KR102638210B1 - Biomarkers for the diagnosis of thyroid ophthalmopathy and uses thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 갑상선 안병증의 진단을 위한 단백질 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 갑상선 안병증 또는 저산소증에 의해 유도되는 갑상선 안병증의 중증도와 관련된 바이오마커, 갑상선 안병증 진단용 조성물, 키트, 이를 이용한 갑상선 안병증의 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.The present invention relates to a protein biomarker for the diagnosis of thyroid ophthalmopathy and its use, and more specifically, to a biomarker related to the severity of thyroid ophthalmopathy or hypoxia-induced thyroid ophthalmopathy, a composition, and a kit for diagnosing thyroid ophthalmopathy. This is about a method of providing information for the diagnosis of thyroid ophthalmopathy using this method.
Description
본 발명은 갑상선 안병증의 진단을 위한 단백질 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 갑상선 안병증의 발병 및 중증도와 관련된 바이오마커, 갑상선 안병증 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 갑상선 안병증의 진단을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.The present invention relates to protein biomarkers for the diagnosis of thyroid ophthalmopathy and their use, and more specifically, to biomarkers related to the onset and severity of thyroid ophthalmopathy, compositions and kits for diagnosing thyroid ophthalmopathy, and thyroid ophthalmopathy using the same. It concerns methods of providing information for diagnosis.
그레이브스병 (Graves' disease)은 잘 알려진 갑상선 자가면역질환이다. 갑상선여포의 내피세포에 존재하는 갑상선자극호르몬 수용체에 결합하는 자가항체가 병인이며, 갑상선의 기능을 활성화시켜 갑상선호르몬의 과다형성, 분비를 유발한다. 그레이브스병 환자의 약 50%에서 눈에 증상이 발생하며, 이를 그레이브스 안병증 (Graves' orbitopathy), 갑상선안병증 (Thyroid associated orbitopathy)이라고 일컫는다. 갑상선안병증의 가장 흔한 증상으로는 윗눈꺼풀뒤당김, 안와주변조직의 부종, 붉어짐과 안구돌출 등이 있다. 이렇게 안병증에 이환된 환자 중에서 약 3-5%에서는 심한 통증과 염증, 복시, 그리고 시력을 위협하는 압박성시신경병증이 유발되며 실명까지 가능하다.Graves' disease is a well-known thyroid autoimmune disease. The etiology is autoantibodies that bind to the thyroid-stimulating hormone receptors present in the endothelial cells of thyroid follicles, and activate the function of the thyroid gland, causing hyperproduction and secretion of thyroid hormones. Approximately 50% of Graves' disease patients develop eye symptoms, which are called Graves' orbitopathy or Thyroid associated orbitopathy. The most common symptoms of thyroid ophthalmopathy include upper eyelid retraction, periorbital tissue swelling, redness, and exophthalmos. Among patients suffering from this type of ophthalmopathy, approximately 3-5% develop severe pain, inflammation, double vision, and compressive optic neuropathy that threatens vision, and even blindness is possible.
갑상선안병증의 병리기전에 대해서는 명확히 밝혀지지는 않았다. 갑상선자극호르몬 수용체에 대한 자가항체가 갑상선안병증에서도 주요 병인 중 하나로 알려져 있지만 10%의 갑상선안병증 환자에서는 갑상선기능이 정상이어도 갑상선안병증이 진행된다는 보고가 있다. 현재까지 밝혀진 병리기전을 정리해보면 크게 염증, 히알루론산의 축적, 지방화로 나누어 볼 수 있다. 심한 활성기의 갑상선안병증 환자에서는 안와를 구성하는 뼈조직 내에 존재하는 결체/지방조직이 증가한다. 이러한 조직의 확장부에는 면역세포인 T-림프구, B-림프구 및 비만세포의 뚜렷한 침윤뿐만 아니라, 친수성의 글루코스아미노글리칸 (glucosaminoglycans), 특히 히알루론산(hyaluronan)의 축적이 특징적으로 나타난다. 또한 안와 내에는 지방세포로 분화할 수 있는 능력을 지닌 전구 세포들도 정상보다 높은 비율로 포함되어 있는데 이들은 지방분화를 촉진시킴으로써 지방부피가 증가하여 안구가 앞으로 밀려 돌출되면서 미관상 및 시각기능상 문제를 유발하게 된다.The pathogenesis of thyroid ophthalmopathy has not been clearly elucidated. Autoantibodies against the thyroid-stimulating hormone receptor are known to be one of the main causes of thyroid ophthalmopathy, but there are reports that thyroid ophthalmopathy progresses in 10% of patients with thyroid ophthalmopathy even if thyroid function is normal. Summarizing the pathological mechanisms revealed to date, they can be broadly divided into inflammation, accumulation of hyaluronic acid, and localization. In patients with severe active thyroid ophthalmopathy, the connective/fatty tissue present in the bone tissue that constitutes the orbit increases. These tissue extensions are characterized by marked infiltration of immune cells such as T-lymphocytes, B-lymphocytes, and mast cells, as well as accumulation of hydrophilic glucosaminoglycans, especially hyaluronan. In addition, within the orbit, progenitor cells with the ability to differentiate into adipocytes are also contained at a higher than normal rate. These promote adipogenic differentiation, which increases the fat volume and causes the eyeball to protrude forward, causing problems in aesthetics and visual function. I do it.
갑상선안병증은 안구가 돌출되기 때문에 갑상선안병증 질환을 가진 환자에게 미관상 좋지 않은 외형을 유발할 수 있다. 또한 만성적 질환으로 한번 외형상 변형이 발생하면 변형된 외관을 치료하기도 쉽지 않다. 따라서 갑상선안병증 질환자의 경우 외모로 인한 자신감 결여 등으로 인해 사회생활에 어려움을 겪기도 한다.Because thyroid ophthalmopathy causes the eyeball to protrude, it can cause an unsightly appearance in patients with thyroid ophthalmopathy. Additionally, once the appearance is deformed due to a chronic disease, it is not easy to treat the deformed appearance. Therefore, people with thyroid eye disease may experience difficulties in social life due to lack of confidence due to their appearance.
심한 활성기의 안병증에 대한 치료방법으로 고용량의 글루코코티코이드(Glucocorticoids)가 지난 수십 년 동안 사용되어 왔으며, 항염증과 면역억제 효과가 있어 여전히 갑상선안병증의 첫 번째 치료방법으로 적용되고 있다. 그러나, 갑상선안병증의 활성도가 높지 않은 환자에서, 스테로이드 치료의 적응증이 아닐 경우, 현재까지 질병의 진행을 막거나, 호전시킬 수 있는 약물은 아직까지 밝혀진 바 없으며, 또한 스테로이드 치료를 시행하게 될 경우 고용량의 주기적 사용이 필요하게 되어 이로 인한 다양한 전신 부작용이 흔히 발생하는 문제가 있다. 현재, 갑상선 안병증의 식별은 안구 변화의 유무를 통해 의심하여 진단하게 되는데아직까지 갑상선 안병증의 조기 진단이 어렵고 질환의 진행 및 예후를 예측할 수 있는 방법이 개발되지 않은 상태이다. 따라서, 임상적으로 갑상선 안병증을 조기에 진단하고 질환의 진행 여부를 예측할 수 있는 바이오 마커 개발의 필요성이 요구되는 상황이다.High doses of glucocorticoids have been used for the past several decades as a treatment method for severe active-phase ophthalmopathy, and are still used as the first treatment method for thyroid ophthalmopathy due to their anti-inflammatory and immunosuppressive effects. However, in patients whose thyroid ophthalmopathy is not highly active, when steroid treatment is not indicated, no drug has yet been discovered that can prevent or improve the progression of the disease, and if steroid treatment is administered, Because periodic use of high doses is required, various systemic side effects commonly occur. Currently, thyroid ophthalmopathy is diagnosed based on suspicion based on the presence or absence of ocular changes. However, early diagnosis of thyroid ophthalmopathy is still difficult and no method has been developed to predict the progression and prognosis of the disease. Therefore, there is a need to develop biomarkers that can clinically diagnose thyroid ophthalmopathy early and predict the progression of the disease.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 갑상선 안병증을 진단할 수 있는 단백질 바이오마커 를 선별 및 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.Against this background, the present inventors made diligent research efforts to overcome the problems of the prior art and completed the present invention by selecting and confirming protein biomarkers that can diagnose thyroid ophthalmopathy.
