KR102642826B1 - 안정한 vamp 리포터 검정 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것으로서, 이때 VAMP는 소낭-관련된 막 단백질을 나타낸다. 본 발명은 또한 상응하는 핵산 분자, 발현 벡터 및 유전자 변형된 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이의 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

안정한 VAMP 리포터 검정
본 발명은 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것으로서, VAMP는 소낭-관련된 막 단백질을 나타낸다. 본 발명은 또한 상응하는 핵산 분자, 발현 벡터 및 유전자 변형된 세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이의 방법 및 용도에 관한 것이다.
파상풍은 파상풍균(Clostridium tetani)에 의해 야기된 급성 독소-매개된 질병이다. 괴사성 상처에서와 같은 바람직한 혐기성 조건 하에, 이러한 편재하는 바실루스는 매우 강력한 신경독소인 파상풍 독소를 생성할 수 있다. 파상풍 신경독소(본원에서 "TeNT" 또는 "TNx"로도 지칭됨)는 중추신경계에서 억제성 신경전달을 차단하여, 특징적인 근육 강직 및 경련을 야기한다(1). 실제 치사율(case-fatality rate)은 현대의 집중적인 관리가 이용가능한 경우에도 높다(80% 이하).
파상풍 및 관련된 보툴리누스균 신경독소(BoNT)는 뉴런-특이적 갱글리오사이드 및 단백질과의 상호작용에 주로 기인하여, 높은 어비디티(avidity)로 뉴런에 결합하는 큰 멀티도메인 단백질이다(1,5). 이러한 결합은 효과기 부분으로부터 구조적으로 분리된 50 kDa 결합 도메인에 의해 매개된다. 뉴런 결합에 이어서, 신경독소는, 산성화에 기인하여, 형태적인 변화를 겪는 식작용성 소낭 내로 내면화된다. 이러한 pH-유발된 구조적 변화는 프로테아제(경쇄로도 공지됨)를 단백질분해 표적이 잔류하는 시토솔로 방출하도록 한다. 특이적인 단백질분해 표적은 특이적인 신경독소에 의존할 것이고, 파상풍 신경독소, 보툴리누스균 B형 신경독소, 보툴리누스균 D형 신경독소, 보툴리누스균 F형 신경독소 및 보툴리누스균 G형 신경독소는 모두 소낭-관련된 막 단백질(VAMP) 1, 2 및 3을 절단한다(비록 별개의 절단 부위에 존재할지라도).
VAMP 1, 2 및 3은 신경전달에 필수적이고, 이들의 절단은 신경전달물질의 분비의 차단을 야기하고, 이는 사망을 야기할 수 있다(1,5). 예를 들어, VAMP2 절단은 신경근육 마비가 일어나는 신경전달물질의 강력한 차단을 야기한다. 불행하게도, 절단된 VAMP2는 뉴런간 기전에 의해 매우 신속하게 분해되고, 이에 따라, 절단된 VAMP2 분자의 검출이 사실상 불가능하다.
인간 및 관리되는 동물 둘 다에서, 파상풍은 파상풍 톡소이드(TeNT의 무독화된 형태)를 함유하는 백신에 의한 면역화를 통해 예방된다. 파상풍 톡소이드는 TeNT를 이의 면역 특성을 파괴하지 않으면서 포름알데하이드로 무독화시킴으로써, 이로부터 제조된다. 파상풍 백신의 생산은 (i) TeNT의 생산, (ii) TeNT의 화학적 불활성화, 및 (iii) 잔여 TeNT 활성의 시험을 포함한다(2). 상기 생산 방법은 톡소이드가 독소로 복귀하지 않도록 하여야 한다.
잔여 신경독소 활성에 대한 시험은 파상풍 백신의 생산 전반에 걸쳐 필수적이다. 파상풍 제품 안전성을 평가하는 데 사용되는 전통적인 도구는 수십 년에 걸쳐 거의 변하지 않았고, 평가는 여전히 신경근육 마비와 관련된 치사 효과에 의한 설치류 생물검정에 의존한다. WHO 지침에 따라서, 각각의 신규한 톡소이드 배치가 잔여 TeNT 마비 활성에 대해 기니아 피그 또는 마우스에서 시험되어야 한다(2). 동물 안전 시험은 비싸고 고되고 시간-소비적이다(3,4). 심지어 백신 생산 후에도, 추가적인 설치류 생물검정 시험이 TeNT 활성의 가능한 복귀에 대한 파상풍 백신의 저장 특성에 대해 수행된다. WHO가 최근에 80억명의 인간 인구의 완전한 파상풍방지 커버리지의 목적을 발표한 것을 고려하면, 신규하고 진보하고 더욱 효율적인 방법이 파상풍 톡소이드의 생산 및 평가에 요구된다.
파상풍 톡소이드에 의한 범-인간 면역이 이미 WHO 목적인 반면에, 많은 가축 동물은 통상적으로 파상풍뿐만 아니라 보툴리누스균 D형에 대해 면역화된다(6). 보툴리누스균 백신은 또한 임의의 잔여 신경독소 활성이 존재하는지 여부를 측정하기 위해 개발 중에 시험되어야 한다. 파상풍 백신에 관해, 설치류 생물검정이 보툴리누스균 백신 안전성을 평가하는 데 사용된다.
잔여 신경독소 활성에 대해 파상풍 및 보툴리누스균 톡소이드를 시험하기 위한 신규한 동물 대체 검정에 대한 요구가 존재한다. 또한, 보툴리누스균 B형 신경독소는 이의 효능 시험을 필요로 하는 승인된 약이다. 일반적으로, 동물-대체 검정이 신경독소 작용의 3개의 하기 단계를 모두 설명하여야 함에 동의한다: 세포 표면 결합, 내면화 및 기재(예컨대, VAMP2) 절단. 현재까지, 2개의 하기 주요 문제가 이러한 세포-기반 검정의 개발을 방해하였다: 파상풍 및 보툴리누스균 신경독소에 강하게 결합하는 연속적인 세포주의 결핍, 및 절단된 생성물의 신속한 분해(이에 의해, 신경독소 작용의 생성물의 검출을 제외함).
본 발명자들은 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 포함하는 신규한 리포터 분자를 개발하였다. 상기 리포터 분자는 파상풍 신경독소, 보툴리누스균 B형 신경독소, 보툴리누스균 D형 신경독소, 보툴리누스균 F형 신경독소 및/또는 보툴리누스균 G형 신경독소(및 신경독소 활성을 보유하는 이의 변형된 버전, 예컨대 키메라)에 의해 절단될 수 있다. 리포터 분자의 절단은 2개의 절단 생성물을 생성한다: 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인의 부분을 포함하는 제1 단편; 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인의 나머지 부분을 포함하는 제2 단편. 놀랍게도, 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인은 제1 단편의 세포간 분해를 감소시키거나 예방한다. 따라서, 유리하게는, 신규한 리포터 분자는 신경독소 활성의 정량적인 측정을 위한 신규한 기전을 제공한다.
본 발명자들은 C-말단 VAMP2 폴리펩티드에 부착된 N-말단 루시퍼라제 폴리펩티드를 포함하는 신규한 리포터 분자를 코딩하는 신규한 핵산 분자를 생성함으로써, 본 발명을 예시하였다. 핵산 분자는 유전자 변형된 SiMa 신경모세포종 세포주에서 발현되었다. 상기 세포를 적절한 보툴리누스균 또는 파상풍 신경독소의 존재 하에 배양하였고, 리포터 분자의 신경독소-유발된 절단을 연구하였다. 놀랍게도, 신규한 리포터 분자의 신경독소-유발된 절단은, 절단 생성물의 감소된 분해에 기인하여, 정량적으로 검출될 수 있다.
VAMP1, VAMP2 및 VAMP3의 기능, 구조 및 신경독소 절단 부위는 매우 유사하고, 고도로 보존된다. 따라서, 본 발명이 C-말단 VAMP2 폴리펩티드 도메인(즉, VAMP2 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인)을 포함하는 신규한 리포터 구조체에 의해 예시되지만, 본 발명은 VAMP2 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인이 VAMP1 또는 VAMP3 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인으로 대체된 리포터 구조체에 동등하게 적용된다.
이러한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 및 발현 벡터가 또한 본원에 제공된다. 핵산 분자 및/또는 발현 벡터는 임의의 적절한 숙주 세포(즉, 유전자 변형된 세포) 내에 존재할 수 있다.
한 양상에서, 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다.
적절하게는, VAMP2 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인은 서열번호 8 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이의 보존적 아미노산 서열 변이체를 포함한다.
적절하게는, VAMP1 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인은 서열번호 7 또는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 보존적 아미노산 서열 변이체를 포함한다.
적절하게는, VAMP3 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인은 서열번호 9 또는 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이의 보존적 아미노산 서열 변이체를 포함한다.
적절하게는, 루시퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인은 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 이의 보존적 아미노산 서열 변이체를 포함한다.
한 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
한 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산 분자, 또는 본 발명에 따른 발현 벡터를 포함하는 유전자 변형된 세포를 제공한다.
적절하게는, 유전자 변형된 세포는 SiMa 신경모세포종 세포, LAN5 신경모세포종 세포, NG108 신경모세포종 세포, 불멸화된 뉴런 및 1차 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
한 양상에서, 본 발명은 신경독소 활성의 검출을 위한, 본 발명에 따른 폴리펩티드, 핵산 분자, 발현 벡터 또는 유전자 변형된 세포의 용도를 제공하고, 신경독소 활성은 파상풍 신경독소 활성, 보툴리누스균 B형 신경독소 활성, 보툴리누스균 D형 신경독소 활성, 보툴리누스균 F형 신경독소 활성, 보툴리누스균 G형 신경독소 활성, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
적절하게는, 신경독소 활성은 약물 제품, 식품 샘플, 임상 샘플, 환경 샘플 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 시험 샘플에서 검출된다.
적절하게는, 신경독소 활성은 파상풍 톡소이드, 보툴리누스균 톡소이드 또는 이들의 조합을 포함하는 시험 샘플에서 검출된다.
적절하게는, 신경독소 활성은 파상풍 신경독소, 보툴리누스균 B형 신경독소, 보툴리누스균 D형 신경독소, 보툴리누스균 F형 신경독소, 보툴리누스균 G형 신경독소, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 시험 샘플에서 검출된다. 시험 샘플은 천연 발생 신경독소 및/또는 이의 변형된(예컨대, 인공적으로 변형된, 예컨대 키메라) 버전을 포함할 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 (a) 본 발명에 따른 유전자 변형된 세포를, 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 조건 하에 배양하는 단계; (b) (a)의 세포를 시험 샘플의 존재 하에, 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 신경독소-유발된 절단을 가능하게 하는 조건 하에 배양하는 단계; 및 (c) 폴리펩티드의 신경독소-유발된 절단의 수준을 측정하는 단계로서, 상기 폴리펩티드의 신경독소-유발된 절단의 검출이 신경독소 활성을 나타내는 단계를 포함하는 방법으로서, 상기 신경독소 활성이 파상풍 신경독소 활성, 보툴리누스균 B형 신경독소 활성, 보툴리누스균 D형 신경독소 활성, 보툴리누스균 F형 신경독소 활성, 보툴리누스균 G형 신경독소 활성, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법을 제공한다.
적절하게는, 배양 단계 (a) 및 (b)는 동시에 수행된다.
적절하게는, 시험 샘플은 배양 매질에서 제공된다.
적절하게는, 폴리펩티드의 신경독소-유발된 절단은 ELISA, 면역블롯(immunoblot) 또는 생세포 이미징(live cell imaging)에 의해 검출된다.
적절하게는, 시험 샘플은 약물 제품, 식품 샘플, 임상 샘플, 환경 샘플 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
적절하게는, 시험 샘플은 파상풍 톡소이드, 보툴리누스균 톡소이드, 또는 이들의 조합을 포함한다.
적절하게는, 시험 샘플은 파상풍 신경독소, 보툴리누스균 B형 신경독소, 보툴리누스균 D형 신경독소, 보툴리누스균 F형 신경독소, 보툴리누스균 G형 신경독소, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 시험 샘플은 천연 발생 신경독소 및/또는 이의 변형된(예컨대, 인공적으로 변형된, 예컨대 키메라) 버전을 포함할 수 있다.
한 양상에서, 본 발명은 (a) 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및 (b) 신경독소 활성을 검출하기 위한 양성 대조군으로서, (a)의 핵산 분자에 의해 코딩된 폴리펩티드를 절단할 수 있는 양성 대조군을 포함하는, 신경독소 활성을 검출하기 위한 키트를 제공한다.
신경독소 활성은 파상풍 신경독소 활성, 보툴리누스균 B형 신경독소 활성, 보툴리누스균 D형 신경독소 활성, 보툴리누스균 F형 신경독소 활성 및 보툴리누스균 G형 신경독소 활성으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
적절하게는, 핵산 분자는 발현 벡터의 부분이다.
적절하게는, 핵산 분자는 유전자 변형된 세포 내에 존재한다.
적절하게는, 유전자 변형된 세포는 유전자 변형된 SiMa 신경모세포종 세포, LAN5 신경모세포종 세포, NG108 신경모세포종 세포, 불멸화된 뉴런 및 1차 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
적절하게는, 키트는 루시퍼라제 활성의 검출을 위한 시약을 추가로 포함한다.
본원의 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다" 및 "함유하다" 및 이들의 변형은 "비제한적으로 포함하는"을 의미하고, 이들은 다른 잔기, 첨가제, 성분, 정수 또는 단계를 제외하는 것으로 의도되지 않는다(그리고, 제외하지 않는다).
본원의 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 형태는 복수 형태를 포괄한다. 특히, 불명확한 품목이 사용되는 경우, 명세서는, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수 형태뿐만 아니라 복수 형태를 고려하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명의 특정 양상, 양태 또는 예와 함께 기술되는 특징부, 정수, 특징, 화합물, 화학적 잔기 또는 기는 상충되지 않는 한 본원에 기술된 임의의 다른 양상, 양태 또는 예에 적용가능한 것으로 이해되어야 한다.
본원에 언급된 특허, 과학 및 기술 문헌은 출원 시 당업자에게 이용가능한 지식을 확립한다. 본원에 인용된 허여된 특허, 공개되고 계류 중인 특허출원 및 다른 공개문헌의 전체 개시내용은 각각이 참조로 혼입되도록 구체적으로 및 개별적으로 지시된 것처럼 본원에 참조로 혼입된다. 임의의 불일치가 존재하는 경우, 본원이 우세할 것이다.
본 발명의 다양한 양상은 하기에 더욱 상세하게 기술된다.
본 발명의 양태는 첨부된 도면을 참조하여 이하에서 추가로 기술된다.
도 1은 패널 A에서 세포의 감염에 대해 지시된 바이러스 벡터에 삽입된 녹색 형광 단백질(GFP)-VAMP2 구조체를 도시한다. 패널 B: 신경모세포종 세포가 퓨로마이신 선택에 따라서 강건한 GFP-VAMP2 발현을 나타낸다. 명-시야(bright-field) 및 GFP 형광 이미지가 도시된다. 패널 C: 소낭 구조에 국한되는 GFP-VAMP2(상부)는 단백질(하부 우측)에 융합된 파상풍 경쇄의 발현 시 시토솔(하부 좌측) 내로 방출될 수 있다. 패널 D: 안정한 절단된 GFP-VAMP2 생성물은 GFP 항체를 사용하는 통상적인 면역블로팅에 의해 검출될 수 있다.
도 2는 불멸화된 마우스 뉴런이 절단된 GFP-VAMP2 생성물의 출현에 의해 증명되는 보툴리누스균 D형 신경독소에 민감함을 도시한다. 독소-민감성 세포에서 GFP-VAMP2(블롯) 및 GFP-VAMP2의 시토솔 전위(우측 패널)의 절단에 유의한다.
도 3은 퍼옥시다제 APEX2(APX2)와의 VAMP2 융합을 도시하고, 루시퍼라제(나노루크, NanoLuc)는 바이러스에 의해 형질도입된 SiMa 신경모세포종 세포에서 안정한 형태로 발현되고; 구조체는 둘 다 HA-태그를 갖는다(면역블로팅에 사용됨, 좌측 패널). 융합 단백질은 HA-태그 면역염색을 사용하여 나타낸 소낭 구조에 국한된다(우측 패널).
도 4는 10 nM 보툴리누스균 신경독소 B형 및 D형에 의한 48시간 처리 후에 절단을 나타내는 나노루크-VAMP2 리포터를 갖도록 조작된 SiMa 신경모세포종 세포를 도시한다. APEX2-VAMP 리포터 분자는 보툴리누스균 절단에 저항한다. 절단된 VAMP2 생성물의 출현은 전체 VAMP2 항체를 사용하는 면역블로팅에 의해 증명된다. 보툴리누스균 B형 절단된-생성물에 비해 명백히 더 빠른 보툴리누스균 D형 절단된-생성물의 이동은 Gln76 대신에 Lys59 위치에서의 VAMP의 절단과 일치한다.
도 5는 SiMa 세포가 BoNT/D보다 BoNT/B에 더욱 민감함을 나타내는, BoNT B 및 D(nM)에 의한 적정에 따른 면역블롯을 도시한다. 항-VAMP2 항체를 사용하는 검출은 BoNT/B에 대해 1 nM 및 BoNT/D에 대해 10 nM까지의 절단을 나타낸다. 매우 특이적인 BoNT/B-절단된 VAMP2 및 BoNT/D-절단된 VAMP2 항체를 사용하는 검출은 BoNT/B에 대해 300 pM 및 BoNT/D에 대해 10 nM까지의 절단을 나타낸다. 항-BoNT/B 절단된 VAMP2 및 항-BoNT/D 절단된 VAMP2 항체가 각각 펩티드 ALQAGASQ 및 펩티드 KVLERDQK에 대항하여 생성되었다.
도 6은 면역블로팅과 나노루크 ELISA 검정 사이의 민감성과 2개의 기술 사이의 비교되는 EC50의 비교를 도시한다. 그러나, 나노루크 검정은 30 pM 이하의 기저선 위의 BoNT/B에 의한 VAMP 절단을 검출하는 능력을 갖는 더욱 큰 민감성을 나타냈다(우측 패널). 나노루크 ELISA 검정은 매우 특이적인 BoNT-절단된 VAMP2 항체를 갖는 마이크로플레이트 상의 보툴리누스균 절단된 나노루크-VAMP 생성물의 포획, 및 마이크로플레이트 광도계 상의 광 방출의 후속 판독을 포함한다.
