KR102631637B1 - 아미노산을 유효성분으로 함유하는 대사체 정량분석용 기질 조성물 및 이를 이용한 분석 방법 - Google Patents

아미노산을 유효성분으로 함유하는 대사체 정량분석용 기질 조성물 및 이를 이용한 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아미노산을 유효성분으로 함유하는 대사체 정량분석용 기질(Matrix) 조성물 및 이를 이용한 대사체 정량분석 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 안정한 동위원소로 표지된 페닐알라닌을 기질로 사용하여 시간비행형 이차이온질량분석법(ToF-SIMS)을 수행하여 아미노산 대사체의 정량분석을 수행한 결과, 상기 페닐알라닌 기질은 분석용 기판 위에 균일한 층을 형성하였으며, 시료 건조 후에도 낮은 농도의 아미노산 대사체의 정밀한 정량분석이 가능한 것을 확인함에 따라, 상기 안정한 동위원소로 표지된 페닐알라닌을 유효성분으로 함유하는 조성물은 질량분석법을 이용한 대사체 정량분석용 기질 조성물로 제공될 수 있다.

Description

아미노산을 유효성분으로 함유하는 대사체 정량분석용 기질 조성물 및 이를 이용한 분석 방법{Substrate composition for quantitative analysis of metabolites comprising amino acids and analysis method using the same}
본 발명은 아미노산을 유효성분으로 함유하는 대사체 정량분석용 기질(Matrix) 조성물 및 이를 이용한 대사체 정량분석 방법에 관한 것이다.
이차이온질량분석법(Secondary Ion Mass Spectrometry, SIMS)은 가속 이온빔을 시료에 조사하여 시료 표면과 충돌하여 탈착되어 나오는 이차 이온의 질량을 분석하는 방식으로서 표면에 흡착된 분자의 질량 분석 기술로 최근 이온빔과 질량분석기의 발달로 조직과 세포와 같은 생체시료의 지질과 대사체를 높은 공간분해능과 질량분해능의 이미징 분석을 가능하게 한다.
이러한 SIMS 분석의 주요 장점은 극미량 분석으로서, 검출한계는 수소에서 우라늄까지 거의 모든 원소를 ppm 내지 ppb 수준으로 정밀 분석이 가능하고, 또한 안정한 동위원소로 분석할 수 있으며, 뎁스 프로파일(depth profile)과 이온 이미지(ion image)가 가능하며, 미량 성분의 깊이 분포 측정과 3차원 분석을 할 수 있는 것이다. 그러나 이차 이온의 방출량이 기질(matrix)과 표면의 전자 상태에 극히 민감하여 매질에 따라 스퍼터링된 이차 이온의 양이 현저히 다르게 나타나는 기질 효과(matrix effect)가 있고, 또한 본질적으로 파괴적인 분석 방법이라는 단점이 있다.
액체생검(liquid biopsy)은 천자나 절개 등의 침습적인 시술 없이 비침습적으로 획득할 수 있는 혈액이나 복수 등의 액체 상태의 체액 시료를 활용하여 질병을 진단하거나 분석하는 방법이다. 액체생검은 환자로부터 비교적 간편하게 체액을 채취하여 암 발생 및 전이 여부를 신속하고 상세하게 파악할 수 있으며, 액체생검 내에 존재하는 핵산 또는 엑소좀과 같은 생체물질은 다양한 질병에 대한 다각적인 분석을 가능하게 하여 질병의 원인 및 치료에 폭넓게 활용될 것으로 전망된다.
그러나 환자 유래 액체생검(혈액, 소변, 침, 눈물, 뇌척수액, 땀, 폐포 세척액(Bronchoalveolar Lavage Fluid, BALF) 등) 내의 대사체 분석을 위한 종래 기술(Nuclear magnetic response(NMR) spectroscopy, gas or liquid chromatography mass spectroscopy(GC-MS or LC-LS) 등)은 시편 당 적어도 수십 ~ 수백 μL(마이크로리터) 용량이 필요하고 각 시편을 개별적으로 한 개씩만 분석하기 때문에 수 마이크로리터 이하 나노리터 수준의 극미량 다수 시편을 신속히 분석하는 데 한계가 있다.