본 발명의 목적은 갑상선 안병증을 진단과 진행을 예측하기 위한 단백질 바이오마커, 이를 이용하여 갑상선 안병증을 진단하기 위한 조성물, 키트, 정보제공방법 및 갑상선 안병증의 중증도 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.The purpose of the present invention is to provide protein biomarkers for diagnosing and predicting the progression of thyroid ophthalmopathy, a composition, kit, and information provision method for diagnosing thyroid ophthalmopathy using the same, and an information provision method for diagnosing the severity of thyroid ophthalmopathy. It is provided.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.The technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the problems mentioned above, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the description below.
상술한 과제를 해결하기 위한 제1 양태로, 본 발명은 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A단백질 및 상기 각각의 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함하는, 갑상선 안병증을 진단하기 위한 바이오마커 조성물을 제공한다.In a first aspect for solving the above-described problem, the present invention provides at least one selected from the group consisting of hypoxia-inducible factor-1α protein, PAPP-A protein, and genes encoding each of the above proteins. It provides a biomarker composition for diagnosing thyroid ophthalmopathy, including:
상기 바이오마커 조성물을 이용한 갑상선 안병증의 진단은 저산소 자극에 의해 발생되는 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A 단백질 또는 상기 각각의 단백질을 코딩하는 유전자를 통해 갑상선 안병증의 중증도를 판단하는 것이며, 상기 저산소 자극은 안와구조물의 변화 즉, 조직의 확장 및 지방세포화를 통해 발생하는 것으로 생각되며 흡연에 의해 악화될 것으로 예상된다.Diagnosis of thyroid ophthalmopathy using the biomarker composition can be performed through hypoxia-inducible factor-1α protein, PAPP-A protein, or genes encoding each of the above proteins, which are generated by hypoxic stimulation. The severity is judged, and the hypoxic stimulation is thought to occur through changes in orbital structures, that is, tissue expansion and adipocytes, and is expected to worsen by smoking.
제1 양태와 관련하여, 본 발명은 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A단백질 또는 상기 각각의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 갑상선 안병증을 진단하기 위한 조성물 및 이를 포함하는 키트를 제공한다.In relation to the first aspect, the present invention relates to thyroid ophthalmopathy, comprising an agent for measuring the expression level of hypoxia-inducible factor-1α protein, PAPP-A protein, or the gene encoding each of the above proteins. A composition for diagnosing and a kit containing the same are provided.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A 단백질 또는 상기 각각의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물을 포함할 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the agent for measuring the expression level of the hypoxia-inducible factor-1α protein, PAPP-A protein, or the gene encoding each of the proteins is specific for the protein. It may include a primer or probe that binds to, an antibody, peptide, aptamer, or compound that specifically binds to the protein.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 키트는 실시간 PCR (RT-PCR) 키트, 마이크로어레이 키트 또는 SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 키트일 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the kit may be a real-time PCR (RT-PCR) kit, a microarray kit, or a SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) kit.
제1 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 갑상선 안병증의 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다:In relation to the first aspect, the present invention also provides an information providing method for diagnosis of thyroid ophthalmopathy comprising the following steps:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A단백질, 상기 각각의 단백질의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;(a) measuring the expression level of hypoxia-inducible factor-1α protein, PAPP-A protein, fragments of each protein, or gene encoding the protein in a biological sample isolated from an individual;
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된, 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A단백질, 상기 각각의 단백질의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계.(b) The expression level of hypoxia-inducible factor-1α protein, PAPP-A protein, fragments of each protein, or gene encoding the protein measured in step (a) was measured in a normal control sample. Step to compare with.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 점액, 타액, 눈물 또는 이들의 조합일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the biological sample in step (a) may be blood, plasma, serum, urine, mucus, saliva, tears, or a combination thereof.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 정보제공방법은 (c) 상기 (a) 단계에서 측정된, 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A단백질, 상기 각각의 단백질의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 증가하는 경우, 갑상선 안병증으로 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 또한 임상적으로 이미 갑상선 안병증이 진단되어 있는 경우 불량한 예후를 예상할 수 있어 적극적인 치료 대상으로 간주할 수 있다.According to another preferred embodiment of the present invention, the method of providing information is (c) the hypoxia-inducible factor-1α protein, PAPP-A protein, and each of the proteins measured in step (a). If the expression level of the fragment or the gene encoding the protein increases compared to the expression level in the normal control sample, the step of diagnosing thyroid ophthalmopathy may be further included. Additionally, if thyroid ophthalmopathy has already been clinically diagnosed, a poor prognosis can be expected and the patient can be considered a candidate for active treatment.
본 발명의 일 실시예에서 상기 (a) 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 면역 조직 화학 염색, 단백질 칩, 면역침강, 질량분 석, 또는 이들의 조합으로 수행하거나(및/또는) 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩, 또는 이들의 조합으로 수행할 수 있다.In one embodiment of the present invention, step (a) includes electrophoresis, immunoblotting, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunohistochemical staining, protein chip, immunoprecipitation, mass spectrometry, Or, performing a combination thereof (and/or) measuring the expression level of the gene may include RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, It can be performed using an RNase protection assay (RPA), Northern blotting, DNA chip, or a combination thereof.
제1 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 갑상선 안병증의 중증도를 평가하기 위한 정보 제공 방법을 제공한다:In relation to the first aspect, the present invention also provides an informational method for assessing the severity of thyroid ophthalmopathy:
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A단백질, 상기 각각의 단백질의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;(a) measuring the expression level of hypoxia-inducible factor-1α protein, PAPP-A protein, fragments of each protein, or gene encoding the protein in a biological sample isolated from an individual;
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된, 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계 및(b) comparing the expression level of hypoxia-inducible factor-1α protein measured in step (a) with a normal control sample, and
(c) 상기 측정된 발현 수준을 갑상선 안병증 중증도 점수로 환산하여 갑상성안병증의 중증도를 평가하는 단계.(c) Converting the measured expression level into a thyroid ophthalmopathy severity score to evaluate the severity of thyroid ophthalmopathy.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, (a) 단계의 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 점액, 타액, 눈물, 또는 이들의 조합일 수 있다.According to a preferred embodiment of the present invention, the biological sample in step (a) may be blood, plasma, serum, urine, mucus, saliva, tears, or a combination thereof.
본 발명에 따른 HIF-1α 단백질 또는 PAPP-A 단백질을 포함하는 바이오마커 조성물은 갑상선 안병증을 진단할 수 있을 뿐만 아니라, 갑상선 안병증의 중증도를 진단하는 것이 가능하고 질환의 진해을 예측할 수 있어, 이에 따라 환자 맞춤별 치료방법을 제공함으로써 감상선 안병증을 조기에 발견하고 진행을 차단하는 적극적인 치료를 수행함으로써 갑상선 안병증에 의한 다양한 증상의 발현을 예방할 수 있을 것으로 기대된다.The biomarker composition containing HIF-1α protein or PAPP-A protein according to the present invention can not only diagnose thyroid ophthalmopathy, but also diagnose the severity of thyroid ophthalmopathy and predict the progression of the disease. Accordingly, by providing treatment methods tailored to each patient, it is expected that it will be possible to prevent the development of various symptoms caused by thyroid ophthalmopathy by detecting thyroid ophthalmopathy early and providing active treatment to block its progression.
도 1, 2는 갑상선안병증 환자에서 추출 분리된 안와 섬유모세포와 비갑상선안병증 환자의 안와섬유모세표를 저산소 상태와 정상 산소상태에 노출시켰을 때 HIF-1α의 발현 양상을 확인한 이미지이다. 도 1을 참조하면, 비갑상선안병증 환자로부터 유래된 안와섬유모세포에서는 HIF-1α발현이 거의 나타나지 않으며 저산소 상태에서도 단백질 발현의 증가 양상이 관찰되지 않는데 비해 갑상선안병증 환자로부터 유래된 안와섬유모세포에서는 정상 산소상태와 저산소 상태에서 모두 HIF-1α발현을 확인할 수 있으며 특히, 저산소 상태에서 HIF-1α의 발현이 유의미하게 증가됨을 알 수 있다.
도 3은 정상 산소 및 저산소 상태에서 지방 형성 표현형(Adipogenic Phenotype) 변화를 관찰한 이미지이다. 해당 실험에서는 표현형으로 14일 동안 지방생성 배지에서 배양된 TAO OF는 지방생성 분화를 나타내었다. 도 3에 따르면, 저산소 조건에서 정상 산소 조건보다 더 높은 ORO 염색이 관찰되었다.