도 7은 면역블로팅을 도시하고, 나노루크 검정은 둘 다 파상풍 독소에 의한 VAMP2의 절단을 검출하는 데 사용될 수 있지만, SiMa 신경모세포종 세포에서의 민감성은 BoNT/B 및 BoNT/D에 의해 보여지는 것보다 낮다.
도 8은 인간 VAMP1에 대한 아미노산 서열(서열번호 1)을 제공한다. 인간 VAMP1의 아미노산 40 내지 118(서열번호 7)에 밑줄을 친다.
도 9는 인간 VAMP2에 대한 아미노산 서열(서열번호 2)을 제공한다. 인간 VAMP2의 아미노산 38 내지 116(서열번호 8)에 밑줄을 친다.
도 10은 인간 VAMP3에 대한 아미노산 서열(서열번호 3)을 제공한다. 인간 VAMP3의 아미노산 21 내지 100(서열번호 9)에 밑줄을 친다.
도 11은 나노루크에 대한 아미노산 서열(서열번호 4)을 제공한다.
도 12는 HA-APEX-VAMP2 구조체에 대한 핵산 서열(서열번호 5)을 제공한다.
도 13은 HA-나노루크-VAMP2에 대한 핵산 서열(서열번호 6)을 제공한다.
도 14는 나노루크-VAMP2 발현 세포가, 본원에서 I 내지 IV로 지정된 BoNT/B의 신규한 합성 버전의 효능을 구별짓는 데 사용될 수 있음을 도시한다. 면역블롯은 표시된 범위(nM)의 BoNT/B 제제 I 내지 IV의 65시간 적용에 따른 나노루크-VAMP2의 상이한 절단도를 도시한다. 검출은 펩티드 ALQAGASQ에 대항하여 생성된 절단된 VAMP2 항체를 사용하였다. 항-SNAP25 항체를 로딩(loading) 대조군으로서 사용하였다.
도 15는 인간 VAMP1의 아미노산 40 내지 118(서열번호 7)(VAMP1의 코어 아미노산 서열로도 지칭됨)을 도시한다.
도 16은 인간 VAMP2의 아미노산 38 내지 116(서열번호 8)(VAMP2의 코어 아미노산 서열로도 지칭됨)을 도시한다.
도 17은 인간 VAMP3의 아미노산 21 내지 100(서열번호 9)(VAMP3의 코어 아미노산 서열로도 지칭됨)을 도시한다.
수십 년 동안, 성가진 동물 검정을 파상풍 및/또는 보툴리누스균 신경독소 작용의 모든 핵심 단계의 민감한 평가를 가능하게 하는 시험관내 검정으로 대체하기 위한 강한 요구가 존재하였다. 연속적인 세포주가 마우스 생물검정을 대체할 수 있는 검정을 개발하는 데 필수적인 민감성의 결핍을 갖지만, 동시에 1차 뉴런 또는 태아 세포-유래 뉴런의 사용은, 이들이 동물 조직으로부터 신선하게 유래되어야 하거나, 완전히 분화될 때까지 복잡한 프로토콜 및 주/개월을 요구하므로, 이들 자체의 도전을 제기함이 도그마였다. 치료적인 보툴리누스균 신경독소 A형의 SNAP25-절단 활성을 측정하는 SiMa 신경모세포종 세포주를 이용하는 제1 세포-기반 효능 검정은 마우스 생물검정보다 우수한(EC50~1 U/웰) 것으로 증명되었다(11). 그러나, 파상풍 및/또는 보툴리누스균 신경독소의 VAMP-절단 활성을 측정하기 위한 등가의 검정의 개발은, VAMP 절단 생성물의 신속한 분해에 기인하여, 도전적인 것으로 증명되었다.
본 발명자들은 이제 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 포함하는 신규한 리포터 분자를 개발하였다. 리포터 분자는 파상풍 신경독소, 보툴리누스균 B형 신경독소, 보툴리누스균 D형 신경독소, 보툴리누스균 F형 신경독소 및/또는 보툴리누스균 G형 신경독소(및 신경독소 활성을 보유하는 이들의 변형된 버전, 예컨대 키메라)에 의해 절단될 수 있다. 리포터 분자의 절단은 하기 2개의 절단 생성물을 생성한다: 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인의 부분을 포함하는 제1 단편; 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인의 나머지 부분을 포함하는 제2 단편. 놀랍게도, 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인은 제1 단편의 분해를 감소시키거나 예방한다. 따라서, 유리하게는, 신규한 리포터 분자는 신경독소 활성의 정량적인 측정을 위한 신규한 기전을 제공한다. 이러한 신규한 리포터 분자의 사용(예를 들어, 불멸화된 뉴런 세포주를 사용하는 세포-기반 검정에서)은 보툴리누스균 및 파상풍 백신 생성을 촉진하고, 보툴리누스 중독의 치료적인 보툴리누스균 생성물 시험 및 진단적 검출을 용이하게 하는 것으로 기대된다.
본 발명의 이용의 추가 예에 의해서, 나노루크-VAMP2 발현 세포가 BoNT/B의 신규한 합성 버전의 효능을 구별짓는 데 사용될 수 있는 것으로 나타났다(도 14 참조).
폴리펩티드
루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다.
용어 "펩티드", "단백질" 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 폴리펩티드 "도메인"은 폴리펩티드 쇄의 나머지와 독립적으로 발전하고 기능하고 존재할 수 있는 폴리펩티드 서열의 부분을 지칭한다. 전형적으로, 폴리펩티드 내의 각각의 도메인은 밀집한 3-차원 구조를 형성할 수 있고, 종종 독립적으로 안정하고 폴딩(folding)될 수 있다. 본원의 문맥에서 폴리펩티드 "도메인"의 예는 루시퍼라제 활성을 갖는 도메인, VAMP1 활성을 갖는 도메인, VAMP2 활성을 갖는 도메인, 또는 VAMP3 활성을 갖는 도메인이다.
단백질의 N-말단(아미노-말단, NH2-말단, N-말단 단부 또는 아민-말단으로도 공지됨)은 유리 아민 기(-NH2)를 갖는 아미노산에 의해 종결된 단백질 또는 폴리펩티드의 개시부이다. 통상적으로, 펩티드 서열은 N-말단으로부터 C-말단으로(좌측으로부터 우측으로) 기재된다. C-말단(카복실-말단, 카복시-말단, C-말단 꼬리, C-말단 단부 또는 COOH-말단으로도 공지됨)은 유리 카복실 기(-COOH)에 의해 종결되는 아미노산 쇄의 단부(단백질 또는 폴리펩티드)이다.
본원에 사용된 용어 "N-말단" 및 "C-말단"은, 예컨대 폴리펩티드 내의 도메인의 상대적인 위치를 기술하는 데 사용된다. 따라서, "N-말단"인 도메인은 폴리펩티드의 C-말단보다 N-말단에 가깝게(상대적인 용어) 위치한다. 반대로, "C-말단"인 도메인은 폴리펩티드의 N-말단보다 C-말단에 가깝게(상대적인 용어) 위치한다. 본원에 사용된 용어 "위치한"은, 예컨대 폴리펩티드의 선형 아미노산 서열 내의 도메인의 위치를 지칭한다.
용어 "N-말단" 및 "C-말단"은 폴리펩티드 내의 2개 이상의 도메인의 상대적인 위치를 기술하는 데 사용될 수 있다. 이러한 문맥에서, "N-말단"인 도메인은 "C-말단"인 도메인보다 폴리펩티드의 N-말단에 가깝게(상대적인 용어) 위치한다. 반대로, C-말단"인 도메인 "N-말단"인 도메인보다 폴리펩티드의 C-말단에 가깝게(상대적인 용어) 위치한다.
"N-말단"인 도메인은 폴리펩티드의 N-말단에 존재할 수 있지만, 존재하여야 하는 것은 아니다(즉, 이것은 유리 아민 기를 갖는 아미노산에 의해 종결되는 폴리펩티드의 개시부에 존재할 수 있지만, 존재하여야 하는 것은 아님). 즉, N-말단 도메인의 첫 번째 아미노산은 폴리펩티드의 첫 번째 아미노산이어야 할 필요는 없다(하지만, 폴리펩티드의 첫 번째 아미노산일 수 있음). 이것은 폴리펩티드의 N-말단과 "N-말단" 도메인의 개시부 사이에 다른 아미노산, 폴리펩티드 도메인(예컨대, HA 태그와 같은 태그) 등이 존재할 수 있음을 의미한다(단, 도메인은 폴리펩티드의 C-말단보다 N-말단에 가깝게 위치하거나; 2개 이상의 도메인의 상대적인 위치를 기술하는 데 사용될 때, 도메인은 "C-말단"인 도메인보다 N-말단에 가깝게 위치함).
마찬가지로, "C-말단"인 도메인은 존재할 수 있지만, 존재하여야 하는 것은 아니다(즉, 이것은 유리 카복실 기를 갖는 아미노산에 의해 종결되는 폴리펩티드의 단부에 존재할 수 있지만, 존재하여야 하는 것은 아님). 즉, C-말단 도메인의 마지막 아미노산은 폴리펩티드의 마지막 아미노산이어야 할 필요는 없다(하지만, 폴리펩티드의 마지막 아미노산일 수 있음). 이것은 폴리펩티드의 C-말단과 "C-말단" 도메인의 단부 사이에 다른 아미노산, 폴리펩티드 도메인 등(예컨대, 태그)이 존재할 수 있음을 의미한다(단, 도메인은 폴리펩티드의 N-말단보다 C-말단에 가깝게 위치하거나; 2개 이상의 도메인의 상대적인 위치를 기술하는 데 사용될 때, 도메인은 "N-말단"인 도메인보다 C-말단에 가깝게 위치함).
N-말단 폴리펩티드 도메인(A) 및 C-말단 폴리펩티드 도메인(B)을 포함하는 폴리펩티드는 통상적으로 A-B, 즉 N-말단-C-말단(좌측-우측)으로 기재된다. 예를 들어, N-말단 효소 루시퍼라제(예컨대, 나노루크 또는 "Nluc") 도메인 및 C-말단 VAMP2 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 통상적으로 Nluc-VAMP2(또는 NlucVAMP2)로 기재될 것이다.
예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 루시퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인에 대한 HA 태그 N-말단을 포함할 수 있다. 다른 적합한 태그는 당업계에 주지되어 있고, 추가적으로 또는 대안적으로 사용될 수 있다.
링커는 또한 루시퍼라제 활성을 갖는 도메인과 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 도메인 사이에 존재할 수 있고, 예컨대 프롤린 글리신 링커가 사용될 수 있다. 다른 적합한 링커는 당업계에 주지되어 있고, 추가적으로 또는 대안적으로 사용될 수 있다.
본원에 제공된 폴리펩티드는 효소적 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인을 포함한다.
"루시퍼라제 활성"을 갖는 폴리펩티드 도메인은 루시퍼라제 효소의 작용 활성을 보유하는 폴리펩티드 도메인을 지칭하고, 즉 이것은 광자-방출 기질, 예컨대 루시페린 및 퓨리마진을 산화시킴으로써 생물발광을 생성할 수 있다(문헌[ACS Chem Biol. 2012 Nov 16; 7(11): 1848-1857 'Engineered Luciferase Reporter from a Deep Sea Shrimp Utilizing a Novel Imidazopyrazinone Substrate' Hall et al]). 본원에 사용되는 바와 같이, "루시퍼라제 활성"을 갖는 폴리펩티드는 루시페린 또는 퓨리마진을 산화시킴으로써 생물발광을 생성하는 산화성 효소의 루시퍼라제 클래스로부터의 임의의 폴리펩티드를 포함한다(즉, 이것은 임의의 작용성 루시퍼라제를 포함함). 당업자는 당업계에 공지된 일상적인 실험을 사용하여 루시퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인을 동정하는 방법을 용이하게 인식한다. 작용성 루시퍼라제를 동정하기 위한 적합한 실험은 문헌[Beyond D-Luciferin: Expanding the Scope of Bioluminescence Imaging in vivo. Spencer T. Adams, Jr., Stephen C. Miller Curr Opin Chem Biol. 2014; 0: 112-120.]에 요약되어 있다.
한 양태에서, 루시퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인은 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 작용성 변이체(또는 작용성 단편)을 포함하다. 이러한 변이체는 서열번호 4의 천연 발생(예컨대, 대립형질), 합성 또는 합성적으로 개선된 작용성 변이체를 포함한다. 용어 "변이체"는 또한 상동체를 포괄한다.
작용성 변이체는 전형적으로 서열번호 4의 하나 이상의 아미노산의 단지 보존적인 치환, 또는 단백질의 비-임계 영역에서 비-임계 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입을 함유할 것이다. 따라서, 서열번호 4의 작용성 변이체는 서열번호 4의 보존적 아미노산 서열 변이체일 수 있고, 변이체는 루시퍼라제 활성을 갖는다.
비-작용성 변이체는 루시퍼라제 활성을 갖지 않는 서열번호 4의 아미노산 서열 변이체이다. 비-작용성 변이체는 전형적으로 서열번호 4의 아미노산 서열의 비-보존적 치환, 결실, 삽입 또는 조숙 절두(premature truncation), 또는 임계 아미노산 또는 임계 영역 내의 치환, 삽입 또는 결실을 함유할 것이다. 작용성 및 비-작용성 변이체(예컨대, 작용성 및 비-작용성 대립형질 변이체)를 동정하는 방법은 당업자에게 주지되어 있다.
루시퍼라제 중 임계 및 비-임계 아미노산의 요약은 문헌[Engineered luciferase reporter from a deep sea shrimp utilizing a novel imidazopyrazinone substrate. Hall MP, Unch J, Binkowski BF, Valley MP, Butler BL, Wood MG, Otto P, Zimmerman K, Vidugiris G, Machleidt T, Robers MB, Benink HA, Eggers CT, Slater MR, Meisenheimer PL, Klaubert DH, Fan F, Encell LP, Wood KV. ACS Chem Biol. 2012, 7(11):1848-57]에 제공된다. 따라서, 당업자는 서열번호 4의 작용성 변이체(또는 작용성 단편), 예컨대 보존적 아미노산 서열 변이체를 제공하도록 치환될 수 있는 아미노산을 용이하게 동정할 수 있다. 서열번호 4의 상동체는 또한 표준 서열 정렬 프로그램을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 동정될 수 있다.
루시퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 4의 아미노산 서열, 또는 이의 부분 또는 단편에 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 적절하게는, % 동일성은 기준 서열(예컨대, 서열번호 4), 또는 이의 부분 또는 단편의 전장에 대한 동일성의 백분율로서 계산될 수 있다.
서열번호 4에 제시된 아미노산 서열은 루시퍼라제 나노루크[프로메가(Promega)에 의해 시판됨]의 아미노산 서열이다. 용어 "나노루크" 및 "NLuc"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 나노루크 루시퍼라제에 대한 더욱 상세한 내용은 문헌[Hall et al., ACS chem Biol 2012, 7, pg 1848 to 1857]에서 발견될 수 있다.
적합한 루시퍼라제의 다른 예는 반딧불이(Photinus pyralis)로부터의 반딧불이 루시퍼라제(FLuc; EC 1.13.12.7)를 포함한다. 반딧불이 루시퍼라제는 옥시루시페린(이의 바닥 상태로의 이완 시 빛을 방출하는 매우 불안정한 단일선-여기된 화합물)을 생산하기 위해 ATP 및 분자 산소를 사용하는 루시페린의 산소화를 촉진하는 유글로불린 단백질이다. 다양한 다른 유기체는 다양한 발광 반응으로 상이한 루시퍼라제를 사용하여 유기체의 빛 생성물을 조절한다[예컨대, 잭-오-랜턴(Jack-o-lantern) 버섯(Omphalotus olearius), 여러 가지 해양 생물, 예컨대 바다 팬시(sea pansy)(Renilla reniformis, 이의 루시퍼라제 레닐라-루시페린 2-모노옥시게나제(RLuc)를 가짐), 및 와편모조류의 루시퍼라제]. 루시퍼라제의 다른 예는 변형된 반딧불이 루시퍼라제[울트라-글로(Ultra-GLo); 포투리스 페니실바니카(Photuris pennysylvanica)로부터 유래함], 방아벌레 루시퍼라제[CBLuc; 피로포러스 플라지오프탈라무스(Pyrophorus plagiophthalamus)로부터 유래함], 코페포드(Copepod) 갑각류 루시퍼라제(GLuc; 가우시아 프린셉스(Gaussia princeps)로부터 유래함] 및 오스트라코드(Ostracod) 갑각류 루시퍼라제[CLuc; 시프리디나 녹틸루카(Cypridina noctiluca)로부터 유래함]를 포함한다. 당업계에 통상적으로 사용되는 상이한 루시퍼라제의 검토는 문헌[Thorne et al., Chem Biol. 2010 Jun 25; 17(6); 646-657]에서 발견될 수 있다.
본원에 제공된 폴리펩티드는 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 추가로 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, "VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는" 폴리펩티드 도메인은 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 단백질로서 작용할 수 있는 폴리펩티드 도메인을 지칭한다.
VAMP는 C-말단 내지 막 도메인에 의해 특징지어 지는 단백질의 계열을 포괄한다. N-말단(이성질형 및 종에 따라 aa 1 내지 90 또는 그 이상)은 시토솔을 대면하고, SNAP-25 및 신탁신과의 상호작용을 위한 SNARE 모티프를 포함한다. 모든 VAMP는 막 융합 과정에 관여한다. VAMP는 이의 N-말단 쇄에 의해 신탁신 및 SNAP-25 계열 구성원과 상호작용하여, 엑소사이토시스를 위한 선결요건으로서, 융합 코어 또는 SNARE 복합체를 형성한다. 소낭 융합을 위한 VAMP의 근본적인 역할은 VAMP 녹아웃 동물 모델을 분석할 때 나타났다.
VAMP1 및 VAMP2는 시납토브레빈으로서 공지되어 있고, 뇌, 척수 및 말초 뉴런에서 발현된다. 이들은 시냅틱 소낭의 구성요소이고, 이들은 신경전달물질 방출에 참여한다. VAMP3(셀루브레빈으로도 공지됨)은 도처에서 발현되고, 분지성 과립 및 분지성 소낭의 구성요소로서 조절된 구성적인 엑소사이토시스에 참여한다(문헌[Nature Reviews Molecular Cell Biology 2, 98-106 (February 2001) 'SNARE-mediated mebrane fusion' Y. A. Chen & R. H. Scheller]).