대한민국 공개특허 제 10-2009-0122638호(2009. 12. 01. 공개)
종래 분석용 기질로 사용된 그래핀 옥사이드(Graphene oxide)는 균일성 및 분석 물질 신호 향상과 같은 기질로서 좋은 장점을 가지고 있지만, 정량분석이 불가능한 문제점이 있으며, Paper-based microarray를 이용한 정량분석은 충분한 방법 검증이 이루어지지 않아 교정 곡선이 정밀하지 않고, 정량한계가 확인되지 않은 문제점이 있는 바, 본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 아미노산을 유효성분으로 함유하는 대사체 정량분석용 기질(Matrix) 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 안정한 동위원소로 표지된 아미노산을 유효성분으로 함유하는 대사체 정량분석용 기질(Matrix) 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 안정한 동위원소로 표지된 아미노산을 유효성분으로 함유하는 기질(Matrix)과 분석물질을 혼합하여 시료 혼합물을 준비하는 단계; 및
상기 시료 혼합물을 분석용 기판에 주입 후 건조시키는 단계를 포함하는, 질량분석법을 이용한 대사체 정량분석 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 안정한 동위원소로 표지된 페닐알라닌을 기질로 사용하여 시간비행형 이차이온질량분석법(ToF-SIMS)을 수행하여 아미노산 대사체의 정량분석을 수행한 결과, 상기 페닐알라닌 기질은 분석용 기판 위에 균일한 층을 형성하였으며, 시료 건조 후에도 낮은 농도의 아미노산 대사체의 정밀한 정량분석이 가능한 것을 확인함에 따라, 상기 안정한 동위원소로 표지된 페닐알라닌을 유효성분으로 함유하는 조성물은 질량분석법을 이용한 대사체 정량분석용 기질 조성물로 제공될 수 있다.
도 1은 패럴린 우물 배열 기판 제작 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 패럴린 우물 배열 기판 위에 아미노산 시료를 준비하는 과정 및 시간비행형 이차이온질량분석법(TOF-SIMS) 분석 결과이다.
도 3은 그래핀 옥사이드(GO) 기질 내의 아미노산 알라닌(alanine)의 농도별 ToF-SIMS 분석 결과이며, 패럴린 기판의 우물 패턴 위에 건조된 GO 기질을 확인한 이미지이다.
도 4는 패럴린 기판의 우물 패턴 위에 건조된 20 종의 아미노산을 확인한 이미지이다.
도 5는 알라닌(alanine), 트레오닌(threonine), 시스테인(cysteine), 이소루이신(isoleucine), 루이신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 트레오신(tyrosine) 및 트립토판(tryptophan)의 ToF-SIMS 분석 결과이다.
도 6은 프롤린(proline), 발린(valine), 아스파라긴(asparagine), 글루탐산(glutamic acid), 글루타민(glutamine) 및 히스티딘(histidine)의 ToF-SIMS 분석 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 안정한 동위원소로 표지된 아미노산을 유효성분으로 함유하는 대사체 정량분석용 기질(Matrix) 조성물을 제공할 수 있다.
상기 아미노산은 페닐알라닌(phenylalanine), 발린(valine), 메티오닌(methionine), 이소루이신(isoleucine), 루이신(leucine) 및 트립토판(tryptophan)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 페닐알라닌일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 안정한 동위원소로 표지된 아미노산을 유효성분으로 함유하는 기질(Matrix)과 분석물질을 혼합하여 시료 혼합물을 준비하는 단계; 및
상기 시료 혼합물을 분석용 기판에 주입 후 건조시키는 단계를 포함하는, 질량분석법을 이용한 대사체 정량분석 방법을 제공할 수 있다.
상기 기질은 안정한 동위원소로 표지된 페닐알라닌일 수 있으며, 보다 바람직하게는 안정한 동위원소로 표지된 L-페닐알라닌일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 기질은 5 내지 20mM 농도로 포함되는 것일 수 있다.