도 4는 갑상선 안질환(TAO) 환자(각각 112, 144 및 172 환자의 1차 세포)에서, 산소(O2) 함량에 따른 지방 생성 마커(HIF-1α, PPARγ 및 CEBP)의 발현 양상을 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인한 결과이다. 도 4는 정상 산소 상태에서 TOA 112(A), 144(C), 172(E), 저산소 상태에서 TA0 112(B), 144(D), 172(F)의 결과이다. 도 4에서 ß-ACTIN은 내부 대조군이며, 데이터 값은 ±SD, n = 4 이다.
도 5은 본 발명의 일 실시예에 따라 Orbital fibroblast의 단백질 용해물을 사용하여 58개 아디포카인의 상대적 발현 수준을 동시에 검출한 결과이며, orbital fibroblast를 인큐베이터(5% CO2가 있는 37℃) 및 인큐베이터 챔버(1% O2, 5% CO2, 94% N2 및 37°C에서 48시간 동안 인큐베이션한 후 관찰한 것이다. 도 6을 해당 값을 그래프로 나타낸 것이다.
도 7은 O2 함량에 따른 사이토카인의 변화를 확인한 것으로, 갑상선 안병증(TAO)에서 PAPP-A의 ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)결과이다.Figures 1 and 2 are images confirming the expression pattern of HIF-1α when orbital fibroblasts isolated from patients with thyroid ophthalmopathy and orbital fibroblasts from patients with non-thyroid ophthalmopathy were exposed to hypoxic and normoxic conditions. Referring to Figure 1, orbital fibroblasts derived from patients with non-thyroid ophthalmopathy show little HIF-1α expression and no increase in protein expression is observed even under hypoxia, whereas orbital fibroblasts derived from patients with thyroid ophthalmopathy show no increase in protein expression. HIF-1α expression can be confirmed in both normal and hypoxic conditions, and in particular, HIF-1α expression is significantly increased in hypoxic conditions.
Figure 3 is an image observing changes in adipogenic phenotype under normal oxygen and hypoxic conditions. In this experiment, TAO OF cultured in adipogenic medium for 14 days phenotypically showed adipogenic differentiation. According to Figure 3, higher ORO staining was observed in hypoxic conditions than in normoxic conditions.
Figure 4 shows the expression patterns of adipogenic markers (HIF-1α, PPARγ, and CEBP) according to oxygen (O 2 ) content in thyroid eye disease (TAO) patients (primary cells from 112, 144, and 172 patients, respectively) by Western analysis. This is a result confirmed through blot analysis. Figure 4 shows the results of TOA 112 (A), 144 (C), and 172 (E) in normoxic conditions and TA0 112 (B), 144 (D), and 172 (F) in hypoxic conditions. In Figure 4, ß-ACTIN is an internal control, and data values are ±SD, n = 4.
Figure 5 shows the results of simultaneously detecting the relative expression levels of 58 adipokines using protein lysates of orbital fibroblasts according to an embodiment of the present invention, and orbital fibroblasts were incubated in an incubator (37°C with 5% CO 2 ). and an incubator chamber (1% O 2 , 5% CO 2 , 94% N 2 and 37°C) for 48 hours. FIG. 6 shows the corresponding values as a graph.
Figure 7 shows changes in cytokines according to O 2 content and shows the ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) results of PAPP-A in thyroid ophthalmopathy (TAO).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 게시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 게시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail. The advantages and features of the present invention and the embodiments for achieving them will become clear with reference to the embodiments described below. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below and may be implemented in various different forms. The present embodiments are merely intended to ensure that the disclosure of the present invention is complete and to provide common knowledge in the technical field to which the present invention pertains. It is provided to fully inform those who have the scope of the invention, and the present invention is only defined by the scope of the claims. Like reference numerals refer to like elements throughout the specification.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.Unless otherwise defined, all terms (including technical and scientific terms) used in this specification may be used with meanings that can be commonly understood by those skilled in the art to which the present invention pertains. Additionally, terms defined in commonly used dictionaries are not interpreted ideally or excessively unless clearly specifically defined. The terminology used herein is for describing embodiments and is not intended to limit the invention. As used herein, singular forms also include plural forms, unless specifically stated otherwise in the context.
상술한 바와 같이, 갑상선 안병증의 식별은 안구 변화의 유무의 측정에 따라 나뉘어지고 있으며, 저산소 자극에 의한 갑상선 안병증을 조기 진단하거나 갑상선 안병증의 중증도를 진단할 수 있는 단백질 바이오마커를 발굴하고 치료 경과 판단에 활용하고자 연구는 전무한 실정이다. As described above, the identification of thyroid ophthalmopathy is divided according to the measurement of the presence or absence of ocular changes, and protein biomarkers that can be used to diagnose thyroid ophthalmopathy caused by hypoxic stimulation early or to diagnose the severity of thyroid ophthalmopathy are being discovered. There is no research to use it to determine treatment progress.
이에, 본 발명자들은 갑상선 안병증, 특히 저산소 자극에 의한 갑상선 안병증을 진단할 수 있는 단백질 바이오마커를 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 본 발명에 따른 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 바이오마커 조성물은 갑상선 안병증의 조기 진단 또는 중증도를 진단하는 것이 가능하여, 갑상선 안병증의 원인을 보다 세밀하고 정확하게 진단할 수 있고, 이에 따라 환자 맞춤별 치료방법을 제공할 수 있다.Accordingly, the present inventors sought a solution to the above-mentioned problem by providing a protein biomarker that can diagnose thyroid ophthalmopathy, especially thyroid ophthalmopathy caused by hypoxic stimulation. The biomarker composition containing a protein or a fragment thereof according to the present invention is capable of early diagnosis or diagnosing the severity of thyroid ophthalmopathy, allowing more detailed and accurate diagnosis of the cause of thyroid ophthalmopathy, and thus providing customized patient care. Treatment methods can be provided.
본 발명의 용어 "바이오마커"는 생물학적 현상의 존재와 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미하며, 본 발명의 바이오마커는 갑상선 관련 질환(갑상선 안병증)이 나타나는지 확인할 수 있는 단백질 또는 갑상선 안병증 치료 후 예후가 양호하거나 불량한 환자를 예측해내는 기준이 되는 유전자를 지칭한다. 이 용어는 바이오 마커 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 바이오마커 단백질을 코딩하는 유전자 서열에 상보적이거나 이에 플랭킹된 핵산 서열, 예컨대 마커 단백질을 코딩하는 유전자를 증폭시킬 수 있는 프로브 또는 프라이머 쌍으로 사용된 핵산을 포함한다.The term "biomarker" of the present invention refers to a molecule that is quantitatively or qualitatively associated with the presence of a biological phenomenon, and the biomarker of the present invention is a protein that can determine whether a thyroid-related disease (thyroid ophthalmopathy) appears or treat thyroid ophthalmopathy. It refers to a gene that serves as a standard for predicting patients with a good or poor prognosis. This term refers to a biomarker protein, the gene encoding it, a nucleic acid sequence complementary to or flanking the gene sequence encoding the biomarker protein, such as a probe or primer pair capable of amplifying the gene encoding the marker protein. Contains nucleic acids.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.
본 발명의 제1 양태는 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 갑상선 안병증을 진단하기 위한 바이오마커 조성물에 관한 것이다.The first aspect of the present invention relates to a biomarker composition for diagnosing thyroid ophthalmopathy, including hypoxia-inducible factor-1α protein or a gene encoding it.
본 발명에서는 갑상선 안병증의 발명 여부 또는 중등도를 모니터링할 수 있는 단백질 바이오마커를 식별하기 위하여, 갑상선 관련 안병증(TAO) 환자의 수술을 통해 안와 섬유아세포 획득하고, 정상인의 안와 섬유아세포에서의 중요 단백질 변화를 관찰하였다. 갑상선 안병증 환자의 안와 섬유아세포 샘플을 수집하여 분석한 결과, 면역체계 활성화로 인해 자극을 받은 안와 섬유모세포의 변화(expanded orbital tissue)는 조직의 저산소 상태를 유발하여 HIF-1α 과발현을 유발하고, 갑상선 안병증을 더욱 악화시키는 악순환이 유도되며 질환의 진행 즉 지방세포분화 및 증식 유발하게 됨을 확인하였다.In the present invention, in order to identify protein biomarkers that can monitor the presence or severity of thyroid ophthalmopathy, orbital fibroblasts were obtained through surgery of patients with thyroid-related ophthalmopathy (TAO), and the significance of the presence of thyroid ophthalmopathy in orbital fibroblasts of normal subjects was obtained. Protein changes were observed. As a result of collecting and analyzing orbital fibroblast samples from patients with thyroid ophthalmopathy, changes in orbital fibroblasts stimulated by immune system activation (expanded orbital tissue) cause tissue hypoxia, leading to HIF-1α overexpression. It was confirmed that a vicious cycle that further worsens thyroid ophthalmopathy is induced and the disease progresses, that is, causing adipocyte differentiation and proliferation.