VAMP1, VAMP2 및 VAMP3은 모두 파상풍 신경독소(TeNT), 보툴리누스균 B형 신경독소(BoNT/B), 보툴리누스균 D형 신경독소(BoNT/D), 보툴리누스균 F형 신경독소(BoNT/F), 및 보툴리누스균 G형 신경독소(BoNT/G)에 대한 공지된 기질이다. 신경독소는, 하기 표 1에 제시된 바와 같이, 보존된 절단 부위 서열에서 VAMP1, VAMP2 및 VAMP3을 절단한다.
[표 1]
Figure 112019093417873-pct00001
"VAMP1 활성"을 갖는 폴리펩티드 도메인은 (i) VAMP1의 작용성 활성을 보유하고(즉, 소낭에 존재하고, SNARE 복합체를 형성할 수 있음), (ii) 파상풍 신경독소(TeNT), 보툴리누스균 B형 신경독소(BoNT/B), 보툴리누스균 D형 신경독소(BoNT/D), 보툴리누스균 F형 신경독소(BoNT/F) 및 보툴리누스균 G형 신경독소(BoNT/G) 중 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 적어도 모두에 의해 절단될 수 있는 폴리펩티드 도메인을 지칭한다.
당업자는 당업계에 공지된 일상적인 실험을 사용하여 소낭-관련된 VAMP1 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인을 동정하는 방법을 용이하게 인식한다. 작용성 VAMP1을 동정하기 위한 적합한 실험은 문헌[Identification of a minimal core of the synaptic SNARE complex sufficient for reversible assembly and disassembly. Fasshauer D, Eliason WK, Brㆌnger AT, Jahn R. Biochemistry. 1998 Jul 21;37(29):10354-62] 및 또한 문헌[Vesicular restriction of synaptobrevin suggests a role for calcium in membrane fusion. Hu K, Carroll J, Fedorovich S, Rickman C, Sukhodub A, Davletov B. Nature. 2002 Feb 7;415(6872):646-50]에 요약되어 있다.
당업자는 또한 당업계에 공지된 일상적인 실험을 사용하여 파상풍 신경독소(TeNT), 보툴리누스균 B형 신경독소(BoNT/B), 보툴리누스균 D형 신경독소(BoNT/D), 보툴리누스균 F형 신경독소(BoNT/F), 및 보툴리누스균 G형 신경독소(BoNT/G) 중 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 적어도 모두에 의해 절단될 수 있는 폴리펩티드 도메인을 동정하는 방법을 용이하게 인식할 것이다. 전술된 바와 같이 절단될 수 있는 폴리펩티드 도메인을 동정하기 위한 적합한 실험은 문헌[Specificity of botulinum protease for human VAMP family proteins. Yamamoto H, et al. Microbiol Immunol, 2012 Apr. PMID 22289120]에 요약되어 있다. 또한, AMP1의 적절한 절단 부위 서열의 충분한 안내는 표 1에 제공된다. 폴리펩티드 도메인에서 하나(또는 그 이상)의 상기 보존된 절단 부위 서열의 존재는 또한 이것이 파상풍 신경독소(TeNT), 보툴리누스균 B형 신경독소(BoNT/B), 보툴리누스균 D형 신경독소(BoNT/D), 보툴리누스균 F형 신경독소(BoNT/F), 및/또는 보툴리누스균 G형 신경독소(BoNT/G)에 의해 적절하게 절단될 수 있음을 나타낼 수 있다.
한 양태에서, VAMP1 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인은 서열번호 1에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 작용성 변이체(또는 작용성 단편)를 포함한다. 이러한 변이체는 서열번호 1의 천연 발생(예컨대, 대립형질), 합성 또는 합성적으로 개선된 작용성 변이체일 수 있다. 용어 "변이체"는 또한 상동체를 포괄한다.
한 양태에서, VAMP1 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인은 서열번호 1의 아미노산 40 내지 118, 또는 이의 작용성 변이체(또는 작용성 단편)를 포함한다. 이러한 변이체는 서열번호 1의 천연 발생(예컨대, 대립형질), 합성 또는 합성적으로 개선된 작용성 변이체일 수 있다. 용어 "변이체"는 또한 상동체를 포괄한다.
서열번호 1의 아미노산 40 내지 118은 BoNT 상호작용 및 절단을 위한 코어 VAMP1 아미노산 서열을 나타낸다(아미노산 40 내지 118은 또한 서열번호 7로서 본원에 지칭되고, 도 8(밑줄 친 아미노산만) 및 도 15에 도시됨). VAMP1 아미노산 서열, BoNT 상호작용 및 절단 부위는 당업계에 주시된다(예를 들어, 문헌[Yamamoto H, Ida T, Tsutsuki H, Mori M, Matsumoto T, Kohda T, Mukamoto M, Goshima N, Kozaki S, Ihara H. Microbiol Immunol. 2012 Apr;56(4):245-53] 참고). 따라서, VAMP1 활성을 갖는 다른 적절한 폴리펩티드 도메인은 또한 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
작용성 변이체는 전형적으로 서열번호 1의 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환만을 함유하거나, 단백질의 비-임계 영역 내의 치환, 결실 또는 삽입을 함유할 것이다. 따라서, 서열번호 1의 작용성 변이체는 서열번호 1의 보존적 아미노산 서열 변이체일 수 있고, 이때 변이체는 VAMP1 활성을 갖는다.
비-작용성 변이체는 VAMP1 활성을 갖지 않는 서열번호 1의 아미노산 서열 변이체이다. 비-작용성 변이체는 전형적으로 서열번호 1의 아미노산 서열의 비-보존적 치환, 결실, 또는 삽입 또는 조숙 절두, 또는 임계 아미노산 또는 임계 영역 내에서의 치환, 삽입 또는 결실을 함유할 것이다. 작용성 및 비-작용성 변이체(예컨대, 작용성 및 비-작용성 대립형질 변이체)를 동정하는 방법은 당업자에게 주지되어 있다.
VAMP1 내의 임계 및 비-임계 아미노산의 요약은 문헌[Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Dec 22;95(26):15781-6. Conserved structural features of the synaptic fusion complex: SNARE proteins reclassified as Q- and R-SNAREs. Fasshauer D, Sutton RB, Brunger AT, Jahn R]에 제공된다. 따라서, 당업자는 서열번호 1의 작용성 변이체(또는 작용성 단편), 예컨대 보존적 아미노산 서열 변이체를 제공하도록 치환될 수 있는 아미노산을 용이하게 동정할 것이다. 서열번호 1의 상동체는 또한 표준 서열 정렬 프로그램을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 동정될 수 있다.
VAMP1 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열, 또는 이의 부분 또는 단편에 대해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 적절하게는, % 동일성은 기준 서열(예컨대, 서열번호 1), 또는 이의 부분 또는 단편의 전장에 대한 동일성의 백분율로서 계산될 수 있다.
서열번호 1에 제시된 아미노산 서열은 천연 발생 인간 VAMP1의 아미노산 서열이다. 인간 VAMP1에 대한 더욱 상세한 사항은 문헌[Specificity of botulinum protease for human VAMP family proteins. Yamamoto H, et al. Microbiol Immunol, 2012 Apr. PMID 22289120]에서 발견될 수 있다.
"VAMP2 활성"을 갖는 폴리펩티드 도메인은 (i) VAMP2의 작용성 활성을 보유하고(즉, 소낭에 존재하고, SNARE 복합체를 형성할 수 있음), (ii) 파상풍 신경독소(TeNT), 보툴리누스균 B형 신경독소(BoNT/B), 보툴리누스균 D형 신경독소(BoNT/D), 보툴리누스균 F형 신경독소(BoNT/F), 및 보툴리누스균 G형 신경독소(BoNT/G) 중 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 적어도 모두에 의해 절단될 수 있는 폴리펩티드 도메인을 지칭한다.
당업자는 당업계에 공지된 일상적인 실험을 사용하여 소낭-관련된 VAMP2 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인을 동정하는 방법을 용이하게 인식한다. 작용성 VAMP2를 동정하기 위한 적합한 실험은 문헌[J Biol Chem. 1999 May 28; 274(22):15440-6. Mixed and non-cognate SNARE complexes. Characterization of assembly and biophysical properties. Fasshauer D, Antonin W, Margittai M, Pabst S, Jahn R.] 및 또한 문헌[Nature. 2002. Feb 7;415(6872):646-50. Vesicular restriction of synaptobrevin suggests a role for calcium in membrane fusion. Hu K, Carroll J, Fedorovich S, Rickman C, Sukhodub A, Daveltov B.]에 요약되어 있다.
당업자는 또한 당업계에 공지된 일상적인 실험을 사용하여, 파상풍 신경독소(TeNT), 보툴리누스균 B형 신경독소(BoNT/B), 보툴리누스균 D형 신경독소(BoNT/D), 보툴리누스균 F형 신경독소(BoNT/F), 및 보툴리누스균 G형 신경독소(BoNT/G) 중 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 적어도 모두에 의해 절단될 수 있는 폴리펩티드 도메인을 동정하는 방법을 용이하게 인식한다. 전술된 바와 같이 절단된 폴리펩티드 도메인을 동정하기 위한 적합한 실험은 문헌[Specificity of botulinum protease for human VAMP family proteins. Yamamoto H, et al. Microbiol Immunol, 2012 Apr. PMID 22289120]에 요약되어 있다. 또한, VAMP2의 적절한 절단 부위 서열의 충분한 안내는 표 1에 제공된다. 폴리펩티드 도메인 내의 하나(또는 그 이상)의 이러한 보존된 절단 부위 서열의 존재는 또한 파상풍 신경독소(TeNT), 보툴리누스균 B형 신경독소(BoNT/B), 보툴리누스균 D형 신경독소(BoNT/D), 보툴리누스균 F형 신경독소(BoNT/F), 및/또는 보툴리누스균 G형 신경독소(BoNT/G)에 의해 적절하게 절단될 수 있음을 나타낼 수 있다.
한 양태에서, VAMP2 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인은 서열번호 2에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 작용성 변이체(또는 작용성 단편)를 포함한다. 이러한 변이체는 서열번호 2의 천연 발생(예컨대, 대립형질), 합성 또는 합성적으로 개선된 작용성 변이체일 수 있다. 용어 "변이체"는 또한 상동체를 포괄한다.
한 양태에서, VAMP2 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인은 서열번호 2의 아미노산 38 내지 116, 또는 이의 작용성 변이체(또는 작용성 단편)를 포함한다. 이러한 변이체는 서열번호 2의 천연 발생(예컨대, 대립형질), 합성 또는 합성적으로 개선된 작용성 변이체일 수 있다. 용어 "변이체"는 또한 상동체를 포괄한다.
서열번호 2의 아미노산 38 내지 116은 BoNT 상호작용 및 절단을 위한 코어 VAMP2 아미노산 서열을 나타낸다[아미노산 38 내지 116은 또한 서열번호 8로서 본원에서 지칭되고, 도 9(밑줄친 아미노산만) 및 도 16에 도시됨]. VAMP2 아미노산 서열, BoNT 상호작용 및 절단 부위는 당업계에 주지되어 있다(예를 들어, 문헌[Yamamoto H, Ida T, Tsutsuki H, Mori M, Matsumoto T, Kohda T, Mukamoto M, Goshima N, Kozaki S, Ihara H. Microbiol Immunol. 2012 Apr;56(4):245-53] 참조). 따라서, VAMP2 활성을 갖는 다른 적절한 폴리펩티드 도메인은 또한 당업자에 의해 용이하게 측정될 수 있다.
작용성 변이체는 전형적으로 서열번호 2의 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환만, 또는 단백질의 비-임계 영역 내의 비-임계 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입을 함유할 것이다. 따라서, 서열번호 2의 작용성 변이체는 서열번호 2의 보존적 아미노산 서열 변이체일 수 있고, 이때 변이체는 VAMP2 활성을 갖는다.
비-작용성 변이체는 VAMP2 활성을 갖지 않는 서열번호 2의 아미노산 서열 변이체이다. 비-작용성 변이체는 전형적으로 서열번호 2의 아미노산 서열의 비-보존적 치환, 결실, 또는 삽입 또는 조숙 절두, 또는 임계 아미노산 또는 임계 영역 내의 치환, 삽입 또는 결실을 함유할 것이다. 작용성 및 비-작용성 변이체(예컨대, 작용성 및 비-작용성 대립형질 변이체)를 동정하는 방법은 당업자에게 주지되어 있다.
소낭-관련된 VAMP2 내의 임계 및 비-임계 아미노산의 요약은 문헌[Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Dec 22;95(26):15781-6. Conserved structural features of the synaptic fusion complex: SNARE proteins reclassified as Q- and R-SNAREs. Fasshauer D, Sutton RB, Brunger AT, Jahn R] 및 문헌[Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 May 30;103(22):8378-83. Conformation of the synaptobrevin transmembrane domain. Bowen M, Brunger AT.]에 제공된다. 따라서, 당업자는 서열번호 2의 작용성 변이체(또는 작용성 단편), 예컨대 보존적 아미노산 서열 변이체를 제공하도록 치환될 수 있는 아미노산을 용이하게 동정할 수 있을 것이다. 서열번호 2의 상동체는 또한 표준 서열 정렬 프로그램을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 동정될 수 있다.
VAMP2 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 2의 아미노산 서열, 또는 이의 부분 또는 단편에 대해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 적절하게는, % 동일성은 기준 서열(예컨대, 서열번호 2), 또는 이의 부분 또는 단편의 전장에 대한 동일성의 백분율로서 계산될 수 있다.
서열번호 2에 제시된 아미노산 서열은 천연 발생 인간 VAMP2의 아미노산 서열이다. 인간 VAMP2에 대한 더욱 상세한 사항은 문헌[Substrate recognition of VAMP-2 by botulinum neurotoxin B and tetanus neurotoxin. Chen S, et al. J Biol Chem, 2008 Jul 25. PMID 18511417]에서 발견될 수 있다.
"VAMP3 활성"을 갖는 폴리펩티드 도메인은 (i) VAMP3의 작용성 활성을 보유하고(즉, 소낭에 존재하고, SNARE 복합체를 형성할 수 있음), (ii) 파상풍 신경독소(TeNT), 보툴리누스균 B형 신경독소(BoNT/B), 보툴리누스균 D형 신경독소(BoNT/D), 보툴리누스균 F형 신경독소(BoNT/F) 및 보툴리누스균 G형 신경독소(BoNT/G) 중 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 적어도 모두에 의해 절단될 수 있는 폴리펩티드 도메인을 지칭한다.
당업자는 당업계에 공지된 일상적인 실험을 사용하여, VAMP3 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인을 동정하는 방법을 용이하게 인식한다. 작용성 VAMP3을 동정하기 위한 적합한 실험은 문헌[J Biol Chem. 1999 May 28; 274(22):15440-6. Mixed and non-cognate SNARE complexes. Characterization of assembly and biophysical properties. Fasshauer D, Antonin W, Margittai M, Pabst S, Jahn R.]에 요약되어 있다.
당업자는 또한 당업계에 공지된 일상적인 실험을 사용하여, 파상풍 신경독소(TeNT), 보툴리누스균 B형 신경독소(BoNT/B), 보툴리누스균 D형 신경독소(BoNT/D), 보툴리누스균 F형 신경독소(BoNT/F), 및 보툴리누스균 G형 신경독소(BoNT/G) 중 하나 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상 또는 적어도 모두에 의해 절단될 수 있는 폴리펩티드 도메인을 동정하는 방법을 용이하게 인식한다. 전술된 바와 같이 절단된 폴리펩티드 도메인을 동정하기 위한 적합한 실험은 문헌[Specificity of botulinum protease for human VAMP family proteins. Yamamoto H, et al. Microbiol Immunol, 2012 Apr. PMID 22289120]에 요약되어 있다. 또한, VAMP3의 적절한 절단 부위 서열의 충분한 안내는 표 1에 제공된다. 폴리펩티드 도메인 내의 하나(또는 그 이상)의 이러한 보존된 절단 부위 서열의 존재는 또한 파상풍 신경독소(TeNT), 보툴리누스균 B형 신경독소(BoNT/B), 보툴리누스균 D형 신경독소(BoNT/D), 보툴리누스균 F형 신경독소(BoNT/F), 및/또는 보툴리누스균 G형 신경독소(BoNT/G)에 의해 적절하게 절단될 수 있음을 나타낼 수 있다.
한 양태에서, VAMP3 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인은 서열번호 3에 제시된 아미노산 서열, 또는 이의 작용성 변이체(또는 작용성 단편)를 포함한다. 이러한 변이체는 서열번호 3의 천연 발생(예컨대, 대립형질), 합성 또는 합성적으로 개선된 작용성 변이체일 수 있다. 용어 "변이체"는 또한 상동체를 포괄한다.
한 양태에서, VAMP3 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인은 서열번호 3의 아미노산 21 내지 100, 또는 이의 작용성 변이체(또는 작용성 단편)를 포함한다. 이러한 변이체는 서열번호 3의 천연 발생(예컨대, 대립형질), 합성 또는 합성적으로 개선된 작용성 변이체일 수 있다. 용어 "변이체"는 또한 상동체를 포괄한다.
서열번호 3의 아미노산 21 내지 100은 BoNT 상호작용 및 절단을 위한 코어 VAMP3 아미노산 서열을 나타낸다[아미노산 21 내지 100은 또한 서열번호 9로서 본원에서 지칭되고, 도 10(밑줄친 아미노산만) 및 도 17에 도시됨). VAMP3 아미노산 서열, BoNT 상호작용 및 절단 부위는 당업계에 주지되어 있다(예를 들어, 문헌[Yamamoto H, Ida T, Tsutsuki H, Mori M, Matsumoto T, Kohda T, Mukamoto M, Goshima N, Kozaki S, Ihara H. Microbiol Immunol. 2012 Apr;56(4):245-53] 참조). 따라서, VAMP3 활성을 갖는 다른 적절한 폴리펩티드 도메인는 또한 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
작용성 변이체는 전형적으로 서열번호 3의 하나 이상의 아미노산의 보존적 치환만, 또는 단백질의 비-임계 영역 내의 비-임계 아미노산의 치환, 결실 또는 삽입을 함유할 것이다. 따라서, 서열번호 3의 작용성 변이체는 서열번호 3의 보존적 아미노산 서열 변이체일 수 있고, 이때 변이체는 VAMP3 활성을 갖는다.