상기 시료 혼합물은 신호표준화 물질로 발린을 추가로 더 포함하는 것일 수 있으며, 보다 상세하게는 상기 발린은 안정한 동위원소로 표지된 L-발린일 수 있으며, 상기 신호표준화 물질은 50 내지 150μM 농도로 포함될 수 있다.
상기 분석물질은 생체물질일 수 있으며, 보다 상세하게는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 침, 눈물, 뇌척수액 폐포 세척액(Bronchoalveolar Lavage Fluid, BALF) 및 땀으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 시료 혼합물을 분석용 기판에 주입 후 건조시키는 단계는 시료 혼합물이 주입된 분석용 기판을 -20℃에서 동결시킨 후 4 내지 25℃에서 건조시키는 것일 수 있다.
보다 상세하게는 안정한 동위원소로 표지된 L-페닐알라닌(F*) 10mM, 안정한 동위원소로 표지된 L-발린(V*) 100μM과 한 종류의 아미노산을 3차 수에 녹인 표준 용액을 제조하였다. 상기 표준 용액 내의 아미노산의 농도는 0, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200 및 500μM로 준비하였다. 상기 표준 용액을 패럴린 기판의 우물 패턴(직경: 1mm) 위에 200nL씩 주입하였으며, 농도별로 3번 반복하였다. 기판 위의 용액 방울을 냉동실 -20℃에서 24시간 동안 동결시킨 후, 4℃ 냉장고에서 1시간 동안 천천히 건조하였으며, 이후 남은 수분을 공기(20℃) 중에 완전히 건조시켰다.
상기 대사체는 아미노산일 수 있으며, 보다 상세하게는 상기 아미노산은 알라닌(alanine), 트레오닌(threonine), 시스테인(cysteine), 이소루이신(isoleucine), 루이신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine) 및 트립토판(tryptophan)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따르면, 페닐알라닌(F*)을 기질(matrix) 물질로, 발린(V*)을 ToF-SIMS 신호표준화 물질로 사용하여 20 종의 아미노산을 농도 0 ~ 500μM 범위에서 분석하여 교정 곡선을 그리고, 검출한계, 정량 하한, 분석 농도 범위 및 직선성을 확인하였다.
그 결과, 도 5 및 표 2와 같이 20 종의 아미노산 중 8 종의 아미노산 알라닌(alanine), 트레오닌(threonine), 시스테인(cysteine), 이소루이신(isoleucine), 루이신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine) 및 트립토판(tryptophan)은 농도 500μM 범위 내에서 높은 직선성(R2: 0.991~0.999)으로 정량 분석이 가능한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 농도별 신호 세기가 일정하여 편차가 적고, 정량 하한은 농도 수 μM 정도까지 가능한 것이 확인되었다.
상기 질량분석법은 시간비행형 이차이온질량분광법(TOF-SIMS), 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행시간형 질량분석법(MALDI-TOF MS) 및 탈착 전기 분무 이온화 질량분석법(DESI-MS)으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으며, 보다 바람직하게는 시간비행형 이차이온질량분광법(TOF-SIMS)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<참고예>
하기의 참고예는 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 참고예를 제공하기 위한 것이다.
1. 물질
아미노산 글리신(glycine, G7126), L-알라닌(L-alanine, A7627), L-세린(L-serine, S4500), L-프롤린(L-proline, P0380), L-발린(L-valine, V0500), L-트레오닌(L-threonine, T8625), L-시스테인염산(L-cysteine hydrocholoride, C1276), L-아이소루신(L-isoluecine, I2752), L-루신(L-leucine, L8000), L-아스파라진(L-asparagine, A0884), L-아스파트산(L-aspartic acid, A9256), L-글루타민(L-glutamine, G3126), L-라이신 염산염(L-lysine monohydrochloride, L5626), L-글루탐산(L-glutamic acid, G1251), L-메티오닌(L-methionine, M9625), L-히스티딘 일염화물(L-histidine monohydrochloride monohydrate, H8125), L-페닐알라닌(L-phenylalanine, P2126), L-아르기닌(L-arginine, A5006), L-티로신(L-tyrosine, T3754) 및 그래핀 옥사이드(graphene oxide, GO, 777676)를 Sigma Aldrich에서 구매하였고, 동위원소가 표지된 L-페닐알라닌(L-phenylalanine, 13C9, 99%; 15N, 99%)과 L-발린(L-valine, 13C5, 99%; 15N, 99%)은 Cambridge Isotope Laboratories Inc. 제품을 사용하였다.