본 발명에서, 저산소증 유도인자 (HIF-1(hypoxia-inducible factor-1))는 저산소 관련 반응을 매개하는 이종성 이중의 전사인자로, 산소 농도에 따라 조절되는 α 소단위(HIF-1α 또는 HIF-2α) 및 항상 발현되는 β 소단위(HIF-1β)로 구성되어 있으며, HIF-1α는 저산소 환경에서는 안정화된다. HIF-1α는 내피세포의 마스터 조절인자인 VEGF를 직접적으로 조절함으로써 병리생리학적으로 혈관을 생성시킨다.In the present invention, hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) is a heterologous dual transcription factor that mediates hypoxia-related responses, and is an α subunit (HIF-1α or HIF-2α) regulated depending on oxygen concentration. ) and a constitutively expressed β subunit (HIF-1β), and HIF-1α is stabilized in a hypoxic environment. HIF-1α pathophysiologically creates blood vessels by directly regulating VEGF, a master regulator of endothelial cells.
본 명세서에서 저산소증 유도인자-1α는 HIF-1α, hypoxia-inducible factor-1α로 표시될 수 있으며, 인간에서 Gene ID: 3091의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 암호화된 단백질일 수 있다. 본원 발명의 바이오마커 조성물은 HIF-1α 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.In this specification, hypoxia-inducible factor-1α may be referred to as HIF-1α or hypoxia-inducible factor-1α, and may be an encoded protein containing the nucleotide sequence of Gene ID: 3091 in humans. The biomarker composition of the present invention may include HIF-1α protein or a gene encoding it.
본 명세서에서, PAPP-A는, 임신 연관 혈장 단백-A(Pregnancy-associated plasma protein A)이라 지칭되며, 임신 초기 영양막의 바깥층에서 생산되다가 이후 성장된 태반에서 생성되는 단백질로 알려져 있다. 본 발명의 PAPP-1A는, 인간에서 Gene ID: 5069의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 암호화된 단백질일 수 있다. 본원 발명의 바이오마커 조성물은 PAPP-A 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 특히, 본 발명에 따르면 PAPP-A단백질은 안와의 저산소 미세환경에서 발현이 증가하여, 갑상선 안병증의 진단에 이용될 수 있다.In this specification, PAPP-A is referred to as pregnancy-associated plasma protein A, and is known to be a protein produced in the outer layer of the trophoblast in early pregnancy and then in the grown placenta. PAPP-1A of the present invention may be an encoded protein containing the nucleotide sequence of Gene ID: 5069 in humans. The biomarker composition of the present invention may include PAPP-A protein or a gene encoding it. In particular, according to the present invention, the expression of PAPP-A protein increases in the hypoxic microenvironment of the orbit, so it can be used for the diagnosis of thyroid ophthalmopathy.
본 발명의 일 양태에 따르면, HIF-1α는 안와의 저산소 미세환경 노출 예측용 바이오마커인 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에서는 갑상선안병증 환자 유래 안와섬유모세포에서 HIF-1α 단백질의 발현 및 저산소증에 대한 단백질발현의 뚜렷한 증가(변화)와 지방세포 분화를 통해 저산소 미세환경 노출은 갑상선 안병증의 발병 및 악화와 연관되어 있음을 확인하였다. 본 발명에서 설정한저산소 미세환경은 임상적으로 잘 알려진 갑상선안병증의 위험 요인인 흡연에 발생 가능성이 높고 질환의 발생 중 쉽게 발생하는 제한된 구조(뼈로 둘러싸인 안와 구조) 내에서의 과도한 조직의 팽창과 지방세포화/증식에 의해 쉽게 발생할 수 있다는 점에서 질환의 발생 및 악화에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다. 따라서 본 발명에서는 HIF-1α 단백질 바이오마커 및 지방세포분화와 관련된 단백질과 아디포카인의 발현량을 측정하여, 저산소 미세환경 노출에 따른 갑상선 안병증의 발병 여부 또는 갑상선 안병증의 중증도(심각도)와 예휴를 예측하는데 도움이 되는 결과를 보일 수 있었다.According to one aspect of the present invention, HIF-1α may be characterized as a biomarker for predicting exposure to the hypoxic microenvironment of the orbit. In the present invention, exposure to a hypoxic microenvironment is associated with the onset and worsening of thyroid ophthalmopathy through the expression of HIF-1α protein in orbital fibroblasts derived from patients with thyroid ophthalmopathy and a marked increase (change) in protein expression in response to hypoxia and adipocyte differentiation. It was confirmed that it was done. The hypoxic microenvironment established in the present invention is highly likely to occur due to smoking, which is a clinically well-known risk factor for thyroid ophthalmopathy, and causes excessive tissue expansion within a limited structure (orbital structure surrounded by bone) that easily occurs during the development of the disease. Since it can easily occur due to adipocyte formation/proliferation, it can be seen that it plays an important role in the occurrence and worsening of the disease. Therefore, in the present invention, the expression level of HIF-1α protein biomarker and proteins related to adipocyte differentiation and adipokine are measured to determine whether thyroid ophthalmopathy occurs due to exposure to a hypoxic microenvironment or the severity of thyroid ophthalmopathy. We were able to show results that were helpful in predicting the future.
본 발명의 제2 양태는 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A 단백질, 상기 각각의 단백질의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 갑상선 안병증을 진단하기 위한 조성물에 관한 것이다.The second aspect of the present invention is a thyroid gland comprising an agent for measuring the expression level of hypoxia-inducible factor-1α protein, PAPP-A protein, fragments of each of the proteins, or genes encoding the proteins. It relates to a composition for diagnosing ophthalmopathy.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 상기 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합단편, 또는 압타머인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.In the present invention, the agent may be an antibody, an antigen-binding fragment thereof, or an aptamer that specifically binds to the protein or fragment thereof, but is not limited thereto.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.In the present invention, the agent may be a primer, probe, or antisense nucleotide that specifically binds to the polynucleotide encoding the protein, but is not limited thereto.
상기 단백질의 단편은 면역원성 단편일 수 있다. 상기 단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 단편일 수 있다.Fragments of the protein may be immunogenic fragments. It may be a fragment that has one or more epitopes that can be recognized by antibodies against the protein.
상기 "단백질의 발현 수준 측정"은 대상체의 시료에서 상기 유전자에 의하여 코딩되는 단백질의 존재 여부와 발현정도를 확인하는 과정으로, 단백질의 양을 측정하는 것일 수 있다. 또는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 mRNA 발현 수준을 측정함으로써 확인 가능한 것일 수 있다.The “measuring protein expression level” is a process of confirming the presence and expression level of a protein encoded by the gene in a sample of a subject, and may be measuring the amount of the protein. Alternatively, it may be confirmed by measuring the expression level of a polynucleotide encoding a protein, for example, mRNA.
일 양태로서 단백질의 발현 수준 측정은 상기 단백질 또는 이의 단편에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편 또는 압타머를 이용하여 단백질을 확인할 수 있다.In one embodiment, the expression level of a protein can be measured using an antibody, antigen-binding fragment, or aptamer that specifically binds to the protein or fragment thereof.
단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 다른 양태의 분석방법으로는 웨스턴블랏팅, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), 방사선 면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법 (radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트 (rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법 (Complement Fixation Assay), 질량 분석법(Mass Spectrometry), 유세포 분석 (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 및 단백질 칩 (protein chip) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.Other analytical methods for measuring protein expression levels include Western blotting, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), RIA (Radioimmunoassay), radioimmunodiffusion, and Ouchterlony. Immune diffusion method, rocket immunoelectrophoresis, tissue immunostaining, immunoprecipitation assay, complement fixation assay, mass spectrometry, flow cytometry (Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), and protein chips, but are not limited thereto.
본 명세서에서 용어 "항체"는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미할 수 있다. 일 양상에 따른 항체의 형태는 특별히 한정되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있으며, 나아가, 인간화 항체 등의 특수항체도 포함될 수 있다. 일 양상에 따른 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편은 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, 예를 들어, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv 등일 수 있다.As used herein, the term “antibody” is a term known in the art and may refer to a specific protein molecule directed to an antigenic site. The form of the antibody according to one aspect is not particularly limited, and may include polyclonal antibodies, monoclonal antibodies, or parts thereof as long as they have antigen binding properties, and may include all immunoglobulin antibodies, and may also include special antibodies such as humanized antibodies. Antibodies may also be included. Antibodies according to one aspect may include intact forms with two full-length light chains and two full-length heavy chains, as well as functional fragments of the antibody molecule. A functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment that possesses at least an antigen-binding function, and may be, for example, Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, etc.