비-작용성 변이체는 VAMP3 활성을 갖지 않는 서열번호 3의 아미노산 서열 변이체이다. 비-작용성 변이체는 전형적으로 서열번호 3의 아미노산 서열의 비-보존적 치환, 결실, 또는 삽입 또는 조숙 절두, 또는 임계 아미노산 또는 임계 영역 내의 치환, 삽입 또는 결실을 함유할 것이다. 작용성 및 비-작용성 변이체(예컨대, 작용성 및 비-작용성 대립형질 변이체)를 동정하기 위한 방법은 당업자에게 주지되어 있다.
VAMP3 내의 임계 및 비-임계 아미노산의 요약은 문헌[Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Dec 22;95(26):15781-6. Conserved structural features of the synaptic fusion complex: SNARE proteins reclassified as Q- and R-SNAREs. Fasshauer D, Sutton RB, Brunger AT, Jahn R]에 제공된다. 따라서, 당업자는 서열번호 3의 작용성 변이체(또는 작용성 단편), 예컨대 보존적 아미노산 서열 변이체를 제공하도록 치환될 수 있는 아미노산을 용이하게 동정할 수 있을 것이다. 서열번호 3의 상동체는 또한 표준 서열 정렬 프로그램을 사용하여 당업자에 의해 용이하게 동정될 수 있다.
VAMP3 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열, 또는 이의 부분 또는 단편에 대해 적어도 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 적절하게는, % 동일성은 기준 서열(예컨대, 서열번호 3), 또는 이의 부분 또는 단편의 전장에 대한 동일성의 백분율로서 계산될 수 있다.
서열번호 3에 제시된 아미노산 서열은 천연 발생 인간 VAMP3의 아미노산 서열이다. 인간 VAMP3에 대한 더욱 상세한 사항은 문헌[Nature Reviews Molecular Cell Biology 2, 98-106 (February 2001) SNARE-mediated membrane fusion' Y. A. Chen & R. H. Scheller]에서 발견될 수 있다.
"비-본질적인" 또는 "비-임계" 아미노산 잔기는 생물학적 활성을 완전히 파괴하거나, 더욱 바람직하게는, 실질적으로 변경하지 않고, 야생형 서열(예컨대, 서열번호 1 내지 4의 서열)로부터 변경될 수 있는 잔사인 반면에, "본질적인" 아미노산 잔기는 이러한 변화를 야기한다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 중에서 보존되는 아미노산 잔기는 경막 도메인 내의 아미노산 잔기가 일반적으로 활성을 유의하게 변경하지 않고 대략 등가의 소수성을 갖는 다른 잔사로 대체될 수 있음을 제외하고는, 구체적으로 변경하기 쉽지 않을 것으로 예측된다.
"보존적 아미노산 치환"은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 잔기의 계열은 당업계에 정의되어 있다. 이러한 계열은 염기성 측쇄(예컨대, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄(예컨대, 아스파르트산, 글루탐산), 비하전된 극성 측쇄(예컨대, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비-극성 측쇄(예컨대, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), β-분지된 측쇄(예컨대, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄(예컨대, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다. 따라서, 단백질 내의 비-본질적인 아미노산 잔기는 바람직하게는 동일한 측쇄 계열로부터의 다른 아미노산 잔기로 대체된다. 다르게는, 다른 양태에서, 돌연변이는 코딩 서열의 전부 또는 일부에 따라, 예컨대 포화 돌연변이유발(saturation mutagenesis)에 의해 임의로 도입될 수 있고, 생성된 돌연변이체는 활성을 보유하는 돌연변이체를 동정하기 위해 생물학적 활성에 대해 스크리닝(screening)될 수 있다. 서열번호 1 내지 4의 돌연변이유발에 따라서, 코딩된 단백질은 재조합적으로 발현될 수 있고, 단백질의 생물학적 활성이 측정될 수 있다.
본원에 사용되는 바와 같이, 단백질의 "생물학적 활성 부분" 또는 "생물학적 활성"을 갖는 단백질 부분은 분자와 비-분자 사이의 상호작용에 참여하는 단백질의 단편을 포함한다. 단백질의 생물학적 활성 부분은 전장 단백질보다 적은 아미노산을 포함하고 코딩된 단백질의 하나 이상의 활성을 나타내는 단백질의 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 1 내지 4에 제시된 아미노산 서열에 충분히 상동성이거나 이로부터 유래하는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드를 포함한다. 전형적으로, 생물학적 활성 부분은 단백질의 하나 이상의 활성을 갖는 도메인 또는 모티프를 포함하고, 예컨대 생물학적 활성 부분은 하기 활성 중 하나를 보유할 수 있다(적절하게): 루시퍼라제, VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성.
단백질의 생물학적 활성 부분은, 예를 들어, 서열번호 1 내지 4의 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500개 또는 그 이상의 아미노산 길이인 폴리펩티드일 수 있다. 단백질의 생물학적 활성 부분은 매개된 활성, 예컨대 본원에 기술된 생물학적 활성을 조절하는 시약을 개발하기 위한 표적으로서 사용될 수 있다.
서열 사이의 서열 상동성 또는 동일성(이러한 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용됨)의 계산은 다음과 같이 수행된다.
2개의 아미노산 서열, 또는 2개의 핵산 서열 사이의 % 동일성을 측정하기 위하여, 서열을 최적 비교 목적을 위해 정렬한다(예컨대, 갭은 최적 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열 중 하나 또는 둘 다에 도입될 수 있고, 비-상동성 서열은 비교 목적을 위해 무시될 수 있음). 바람직한 양태에서, 비교 목적을 위해 정렬된 기준 서열의 길이는 기준 서열의 길이의 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 60% 이상, 더욱 더 바람직하게는 적어도 70%, 75%, 80%, 82%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다. 이때, 상응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 제1 서열 내의 위치가 제2 서열 내의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유될 때, 분자는 그 위치에서 동일하다(본원에 사용되는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 "동일성"은 아미노산 또는 핵산 "상동성"과 동등함). 2개의 서열 사이의 % 동일성은 2개의 서열의 최적 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수 및 갭의 길이를 고려하는, 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다.
서열의 비교 및 2개의 서열 사이의 % 동일성의 측정은 수학 알고리즘을 사용하여 달성될 수 있다. 바람직한 양태에서, 2개의 아미노산 서열 사이의 % 동일성은 BLOSUM 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램(웹사이트[http://www.gcg.com]에서 이용가능함)에 혼입된 문헌[Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453]의 알고리즘을 사용하여 측정된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 % 동일성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스, 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지 내의 GAP 프로그램(웹사이트[http://www.gcg.com]에서 이용가능함)을 사용하여 측정된다. 변수의 특히 바람직한 집합(및 분자가 본 발명의 서열 동일성 또는 상동성 한계 내에 존재하는지 여부를 결정하도록 적용되어야 하는 변수가 무엇인지 실시자가 특정하지 못 할 때 사용되어야 하는 것)은 12의 갭 페널티, 4의 갭 익스텐드 페널티, 및 5의 프레임쉬프트 갭 페널티를 갖는 BLOSUM 62 스코어링 매트릭스이다.
다르게는, 2개의 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열 사이의 % 동일성은, PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용하는 ALIGN 프로그램(버전 2.0)에 혼입된 문헌[Meyers et al. (1989) CABIOS 4:11-17]의 알고리즘을 사용하여 측정될 수 있다.
본원에 기술된 핵산 및 단백질 서열은, 예를 들어, 다른 계열 구성원 또는 관련 서열을 동정하기 위해 공중 데이터베이스에 대한 연구를 수행하기 위한 "쿼리(query) 서열"로서 사용될 수 있다. 이러한 연구는 문헌[Altschul, et al. (1990) J. Mol . Biol. 215:403-410]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 뉴클레오티드 연구는 본 발명의 핵산 분자에 대해 상동성인 뉴클레오티드 서열을 수득하기 위하여 NBLAST 프로그램(스코어 = 100, 단어 길이 = 12)을 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 연구는 본 발명의 단백질 분자에 대해 상동성인 아미노산 서열을 수득하기 위하여 XBLAST 프로그램(스코어 = 50, 단어 길이 = 3)을 사용하여 수행될 수 있다. 비교 목적을 위하여 개핑(gapping)된 정렬을 수득하기 위하여, 개핑된 BLAST는 문헌[Altschul et al., 1997, Nucl . Acids Res. 25:3389-3402]에 기술된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 개핑된 BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램(예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 기정 변수가 사용될 수 있다(웹사이트[http://www.ncbi.nlm.nih.gov] 참조).
본원에 기술된 폴리펩티드는 서열번호 1 내지 4의 아미노산 서열과 충분히 또는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 용어 "충분히 동일한" 또는 "실질적으로 동일한"은 제1 및 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 공통의 구조 도메인 또는 공통의 작용성 활성을 갖도록 제2 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 이에 동등한(예컨대, 유사한 측쇄를 가짐) 충분한 또는 최소 수의 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 함유하는 제1 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열을 지칭하는 것으로 본원에 사용된다. 예를 들어, 적어도 약 60% 또는 65% 동일성, 예컨대 75% 동일성, 더욱 예컨대 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 공통의 구조 도메인을 함유하는 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 충분히 또는 실질적으로 동일한 것으로서 본원에 정의된다.
핵산 분자
본원에 기술된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자가 또한 제공된다.
폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 확립된 표준 방법, 예컨대 문헌[Beucage S.L. et al (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869]에 의해 기술된 포스포로아미다이트 방법, 또는 문헌[Matthes et al (1984) EMBO J. 3, p 801-805]에 의해 기술된 방법에 의해 합성적으로 제조될 수 있다. 포스포로아미다이트 방법에서, 올리고뉴클레오티드는, 예컨대 자동 DNA 합성기에서 합성되고, 정제되고, 어닐링(annealing)되고, 결찰되고, 클로닝된다(적절한 벡터 중에서).
뉴클레오티드 서열은 표준 기술에 따라 합성, 게놈 또는 cDNA 유래(적절한 경우)의 단편을 결찰시킴으로써 제조된 혼합된 게놈 및 합성 유래, 혼합된 합성 및 cDNA 유래, 또는 혼합된 게놈 및 cDNA 유래일 수 있다. 각각의 결찰된 단편은 전체 뉴클레오티드 서열의 다양한 부분에 상응한다. DNA 서열은 또한 특이적인 프라이머(예를 들어, 미국 특허공보 제4,683,202호 또는 문헌[Saiki R et al., Science (1988) 239, pp 487-491]에 기술됨)를 사용하는 폴리머라제 쇄 반응(PCR)에 의해 제조될 수 있다.
뉴클레오티드 서열은 표준 기술에 따른 게놈 및 외래 유래의 믹스(mix)일 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열은 CRISPR/Cas9와 같은 유전자 편집 기술을 사용하여 생성될 수 있고, 이때 루시퍼라제 활성을 갖는 도메인을 코딩하는 핵산 서열은 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 도메인을 코딩하는 천연 핵산 서열의 업스트림에 도입된다.
본원에 사용된 용어 "핵산 분자" 또는 "뉴클레오티드 서열"은 올리고뉴클레오티드 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 이의 변이체, 상동체, 단편 및 유도체(예컨대, 이의 부분)을 지칭한다. 뉴클레오티드 서열은 게놈 또는 합성 또는 재조합 유래일 수 있고, 센스 또는 안티센스 가닥을 나타내는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 본 발명과 관련되는 용어 "뉴클레오티드 서열"은 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 및 RNA(예컨대, mRNA) 및 생성된 DNA 또는 RNA의 유사체(예컨대, 뉴클레오티드 유사체의 사용에 의함)를 포함한다.
핵산 분자는 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중-가닥 DNA, 더욱 바람직하게는 코딩 서열을 위한 cDNA이다. 바람직한 양태에서, 본원에 정의된 특이적인 특성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 자체는, 이의 천연 환경 내에 또한 존재하는 이의 천연-관련된 서열에 연결될 때, 이의 천연 환경에서 천연 뉴클레오티드 서열을 포괄하지 않는다. 용이한 참조를 위해, 본 발명자들은 이러한 바람직한 양태를 "비-천연 뉴클레오티드 서열" 또는 "비-천연 발생 서열"로 지칭하여야 한다. 이에 관하여, 용어 "천연 뉴클레오티드 서열" 또는 "천연 발생 서열"은 이의 천연 환경에서 존재하는 전체 뉴클레오티드 서열을 의미하고, 천연-관련된 전체 프로모터에 작동적으로 연결될 때, 프로모터가 또한 천연 환경에 존재한다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 이의 천연 유기체 내의 뉴클레오티드 서열에 의해 발현될 수 있지만, 뉴클레오티드 서열은 유기체 내에서 천연-관련된 프로모터의 제어 하에 있지 않다.
바람직하게는, 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드가 아니다. 이에 관하여, 용어 "천연 폴리펩티드" 또는 "천연 발생 폴리펩티드"는 이의 천연 환경에 존재하고 이의 천연 뉴클레오티드 서열에 의해 발현되는 전체 폴리펩티드를 의미한다. 전형적으로, 본원에 정의된 특이적인 특성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 재조합 DNA 기술(즉, 재조합 DNA)을 사용하여 제조된다. 그러나, 본 발명의 다른 양태에서, 뉴클레오티드 서열은, 전체적으로 또는 부분적으로, 당업계에 주지된 화학적 방법을 사용하여 합성될 수 있다(문헌[Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23] 및 문헌[Horn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232] 참조).
본원에 사용된 용어 "재조합"은 (1) 이의 천연 발생(천연) 환경으로부터 제거되거나, (2) 자연에서 발견되는 핵산 분자 또는 단백질의 전부 또는 일부와 관련되지 않거나, (3) 천연적으로 연결되지 않는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 작동적으로 연결되거나, (4) 천연적으로 발생하지 않는 생체분자, 예를 들어 유전자 또는 단백질을 지칭한다.
예를 들어, 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 포함하는 폴리펩티드는 재조합 생체분자(본원에 제공된 폴리펩티드의 특이적인 환경 전부에 존재함)로 간주된다. 마찬가지로, 본원에 제공된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자는 또한 "재조합체"이다.
혼성화
본 발명은 또한 본 발명의 서열에 상보적인 서열, 또는 본 발명의 서열 또는 이에 상보적인 서열로 혼성화될 수 있는 서열의 용도를 포괄한다.
본원에 사용된 용어 "혼성화"는 "핵산의 가닥이 염기 짝짓기를 통해 상보적인 가닥과 결합되는 과정" 및 폴리머라제 쇄 반응(PCR) 기술에서 수행되는 증폭 과정을 포함하여야 한다.
혼성화 조건은 문헌[Berger and Immel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA)]에 교시된 바와 같이, 뉴클레오티드 결합 복합체의 용융 온도(Tm)를 기초로 하고, 하기 설명된 바와 같이 정의된 "스트린전시(stringency)"를 부여한다.
최대 스트린전시는 전형적으로 약 Tm - 5℃(프로브의 Tm보다 5℃ 아래)에서 발생하고 높은 스트린전시는 Tm보다 약 5 내지 10℃ 아래에서 발생하고; 중간 스트린전시는 Tm보다 약 10 내지 20℃ 아래에서 발생하고; 낮은 스트린전시는 Tm보다 약 20 내지 25℃ 아래에서 발생한다. 당업자에게 이해되는 바와 같이, 최대 스트린전시 혼성화는 동일한 뉴클레오티드 서열을 동정하거나 검출하는 데 사용될 수 있는 반면, 중간(또는 낮은) 스트린전시 혼성화는 유사한 또는 관련된 폴리뉴클레오티드 서열을 동정하거나 검출하는 데 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명은 중간 스트린전시 조건(예컨대, 50℃ 및 O.2xSSC) 또는 높은 스트린전시 조건(예컨대, 65℃ 및 O.1xSSC{lxSSC - 0.15 M NaCl, 0.015 M Na-시트레이트 pH 7.0}) 하에 본원에 정의된 뉴클레오티드 서열(또는 이의 상보적인 서열)로 혼성화될 수 있는 서열의 용도를 포괄한다.
발현 벡터
본원에 사용된 용어 "벡터" 또는 "구조체"는 작동적으로 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 용어 "벡터" 및 "구조체"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 벡터는 자가 복제될 수 있거나, 숙주 DNA에 통합될 수 있다. 벡터는 재조합 DNA의 삽입을 위한 제한 효소 부위를 포함할 수 있고, 하나 이상의 선택가능한 마커를 포함할 수 있다. 벡터는 플라스미드, 박테리오파지 또는 코스미드의 형태의 핵산 분자일 수 있다. 바람직하게는, 벡터는 세포 내의 발현에 적합하다(즉, 벡터는 "발현 벡터"임). 바람직하게는, 발현 벡터는 뉴런 세포 또는 뉴런 세포주 내의 발현에 적합하다. 가장 바람직하게는, 벡터는 신경모세포종 세포주(예컨대, SiMa 신경모세포종 세포, LAN5 신경모세포종 세포 또는 NG108 신경모세포종 세포), 불멸화된 뉴런, 1차 뉴런 또는 유전자 변형된 유기체 내의 발현에 적합하다.
바람직하게는, (발현) 벡터는 숙주 세포에서 증식될 수 있고, 미래 세대로 안정적으로 유전된다.
본원에 사용된 "작동적으로 연결된"은 후술된 제어 요소의 단일체, 또는 서로 작용성 관계가 있는, 예를 들어, 코딩 서열의 직접적인 발현을 위해 연결된 관계인 코딩 서열과의 조합을 지칭한다.
본원에 사용된 "조절 서열"은 유전자 발현을 제어할 수 있는 DNA 또는 RNA 요소를 지칭한다. 발현 제어 서열의 예는 프로모터, 인핸서, 사일렌서, 샤인 달가르노(Shine Dalgarno) 서열, TATA-박스, 내무 리보좀 도입 부위(IRES), 전사 인자를 위한 부착 부위, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위, RNA 수송 신호, 또는 UV-광 매개된 유전자 반응에 중요한 서열을 포함한다. 바람직하게는, 벡터는 발현되는 핵산 서열에 작동적으로 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함한다. 조절 서열은 구성적인 발현을 지향하는 것, 및 조직-특이적 조절 및/또는 유도 서열을 포함한다.
본원에 사용된 "프로모터"는 RNA 폴리머라제가 전사를 개시하도록 결합하는 DNA 또는 RNA 내의 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 프로모터는 유도성이거나 구성적으로 발현될 수 있다. 다르게는, 프로모터는 리프레서 또는 자극성 단백질의 제어 하에 있다. 바람직하게는 프로모터는 SV40, CMV, 액틴, EF1 α, UB, RCV, PGK, CAG, MMLV-LTR 및 CMV-LTR 하이브리드 프로모터로부터 선택된다.