<실시예 1> 패럴린 우물 배열 기판 제작
도 1과 같이 우물 배열의 기판을 제작하였다.
보다 상세하게 화학기상증착법(Chemical Vapor Deposition, CVD)을 이용하여 실리콘(Si) 기판 표면 위에 패럴린 필름(~300nm)을 증착하였다. 포토레지스트(PR, AZ GXR 601)를 1μm 두께로 코팅한 후 노광(UV Dose 100mJ/cm2)과 현상 과정을 거쳐서 직경 1mm 크기의 우물 배열 패턴(4 x 9 array)을 새겼다. 반응성 이온식각 장비(Reactive ion etching, RIE, O2 20 sccm, 50W)으로 패럴린을 식각하여 PR과 동일한 패턴을 만들고, 아세톤(Acetone)으로 기판을 20분 동안 세척하여 패럴린 표면 위에 PR과 불순물을 제거한 후 메탄올(methanol) 및 이소프로필알코올(isopropyl alcohol, IPA)로 각 5분씩 기판을 세척하고 질소(N2) 건으로 건조하였다.
<실시예 2> 시료 분석
1. 시료 준비
안정한 동위원소로 표지된 L-페닐알라닌(L-phenylalanine, F*) 10mM, 안정한 동위원소로 표지된 L-발린(L-valine, V*) 100μM과 한 종류의 아미노산을 3차 수에 녹인 표준 용액을 만들었다. 표준 용액 내의 아미노산의 농도는 0, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200 및 500μM 로 상기 표준 용액을 패럴린 기판의 우물 패턴 (직경: 1mm) 위에 200nL 씩 주입하였으며, 농도별로 3번 반복하였다. 기판 위의 용액 방울을 냉동실 -20℃에서 24시간 동안 동결시킨 후, 4℃ 냉장고에서 1시간 동안 천천히 건조하였다. 이후 남은 수분을 공기(20℃) 중에 완전히 건조하였다. 또한, 아미노산 10mM 용액 및 그래핀 옥사이드(graphene oxide, 1 mg/ml) 용액도 동일한 방법으로 준비하였다.
2. ToF-SIMS 분석
ToF-SIMS 분석을 위해 독일 ION-TOF 사의 ToF-SIMS 5-100 모델을 사용하였고, Positive mode에서 Pulsed 30 keV Bi3 + 일차 이온빔(0.4pA)을 이용하여 시료 표면의 250 x 250 μm2 영역(128 x 128 pixels)을 각 시료 당 약 1분씩 분석하였다. 측정하여 얻은 모든 mass spectra는 CH3+, C2H3+, C3H5+ 및 13C9H11 15NO2+ peaks를 이용하여 internal calibration 하였으며, 아미노산 ToF-SIMS 분석 정보는 표 1과 같다. 각 아미노산의 ToF-SIMS 분석 측정값을 V* 측정값으로 나누어서 표준화하였다.