상기 "유전자의 발현 수준"은 해당 유전자의 mRNA의 발현 수준 또는 해당 유전자에 의해 코딩 되는 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 확인 가능한 것일 수 있다. 일 양태로서, 발현 수준에 차이가 나는 유전자는 마커로 활용될 수 있으며, 구체적으로, 해당 유전자의 발현 수준에 따라 갑상선 안병증의 유무 및/또는 갑상선 안병증의 중증도(심각도) 등이 판단되는 것일 수 있다.The “gene expression level” may be confirmed by measuring the expression level of the mRNA of the gene or the expression level of the protein encoded by the gene. In one aspect, genes with differences in expression levels can be used as markers, and specifically, the presence or absence of thyroid ophthalmopathy and/or the severity of thyroid ophthalmopathy, etc. are determined depending on the expression level of the gene. You can.
본 명세서에서 용어 "유전자"는 단백질 코딩 또는 전사시에 또는 다른 유전자 발현의 조절시에 기능적 역할을 갖는 임의의 핵산 서열 또는 그의 일부를 의미할 수 있다. 유전자는 기능적 단백질을 코딩하는 모든 핵산 또는 단백질을 코딩 또는 발현하는 핵산의 일부만으로 이루어질 수 있다. 핵산 서열은 엑손, 인트론, 개시 또는 종료 영역, 프로모터 서열, 다른 조절 서열 또는 유전자에 인접한 특유한 서열 내에 유전자 이상을 포함할 수 있다.As used herein, the term “gene” may refer to any nucleic acid sequence or portion thereof that has a functional role in protein coding or transcription or in regulating the expression of other genes. A gene may consist of all nucleic acids that encode a functional protein or only a portion of the nucleic acids that encode or express the protein. The nucleic acid sequence may contain genetic abnormalities within exons, introns, initiation or termination regions, promoter sequences, other regulatory sequences, or unique sequences adjacent to the gene.
이를 위한 분석방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RTPCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: Rnase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), 또는 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.Analysis methods for this include RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA), and Northern blotting. , or DNA chips, etc., but are not limited thereto.
상기 단백질을 암호화하는 mRNA 발현양을 측정하는 제제는 일 양태에 따르면 유전자의 mRNA에 대해 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 또는 안티센스 뉴클레오티드이며, 상기 유전자의 핵산 서열이 알려져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 mRAN에 대해 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.According to one embodiment, the agent for measuring the expression level of mRNA encoding the protein is a primer, probe, or antisense nucleotide that specifically binds to the mRNA of the gene. Since the nucleic acid sequence of the gene is known, those skilled in the art will know the sequence. Based on this, primers or probes that specifically bind to the mRNA of these genes can be designed.
본 명세서에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기 쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 핵산 서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머라아제 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 서열은 반드시 주형의 서열과 정확히 동일할 필요는 없으며, 충분히 상보적이어서 주형과 혼성화될 수 있으면 된다. 프라이머의 위치 혹은 프라이머 결합부위는 프라이머가 혼성화하는 표적 DNA 절편을 의미할 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 유전자의 mRNA의 센스 및 안티센스 프라 이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성량의 측정을 통해 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.As used herein, the term "primer" refers to a nucleic acid sequence having a short free 3' hydroxyl group that can form base pairs with a complementary template and acts as a starting point for copying the template strand. refers to a short nucleic acid sequence. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and a reagent for polymerization (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer solution and temperature. Additionally, primers, both sense and antisense nucleic acids having a sequence of 7 to 50 nucleotides, may incorporate additional features that do not change the basic nature of the primer, which serves as an initiation point for DNA synthesis. The sequence of the primer does not necessarily have to be exactly the same as the sequence of the template, but just needs to be sufficiently complementary so that it can hybridize with the template. The location of the primer or the primer binding site may refer to the target DNA fragment to which the primer hybridizes. According to one embodiment of the present invention, diagnosis can be made by measuring the amount of desired product produced by performing PCR amplification using sense and antisense primers of the mRNA of the gene. PCR conditions and lengths of sense and antisense primers can be appropriately selected according to techniques known in the art.
본 명세서에서 용어 "프로브"란 mRNA외 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무, 발현양을 확인할 수 있다.As used herein, the term "probe" refers to a nucleic acid fragment, such as RNA or DNA, ranging from a few bases to several hundred bases in length, that can specifically bind to mRNA, and is labeled to determine the presence or absence of a specific mRNA and its expression. You can check the amount.
본 발명에서 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다In the present invention, probes may be manufactured in the form of oligonucleotide probes, single strand DNA probes, double strand DNA probes, RNA probes, etc. Selection of appropriate probes and hybridization conditions can be modified based on those known in the art.
상기 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등과 같은 하전되지 않은 연결체 또는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등과 같은 하전된 연결체로의 변형이 있다.The primer or probe can be chemically synthesized using the phosphoramidite solid support method or other well-known methods. These nucleic acid sequences can also be modified using many means known in the art. Non-limiting examples of such modifications include methylation, capping, substitution of a native nucleotide with one or more homologs, and modifications between nucleotides, such as methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates, carbamates, etc. There are modifications to the linkage or charged linkage such as phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.
본 발명의 제3 양태는 본 발명에 따른 갑상선 안병증을 진단하기 위한 조성물을 포함하는, 갑상선 안병증을 진단하기 위한 키트에 관한 것이다.A third aspect of the present invention relates to a kit for diagnosing thyroid ophthalmopathy, comprising the composition for diagnosing thyroid ophthalmopathy according to the present invention.
본 발명의 키트는 정량적 실시간 PCR (qRT-PCR)과 같은 실시간 PCR (RT-PCR) 키트, 마이크로어레이 키트 또는 SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적인 예로, 상기 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 키트는, miRNA 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 디옥시뉴클레오타이드(dNTPs), 디디옥시뉴클레오타이드(ddNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 DNA, RNA 또는 miRNA에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.The kit of the present invention may be a real-time PCR (RT-PCR) kit such as quantitative real-time PCR (qRT-PCR), a microarray kit, or a SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) kit, but is not limited thereto. As a specific example, the kit may be a kit containing essential elements required to perform RT-PCR. For example, an RT-PCR kit requires, in addition to each primer specific for a miRNA gene, test tubes or other suitable containers, reaction buffer (of varying pH and magnesium concentration), deoxynucleotides (dNTPs), and dideoxynucleotides (ddNTPs). ), enzymes such as Taq-polymerase and reverse transcriptase, DNase, RNAse inhibitor, DEPC-water, sterilized water, etc. Additionally, it may include a primer pair specific for DNA, RNA, or miRNA used as a quantitative control.
본 발명의 키트에는 체액, 세포 또는 조직으로부터 단백질 또는 핵산(예를 들면, total RNA)을 추출하기 위한 키트, 표지용 형광물질, 핵산 증폭용 효소 및 배지, 사용 설명서 등을 포함시킬 수 있다.The kit of the present invention may include a kit for extracting proteins or nucleic acids (e.g., total RNA) from body fluids, cells or tissues, a fluorescent substance for labeling, enzymes and media for nucleic acid amplification, instructions for use, etc.
본 발명의 키트는 상기 단백질 또는 핵산이, 예를 들면 고상에 결합 또는 부착된 갑상선 안병증마커 측정을 위한 디바이스이다. 고상의 재질의 예는 플라스틱, 종이, 유리, 실리콘 등이며, 가공의 용이함으로부터 바람직한 고상의 재질은 플라스틱이다. 고상의 형상은 임의이며, 예를 들면 사각형, 원형, 직사각형, 필름형 등이다.The kit of the present invention is a device for measuring thyroid ophthalmopathy markers in which the protein or nucleic acid is bound or attached to, for example, a solid phase. Examples of solid materials include plastic, paper, glass, silicon, etc., and plastic is a preferable solid material due to ease of processing. The shape of the solid phase is arbitrary, for example, square, circular, rectangular, film-shaped, etc.
본 발명의 키트는 상기 단백질의 적어도 1개와 특이적으로 결합 가능한 핵산을 포함할 수 있다.The kit of the present invention may include a nucleic acid capable of specifically binding to at least one of the above proteins.
제1 양태와 관련하여, 본 발명은 또한 다음의 단계를 포함하는 갑상선 안병증의 진단을 위한 정보 제공방법을 제공한다.In relation to the first aspect, the present invention also provides a method of providing information for diagnosis of thyroid ophthalmopathy, comprising the following steps.