본원에 사용된 "전사 종결자"는 DNA를 RNA로 전사시키는 RNA 폴리머라제의 기능을 종결시키는 DNA 요소를 지칭한다. 바람직한 전사 종결자는 T 잔사, 및 이어서 GC 풍부 다이아드 대칭 영역의 런(run)에 의해 특징지어진다.
본원에 사용된 "번역 제어 요소"는 mRNA의 번역을 제어하는 DNA 또는 RNA 요소를 지칭한다. 바람직한 번역 제어 요소는 리보좀 결합 부위이다. 바람직하게는, 번역 제어 요소는 프로모터와 상동성인 시스템, 예를 들어, 프로모터 및 이와 관련된 리보자임 결합 부위로부터 유래한다. 바람직한 리보좀 결합 부위는 T7 또는 T3 리보좀 결합 부위이다.
본원에 사용된 "제한 효소 인식 부위"는 제한 효소에 의해 인식되는 DNA 상의 모티프를 지칭한다.
본원에 사용된 "선택가능한 마커"는, 숙주 세포에서 발현될 때, 상기 선택가능한 마커 유전자를 발현하는 세포의 선택을 가능하게 하는 세포 상에 표현형을 부여하는 단백질을 지칭한다. 일반적으로, 이것은 암피실린, 카나마이신, 클로르암페니콜, 테트라사이클린, 하이그로마이신, 네오마이신 또는 메토트렉세이트와 같은 항생제에 내성을 부여하는 단백질일 수 있다. 항생제의 추가 예는 페니실린; 암피실린 HCl, 암피실린 Na, 아목시실린 Na, 카베니실린 나트륨, 페니실린 G, 세팔로스포린스, 세포탁심 Na, 세팔렉신 HCl, 반코마이신, 사이클로세린이다. 다른 예는 정균 억제제, 예컨대 클로르암페니콜, 에리트로마이신, 린코마이신, 테트라사이클린, 스펙티노마이신 설페이트, 클린다마이신 HCl, 클로르테트라사이클린 HCl을 포함한다.
발현 벡터의 디자인은 형질전환될 숙주 세포의 선택, 목적 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 의존한다. 본 발명의 발현 벡터는 숙주 세포에 도입되어 본원에 기술된 핵산(예컨대, 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 도메인을 포함하는 폴리펩티드)에 의해 코딩된 단백질 또는 폴리펩티드, 예컨대 융합 단백질 또는 폴리펩티드를 생성할 수 있다.
바람직하게는, 벡터는 숙주 세포에 의한 본원에 기술된 폴리펩티드의 발현에 필요한 유전 요소를 포함한다. 숙주 세포에서의 전사 및 번역에 필요한 요소는 프로모터, 해당 단백질에 대한 코딩 영역, 및 전사 종결자를 포함한다.
본 발명의 발현 벡터는 표준 발현 벡터, 예컨대 pCDNA3, pIRES-NEO 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 pQCXIP, pQCXIN, pQCXIG, pLXIN, pBMN, pBABE-하이그로 및 pBABE-퓨로일 수 있다.
용어 "발현 벡터", "발현 구조체", "구조체" 및 "벡터"는 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
바람직하게는, 발현 벡터는 하이-카피-넘버(high-copy-number) 발현 벡터이고; 다르게는, 발현 벡터는 로우-카피-넘버(low-copy-number) 발현 벡터이다.
발현 벡터의 제조
당업자는 발현 벡터의 제조에 이용가능한 분자 기술을 인식할 것이다.
전술된 바와 같은 본 발명의 발현 벡터에 혼입하기 위한 핵산 분자는 프라이밍(priming) 올리고뉴클레오티드 및 본원에 기술된 핵산 서열을 서로 사용하는 핵산 분자를 합성함으로써 제조될 수 있다.
다수의 분자 기술이 상보적인 접착성 말단을 통해 DNA를 벡터에 작동적으로 연결하도록 개발되었다. 한 양태에서, 상보적인 단독중합체 트랙이 벡터 DNA 내로 삽입될 핵산 분자에 첨가될 수 있다. 이때, 벡터 및 핵산 분자는 상보적인 단독중합체 꼬리 사이에 수소 결합에 의해 접합되어 재조합 DNA 분자를 형성할 수 있다.
다른 양태에서, 하나 이상의 제한 부위를 함유하는 합성 링커는 핵산 분자를 발현 벡터에 작동적으로 연결하도록 사용된다. 한 양태에서, 핵산 분자는 제한 엔도뉴클레아제 분해에 의해 생성된다. 바람직하게는, 핵산 분자는 박테리오파지 T4 DNA 폴리머라제 또는 대장균 DNA 폴리머라제 I, 3'-5'-엑소뉴클레올리틱 활성을 갖는 돌출된 3'-단일-가닥 말단을 제거하고 중합 활성을 갖는 오목한 3'-단부에 충전하여 둔감한 단부(blunt-ended)의 DNA 분절을 생성하는 효소로 처리된다. 이때, 둔감한 단부의 분절은 둔감한 단부의 DNA 분자의 결찰을 촉진할 수 있는 효소, 예컨대 박테리오파지 T4 DNA 리가제의 존재 하에 큰 몰 과량의 링커 분자와 함께 항온처리된다. 따라서, 반응 생성물은 중합체성 링커 서열을 이의 단부에 갖는 핵산 분자이다. 이때, 이러한 핵산 분자는 적절한 제한 효소에 의해 절단되고, 핵산 분자의 말단과 상용가능한 말단을 생성하는 효소에 의해 절단된 발현 벡터에 결찰된다.
다르게는, 결찰-독립적인 클로닝(LIC) 부위를 포함하는 벡터가 사용될 수 있다. 이때, 필요한 PCR 증폭 핵산 분자는 제한 분해 또는 결찰 없이 LIC 벡터 내로 클로닝될 수 있다(문헌[Aslanidis and de Jong, Nucl. Acid. Res. 18, 6069-6074, (1990), Haun, et al, Biotechniques 13, 515-518 (1992)]).
선택된 플라스미드 내로의 삽입을 위한 해당 핵산 분자를 단리하고/거나 변형하기 위하여, PCR을 사용하는 것이 바람직하다. 서열의 PCR 제조에 사용하기에 적절한 프라이머는 핵산 분자의 요구되는 코딩 영역을 단리하고, 제한 엔도뉴클레아제 또는 LIC 부위를 첨가하고, 목적하는 판독 프레임에 코딩 영역을 위치시키도록 디자인될 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명의 발현 벡터 내로의 혼입을 위한 핵산 분자는 적절한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는, 문헌[Saiki et al (1988) Science 239, 487-491]에 개시된 폴리머라제 쇄 반응의 사용에 의해 제조된다. 코딩 영역은, 프라이머 자체가 증폭된 서열 생성물 내로 혼입되는 동안, 증폭된다. 바람직한 양태에서, 증폭 프라이머는 증폭된 서열 생성물이 적절한 벡터 내로 클로닝되도록 하는 제한 엔도뉴클레아제 인식 분위를 함유한다.
바람직하게는, 핵산 분자는 PCR에 의해 수득되고, 제한 엔도뉴클레아제 분해 및 결찰(당업계에 주지된 기술)을 사용하여 발현 벡터에 도입된다. 더욱 바람직하게는, 핵산 분자는 발현 벡터, 예컨대 pCDNA3, pIRES-NEO 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대 pQCXIP, pQCXIN, pQCXIG, pLXIN, pBMN, pBABE-하이그로 또는 pBABE-퓨로에 도입된다.
본 발명의 발현 벡터는 전술된 핵산 분자의 단일 카피, 또는 전술된 핵산 분자의 다중 카피를 함유할 수 있다.
본원에 기술된 핵산 분자 및/또는 발현 벡터는 적절한 숙주 세포 내에 존재할 수 있다(이에 의해, 유전자 변형된 세포를 생성함).
숙주 세포
본 발명과 관련된 용어 "숙주 세포"는 본 발명에 따른 뉴클레오티드 서열, 또는 본원에 정의된 특이적인 특성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열를 포함하는 임의의 세포를 포함한다. 바람직하게는, 뉴클레오티드 서열는 세포의 게놈에 혼입된다.
용어 "숙주 세포", "유전자 변형된 세포" 및 "재조합 숙주 세포"는 상호교환적으로 사용된다. 이러한 용어는 이들이 이의 천연 환경에 또한 존재하는 이들의 천연 프로모터의 제어 하에 존재할 때 이들의 천연 환경 내의 천연 뉴클레오티드 코딩 서열을 포괄하지 않지만, 유전자 변경된(예컨대, 형질전환되거나 형질감염된) 세포를 지칭한다. 상기 용어는 구체적인 대상 세포 및 또한 이러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손을 또한 지칭한다. 특정 변형이 돌연변이 또는 환경적인 영향에 기인하여 다음 세대에서 발생할 수 있으므로, 이러한 자손은 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수 있지만, 여전히 본원에 사용된 용어의 범주 내에 포함된다.
유전자 변형된 세포는 진핵 세포 또는 원핵 세포일 수 있다. 바람직하게는, 유전자 변형된 세포는 클로스트리디아 민감성 세포[예컨대, 클로스트리디아 신경독소가 결합하고 세포 막 전역에 전위할 수 있는 세포(예컨대, 클론/세포주)]이다. 이러한 세포의 예는 주지되어 있고, 당업자는, 예를 들어, 파상풍 신경독소 및/또는 보툴리누스균 신경독소(예컨대, BoNT B형, BoNT D형, BoNT F형 및/또는 BoNT G형)가 세포 막 전역에 결합하고 전위할 수 있는지 여부를 시험함으로써, 상기 세포를 용이하게 동정할 수 있을 것이다. 이를 시험하기 위한 일상적인 실험, 예컨대 하기 실시예 부분에 기술된 일부 실험은 주지되어 있다. 적합한 세포는 신경모세포종 세포주(예컨대, SiMa 신경모세포종 세포, LAN5 신경모세포종 세포, NG108 신경모세포종 세포), 불멸화된 뉴런, 1차 뉴런 또는 유전자 변형된 유기체를 포함한다.
숙주 세포 게놈은 임의의 적합한 수단, 예컨대 루시퍼라제 활성을 갖는 단백질 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 단백질 도메인 천연(내인성) 핵산 서열의 상부에 도입하는 유전자 편집 기술을 사용하여 본 발명의 핵산 서열을 생성하도록 변경될 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 숙주 세포는 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 본 발명의 발현 벡터로 형질전환되거나 감염되거나 형질감염될 수 있다.
숙주 세포 형질전환
전술된 핵산 분자를 포함하고, 본 발명의 발현 벡터로 형질전환되거나 감염되거나 형질감염된 숙주 세포는 본원에 제공된 폴리펩티드를 생성(즉, 발현)하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 발현 벡터는 통상적인 형질전환, 형질감염 또는 형질도입 기술에 의해 도입될 수 있다. "형질전환", "형질감염" 및 "형질도입"은 외래 핵산을 세포에 도입하는 기술을 지칭한다. 사용된 특정 방법은 전형적으로 벡터의 유형 및 세포 둘 다에 의존한다. 상기 기술은, 비제한적으로 칼슘 포스페이트 또는 칼슘 클로라이드 공-침전, DEAE-덱스트란-매개된 형질감염, 리포펙션, 화학천공(chemoporation) 또는 전기천공을 포함한다.
세포의 형질전환, 형질감염 또는 형질도입에 대해 당업계에 공지된 기술은, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y]; 문헌[Ausubel et al (1987) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY]; 문헌[Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110]; 문헌[Luchansky et al (1988) Mol. Microbiol. 2, 637-646]에 개시되어 있다.
성공적으로 형질전환되거나 형질감염되거나 형질도입된 세포(또는 유전자 변형된 세포), 즉 본 발명의 발현 벡터 또는 핵산 분자를 함유하는 세포는 당업계에 주지된 기술에 의해 동정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 발현 벡터로 형질감염된 세포는 루시퍼라제 활성 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 단백질을 생성하도록 배양될 수 있다. 세포는 당업계에 주지된 기술에 의해 발현 벡터 DNA의 존재에 대해 검사될 수 있다. 다르게는, 폴리펩티드 또는 이의 부분 및 단편의 존재는 이에 혼성화되는 항체를 사용하여 검출될 수 있다.
바람직한 양태에서, 본 발명은 형질전환된 세포의 배양물을 포함한다. 바람직하게는, 배양물은 클론적으로 상동성이다.
상기 세포는 전술된 발현 벡터의 단일 카피, 또는 다르게는, 발현 벡터의 다중 카피를 함유할 수 있다.
용도 및 방법
본 발명자들은 놀랍게도 신경독소 활성(구체적으로, 파상풍, 보툴리누스균 B형, 보툴리누스균 D형, 보툴리누스균 F형 및/또는 보툴리누스균 G형 신경독소 활성)을 검출하는 데 사용될 수 있는 신규한 리포터 분자를 동정하였다. 특정된 신경독소에 의한 리포터 분자의 절단 시, 하기 2개의 절단 단편이 생성된다: 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인의 부분을 포함하는 제1 단편; 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인의 나머지 부분을 포함하는 제2 단편. 유리하게는, 제1 단편은 신경독소 활성의 검출(즉, 리포터 분자 절단의 검출)을 가능하게 하도록 충분히 안정하다.
따라서, 본 발명의 폴리펩티드, 핵산 분자, 발현 벡터 또는 유전자 변형된 세포는 신경독소 활성의 검출에 사용될 수 있고, 이때 신경독소 활성은 파상풍 신경독소 활성, 보툴리누스균 B형 신경독소 활성, 보툴리누스균 D형 신경독소 활성, 보툴리누스균 F형 신경독소 활성 및 보툴리누스균 G형 신경독소 활성으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 사용된 "신경독소 활성"은 이의 기질(이러한 경우, VAMP1, VAMP 또는 VAMP3 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인)을 절단시키는 천연 발생 파상풍, 보툴리누스균 B형, 보툴리누스균 D형, 보툴리누스균 F형 및 보툴리누스균 G형 신경독소 중 어느 하나의 능력을 지칭한다. 천연 발생 신경독소 및 이들 각각의 신경독소 활성은 당업계에 주지되어 있고, 다른 곳에 더욱 상세히 기술되어 있다(표 1 및 또한, 예를 들어 문헌[Botulinum Neurotoxins. Editors: Rummel, Andreas, Binz, Thomas (Eds.) Springer, Current Topics in Microbiology and Immunology, 2013] 참조).
예를 들어, "파상풍 신경독소 활성"은 절단 부위 GASQ78FESS에서의 VAMP1(또는 VAMP1 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인)의 절단, 절단 부위 GASQ76FETS에서의 VAMP2(또는 VAMP2 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인)의 절단, 및/또는 절단 부위 GASQ59FETS에서의 VAMP3(또는 VAMP3 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인)의 절단을 지칭한다.
예를 들어, "보툴리누스균 B형 신경독소 활성"은 절단 부위 GASQ78FESS에서의 VAMP1(또는 VAMP1 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인)의 절단, 절단 부위 GASQ76FETS에서의 VAMP2(또는 VAMP2 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인)의 절단, 및/또는 절단 부위 GASQ59FETS에서의 VAMP3(또는 VAMP3 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인)의 절단을 지칭한다.
예를 들어, "보툴리누스균 D형 신경독소 활성"은 절단 부위 RDQK61LSEL에서의 VAMP1(또는 VAMP1 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인)의 절단, 절단 부위 RDQK59LSEL에서의 VAMP2(또는 VAMP2 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인)의 절단, 및/또는 절단 부위 RDQK42LSEL에서의 VAMP3(또는 VAMP3 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인)의 절단을 지칭한다.
예를 들어, "보툴리누스균 F형 신경독소 활성"은 절단 부위 ERDQ60KLSE에서의 VAMP1(또는 VAMP1 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인)의 절단, 절단 부위 ERDQ58KLSE에서의 VAMP2(또는 VAMP2 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인)의 절단, 및/또는 절단 부위 ERDQ41KLSE에서의 VAMP3(또는 VAMP3 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인)의 절단을 지칭한다.
예를 들어, "보툴리누스균 G형 신경독소 활성"은 절단 부위 ESSA83AKLK에서의 VAMP1(또는 VAMP1 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인)의 절단, 절단 부위 ETSA81AKLK에서의 VAMP2(또는 VAMP2 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인)의 절단, 및/또는 절단 부위 ETSA64AKLK에서의 VAMP3(또는 VAMP3 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인)의 절단을 지칭한다.
파상풍, 보툴리누스균 B형, 보툴리누스균 D형, 보툴리누스균 F형 및/또는 보툴리누스균 G형 신경독소의 변형된 버전(예컨대, 인공적으로 변형된, 재조합, 키메라, 톡소이드 등)은 "신경독소 활성"(즉, VAMP1, VAMP2 및/또는 VAMP3을 표 1에 제시된 방식으로 절단하는 능력)을 보유할 수 있다. 따라서, 본 발명은 이러한 변형된 신경독소가 "신경독소 활성"을 보유하는지 여부를 검출하는 데 사용될 수 있다. 이러한 용도 및 방법은 본 발명에 의해 포괄된다.
보툴리누스균 신경독소의 다양성은, 예를 들어, 문헌[Research in Microbiology, Volume 166, Issue 4, May 2015, Pages 303-317, Genomes, neurotoxins and biology of Clostridium boltulinum Group I and Group II, Andrew T. Carter, Michael W. Peck]에 요약되어 있다.
따라서, 본 발명은 이들 신경독소의 천연 발생 형태의 신경독소 활성(및/또는 존재), 및 키메라, 또는 이의 인공적으로 변형된 형태의 신경독소 활성을 변형하는 데 사용될 수 있다. 따라서, 유리하게는, 본 발명은 증가된 또는 감소된 신경독소 활성을 위한 이들 신경독소의 변형된 형태를 시험하기 위한 수단을 제공한다.
신경독소 활성을 검출하기 위한 임의의 적합한 수단이 사용될 수 있다. 여러 가지 표준 기술이 본원에 기술된 폴리펩티드의 절단을 검출하는 데 사용될 수 있다. 예시적인 기술은, 비제한적으로 면역블로팅(웨스턴 블로팅으로도 공지됨), 샌드위치 ELISA 검정 또는 생세포 이미징을 포함한다. 당업계의 이러한 방법 또는 일상 과정 및 이들 각각의 수행 방법의 세부사항은 주지되어 있다(예를 들어, 문헌[Specificity of botulinum protease for human VAMP family proteins. Yamamoto H, et al. Microbiol Immunol, 2012 Apr. PMID 22289120]; 문헌[Substrate recognition of VAMP-2 by botulinum neurotoxin B and tetanus neurotoxin. Chen S, et al. J Biol Chem, 2008 Jul 25. PMID 18511417] 참조).