Amino　acids Peak　assignment Mass
G,　Glycine　 C2H6NO2+ 76.04
A,　Alanine　 C3H8NO2+ 90.05
S,　Serine　　 C3H8NO3+ 106.05
P,　Proline　 C5H10NO2+ 116.07
V,　Valine C5H12NO2+ 118.08
T,　Threonine　 C4H10NO3+ 120.06
C,　Cysteine C3H8NO2S+ 122.03
L,　Leucine　
I,　Isoleucine		 C6H14NO2+ 132.11
N,　Asparagine C4H9N2O3+ 133.06
D,　Aspartic　acid　 C4H8NO4+ 134.05
Q,　Glutamine　 C5H11N2O3+ 147.08
K,　Lysine C6H15N2O2+ 147.11
E,　Glutamic　acid　 C5H10NO4+ 148.06
M,　Methionine C5H12NO2S+ 150.06
H,　Histidine C6H10N3O2+ 156.07
F,　Phenylalanine　 C9H12NO2+ 166.08
R,　Arginine C6H15N4O2+ 175.12
Y,　Tyrosine　 C9H12NO3+ 182.08
W,　Tryptophan C11H13N2O2+ 205.10
V*,　Stable　isotope　labeled　L-valine 13C5H12 15NO2+ 124.08
3. 검증
아미노산 농도를 x 값, 표준화한 ToF-SIMS 측정값을 y 값으로 하고, 아미노산 농도별 표준화된 측정값의 평균과 표준 편차를 그래프로 그렸다. 농도별 평균값에 대해 최소 제곱법(method of least square)을 적용하여 직선 교정 곡선(y=mx+b)을 그렸다. 직선의 식에서 m은 기울기(slope)이고, b는 y 절편(y intercept)이다. 직선성(linearity)의 척도를 나타내는 상관계수(correlation coefficient)의 제곱, R2는 다음 식을 이용해서 구하였다.
여기서 는 모든 x 값의 평균, 는 모든 y 값의 평균이다.
3개의 바탕(아미노산 0μM)의 신호를 측정하여 표준 편차(s)를 계산하고, 직선 교정 곡선에서 구한 기울기 m을 이용하여 최소 검출 가능 농도(Limit of detection, LOD)와 정량 하한(Lower limit of quantitation, LLOQ)을 다음 식을 통해 얻었다.
< 실시예 3> 결과 확인
1. 매트릭스(matrix)로서의 아미노산 평가
ToF-SIMS를 이용하여 유기물을 분석하는 데 있어서 분석 신호 세기를 향상시키기 위해 다양한 물질이 기질(matrix)로 제시되었다. 그 중 그래핀 옥사이드 (graphene oxide, GO)는 기판 표면 위에 균일한 층을 형성하고 지질과 같은 생체 분자의 신호를 향상시키는 성질 때문에 ToF-SIMS 분석에 좋은 기질 물질로 간주된다. 그러나 도 3과 같이 패럴린 기판의 우물 패턴 위에 건조된 GO 기질은 아미노산(alanine) 농도별 ToF-SIMS 신호가 일정하지 않고 직선성이 부족하여 정량 분석에는 한계를 나타내었다.
상기 결과는 그래핀 옥사이드와 아미노산이 용액상에서 화학적 성질이 달라, 건조된 후 그래핀 옥사이드 내의 아미노산의 비율이 초기 용액의 농도에 부합하지 않기 때문이다.
ToF-SIMS를 이용한 아미노산 정량 분석을 위해, 용액상에서 화학적 성질이 유사한 형태로 녹아 있는 20 종의 아미노산을 ToF-SIMS 기질로서 확인하였다.
20 종의 아미노산 10mM을 각각 패럴린 기판의 우물 패턴 위에 실험 방법의 시료 준비 절차를 따라 건조한 결과, 도 4와 같이 아미노산 페닐알라닌(phenylalanine), 발린(valine), 메티오닌(methionine), 이소루이신(isoleucine), 루이신(leucine) 및 트립토판(tryptophan)이 기판 표면 위에 연속적이고 균일한 층을 형성하였다. 그 중 페닐알라닌이 1mm 직경의 우물 패턴 위 전체에 가장 균일하게 형성되어 있어 기질(matrix)로 적합한 것이 확인되었다. 다만 분석 물질로서 페닐알라닌과의 신호 간섭을 피하기 위해 안정한 동위원소로 표지된 L-페닐알라닌(L-phenylalanine, F*)을 대신 사용하였다.
2. 아미노산 ToF-SIMS 분석
페닐알라닌(F*)을 기질(matrix) 물질로, 발린(V*)을 ToF-SIMS 신호표준화 물질로 사용하여 20 종의 아미노산을 농도 0 ~ 500μM 범위에서 분석하여 교정 곡선을 그리고, 검출한계, 정량 하한, 분석 농도 범위 및 직선성을 평가하였다.