(a) 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A단백질, 상기 각각의 단백질 단편 또는 상기 각각의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;(a) measuring the expression level of hypoxia-inducible factor-1α protein, PAPP-A protein, each of the protein fragments, or genes encoding each of the proteins in a biological sample isolated from an individual;
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된, 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질, PAPP-A단백질, 상기 각각의 단백질 단편 또는 상기 각각의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계.(b) The expression level of hypoxia-inducible factor-1α protein, PAPP-A protein, each protein fragment, or gene encoding each protein measured in step (a) was measured in the normal control group. Step of comparing with the sample.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 용어 "개체"는 갑상선 안병증이 발병될 가능성이 있거나 또는 발병된 인간, 침팬지를 포함한 영장류, 개, 고양이 등의 애완동물, 소, 말, 양, 염소 등의 가축동물, 마우스, 래트 등의 설치 류 등의 포유동물을 포함하는 의미로 해석된다.In the information provision method of the present invention, the term "individual" refers to humans, primates including chimpanzees, pets such as dogs and cats, cows, horses, sheep, goats, etc., who are likely to develop or have thyroid ophthalmopathy. It is interpreted to include mammals such as livestock animals, rodents such as mice and rats.
본 발명의 정보제공방법에 있어서, 분석을 위해 사용되는 "시료"는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 점액, 타액, 눈물, 등 정상적인 상태와 구별될 수 있는 갑상선 안병증에 특이적인 단백질을 확인할 수 있는 생체 시료를 포함한다. 바람직하게는 생물학적 액체 시료, 예를 들어 혈액, 혈청, 혈장 또는 소변일 수 있다.In the information provision method of the present invention, the "sample" used for analysis is blood, plasma, serum, urine, mucus, saliva, tears, etc., which can identify proteins specific to thyroid ophthalmopathy that can be distinguished from normal conditions. Includes biological samples. Preferably it may be a biological liquid sample, such as blood, serum, plasma or urine.
본 발명의 정보제공방법은 공지된 다양한 시험방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어, 혼성화법, 면역분석(immunoassay) 방법 또는 유전자 증폭방법을 이용하여 실시할 수 있고 이에 한정되는 것은 아니다.The information provision method of the present invention can use various known test methods, for example, hybridization method, immunoassay method, or gene amplification method, but is not limited thereto.
상기 혼성화법은 프로브를 이용하여 바이오 마커 HIF-1α 단백질 또는 PAPP-A 단백질의 존재를 확인하는 것일 수 있다.The hybridization method may confirm the presence of the biomarker HIF-1α protein or PAPP-A protein using a probe.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 또는 그의 단편의 발현 수준을 측정하는 단계는 전기영동, 질량 분석법, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 면역 조직 화학염색, 단백질 칩, 면역침강, 질량분석, 또는 이들의 조합으로 수행; 및/또는 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RTPCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩, 또는 이들의 조합으로 수행되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.In the present invention, the step of measuring the expression level of the protein or its fragment includes electrophoresis, mass spectrometry, immunoblotting, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunohistochemical staining, and protein chip. , performed by immunoprecipitation, mass spectrometry, or a combination thereof; And/or the step of measuring the expression level of the gene includes RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA), It may be characterized as being performed by Northern blotting, DNA chip, or a combination thereof, but is not limited to this.
상기 정상 대조구란 갑상선 안병증 진단을 받지 않은 정상인이며, 이들 로부터 채취한 시료와 갑상선 안병증의 존재 또는 예후를 알고자 하는 환자로부터 채취한 시료에서 단백질 발현수준 또는 발현패턴을 수득하고, 비교함으로써 갑상선 안병증의 발병여부 또는 환자의 예후를 정확하게 예측할 수 있다.The normal control group is a normal person who has not been diagnosed with thyroid ophthalmopathy, and protein expression levels or expression patterns are obtained and compared between samples collected from them and samples collected from patients who wish to know the presence or prognosis of thyroid ophthalmopathy. It is possible to accurately predict the onset of ophthalmopathy or the patient's prognosis.
본 발명의 제1 양태와 관련된 정보제공방법은 (c) 상기 (a) 단계에서 측정된, 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질 또는 PAPP-A 단백질의 발현 수준이 정상 대조구 시료에서의 발현 수준보다 증가하는 경우, 갑상선 안병증으로 진단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.The method of providing information related to the first aspect of the present invention is (c) the expression level of hypoxia-inducible factor-1α protein or PAPP-A protein measured in step (a) above is measured in the normal control sample. If the expression level increases, an additional step of diagnosing thyroid ophthalmopathy may be included.
구체적으로, 저산소증 유도인자(Hypoxia-inducible factor)-1α 단백질의 발현 수준이 정상 대조구 시료에서의 발현 수준보다 200% 이상일 경우 갑상선안병증 진단에 도움이 될 것으로 생각되며 300% 이상(바람직하게는 300% 내지 400%) 상향조절 되어 있는 경우, 중증의 갑상선 안병증으로 진행 위험성이 높다고 판단할 수 있다.Specifically, it is thought to be helpful in diagnosing thyroid ophthalmopathy when the expression level of hypoxia-inducible factor-1α protein is 200% or more than the expression level in normal control samples, and 300% or more (preferably 300% or more) % to 400%), the risk of progression to severe thyroid ophthalmopathy can be judged to be high.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 HIF-1α 단백질 또는 PAPP-A 단백질 바이오마커의 발현양 변화를 확인하고 이를 임상활동점수(clinical activity score, CAS)로 환산하여 갑상선 안병증의 여부 및/또는 감상선 안병증의 중증도를 평가하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이 경우, 상기 방법은 분석하고자 하는 대상체의 샘플에서 바이오마커를 질량 분석법에 의해 정량하고 임상활동점수(clinical activity score, CAS) 기준에 따라 갑상선 안병증의 여부 및/또는 갑상선 안병증의 중증도를 평가하는 것을 특징으로 할 수 있다. 그러나, 본 발명의 기술적 특징은 HIF-1α 단백질 바이오마커가 CAS 지표와 유의한 상관관계가 있음을 최초로 규명한 것인바, 본 발명은 상기 바이오마커에 대한 항체 반응 등 종래 알려진 단백질 발현를 측정하는 다양한 기술을 통하여 단백질을 정량화하고 그에 상응하는 CAS 점수 기준표를 작성하여 상기 바이오마커를 이용한 다양한 방식으로 CAS 지표를 평가할 수 있음은 당업자에게 자명하다.In the present invention, the method confirms changes in the expression level of HIF-1α protein or PAPP-A protein biomarkers and converts them into a clinical activity score (CAS) to determine whether thyroid ophthalmopathy and/or thyroid gland are present. It may be characterized by assessing the severity of ophthalmopathy. In this case, the method quantifies biomarkers in a sample of the subject to be analyzed by mass spectrometry and evaluates the presence of thyroid ophthalmopathy and/or the severity of thyroid ophthalmopathy according to the clinical activity score (CAS) criteria. It can be characterized as: However, the technical feature of the present invention is that it is the first to identify that the HIF-1α protein biomarker has a significant correlation with the CAS index, and the present invention provides various techniques for measuring protein expression known in the art, such as antibody responses to the biomarker. It is obvious to those skilled in the art that the CAS index can be evaluated in various ways using the biomarkers by quantifying the protein and creating a corresponding CAS score standard table.
환자의 선발 및 시료의 준비Patient selection and sample preparation
안와 섬유아세포는 가톨릭대학교 의과대학 서울성모병원 안과에서 얻었다. 안병증 섬유아세포는 환자의 감압 수술에서 획득되었다. 비 안병증 섬유아세포는 눈꺼풀 안검 성형술을 통해 얻었으며 면역, 염증, 갑상선 질환의 병력이 없었다. 섬유아세포의 1차 배양은 10% 소태아혈청(FBS, GIBCO BRL), 1% 페니실린 및 스트렙토마이신(Bio Whittaker Inc., Walkersville, MD)이 보충된 Dulbecco의 Modified Eagle 배지(GIBCO BRL, Grand Island, NY)에서 배양하였다. 세포는 인큐베이터에서 5% CO2로 37℃에서 배양되었다. 저산소 세포(2% O2)를 인큐베이터 챔버(Baker ruskinn, Brigend, UK)에서 48시간 동안 37℃로 배양하였다. 섬유아세포는 초기 배양에서 계대번호 10을 넘어서 사용하지 않았다. 모든 실험은 서울성모병원 규정에 따라 진행되었다.Orbital fibroblasts were obtained from the Department of Ophthalmology, Seoul St. Mary's Hospital, Catholic University College of Medicine. Ophthalmopathic fibroblasts were obtained from the patient's decompressive surgery. Non-ophthalmopathic fibroblasts were obtained through eyelid blepharoplasty and there was no history of immune, inflammatory, or thyroid disease. Primary culture of fibroblasts was in Dulbecco's Modified Eagle's medium (GIBCO BRL, Grand Island, MD) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS, GIBCO BRL), 1% penicillin, and streptomycin (Bio Whittaker Inc., Walkersville, MD). NY). Cells were cultured at 37°C with 5% CO 2 in an incubator. Hypoxic cells (2% O 2 ) were cultured at 37°C for 48 hours in an incubator chamber (Baker ruskinn, Brigend, UK). Fibroblasts were not used beyond passage number 10 in the initial culture. All experiments were conducted in accordance with Seoul St. Mary's Hospital regulations.