신경독소 활성의 검출은 유전자 변형된 세포의 부재 하에 시험관 내에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 신경독소(또는 후술된 시험 샘플)와 접촉할 수 있고, 절단된 생성물의 존재가 검출될 수 있다(예컨대, ELISA 또는 웨스턴 블로팅에 의함). 이러한 검출 방법의 개발은 당업자의 일상적인 능력에 충분히 포함된다.
다르게는, 신경독소 활성의 검출은 본원에 기술된 유전자 변형된 세포를 사용하여 수행될 수 있다. 유리하게는, 유전자 변형된 세포는 신경독소 작용의 3개의 단계[즉, 세포 표면으로의 결합, 세포 시토솔 내로의 신경독소 펩티다제의 전달, 및 이의 기질(이러한 경우에, 본 발명의 폴리펩티드)의 신경독소-유발된 절단]를 시험하기 위한 수단을 제공한다. 절단된 생성물의 존재가 측정될 수 있다(예컨대, 세포 용해물의 ELISA 또는 웨스턴 블로팅에 의해). 폴리펩티드의 신경독소 절단에 의해 생성된 "제1 단편"(루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 도메인의 부분을 포함하는 단편)이 더 이상 소낭 결합되지 않지만, 세포 시토솔에 존재하므로, 생세포 이미징이 또한 신경독소 활성을 검출하는 데 사용될 수 있다. 이러한 검출 방법의 개발은 당업자의 일상적인 능력에 충분히 포함된다.
절단된 폴리펩티드의 루시퍼라제 활성이 또한 신경독소-유발된 절단의 검출에 사용될 수 있다. 루시퍼라제 검출을 포함하고 당업계에 주지된 표준 기술 및 이러한 방법의 개발은 당업자의 일상적인 능력에 충분히 포함된다. 루시퍼라제 검출 방법의 검토는 문헌[Application of enzyme bioluminescence for medical diagnostics. Frank LA, Krasitskaya VV. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2014;144:175-97; Current advanced bioluminescence technology in drug discovery. Hoshino H. Expert Opin Drug Discov. 2009 Apr;4(4):373-89]에서 발견될 수 있다.
폴리펩티드의 절단된 단부에 특이적인 항체가 또한 신경독소-유발된 절단의 검출에 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 절단된 단부에 특이적인 항체를 사용하는 하나의 이점은 어떠한 특이적인 신경독소(예컨대, 파상풍/BoNT B형, BoNT D형, BoNT F형 또는 BoNT G형, 표 1 참조)가 폴리펩티드의 절단에 책임이 있는지(및, 이에 따라 어떠한 신경독소가, 예컨대 후술된 시험 샘플 내에 존재하는지)를 결정하는 데 사용될 수 있다는 것이다.
예를 들어, BoNT/B 절단된 VAMP2 또는 BoNT/D 절단된 VAMP2에 특이적인 항체가 생성될 수 있다(항체는 각각 펩티드 ALQAGASQ 및 펩티드 KVLERDQK에 대항하여 상승하였음, 도 5 및 상응하는 도면 범례 참조).
본 발명은 시험 샘플에서 신경독소 활성을 검출하는 데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "시험 샘플"은 파상풍 신경독소 활성, 보툴리누스균 B형 신경독소 활성, 보툴리누스균 D형 신경독소 활성, 보툴리누스균 F형 신경독소 활성, 보툴리누스균 G형 신경독소 활성, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경독소 활성의 존재에 대해 시험될 임의의 샘플(공지된, 비공지된 또는 부분적으로 공지된 조성을 가짐)일 수 있다.
"시험 샘플"은 약물 제품[예컨대, 대상에게 투여하기 위한 백신, 예컨대 톡소이드, 이때 톡소이드는 병원성 미생물(예컨대, 파상풍 또는 보툴리누스균)로부터 화학적으로 변형되고, 더 이상 독성이 없지만, 여전히 항원성이고, 백신으로서 사용될 수 있는 독소임]을 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 본 발명은 (원치 않는) 잔여 신경독소 활성을 검출하는 데 사용될 수 있다.
본원에 사용된 "대상"은 (예컨대, 백신접종될) 인간 또는 동물이다. 통상적으로, 상기 동물은 척추동물, 예컨대 영장류, 설치류, 가축 동물 또는 경주 동물이다. 영장류는 침팬지, 사이노몰구스 원숭이, 거미 원숭이 및 짧은 꼬리 원숭이, 예컨대, 레서스(Rhesus)를 포함한다. 설치류는 마우스, 래트, 마멋류, 흰족제비, 토끼 및 햄스터를 포함한다. 가축 및 경주 동물은 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 물소, 고양이 종, 예컨대 집고양이, 개 종, 예컨대 개, 여우, 늑대, 조류 종, 예컨대 닭, 에뮤, 타조, 및 어류, 예컨대 송어, 메기 및 연어를 포함한다. 본원에 기술된 양상의 특정 양태에서, 대상은 포유동물, 예컨대 영장류, 예컨대 인간이다. 대상은 수컷 또는 암컷일 수 있다. 대상은 완전히 성장한 대상(예컨대, 성인) 또는 성장 과정에 있는 대상(예컨대, 아동, 유아 또는 태아)일 수 있다.
바람직하게는, 대상은 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만, 이들 예로 제한되지 않는다.
적합한 시험 샘플은 또한 식품 샘플, 임상 샘플 또는 환경 샘플(이때, 식품 샘플, 임상 샘플 또는 환경 샘플은 클로스트리듐에 의해 오염될 수 있고/거나 신경독소를 함유할 수 있음), 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 본 발명은 오염의 존재를 검출하는 데 사용될 수 있다.
적합한 시험 샘플은 또한 파상풍 신경독소, 보툴리누스균 B형 신경독소, 보툴리누스균 D형 신경독소, 보툴리누스균 F형 신경독소 및/또는 보툴리누스균 G형 신경독소(예를 들어, 임의적으로 치료적 또는 비-치료적 용도를 위해 제조된 신경독소의 공지된 배치로부터의 시험 샘플), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 이러한 경우에, 본 발명은 신경독소의 효능을 검출하고 측정하는 데 사용될 수 있다. 의심을 피하기 위하여, 시험 샘플 내의 신경독소는 천연 발생 신경독소일 수 있거나, 이의 변형된(예컨대, 인공적으로 변형된, 예컨대 키메라) 버전일 수 있다.
바람직한 방법에서, 신경독소 활성은 본 발명의 유전자 변형된 세포를 사용하여 검출(또는 측정)될 수 있고, 이때 세포는 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 조건 하에 배양된다. 이러한 예에서, 유전자 변형된 세포는 신경독소(또는 시험 샘플)와 접촉할 수 있고, 절단된 생성물의 존재가 측정될 수 있다(예컨대, ELISA, 웨스턴 블로팅 또는 생세포 이미징에 의해). 이러한 방법의 개발은 또한 당업자의 일상적인 능력에 충분히 포함된다.
따라서, (a) 본 발명에 따른 유전자 변형된 세포를 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 조건 하에 배양하는 단계; (b) (a)의 세포를 시험 샘플의 존재 하에 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 신경독소-유발된 절단을 가능하게 하는 조건 하에 배양하는 단계; 및 (c) 상기 폴리펩티드의 신경독소-유발된 절단의 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 시험 샘플에서 신경독소 활성을 검출하는 방법으로서, 상기 폴리펩티드의 신경독소-유발된 절단의 검출이 신경독소 활성을 나타내고; 상기 신경독소 활성이 파상풍 신경독소 활성, 보툴리누스균 B형 신경독소 활성, 보툴리누스균 D형 신경독소 활성, 보툴리누스균 F형 신경독소 활성, 보툴리누스균 G형 신경독소 활성 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법이 제공된다.
단계 (a)의 배양 조건은 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 발현을 가능하게 한다. 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 배양 조건을 최적화시키는 것은 당업자의 일상적인 능력에 충분히 포함된다. 또한, 선택되는 배양 조건이 폴리펩티드 발현의 발현을 가능하게 하는지 여부를 확인하는 것은 또한 일상적인 것이고, 폴리펩티드 발현의 양은 ELISA 또는 웨스턴 블로팅과 같은 표준 기술을 사용하여 검출될 수 있다.
세포는 숙주 세포에 따라 당업자가 익숙한 방식으로 성장하거나 배양된다. 사용될 배양 매질(본원에서 "성장 매질", "매질" 또는 "배지"로도 지칭됨)은 해당 세포의 요건에 적절히 부합하여야 한다. 바람직하게는, 배양 매질은 숙주 세포의 성장을 지원하기에 충분하다. 다양한 세포에 대한 적합한 배양 매질의 기술은 문헌["Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications, Sixth Edition, R. Ian Freshney, 2010 John Wiley & Sons, Inc."]에서 발견될 수 있다. 단지 예를 들어, SiMa 신경모세포종 세포는 바람직하게는 하기 조건 하에 배양된다: SiMa 세포(DSMZ 세포 수집으로부터)는 10% 태아 소 혈청이 보충된 RPMI 매질에서 성장한다. 분화를 위하여, 플레이트를 10 μg/mL 라미닌으로 사전-코팅하였다. SiMa 세포를 96-웰 플레이트에서 웰 당 1 x 104 세포 또는 48-웰 플레이트에서 웰 당 2 x 104 세포의 밀도로 시딩하고, 분화 매질(RPMI, B27 또는 GS21 보충물, 1 mM HEPES 및 10 μM AT-레티노산을 갖는 1% NEAA)에서 72시간 동안 항온처리하였다.
유전자 변형된 세포는 하나 이상의 탄소 공급원(통상적으로, 당의 형태), 질소 공급원(통상적으로 유기 질소 공급원, 예컨대 효모 추출물 또는 염, 예컨대 암모늄 설페이트), 무기 염, 미량 원소, 예컨대 철, 망간 및 마그네슘의 염, 및, 적절한 경우, 비타민을 액체 매질 중에서, 이산화탄소 중에서 기체 발생시키면서, 0 내지 100℃, 바람직하게는 25 내지 40℃의 온도에서 성장할 수 있다.
바람직한 탄소 공급원은 당, 예컨대 모노-, 다이- 또는 폴리사카라이드이다. 탄소 공급원의 예는 글루코스, 이산화탄소, 나트륨 바이카본에이트, 바이카본에이트, 프럭토스, 만노스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리불로스, 락토스, 말토스, 수크로스, 라피노스, 전분 또는 셀룰로스이다. 바람직하게는, 탄소 공급원은 이산화탄소이다. 다르게는, 탄소 공급원은 바이카본에이트이다. 다양한 탄소 공급원의 혼합물의 첨가가 또한 유리할 수 있다.
질소 공급원은 통상적으로 유기 또는 무기 질소 화합물 또는 이들 화합물을 포함하는 물질이다. 질소 공급원의 예는 액체 또는 기상 형태의 암모니아 또는 암모늄 염, 예컨대 암모늄 설페이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 포스페이트, 암모늄 카본에이트 또는 암모늄 니트레이트, 니트레이트, 우레아, 아미노산 또는 복합 질소 공급원, 예컨대 옥수수 침지액, 대두 가루(soya meal), 대두 단백질, 효모 추출물, 육류 추출물 등을 포함한다. 질소 공급원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.
매질에 존재할 수 있는 무기 염 화합물은 칼슘, 마그네슘, 나트륨, 코발트, 몰리브데늄, 칼륨, 망간, 아연, 구리 및 철의 클로라이드, 인 및 설페이트 염을 포함한다.
무기 황-함유 화합물, 예를 들어, 설페이트, 설파이트, 다이티오나이트, 테트라티오네이트, 티오설페이트, 설파이드, 또는 그 밖의 유기 황 화합물, 예컨대 머캡탄 및 티올은 황-함유 정제 화학제품, 특히 메티오닌의 생산을 위한 황의 공급원으로서 사용될 수 있다.
인산, 칼륨 이수소포스페이트 또는 이칼륨 수소포스페이트 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 인의 공급원으로서 사용될 수 있다.
킬레이트화제는 용액 중에 금속 이온을 유지하기 위하여 매질에 첨가될 수 있다. 특히 적합한 킬레이트화제는 다이하이드록시페놀, 예컨대 카테콜 또는 프로토카테쿠에이트 및 유기 산, 예컨대 시트르산을 포함한다.
본 발명에 따라 사용된 배양 매질은 또한 다른 성장 인자, 예컨대 비타민 또는 성장 촉진제를 포함할 수 있고, 예를 들어, 바이오틴, 리보플라빈, 티아민, 엽산, 니코틴산, 판토테네이트 및 피리독신을 포함한다. 성장 인자 및 염은 종종 복합 매질 성분, 예컨대 효모 추출물, 당밀, 옥수수 침지액 등으로부터 유래한다. 또한, 적합한 전구체를 배양 매질에 첨가하는 것이 가능하다. 매질 화합물의 정확한 조성은 주로 구체적인 실험에 의존하고, 각각의 특이적인 경우에 대해 개별적으로 결정된다. 매질의 최적화에 대한 정보는 문헌["Applied Microbiol. Physiology, A Practical Approach" (Editors P.M. Rhodes, P.F. Stanbury, IRL Press (1997) pp. 53-73, ISBN 0 19 963577 3)]에서 발견될 수 있다. 성장 매질은 상업적인 공급자로부터 입수할 수 있다[예를 들어, 스탠다드(Standard) 1(메르크(Merck)) 또는 BHI(뇌 심장 주입, DIFCO) 등].
액체 매질의 pH는 일정하게 유지되거나(즉, 배양 기간 동안 조절됨) 유지되지 않을 수 있다.
공지된 배양 방법에 대한 개관은 크밀(Chmiel)에 의한 문헌[Bioprozesstechnik 1. Einfㆌhrung in die Bioverfahrenstechnik [Bioprocess technology 1. Introduction to Bioprocess technology] (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)] 또는 스토르하스(Storhas)에 의한 문헌[Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripheral equipment] (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)]에서 발견될 수 있다.
모든 매질 성분은 열(1.5 bar 및 121℃에서 20분) 또는 필터 멸균에 의해 멸균된다. 성분은 함께, 또는, 필요에 따라 별도로 멸균될 수 있다. 모든 매질 성분은 배양의 개시 시에 존재할 수 있거나, 필요에 따라, 연속식 또는 회분식으로 첨가될 수 있다.
배양 온도는 구체적인 실험 및 숙주 세포에 따라 변할 것이다. 배양 온도는 통상적으로 15 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃, 더욱 바람직하게는 25 내지 37℃이고, 일정하게 유지될 수 있거나 실험 중에 변경될 수 있다. 단지 예를 들어, SiMa 신경모세포종 세포의 경우, 온도는 바람직하게는 25 내지 40℃, 더욱 바람직하게는 37℃이다.
매질의 pH는 5 내지 8.5, 바람직하게는 약 7.0이어야 한다. 배양을 위한 pH는 염기성 화합물, 예컨대 나트륨 하이드록사이드, 칼륨 하이드록사이드, 암모니아 및 수성 암모니아 또는 산성 화합물, 예컨대 인산 또는 황산을 첨가함으로써 배양 중에 제어될 수 있다. 발포는 소포제, 예를 들어, 지방산 폴리글리콜 에스터를 사용함으로써 제어될 수 있다. 벡터의 안정성을 유지하기 위하여, 선택적인 효과를 갖는 적합한 물질, 예를 들어 항생제를 매질에 첨가하는 것이 가능하다. 호기성 조건은 산소 또는 산소-함유 기체 혼합물, 예를 들어, 주위 공기를 배양물에 도입함으로써 유지된다. 배양물의 온도는 통상적으로 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃이다. 배양은 폴리펩티드의 발현이 발생할 때까지 계속된다. 이러한 목적은 통상적으로 6 내지 96 시간 내에 달성된다.
단계 (b)의 배양 조건은 시험 샘플의 존재이고, 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 신경독소-유발된 절단을 가능하게 한다. 즉, 배양 조건은, 작용성 신경독소가 시험 샘플에 존재하는 경우, 폴리펩티드의 적어도 일부의 신경독소-유발된 절단이 발생하도록 하는 것이다. 폴리펩티드의 신경독소-유발된 절단을 가능하게 하는 배양 조건을 최적화시키는 것은 당업자의 일상적인 능력에 충분히 포함된다. 또한, 선택된 배양 조건이 폴리펩티드의 신경독소-유발된 절단을 가능하게 하는지 여부를 확인하는 것도 일상적인 것이고, 폴리펩티드의 신경독소-유발된 절단의 양은 표준 기술, 예컨대 ELISA 또는 웨스턴 블로팅(다른 곳에서 논의됨)을 사용하여 검출될 수 있다.
한 양태에서, 배양 단계 (a) 및 (b)는 동시에 수행된다. 즉, 시험 샘플은 세포 배양의 개시 시에 유전자 변형된 세포에 첨가될 수 있거나, 폴리펩티드 발현이 이미 시작되었으면 후에 첨가될 수 있다. 유전자 변형된 세포가 시험 샘플의 존재 하에 배양되는 시점을 최적화시키는 것은 당업자의 일상적인 능력에 충분히 포함된다.
임의적으로, 시험 샘플은 배양 매질 중에 제공된다.
본원에 기술된 바와 같이, 시험 샘플은 약물 제품, 식품 샘플, 임상 샘플 또는 환경 샘플, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 다르게는, 시험 샘플은 파상풍 톡소이드, 보툴리누스균 톡소이드, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
시험 샘플은 파상풍 신경독소, 보툴리누스균 B형 신경독소, 보툴리누스균 D형 신경독소, 보툴리누스균 F형 신경독소, 보툴리누스균 G형 신경독소, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 의심을 피하기 위하여, 시험 샘플 내의 신경독소는 천연 발생 신경독소일 수 있거나, 이의 변형된(예컨대, 인공적으로 변형된, 예컨대 키메라) 버전일 수 있다.