그 결과, 도 5 및 표 2와 같이 20 종의 아미노산 중 8 종의 아미노산 알라(alanine), 트레오닌(threonine), 시스테인(cysteine), 이소루이신(isoleucine), 루이신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine) 및 트립토판(tryptophan)은 농도 500μM 범위 내에서 높은 직선성(R2: 0.991~0.999)으로 정량 분석이 가능한 것을 확인할 수 있었다. 또한, 농도별 신호 세기가 일정하여 편차가 적고, 정량 하한은 농도 수 μM 정도까지 가능하였다.
반면, 도 6과 같이 F* 기질 내 아미노산의 ToF-SIMS 신호 감응의 차이로 나머지 12 종 아미노산 중 6 종의 아미노산 프롤린(proline), 발린(valine), 아스파라긴(asparagine), 글루탐산(glutamic acid), 글루타민(glutamine) 및 히스티딘(histidine)은 농도가 높아질수록 신호 감응이 농도에 비례하지 않아 직선성은 확인되지 않았다. 하지만 농도에 따라 일정한 신호 감응을 보이기 때문에 sigmoid curve와 같은 비선형 모델을 이용하면 정량 분석은 가능할 것으로 예상되었다.
마지막으로 나머지 6 종의 아미노산 글리신(glycine), 세린(serine), 아스파틱산(aspartic acid), 라이신(lysine), 메티오닌(methionine) 및 아르기닌(arginine)은 기질 F* 의 의한 신호 간섭 및 불안정한 ToF-SIMS 신호로 정량 분석을 위한 일정한 패턴의 신호 세기가 나타나지 않았다.
　 LOD
[ μM ] 		LLOQ
[ μM ] 		ULOQ
[ μM ] 		Linearity
(R 2 )
Alanine 10.90 33.02 >500 0.99750
Threonine 3.16 9.56 >500 0.99706
Cysteine 5.73 17.35 >500 0.99186
Isoleucine 0.73 2.22 >500 0.99317
Leucine 0.49 1.48 >500 0.99276
Phenylalanine 3.23 9.79 >500 0.99902
Tyrosine 2.30 6.96 >500 0.99794
Tryptophan 0.15 0.45 >500 0.99739
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (10)

  1. 안정한 동위원소로 표지된 페닐알라닌(phenylalanine)을 유효성분으로 함유하는 대사체 정량분석용 기질(Matrix) 조성물.
  2. 삭제
  3. 안정한 동위원소로 표지된 페닐알라닌(phenylalanine)을 유효성분으로 함유하는 기질(Matrix)과 분석물질을 혼합하여 시료 혼합물을 준비하는 단계; 및
    상기 시료 혼합물을 분석용 기판에 주입 후 건조시키는 단계를 포함하는, 질량분석법을 이용한 대사체 정량분석 방법으로써, 상기 시료 혼합물은 신호표준화 물질로 발린(valine)을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 대사체 정량분석 방법.
  4. 삭제
  5. 청구항 3에 있어서, 상기 기질은 5 내지 20mM 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 대사체 정량분석 방법.
  6. 삭제
  7. 청구항 3에 있어서, 상기 시료 혼합물을 분석용 기판에 주입 후 건조시키는 단계는 시료 혼합물이 주입된 분석용 기판을 -20℃에서 동결시킨 후 4 내지 25℃에서 건조시키는 것을 특징으로 하는 대사체 정량분석 방법.
  8. 청구항 3에 있어서, 상기 대사체는 아미노산인 것을 특징으로 하는 대사체 정량분석 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 아미노산은 알라닌(alanine), 트레오닌(threonine), 시스테인(cysteine), 이소루이신(isoleucine), 루이신(leucine), 페닐알라닌(phenylalanine), 티로신(tyrosine) 및 트립토판(tryptophan)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 대사체 정량분석 방법.
  10. 청구항 3에 있어서, 상기 질량분석법은 시간비행형 이차이온질량분광법(TOF-SIMS), 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행시간형 질량분석법(MALDI-TOF MS) 및 탈착 전기 분무 이온화 질량분석법(DESI-MS)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 대사체 정량분석 방법.
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