으로 연장 형성될 수 있다.

이때, 제2흡수부(400) 일측 또는 타측 중 선택되는 어느 하나 이상의 단부 상측 또는 제1용기(100) 단부 하측 일측 또는 타측 중 선택되는 어느 하나 이상에 점착층이 형성될 수 있다.

이에 따라, 집게 등에 의해 간단히 제2흡수부(400)를 박리시킴으로써, 간단한 조작에 의해 제2흡수부(400)를 제거시킬 수 있는 장점이 있다.

더욱이, 제2흡수부(400)는 제1용기(100) 하측에 견고하게 점착됨과 동시에 용이하게 제거될 수 있도록, 제1용기(100)의 폭보다 같거나 크게 형성될 수 있다.

만약, 도 9에 도시된 바와 같이, 제2흡수부(400)가 제1용기(100)의 단부로부터 좌측 또는 우측 방향으로 연장 형성될 경우, 제2흡수부(400)의 제1용기(100)와 점착되는 측의 단부는 제1용기(100) 단부와 일직선상에 위치될 수 있도록 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.

더욱이, 도 10에 도시된 바와 같이, 제2흡수부(400)는 제1용기(100)의 단부를 중심으로 길이, 좌측 및 우측방향으로 연장 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

이때, 제2흡수부(400)는 제1흡수부(300)와 동일한 소재로 형성될 수 있으나, 이에 한정되지 않음은 물론이다.

이와 같이, 제2흡수부(400)가 형성됨으로써, 세포(10)의 이동 과정 중에 발생될 수 있는 보존액 이탈 시 제2흡수부(400)에 의해 신속한 처리가 용이할 뿐만 아니라, 적정량의 보존액과 세포(10)가 제1용기(100) 상측에 위치되어 보존액에 의한 얼음결정 형성을 최소화시키고, 간단한 조작으로 제2흡수부(400)를 박리시켜 제거할 수 있는 장점이 있다.

더욱이, 상기와 같이, 제1용기(100)에 수용부(200), 제1흡수부(300) 또는 제2흡수부(400)가 선택적으로 더 포함되어 보존액인 유리화 냉동액의 양을 적게 적용시키면서 얼음결정으로 인한 세포(10)의 얼음 결빙을 최소화하여 폐사 또는 손실을 저하시켜줌으로써, 세포(10)의 생존율을 증진시킬 수 있는 장점이 있다.

본 발명은 세포와 함께 병(vial)에 넣어 보관시킴으로써, 세포의 이동 또는 보관 과정에서 세포가 유실될 가능성이 현저히 저하되어 세포의 냉동보존 등의 산업상 이용가능한 발명이다.

Claims

상측에 세포(10)를 수용할 수 있도록 판 형태로 형성된 제1용기(100)를 포함하고,
제1용기(100)는 집게를 포함하는 기구에 의해 파지될 수 있도록 세포(10)와 마주보는 측 단부에 이동 또는 사용의 편의성을 위해 제1표시부(111)를 포함하여 상측방향으로 절곡 형성된 핸들링부(110)를 포함하며,
세포(10)는 시험관아기 시술에 적용되는 정자, 난자 또는 배아를 포함하는 생식세포이고,
제1용기(100)는 합성수지로 PET(polyethyleneterephthalate), PCTFE(Poly-Chloro-Tri-Fluoro Ethylene), PTFE(Polytetrafluoroethylene) 또는 PFA(perfluoroalkoxy) 중 선택되는 어느 하나 이상으로 형성된 것이며,
핸들링부(110)는 바닥면(20)을 기준으로 1 내지 90° 절곡 형성된 것을 특징으로 하는 냉동보존에 이용되는 유리화 용기.
청구항 1에 있어서,
제1용기(100)는 세포(10)와 인접한 위치에 길이 방향으로 연장 형성되며, 내측에 홈이 형성된 수용부(200)를 포함하는 것을 특징으로 하는 냉동보존에 이용되는 유리화 용기.
청구항 2에 있어서,
수용부(200)는 보존액이 모세관 현상에 의해 수용 또는 배출될 수 있도록 제1용기(100)의 단부로부터 길이방향으로 길게 함몰 또는 관통 형성된 것을 특징으로 하는 냉동보존에 이용되는 유리화 용기.
청구항 1에 있어서,
제1용기(100)의 세포(10)와 인접한 위치에 형성된 제1흡수부(300)를 포함하는 것을 특징으로 하는 냉동보존에 이용되는 유리화 용기.
청구항 1에 있어서,
제1용기(100)의 단부 하측에 외측방향으로 돌출 형성된 제2흡수부(400)를 포함하는 것을 특징으로 하는 냉동보존에 이용되는 유리화 용기.
청구항 5에 있어서,
제2흡수부(400)는 제1용기(100)의 단부를 중심으로 길이, 좌측 및 우측 방향으로 연장 형성된 것을 특징으로 하는 냉동보존에 이용되는 유리화 용기.
청구항 1에 있어서,
제1표시부(111)는 제1용기(100)로부터 대비되는 색으로 형성된 것을 특징으로 하는 냉동보존에 이용되는 유리화 용기.
청구항 1에 있어서,
제1용기(100) 합성수지는 투명한 재질로 형성된 것을 특징으로 하는 냉동보존에 이용되는 유리화 용기.
청구항 1에 있어서,
제1용기(100)의 길이는 20 내지 50mm로 형성된 것을 특징으로 하는 냉동보존에 이용되는 유리화 용기.
청구항 1에 있어서,
제1용기(100)의 폭은 0.5 내지 5mm로 형성된 것을 특징으로 하는 냉동보존에 이용되는 유리화 용기.