본원에 제공된 방법은 단계 (c), 즉 폴리펩티드의 신경독소-유발된 절단의 수준을 측정하는 단계를 포함하고, 이때 폴리펩티드의 신경독소-유발된 절단의 검출은 신경독소 활성을 나타내고; 신경독소 활성은 파상풍 신경독소 활성, 보툴리누스균 B형 신경독소 활성, 보툴리누스균 D형 신경독소 활성, 보툴리누스균 F형 신경독소 활성, 보툴리누스균 G형 신경독소 활성, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
폴리펩티드의 신경독소-유발된 절단의 수준은 본원에 논의된 임의의 적합한 표준 기술(예컨대, ELISA, 웨스턴 블로팅, 생세포 이미징 등)을 사용하여 측정(또는 검출)될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 신경독소-유발된 절단의 "검출"은 검출가능한(예컨대, 가시적인, 정량화가능한 등) 신경독소-유발된 절단의 임의의 수준 또는 양을 포괄한다. 예를 들어, 이것은 시험 시점에 기질(본 발명의 폴리펩티드)의 적어도 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%의 절단을 포함한다(이때, 시험 시점은 시험 샘플을 세포에 첨가한 후, 예를 들어, 6 시간 이상일 수 있음). 시험 샘플을 세포에 첨가한 후 적합한 시점(예컨대, 상기 사용된 "시험 시점")의 다른 예는 적어도 24, 48 또는 72 시간을 포함한다.
"신경독소-유발된 절단"은 본 발명의 폴리펩티드의 절단을 지칭하고, 이때 절단은 신경독소의 활성에 기인한다(즉, 비-특이적 폴리펩티드 분해와 같은 다른 기전에 기인한 폴리펩티드의 절단, 또는 다른 비-신경독소 효소에 의한 절단을 포함하지 않음). 신경독소-유발된 절단은 당업계의 표준 기술, 예컨대 ELISA 또는 신경독소-유발된 절단이 발생함을 확인하는 절단 생성물의 크기(예컨대, 웨스턴 블롯 상에서)를 사용하여 확인될 수 있다. 폴리펩티드의 신경독소-유발된 절단의 검출은 신경독소 활성을 나타낸다(예컨대, 절단의 수준 또는 양은 시험 샘플에서 신경독소 활성의 수준 또는 양에 비례함). 본 발명의 문맥에서, 용어 "신경독소-유발된 절단" 및 "신경독소 활성"은 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 음성 대조군(상기 상술됨)을 사용하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 신경독소 유도된 절단의 수준이 측정되고, 이어서 음성 대조군 샘플 중 폴리펩티드의 절단 수준 또는 폴리펩티드의 절단에 대한 소정 기준 수준과 비교될 수 있고, 이때 대조군 샘플과 비교되거나 소정 기준 수준과 비교된 절단 시험 샘플의 존재 하의 절단의 증가된 수준은 신경독소-유발된 절단의 존재를 확인한다. 음성 대조군은 시험 샘플의 부재 하에 또는 신경독소 활성을 결핍한 것으로 공지된 샘플, 예컨대 열 불활성화된 시험 샘플의 존재 하에 동일한 조건에서 동일한 세포를 배양하는 것을 포함한다.
추가로 또는 다르게는, 양성 대조군을 사용하는 것이 유리할 수 있다(예를 들어, 톡소이드의 잔여 신경독소 활성을 시험할 때, 거짓 음성이 생성되지 않도록 보장하기 위해). 양성 대조군의 예는 작용성 신경독소를 포함하는 것으로 공지된 시험 샘플의 존재 하에 동일한 조건에서 동일한 세포를 배양하는 것일 수 있다.
특정 양태에서, 해당 신경독소 절단 생성물에 특이적인 항체를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 항체의 예는 본원에 기술되어 있다(또한 도 5 및 상응하는 도면 범례 참조).
다른 적절한 양성 및 음성 대조군의 개발 및 사용은 당업자의 일상적인 능력에 충분히 포함된다.
키트
(a) 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및 (b) 신경독소 활성을 검출하기 위한 양성 대조군으로서, (a)의 핵산 분자에 의해 코팅된 폴리펩티드를 절단할 수 있는 양성 대조군을 포함하는, 신경독소 활성을 검출하기 위한 키트가 또한 본원에 제공된다.
신경독소 활성은 파상풍 신경독소 활성, 보툴리누스균 B형 신경독소 활성, 보툴리누스균 D형 신경독소 활성, 보툴리누스균 F형 신경독소 활성, 보툴리누스균 G형 신경독소 활성, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
(a)의 핵산 분자(및 코딩된 폴리펩티드)는 본원의 다른 곳에서 상세히 기술되었다.
적절하게는, 핵산 분자는 발현 벡터의 부분일 수 있고/거나 유전자 변형된 세포(예컨대, 유전자 변형된 SiMa 신경모세포종 세포) 내에 존재할 수 있다(예컨대, 이의 부분을 형성하고 이에 존재함). 이러한 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터 및 유전자 변형된 세포가 또한 본원에 상세히 기술된다.
본원에 제공된 키트는 신경독소 활성을 검출하기 위한 양성 대조군으로서, (a)의 핵산 분자에 의해 코딩된 폴리펩티드를 절단할 수 있는 양성 대조군을 추가로 포함한다.
한 양태에서, 양성 대조군은 적절한 양의 하나 이상의 파상풍 신경독소, 보툴리누스균 B형 신경독소, 보툴리누스균 D형 신경독소, 보툴리누스균 F형 신경독소 또는 보툴리누스균 G형 신경독소를 포함할 수 있다. 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이, 신경독소는 천연 발생할 수 있거나 이의 변형된 버전일 수 있고, 이때 변형된 버전은 신경독소 활성을 보유한다.
임의적으로, 루시퍼라제 활성의 검출을 위한 시약을 추가로 포함한다. 적합한 시약은 당업계에 주지되어 있고, 비제한적으로 루시페린, 퓨리마진, 코엘렌테라진, ATP 및 다른 공지된 루시퍼라제 기질을 포함한다(문헌[Beyond D-lucifein: expanding the scope of bioluminescence imaging in vivo. Adams ST Jr, Miller SC. Curr Opin Chem Biol. 2014 Aug;21:112-20]).
키트는 검정 시약, 완충제, 및 하나 이상의 절단된 폴리펩티드 단편에 대한 선택적인 결합 파트너(이들 모두는 수송에 적합한 용기에 하우징될 수 있음) 중 하나 또는 모두를 포함할 수 있다. 선택적인 결합 파트너는 하나의 절단된 폴리펩티드 단편에 선택적으로 결합하는 항체를 포함할 수 있다. 이러한 항체의 예는 본원의 다른 곳에 기술되어 있다(또한 도 5 및 상응하는 도면 범례 참조).
일부 양태에서, 키트는 연속적인 고체 표면 상에 선택적인 결합 파트너를 포함한다. 예시적인 키트는 검출 결합 파트너 및 신경독소 활성을 검출하기 위한 양성 대조군을 갖는 용기를 포함한다.
또한, 키트는 키트에 제공된 물질의 사용을 위한 지침(즉, 프로토콜)을 함유하는 설명적인 재료를 포함할 수 있다. 설명적인 재료가 전형적으로 서면 또는 인쇄 재료를 포함하지만, 이들은 이러한 설명을 저장할 수 있고 최종 소비자와 소통할 수 있는 임의의 매체에 제공될 수 있다. 적합한 매체는, 비제한적으로, 전자 저장 매체(예컨대, 자기 디스크, 테이프, 카트리지, 칩) 및 광학 매체(예컨대, CD ROM)를 포함한다. 매체는 설명적인 재료를 제공하는 인터넷 사이트에 대한 주소를 포함할 수 있다. 이러한 설명은 본원에 상술된 임의의 방법 또는 용도에 따를 수 있다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, 문헌[Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, NY (1 94)]; 및 문헌[Hale and Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)]은 당업자에게 본 발명에 사용된 많은 용어의 일반적인 사전을 제공한다. 본원에 기술된 바와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시예서의 용도를 발견할지라도, 바람직한 방법 및 물질이 본원에 기술된다. 따라서, 직후에 정의된 용어는 명세서 전체를 참조하여 더욱 완전히 기술된다. 또한, 본원에 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 명백히 달리 지시되지 않는 한 복수 형태를 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 핵산은 좌로부터 우로 5'로부터 3' 방향으로 기술되고; 아미노산 서열은 좌로부터 우로 아미노로부터 카복시 방향으로 기술된다. 본 발명은 기술된 구체적인 방법, 프로토콜 및 시약으로 제한되지 않는대, 이들이 당업자에 의해 사용되는 문맥에 따라 변할 수 있기 때문이다.
본 발명의 양상은 하기 비제한적인 실시예에 의해 증명된다.
실시예
VAMP2 분자를 유전자 조작함으로써, 본 발명자들은 신경독소-절단된 VAMP2의 분해가 예방될 수 있음을 나타냈다. 이러한 접근법의 가능성을 증명하기 위하여, 본 발명자들은 바이러스 형질도입을 사용하여 녹색 형광 단백질 GFP-VAMP2 키메라 단백질을 SiMa 신경모세포종 세포에 도입하였다(도 1A 및 B).
본 발명자들은 GFP-VAMP2가 예측한대로 소낭에 국한됨을 관찰하였다(도 1C, 상부). 이어서, 본 발명자들은 mCherry-표지된 파상풍 경쇄(VAMP2-절단 도메인)를 SiMa 세포에 형질감염시켰다(도 1C, 하부 우측). 형질감염 후 2일에, 본 발명자들은 파상풍-발현 세포에서 시토솔로의 GFP-VAMP2 절단된 생성물의 재분배를 검출하였다(도 1C, 하부 좌측). 중요하게는, 면역블로팅은 시험관 내에서 파상풍 작용을 정량화시키는 가능성을 열어주는 안정한 GFP-VAMP2 절단된 생성물을 나타냈다(도 1D). 이러한 결과는 TNx 작용의 모든 단계(결합, 전위 및 VAMP2 절단)의 믿을만한 재생을 갖는 세포주를 엔지니어링하는 것이 가능함을 시사한다. 엔지니어링된 세포주의 하나의 추가 이점은 가축의 면역화(6) 또는 B, D, F 및 G형 보툴리누스균 신경독소를 기반으로 하는 보툴리누스균 약의 생산에 사용되는 보툴리누스균 톡소이드를 시험하기 위한 잠재적인 유용성이다. 특히, 이전에, 절단된 GFP-VAMP2 또는 VAMP3 생성물의 출현이 파상풍 경쇄로 형질감염된 L6-GLUT4myc 근원세포에서 관찰되었다(12).
본 발명자들이 GFP-VAMP2를 불멸화된 마우스 뉴런에 형질감염시켰을 때, 전체 보툴리누스균 D형 신경독소에 의한 처리 시 GFP-VAMP2 생성물의 방출이 관찰되었다(도 2).
웨스턴 블롯은 고-처리량 스크리닝 또는 품질 관리(Quality Control: QC) 검증에 이용가능하지 않다. 방출된 GFP-VAMP2는, 알러간(Allergan)에 의해 특허된 방법인 보톡스에 의한 절단된 SNAP25의 검출에 기술된 바와 같이, ELISA 샌드위치 면역검정에 의해 정량화될 수 있다(11). 실제로, 항원 상에서 상이한 부위에 결합하는 2개의 항체를 기반으로 하는 샌드위치 ELISA 검정은 강건하고 민감하고 검증될 수 있다. 샌드위치 ELISA의 경우, 추가적인 리포터 결합 부위를 필요로 하는 강화된 화학발광 검출 플랫폼이 사용될 수 있다(11).
그러나, 본 발명자들은, 최종 항체 검출 단계를 제거함으로써, GFP 분자를 리포터 효소로 대체할 때, VAMP 절단의 검출을 상당히 촉진할 수 있는 것으로 가정하였다. 본 발명자들은 VAMP2의 파상풍- 및 보툴리누스균-생성된 단편을 인식하고 GFP, 루시퍼라제 또는 퍼옥시다제 효소를 갖는 VAMP2-리포터의 특이적인 포획을 가능하게 하여 정확한 파상풍 대 보툴리누스균 검출을 가능하게 하는 항체를 디자인하였다. 일반적으로, 신경독소의 적용은 VAMP2의 절단, 및 세포 시토솔로의 리포터 VAMP2 생성물의 방출을 야기한다. 이것은 전체 또는 절단된 VAMP2 항체를 사용하는 웨스턴 면역블로팅에 의해 확인될 수 있다. 고유의 변이성을 갖는 웨스턴 블롯이 검증하기 어려우므로, 세포-기반 검정에 대한 용이한 효소적 판독이 QC 환경을 위해 개발되어야 한다. 필수적인 VAMP2-리포터의 하나의 이점은 절단된 생성물의 검출을 위한 비용-효과적인 고-처리량 검정의 확립의 가능성이다.
파상풍 및 보툴리누스균 B형 신경독소에 의해 절단된 VAMP 분자의 포획을 위하여, 본 발명자들은 VAMP 포획 검정의 개발에 유용할 수 있는 VAMP2의 파상풍-절단된 단부(QAGASQ76)를 특이적으로 인식하는 맞춤형 VAMP2 항체를 사용할 수 있다. 효소에 융합된 절단된 VAMP2의 포획은 단일 단계의 절단된 생성물의 양의 정량화를 가능하게 하여 신경독소의 검출을 상당히 단순화시킬 수 있지만, 이것은 세포 환경에서 증명되지 않았다. 루시퍼라제는 루시페린의 산화를 통해 빛의 방출을 촉진하는 생물발광 효소이다. 한편, 퍼옥시다제는 발색체 기질로부터 형광 및 또한 발광까지의 다양한 검출 옵션을 제공한다. 루시퍼라제 및 퍼옥시다제는 둘 다 생체분자 이미징 및 생화학적 검정 시스템에서 매우 유명해졌고, 최적화된 형태의 개발을 촉진하였다. 본 발명자들은 VAMP2와 나노루크(최적화된 루시퍼라제, 프로메가) 및 APEX2(최적화된 퍼옥시다제)의 융합을 준비하고, 플라스미드를 레트로바이러스 벡터에 패키징하였다. 본 발명자들 SiMa 신경모세포종 세포에서 이러한 신규한 VAMP2-리포터의 안정한 발현을 관찰하였다(도 3). 흥미롭게도, 본 발명자들은 APEX2-VAMP2 융합 분자가 파상풍 또는 보툴리누스균 신경독소에 의해 절단될 수 없는 반면에, Nluc-VAMP2가 예측된 절단을 나타냈을을 발견하였다(도 4).
본 발명자들은 전체 및 절단된 VAMP2 항체를 사용하는 면역블로팅에 의해 BoNT/B 및 /D에 대한 나노루크-VAMP2를 갖는 SiMa 신경모세포종 세포의 민감성을 정량화시켰다. 도 5는 보툴리누스균 신경독소의 검출이 유형에 따라 상이함을 나타낸다. 구체적으로, 본 발명자들은 BoNT/B에 의한 VAMP의 절단을 300 pM로 검출할 수 있는 반면에, BoNT/D에 대한 SiMa 세포의 민감성은 nM 범위였다.
이어서, 본 발명자들은 BoNT/B-절단된 단부를 인식하는 VAMP2 항체로 코팅된 96-웰 플레이트를 준비하였다(QAGASQ76). 본 발명자들은 트리톤(Triton) X-100-처리된 SiMa 세포 추출물을 나노루크-VAMP2의 포획을 위해 상기 플레이트에 적용하였다. 나노글로(NanoGlo) 시약(프로메가)을 사용하여 포획된 리포터 효소를 정량화시켰다. 도 6은 나노루크-기반 검출 방법의 정량화와 도 5로부터 유도된 웨스턴 면역블로팅의 직접적인 비교를 도시한다.
또한, 본 발명자들은, 클로스트리듐 신경독소에 대한 SiMa 신경모세포종 세포의 불량한 민감성에도 불구하고, 파상풍 독소에 의한 나노루크-VAMP2의 절단을 검출할 수 있었다(도 7).
이러한 작업의 본체는 (i) 세포-유래 보툴리누스균- 및 파상풍-절단된 VAMP 분자를 포획하는 것이 가능하고, (ii) 효소와의 융합이 VAMP 분자를 안정화시킬 뿐만 아니라 VAMP-표적화 보툴리누스균 및 파상풍 신경독소의 고-처리량 스크리닝에 대한 고도로 민감한 판독을 가능하게 함을 나타낸다.
본 발명에 이르러, 신경독소 활성의 검출을 위하여 나노루크-VAMP2 구조체를 클로스트리디아-민감성 세포 클론에 형질도입하는 것이 가능하다. 나노루크-VAMP2 구조체는 전세계에서 파상풍 생성물을 시험하는 토대를 마련하는 잠재력을 갖는다. 파상풍 백신은 필수적인 전세계 약의 WHO 목록에 존재하고, 이에 따라 본 발명자들의 세포-기반 검정에 대한 잠재적인 시장 크기는 상당할 수 있다. 2012년에, WHO는 2020년까지 파상풍에 대한 전세계적인 면역화 적용을 가능하게 하는 것을 목적으로 하는 전세계 백신 활동 계획에 착수하였다. 주요 백신 생산자, 예컨대 글락소스미스클라인(GlaxoSmithKline), 사노피 파스퇴르(Sanofi Pasteur) 및 매스 바이오로직스(Mass Biologics)는 개발도상국에 더 싸고 더 큰 재고를 제공하려는 재원을 마련하고 있다. 따라서, 성가진 동물 모델을 세포-기반 검정으로 대체하는 것은 UK 정부 안건에서 중요하다. 파상풍 톡소이드 및 보툴리누스균 백신은 본 발명자들의 세포-기반 검정을 위한 다른 잠재적인 시장을 나타내는 가축 농장에 사용된다. 본 발명자들의 VAMP2-나노루크는 또한 보툴리누스균-기반 치료제의 약학적 생산에 이용될 수 있다.
본 발명의 이용의 추가 예로서, 도 14는 나노루크-VAMP2 발현 세포가 BoNT/B의 신규한 합성 버전의 효능을 특수화시키는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.