Oil Red O Staining 실험Oil Red O Staining Experiment
안와 섬유아세포를 6 well 플레이트에 5 x 103 세포/well로 배양하였다. Isobutylmethylxanthine (IBMX, 0·1 mM, 시그마) 및 dexamethasone (1 μM, 시그마)이 첨가된 무혈청 DMEM/Ham's F-12 배지 (thermo fisher science)로 구성된 지방 생성 배지에서 4일 동안 배양되었다. 4일 후 배지를 제거 후, pantothenic acid (17 μM, sigma), biotin (33 μM, sigma), tri-iodothyronine (T3)(0·2 nM, sigma), carbaprostacyclin (0·2 μM, 산타크루즈), 트랜스페린(10 μg/ml)이 첨가된 무혈청 DMEM/Ham's F-12 배지로 교체하였다. 14일 후, 배지를 웰에서 제거하고 PBS에서 3회 세척하였다. 각 웰을 10분 동안 10% 포름알데히드로 고정하였다. 그런 다음 섬유아세포를 증류수로 세척한 후에 각 웰을 증류수와 이소프로판올에 녹인 0.3% Oil Red O 용액으로 20분간 염색하고 60% 이소프로판올과 증류수로 세척하였다. 그 후, 각 웰을 클린 벤치에서 밤새 건조시켰다. 마지막으로 400X 배율에서 현미경(Nikon TS-100F)을 사용하여 시각화하였다.Orbital fibroblasts were cultured at 5 x 10 3 cells/well in a 6 well plate. The cells were cultured for 4 days in adipogenic medium consisting of serum-free DMEM/Ham's F-12 medium (thermo fisher science) supplemented with isobutylmethylxanthine (IBMX, 0·1 mM, Sigma) and dexamethasone (1 μM, Sigma). After removing the medium after 4 days, pantothenic acid (17 μM, Sigma), biotin (33 μM, Sigma), tri-iodothyronine (T3) (0·2 nM, Sigma), carbaprostacyclin (0·2 μM, Santa Cruz) , the medium was replaced with serum-free DMEM/Ham's F-12 medium supplemented with transferrin (10 μg/ml). After 14 days, the medium was removed from the wells and washed three times in PBS. Each well was fixed with 10% formaldehyde for 10 minutes. Then, after washing the fibroblasts with distilled water, each well was stained with 0.3% Oil Red O solution dissolved in distilled water and isopropanol for 20 minutes and washed with 60% isopropanol and distilled water. Afterwards, each well was dried on a clean bench overnight. Finally, it was visualized using a microscope (Nikon TS-100F) at 400X magnification.
도 3는 실시예 2에 따른 결과를 확인한 이미지이다. 도 3에 따르면, 저산소 조건에서 정상 산소 조건보다 더 높은 ORO 염색이 관찰되었다.Figure 3 is an image confirming the results according to Example 2. According to Figure 3, higher ORO staining was observed in hypoxic conditions than in normoxic conditions.
Western blotWestern blot
안와 섬유아세포를 PBS로 3회 세척하고 프로테아제 억제제 칵테일이 포함된 RIPA 용해 완충액에서 용해시켜 사용하였다. BSA 표준을 사용하는 BCA 방법, 샘플에 50ug 단백질이 포함된 샘플을 10% SDS-PAGE 겔에 로딩하고 전기영동하고 멤브레인(Millipore, Bedford, MA)으로 옮겼습니다. 멤브레인은 0.2% Tween 20(Bio-Rad) 및 1차 항체가 포함된 PBS 중 5% 탈지유 및 5% 소 혈청 알부민으로 밤새 블러킹하였다. 그런 다음 양고추냉이 퍼옥시다제-접합 이차 항체와 함께 인큐베이션했다. 그리고 SuperSignalTM West Pico PLUS 화학발광 기질(Thermo ScientificTM)을 사용한 처리 후 단백질 검출 확인은 ChemiDoc MP(Bio-Rad)로 수행되었다. 도 1을 참조하면, 비갑상선안병증 환자로부터 유래된 안와섬유모세포에서는 HIF-1α발현이 거의 나타나지 않으며 저산소 상태에서도 단백질 발현의 증가 양상이 관찰되지 않았지만, 갑상선안병증 환자로부터 유래된 안와섬유모세포에서는 정상 산소상태와 저산소 상태에서 모두 HIF-1α발현을 확인할 수 있다.Orbital fibroblasts were washed three times with PBS and lysed in RIPA lysis buffer containing protease inhibitor cocktail before use. For the BCA method using BSA standards, samples containing 50 μg of protein were loaded onto a 10% SDS-PAGE gel, electrophoresed, and transferred to membranes (Millipore, Bedford, MA). Membranes were blocked overnight with 5% skim milk and 5% bovine serum albumin in PBS containing 0.2% Tween 20 (Bio-Rad) and primary antibodies. They were then incubated with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies. And confirmation of protein detection after treatment using SuperSignal TM West Pico PLUS chemiluminescent substrate (Thermo Scientific TM ) was performed with ChemiDoc MP (Bio-Rad). Referring to Figure 1, HIF-1α expression is rarely observed in orbital fibroblasts derived from patients with non-thyroid ophthalmopathy, and no increase in protein expression was observed even under hypoxia, but in orbital fibroblasts derived from patients with thyroid ophthalmopathy, HIF-1α expression was rarely observed. HIF-1α expression can be confirmed in both normal and hypoxic conditions.
Proteome Profiler adipokine array 분석Proteome Profiler adipokine array analysis
Proteome Profiler Human Adipokine Array Kits는 안와 섬유아세포에서 58개의 adipokine의 상대적인 발현 수준을 동시에 검출하는 데 사용되었다. 안와 섬유아세포는 인큐베이터(37℃, 5% CO2) 및 인큐베이터 챔버(1% O2, 5% CO2, 94% N2 및 37℃)에서 48시간 동안 배양되었다. 세포 배양 상층액을 Detection Antibody Cocktail과 함께 rocking platform 쉐이커에서 4℃로 밤새 배양시켰다. 그리고 각각의 이미지를 ChemiDoc MP(Bio-Rad)으로 캡처하였다. 밴드 분석은 ImageJ 소프트웨어에 사용하였다.Proteome Profiler Human Adipokine Array Kits were used to simultaneously detect the relative expression levels of 58 adipokines in orbital fibroblasts. Orbital fibroblasts were cultured in an incubator (37°C, 5% CO 2 ) and incubator chamber (1% O 2 , 5% CO 2 , 94% N 2 and 37°C) for 48 hours. The cell culture supernatant was cultured overnight at 4°C on a rocking platform shaker with Detection Antibody Cocktail. And each image was captured with ChemiDoc MP (Bio-Rad). Band analysis was used in ImageJ software.
도 5 및 6은 본 실시예에 따른 Proteome Profiler adipokine array 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 5 및 6을 참조하면 저산소증(Hypoxia) 상태에서 아디포카인(adipokine)들의 발현이 변화하는 것을 확인할 수 있으며, 이에 따라 저산소 상태에서 안와 섬유아세포 내 아디포카인의 발현은 변화함을 알 수 있다. 변화한 몇몇의 아디포카인 중에 PAPP-A의 변화가 확연히 나타났다.Figures 5 and 6 show the results of Proteome Profiler adipokine array analysis according to this example. Referring to Figures 5 and 6, it can be seen that the expression of adipokines changes under hypoxia, and accordingly, the expression of adipokines in orbital fibroblasts changes under hypoxia. . Among several adipokines that changed, changes in PAPP-A were evident.