재료 및 방법
바이러스 형질도입
NotI 및 EcorI 제한 부위 내로 클로닝된 VAMP2 융합 서열을 갖는 바이러스 pQCXIP 플라스미드를 상업적으로 입수하였다[클론텍(Clontech)]. HEK-293 세포를 10% FBS를 갖는 DMEM[라이프 테크놀로지스(Life Technologies)]에서 배양하였다. 바이러스를 패키징하기 위해, HEK-293 세포를 10 cm 접시에 시딩하고, 70 내지 90% 합류까지 성장시켰다. 합류에 도달하면, 세포를 PBS로 세척하고, 매질을 6 mL SiMa 세포 성장 배지(RPMI + 10% FBS)로 대체하였다. 이어서, 세포를 37℃에서 2시간 동안 항온처리한 후, 바이러스 플라스미드로 형질감염시켰다. 5.25 μg VAMP2 융합 pQCXIP 플라스미드, 2.6 μg VSV-G 플라스미드(바이러스막) 및 2.6 μg 레트로바이러스 Gag-Pol 플라스미드(기 특이적인 항원 및 폴리머라제)를 400 μL 옵티멘(Optimem)(라이프 테크놀로지스)에 희석하고, 와동시켰다. 폴리에틸렌이민[폴리사이언시스(Polysciences)]을 400 μL 옵티멘 중에서 0.13 mg/mL까지 희석하고, DNA와 조합하고, 이어서 실온에서 20 분 동안 항온처리하였다. 믹스를 세포에 적가한 후, 37℃에서 밤새 방치하였다. 추가로 9 mL의 SiMa 성장 매질을 세포에 첨가한 후, 32℃, 5% CO2에서 24 시간 동안 항온처리하였다. HEK-293 세포로부터의 상청액을 수집하고, 6 μg/mL 폴리브렌[시그마(Sigma)]과 혼합한 후, 0.45 μm 필터 시린지를 통과시켰다. 3 mL의 여과된 매질을 6-웰 플레이트에서 50% 합류까지 성장된 SiMa 세포에 첨가한 후, 실온에서 20 분 동안 항온처리하였다. 플레이트를 실온에서 90 분 동안 2,500 rpm으로 원심분리시키고, 세포를 37℃에서 24 시간 동안 항온처리하였다. 매질을 신선한 SiMa 성장 매질로 대체하고, 세포를 추가로 24 시간 동안 또는 합류에 도달할 때까지 성장시켰다. 세포를 25 cm2 플라스크 내로 팽창시키고, 1 μg/mL 퓨로마이신(시그마)에서 배양하여 양성적으로 형질도입된 세포를 선택하였다.
나노루크 검정
SiMa 세포(DSMZ) 및 HEK-293 세포(ATCC)를 37℃, 5% CO2에서 성장시켰다. SiMa 세포를 10% FBS(라이프 테크놀로지스)가 보충된 RPMI(라이프 테크놀로지스)에서 배양하였다. VAMP2 절단의 검출을 위하여, SiMa NLuc-VAMP2 세포를 48-웰 플레이트에 시딩하고, 종전에 기술된 바와 같이 분화시켰다(문헌[Rust et al. 2016]). 이어서, 세포를 지시된 농도의 독소로 처리하고, 72 시간 동안 항온처리하였다. 독소 항온처리에 이어서, 매질을 제거하고, 웰을 PBS로 1회 세척하였다. 이어서, 세포에 40 μL의 트리톤 X100-기반 세포 추출물 용액[0.5% 트리톤 X-100 및 1x 시그마패스트(SigmaFast) 프로테아제 억제제를 갖는 PBS]을 침투시켰다. 세포를 문질러 깨끗이 하고, 얼음 상의 튜브에 옮기고, 매 3 내지 4 분마다 와동시키면서, 20 분 동안 항온처리하였다. 세포 추출물을 4℃에서 15 분 동안 14,000 rpm으로 원심분리시키고, 상청액을 신선한 튜브로 옮기고, -20℃에서 검정이 수행될 때까지 저장하였다. 단백질 A[써모-피셔(Thermo-Fisher)]로 사전-코팅된 96-웰 플레이트를 약 3 μg/mL 항-절단된 VAMP2 항체와 함께 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 0.05% 트윈(Tween)을 함유하는 PBS(PBS-T)로 웰을 3회 세척하고, 1% BSA로 1 시간 동안 차단하였다. 웰을 다시 PBS-T로 3회 세척한 후, 세포 추출물(35 μL PBS-T와 함께 15 μL 세포 추출물)을 첨가하고, 20℃에서 90 분 동안 항온처리하였다. PBS-T로 추가로 3회 세척한 후, 나노-글로 기질(프로메가)(50 μL PBS-T 중 2 μL)을 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 어둠 속에서 5 분 동안 항온처리하였다. 플루오로스칸 어센트(Fluoroskan Ascent) 플레이트 판독기[랩시스템스(Labsystems)]를 사용하여 발광을 측정하였다.
HA-APEX2-VAMP2 및 HA-나노루크-VAMP2를 합성하고, NotI 및 EcorI를 사용하여 레트로바이러스 발현 벡터 pQCXIP 내로 클로닝하였다.
참조문헌
Figure 112019093417873-pct00002
Figure 112019093417873-pct00003
SEQUENCE LISTING <110> The University of Sheffield <120> Stable VAMP reporter assay <130> P236129WO <140> PCT/GB2018/050397 <141> 2018-02-14 <150> GB 1702500.8 <151> 2017-02-16 <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ser Ala Pro Ala Gln Pro Pro Ala Glu Gly Thr Glu Gly Thr Ala 1 5 10 15 Pro Gly Gly Gly Pro Pro Gly Pro Pro Pro Asn Met Thr Ser Asn Arg 20 25 30 Arg Leu Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Glu Glu Val Val Asp Ile Ile 35 40 45 Arg Val Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu 50 55 60 Leu Asp Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu 65 70 75 80 Ser Ser Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Cys Lys 85 90 95 Met Met Ile Met Leu Gly Ala Ile Cys Ala Ile Ile Val Val Val Ile 100 105 110 Val Ile Tyr Phe Phe Thr 115 <210> 2 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ser Ala Thr Ala Ala Thr Ala Pro Pro Ala Ala Pro Ala Gly Glu 1 5 10 15 Gly Gly Pro Pro Ala Pro Pro Pro Asn Leu Thr Ser Asn Arg Arg Leu 20 25 30 Gln Gln Thr Gln Ala Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val 35 40 45 Asn Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp 50 55 60 Asp Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser 65 70 75 80 Ala Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Leu Lys Met Met 85 90 95 Ile Ile Leu Gly Val Ile Cys Ala Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val 100 105 110 Tyr Phe Ser Thr 115 <210> 3 <211> 100 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ser Thr Gly Pro Thr Ala Ala Thr Gly Ser Asn Arg Arg Leu Gln 1 5 10 15 Gln Thr Gln Asn Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val Asn 20 25 30 Val Asp Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp 35 40 45 Arg Ala Asp Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser Ala 50 55 60 Ala Lys Leu Lys Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Cys Lys Met Trp Ala 65 70 75 80 Ile Gly Ile Thr Val Leu Val Ile Phe Ile Ile Ile Ile Ile Val Trp 85 90 95 Val Val Ser Ser 100 <210> 4 <211> 171 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NanoLuc Ref: ACS Chem Biol. 2012 Nov 16; 7(11): 1848-1857 <400> 4 Met Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala 1 5 10 15 Gly Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu 20 25 30 Phe Gln Asn Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu 35 40 45 Ser Gly Glu Asn Gly Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr 50 55 60 Glu Gly Leu Ser Gly Asp Gln Met Gly Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys 65 70 75 80 Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr 85 90 95 Gly Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe 100 105 110 Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr 115 120 125 Val Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu 130 135 140 Ile Asn Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val 145 150 155 160 Thr Gly Trp Arg Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala 165 170 <210> 5 <211> 1196 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-APEX2-VAMP2 sequence <400> 5 gcggccgcat gtacccatac gatgttccag attacgctgg aaagtcttac ccaactgtga 60 gtgctgatta ccaggacgcc gttgagaagg cgaagaagaa gctcagaggc ttcatcgctg 120 agaagagatg cgctcctcta atgctccgtt tggcattcca ctctgctgga acctttgaca 180 agggcacgaa gaccggtgga cccttcggaa ccatcaagca ccctgccgaa ctggctcaca 240 gcgctaacaa cggtcttgac atcgctgtta ggcttttgga gccactcaag gcggagttcc 300 ctattttgag ctacgccgat ttctaccagt tggctggcgt tgttgccgtt gaggtcacgg 360 gtggacctaa ggttccattc caccctggaa gagaggacaa gcctgagcca ccaccagagg 420 gtcgcttgcc cgatcccact aagggttctg accatttgag agatgtgttt ggcaaagcta 480 tggggcttac tgaccaagat atcgttgctc tatctggggg tcacactatt ggagctgcac 540 acaaggagcg ttctggattt gagggtccct ggacctctaa tcctcttatt ttcgacaact 600 catacttcac ggagttgttg agtggtgaga aggaaggtct ccttcagcta ccttctgaca 660 aggctctttt gtctgaccct gtattccgcc ctctcgttga caaatatgca gcggacgaag 720 atgccttctt tgctgattac gctgaggctc accaaaagct ttccgagctt gggtttgctg 780 atgccctgca gctgcctccc ctggagcgcc tgaccctgga cggacccgga cccggaccca 840 tgtctgctac cgctgccacg gccccccctg ctgccccggc tggggagggt ggtccccctg 900 caccccctcc aaacctcacc agtaacagga gactgcagca gacccaggcc caggtggatg 960 aggtggtgga catcatgagg gtgaacgtgg acaaggtcct ggagcgagac cagaagctgt 1020 cggagctgga cgaccgtgca gatgcactcc aggcgggggc ctcccagttt gaaacaagcg 1080 cagccaagct caagcgcaaa tactggtgga aaaacctcaa gatgatgatc atcttgggag 1140 tgatttgcgc catcatcctc atcatcatca tagtttactt cagcacttaa gaattc 1196 <210> 6 <211> 923 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-NanoLuc-VAMP2 sequence <400> 6 gcggccgcat gtacccatac gatgttccag attacgctgt cttcacactc gaagatttcg 60 ttggggactg gcgacagaca gccggctaca acctggacca agtccttgaa cagggaggtg 120 tgtccagttt gtttcagaat ctcggggtgt ccgtaactcc gatccaaagg attgtcctga 180 gcggtgaaaa tgggctgaag atcgacatcc atgtcatcat cccgtatgaa ggtctgagcg 240 gcgaccaaat gggccagatc gaaaaaattt ttaaggtggt gtaccctgtg gatgatcatc 300 actttaaggt gatcctgcac tatggcacac tggtaatcga cggggttacg ccgaacatga 360 tcgactattt cggacggccg tatgaaggca tcgccgtgtt cgacggcaaa aagatcactg 420 taacagggac cctgtggaac ggcaacaaaa ttatcgacga gcgcctgatc aaccccgacg 480 gctccctgct gttccgagta accatcaacg gagtgaccgg ctggcggctg tgcgaacgca 540 ttctggcggg acccggaccc ggacccatgt ctgctaccgc tgccacggcc ccccctgctg 600 ccccggctgg ggagggtggt ccccctgcac cccctccaaa cctcaccagt aacaggagac 660 tgcagcagac ccaggcccag gtggatgagg tggtggacat catgagggtg aacgtggaca 720 aggtcctgga gcgagaccag aagctgtcgg agctggacga ccgtgcagat gcactccagg 780 cgggggcctc ccagtttgaa acaagcgcag ccaagctcaa gcgcaaatac tggtggaaaa 840 acctcaagat gatgatcatc ttgggagtga tttgcgccat catcctcatc atcatcatag 900 tttacttcag cacttaagaa ttc 923 <210> 7 <211> 79 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Gln Val Glu Glu Val Val Asp Ile Ile Arg Val Asn Val Asp Lys Val 1 5 10 15 Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg Ala Asp Ala 20 25 30 Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ser Ser Ala Ala Lys Leu Lys 35 40 45 Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Cys Lys Met Met Ile Met Leu Gly Ala 50 55 60 Ile Cys Ala Ile Ile Val Val Val Ile Val Ile Tyr Phe Phe Thr 65 70 75 <210> 8 <211> 79 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val Asn Val Asp Lys Val 1 5 10 15 Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg Ala Asp Ala 20 25 30 Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser Ala Ala Lys Leu Lys 35 40 45 Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Leu Lys Met Met Ile Ile Leu Gly Val 50 55 60 Ile Cys Ala Ile Ile Leu Ile Ile Ile Ile Val Tyr Phe Ser Thr 65 70 75 <210> 9 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gln Val Asp Glu Val Val Asp Ile Met Arg Val Asn Val Asp Lys Val 1 5 10 15 Leu Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu Asp Asp Arg Ala Asp Ala 20 25 30 Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser Ala Ala Lys Leu Lys 35 40 45 Arg Lys Tyr Trp Trp Lys Asn Cys Lys Met Trp Ala Ile Gly Ile Thr 50 55 60 Val Leu Val Ile Phe Ile Ile Ile Ile Ile Val Trp Val Val Ser Ser 65 70 75 80 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-BoNT/B cleaved VAMP2 sequence <400> 10 Ala Leu Gln Ala Gly Ala Ser Gln 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-BoNT/D cleaved VAMP2 sequence <400> 11 Lys Val Leu Glu Arg Asp Gln Lys 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNT/B TeNT VAMP 1 cleavage site sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> position 78 in longer sequence <400> 12 Gly Ala Ser Gln Phe Glu Ser Ser 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNT/B TeNT VAMP 2 cleavage site sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> position 76 in longer sequence <400> 13 Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNT/B TeNT VAMP3 cleavage site sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> position 59 in longer sequence <400> 14 Gly Ala Ser Gln Phe Glu Thr Ser 1 5 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNT/D VAMP1 cleavage site sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> position 61 in longer sequence <400> 15 Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu 1 5 <210> 16 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNT/D VAMP2 cleavage site sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> position 59 in longer sequence <400> 16 Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu 1 5 <210> 17 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNT/D VAMP3 cleavage site sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> position 42 in longer sequence <400> 17 Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu Leu 1 5 <210> 18 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNT/F VAMP1 cleavage site sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> position 60 in longer sequence <400> 18 Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu 1 5 <210> 19 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNT/F VAMP 2 cleavage site sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> position 58 in longer sequence <400> 19 Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu 1 5 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNT/F VAMP3 cleavage site sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> position 41 in longer sequence <400> 20 Glu Arg Asp Gln Lys Leu Ser Glu 1 5 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNT/G VAMP 1 cleavage site sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> position 83 in longer sequence <400> 21 Glu Ser Ser Ala Ala Lys Leu Lys 1 5 <210> 22 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNT/G VAMP2 cleavage site sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> position 81 in longer sequence <400> 22 Glu Thr Ser Ala Ala Lys Leu Lys 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNT/G VAMP3 cleavage site sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> position 64 in longer sequence <400> 23 Glu Thr Ser Ala Ala Lys Leu Lys 1 5 <210> 24 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> BoNT/B-cleaved end VAMP 2 cleavage site sequence <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> position 76 in longer sequence <400> 24 Gln Ala Gly Ala Ser Gln 1 5

Claims (25)

  1. 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 포함하되, C-말단에 탈안정화 모이어티를 포함하지 않는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서,
    VAMP2 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인이 서열번호 8 또는 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 이의 보존적 아미노산 서열 변이체를 포함하는, 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서,
    VAMP1 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인이 서열번호 7 또는 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 보존적 아미노산 서열 변이체를 포함하는, 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서,
    VAMP3 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인이 서열번호 9 또는 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이의 보존적 아미노산 서열 변이체를 포함하는, 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    루시퍼라제 활성을 갖는 폴리펩티드 도메인이 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 이의 보존적 아미노산 서열 변이체를 포함하는, 폴리펩티드.
  6. 제1항에 따른 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자.
  7. 제6항에 따른 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
  8. 제6항에 따른 핵산 분자 또는 제7항에 따른 발현 벡터를 포함하는 유전자 변형된 세포.
  9. 제8항에 있어서,
    SiMa 신경모세포종 세포, LAN5 신경모세포종 세포, NG108 신경모세포종 세포, 불멸화된 뉴런 및 1차 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택되는 유전자 변형된 세포.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. (a) 제8항에 따른 유전자 변형된 세포를, 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 발현을 가능하게 하는 조건 하에 배양하는 단계;
    (b) (a)의 세포를 시험 샘플의 존재 하에, 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 포함하는 폴리펩티드의 신경독소-유발된 절단을 가능하게 하는 조건 하에 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 폴리펩티드의 신경독소-유발된 절단의 수준을 측정하는 단계로서, 상기 폴리펩티드의 신경독소-유발된 절단의 검출이, 파상풍 신경독소 활성, 보툴리누스균 B형 신경독소 활성, 보툴리누스균 D형 신경독소 활성, 보툴리누스균 F형 신경독소 활성, 보툴리누스균 G형 신경독소 활성 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신경독소 활성을 나타내는, 단계
    를 포함하는, 시험 샘플에서 신경독소 활성을 검출하는 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    배양 단계 (a) 및 (b)가 동시에 수행되는, 방법.
  16. 제14항에 있어서,
    시험 샘플이 배양 매질에 제공되는, 방법.
  17. 제14항에 있어서,
    폴리펩티드의 신경독소-유발된 절단이 ELISA, 면역블롯(immunoblot) 또는 생세포 이미징(live cell imaging)에 의해 검출되는, 방법.
  18. 제14항에 있어서,
    시험 샘플이 약물 제품, 식품 샘플, 임상 샘플, 환경 샘플 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  19. 제14항에 있어서,
    시험 샘플이 파상풍 톡소이드, 보툴리누스균 톡소이드 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  20. 제14항에 있어서,
    시험 샘플이 파상풍 신경독소, 보툴리누스균 B형 신경독소, 보툴리누스균 D형 신경독소, 보툴리누스균 F형 신경독소, 보툴리누스균 G형 신경독소 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  21. (a) 루시퍼라제 활성을 갖는 N-말단 폴리펩티드 도메인, 및 VAMP1, VAMP2 또는 VAMP3 활성을 갖는 C-말단 폴리펩티드 도메인을 포함하되, C-말단에 탈안정화 모이어티를 포함하지 않는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자; 및
    (b) 신경독소 활성을 검출하기 위한 양성 대조군으로서, (a)의 핵산 분자에 의해 코딩된 폴리펩티드를 절단할 수 있는 양성 대조군
    을 포함하는, 신경독소 활성을 검출하기 위한 키트.
  22. 제21항에 있어서,
    핵산 분자가 발현 벡터의 일부인, 키트.
  23. 제21항에 있어서,
    핵산 분자가 유전자 변형된 세포 내에 존재하는, 키트.
  24. 제23항에 있어서,
    유전자 변형된 세포가 유전자 변형된 SiMa 신경모세포종 세포, LAN5 신경모세포종 세포, NG108 신경모세포종 세포, 불멸화된 뉴런 및 1차 뉴런으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 키트.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    루시퍼라제 활성의 검출을 위한 시약을 추가로 포함하는 키트.
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