효소 면역 분석법enzyme immunoassay
Papp-α는 이중 샌드위치 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)으로 측정하였다. Orbital fibroblasts 세포 상층액은 인큐베이터에서 48시간 동안 5% CO2, 37℃로 배양하였고, 저산소 세포(1% O2, 5% CO2, 94% N2, 및 37℃)는 37℃의 인큐베이터 챔버에서 48 시간 배양하였다. 세포 상층액에서 Papp-α의 레벨을 사용 가능한 ELISA 키트(BD biosciences)로 정량화되었다. 상층액과 스탠다드는 이중으로 반복 실험하였다. 상층액은 96 well 플레이트에 코팅된 항체와 함께 배양하였다. 세척 후, 검출을 위해 2차 항체를 첨가하였다. 20분에 접합된 poly-horseradish peroxidase (HRP) 및 substrate (3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘)을 붙여주었다. 그후 마이크로플레이트 판독기에서 450 nm에서의 흡광도 판독을 하였다.Papp-α was measured by double sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Orbital fibroblasts cell supernatants were cultured in an incubator at 5% CO 2 and 37°C for 48 hours, and hypoxic cells (1% O 2 , 5% CO 2 , 94% N 2 , and 37°C) were cultured in an incubator chamber at 37°C. It was cultured for 48 hours. The levels of Papp-α in cell supernatants were quantified with an available ELISA kit (BD biosciences). The supernatant and standard were repeated in duplicate. The supernatant was incubated with antibodies coated in a 96 well plate. After washing, secondary antibodies were added for detection. Conjugated poly-horseradish peroxidase (HRP) and substrate (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) were attached for 20 minutes. Absorbance was then read at 450 nm in a microplate reader.
실시예 5에 따른 결과는 도 7에 나타내었으며, 도 7을 참조하면 갑상선 안병증 환자의 저산소 상태에서 PAPP-A의 발현이 206 내지 252% 증가하는 것을 알 수 있다. The results according to Example 5 are shown in Figure 7. Referring to Figure 7, it can be seen that the expression of PAPP-A increases by 206 to 252% in hypoxic conditions in patients with thyroid ophthalmopathy.
저산소 상태는 갑상선 안병증의 발생 및 진행에 중추적인 역할을 할 수 있다. 상기 서술된 내용 및 실시예를 참고로 하면, 갑상선 안병증 질환자의 저산소증 상태에서는 HIF-1α의 발현이 증가하여 지방세포 분화가 유도되고 아디포카인의 발현이 증가하는 것이 관찰되었고 따라서, HIF-1α의 발현 정도에 따라 갑상선 안병증의 발병 여부 및 중증도를 판단할 수 있음을 알 수 있다. 이는 임상적으로 흡연이 체내 저산소 상태를 유발하고, 갑상선의 안병증을 악화시킬 수 있는 잘 알려진 위험인자인 점을 고려하였을 때, 본원 발명은 흡연에 의해 유도된 저산소 상태 및 이에 따른 갑상선 안병증의 중증도를 HIF-1α의 발현 정도에 따라 진단하는데 도움이 될 것으로 기대할 수 있다. 특히 아디포카인 중 PAPP-a는 갑상선 안병증과 관련된 기존 연구에서 제시된 바가 없어 저산소증에 대한 PAPP의 변화를 갑상선 안병증의 새로운 마커로써 사용하는 것이 가능할 것으로 예상된다.Hypoxic conditions may play a pivotal role in the development and progression of thyroid ophthalmopathy. Referring to the above-described content and examples, it was observed that under hypoxia in patients with thyroid ophthalmopathy, the expression of HIF-1α increased, induced adipocyte differentiation, and the expression of adipokine increased. Therefore, HIF-1α It can be seen that the onset and severity of thyroid ophthalmopathy can be determined depending on the degree of expression. Considering that smoking is a well-known risk factor that can clinically cause a hypoxic state in the body and worsen thyroid ophthalmopathy, the present invention addresses the hypoxic state induced by smoking and the resulting thyroid ophthalmopathy. It is expected that it will be helpful in diagnosing severity based on the level of HIF-1α expression. In particular, among adipokines, PAPP-a has not been suggested in previous studies related to thyroid ophthalmopathy, so it is expected that changes in PAPP in response to hypoxia can be used as a new marker for thyroid ophthalmopathy.
Claims (12)
상기 진단은 저산소 자극에 의한 갑상선 안병증의 중증도를 판단하는 것인, 바이오마커 조성물.According to claim 1,
The diagnosis is a biomarker composition that determines the severity of thyroid ophthalmopathy caused by hypoxic stimulation.
상기 저산소 자극은 대상체의 해부학적 구조 또는 흡연에 의한 것인, 바이오마커 조성물.According to clause 2,
A biomarker composition, wherein the hypoxic stimulation is caused by the subject's anatomy or smoking.
PAPP-A 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브, 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 펩타이드, 앱타머 또는 화합물을 포함하는 것인, 갑상선 안병증을 진단하기 위한 조성물.According to clause 4,
An agent for measuring the expression level of the PAPP-A protein includes a primer or probe that specifically binds to the protein, an antibody, peptide, aptamer, or compound that specifically binds to the protein. Composition for diagnosis.
상기 키트는 실시간 PCR (RT-PCR) 키트, 마이크로어레이 키트 또는 SAGE(Serial Analysis of Gene Expression) 키트인, 갑상선 안병증을 진단하기 위한 키트.According to clause 6,
The kit is a real-time PCR (RT-PCR) kit, a microarray kit, or a SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) kit, for diagnosing thyroid ophthalmopathy.
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된, PAPP-A 단백질, 상기 단백질의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는, 갑상선 안병증의 진단을 위한 정보 제공방법.(a) measuring the expression level of the PAPP-A protein, a fragment of the protein, or a gene encoding the protein in a biological sample isolated from an individual; and
(b) for the diagnosis of thyroid ophthalmopathy, comprising comparing the expression level of the PAPP-A protein, the fragment of the protein, or the gene encoding the protein, measured in step (a), with a normal control sample. How to provide information.
상기 (a) 단계의 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 점액, 타액, 눈물, 또는 이들의 조합인, 갑상선 안병증의 진단을 위한 정보 제공방법.According to clause 8,
A method of providing information for the diagnosis of thyroid ophthalmopathy, wherein the biological sample in step (a) is blood, plasma, serum, urine, mucus, saliva, tears, or a combination thereof.
(c) 상기 (a) 단계에서 측정된, PAPP-A 단백질, 상기 단백질의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군 시료에서의 발현 수준보다 증가하는 경우, 갑상선 안병증으로 진단하는 단계를 추가로 포함하는, 갑상선 안병증의 진단을 위한 정보 제공방법.According to clause 8,
(c) When the expression level of the PAPP-A protein, the fragment of the protein, or the gene encoding the protein, measured in step (a), increases compared to the expression level in the normal control sample, thyroid ophthalmopathy is diagnosed. A method of providing information for the diagnosis of thyroid ophthalmopathy, further comprising steps.
상기 (a) 단계는 전기영동, 면역블로팅, 효소 결합 면역흡착 분석법(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay: ELISA), 면역 조직 화학 염색, 단백질 칩, 면역침강, 질량분 석, 또는 이들의 조합으로 수행; 및/또는
상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩, 또는 이들의 조합으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 갑상선 안병증의 진단을 위한 정보 제공방법.According to clause 8,
Step (a) is performed by electrophoresis, immunoblotting, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), immunohistochemical staining, protein chip, immunoprecipitation, mass spectrometry, or a combination thereof; and/or
The steps for measuring the expression level of the gene include RT-PCR, competitive RT-PCR, real-time RT-PCR, RNase protection assay (RPA), and Northern PCR. A method of providing information for the diagnosis of thyroid ophthalmopathy, characterized in that it is performed by blotting (Northern blotting), DNA chip, or a combination thereof.
(b) 상기 (a) 단계에서 측정된, PAPP-A 단백질, 상기 단백질의 단편 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
(c) 상기 측정된 발현 수준을 갑상선 안병증 중증도 점수로 환산하여 갑상성안병증의 중증도를 평가하는 단계를 포함하는, 갑상선 안병증의 중증도를 평가하기 위한 정보 제공 방법.(a) measuring the expression level of the PAPP-A protein, a fragment of the protein, or a gene encoding the protein in a biological sample isolated from an individual;
(b) comparing the expression level of the PAPP-A protein, the fragment of the protein, or the gene encoding the protein measured in step (a) with a normal control sample; and
(c) A method of providing information for evaluating the severity of thyroid ophthalmopathy, comprising the step of converting the measured expression level into a thyroid ophthalmopathy severity score to evaluate the severity of thyroid ophthalmopathy.
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