KR102630430B1 - 다발성골수종(multiple myeloma)의 표적치료 및 병용화학치료가 가능한 초분지 폴리글리세롤 항암 복합약물전달체와 그의 제법 - Google Patents

다발성골수종(multiple myeloma)의 표적치료 및 병용화학치료가 가능한 초분지 폴리글리세롤 항암 복합약물전달체와 그의 제법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 초분지 폴리글리세롤 고분자약물전달체를 제조하고, 여기에 다발성골수종(multiple myeloma)의 표적치료제 및 항암화학요법제 등을 수식하여 제조한 초분지 폴리글리세롤 항암 복합약물전달체 조성물과 그의 제법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 다발성골수종의 1차 선택 치료물질인 보르테조밉과 당대사억제물질인 로니다민을 동시에 탑재하고, 골수 타겟팅 물질인 알렌드로네이트를 통한 암 조직 타겟팅 효율을 증진한 초분지 폴리글리세롤(hyperbranched polyglycerol, HPG) 항암 복합약물전달체를 다발성골수종 치료에 사용할 경우, 다발성골수종의 치료 효율 상승과 부작용 경감의 효과를 얻을 수 있다.

Description

다발성골수종(multiple myeloma)의 표적치료 및 병용화학치료가 가능한 초분지 폴리글리세롤 항암 복합약물전달체와 그의 제법{Hyperbranched polyglycerol anticancer complex drug delivery system capable of targeted treatment and combined chemotherapy for multiple myeloma and its preparation}
본 발명은 초분지 폴리글리세롤 고분자약물전달체를 제조하고, 여기에 다발성골수종(multiple myeloma)의 표적치료제 및 항암화학요법제 등을 수식하여 제조한 초분지 폴리글리세롤 항암 복합약물전달체 조성물과 그의 제법에 관한 것이다.
다발성골수종(multiple myeloma, MM)은 우리 몸에서 면역항체를 만드는 형질세포가 암세포로 변하여 주로 골수에서 증식하는 질환이다. 다발성골수종의 암세포는 건강한 항체 대신 비정상 단클론단백(M 단백)을 분비하며, 이로 인해 뼈 병변, 통증, 빈혈, 신장기능 이상, 고칼슘혈증 및 감염과 같은 다양한 증상이 나타나게 된다. 질병 초기에는 약간의 비정상 M 단백만을 분비하나, 증상이 없는 경우에는 의미불명단클론감마병증(Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance, MGUS)이라고 하며, 악성화된 형질세포의 수 또는 M 단백이 증가되어 있으나 다발성골수종의 증상이 없는 경우에는 무증상골수종(Smoldering Myeloma)으로 분류한다.
이러한 다발성골수종은 주로 골수에서 발생하는 혈액암의 일종이나, 간혹 골수를 둘러싸고 있는 뼈나 기타 여러 장기에서 고형 종양의 형태를 보이는 형질세포종으로 발생하기도 한다. 특히 뼈에 침범하는 경우가 흔하며, 이러한 경우 척추의 통증이나 압박골절 및 이로 인한 하지마비와 같은 신경학적 증상을 유발할 수 있다. 다발성골수종은 환자들마다 증상의 차이가 있으나, 가장 흔한 대표적인 증상으로는 빈혈, 뼈 통증, 신장 수치 상승 및 고칼슘혈증이 있다. 빈혈은 다발성골수종의 원인이 되는 형질세포의 골수 내 증식에 의하며, 이로 인한 피로감, 어지러움 및 호흡 곤란 등의 증상이 발생할 수 있다.
다발성골수종의 치료는 항암화학요법, 방사선요법, 조혈모세포 이식에 의한 치료에 의존하고 있다.
다발성골수종 치료에 1차로 선택되는 항암화학요법제로 알킬화제가 있으며, 현재까지도 melphalan과 cyclophosphamides는 중요한 병합치료제로 선택되고 있다. 최근에는 상품명 벨케이드(Velcade®, 얀센제약)로 시판되는 보르테조밉(Bortezomib)과 같은 프로테아좀 억제제와 면역중재 약제인 thalidomide의 유도체 약물, 보리노스타트(Vorinostat)와 같은 탈아세틸화효소억제제(Deacetylase inhibitors) 등이 다발성골수종 치료에 1차 선택약물로 지속적으로 개발되고 있다.
하지만 다발성골수종의 경우 새로운 기전의 화합요법제, 항체치료제 등 단일요법치료로는 완치가 불가능하여 임상현장에서는 표적치료제 혹은 항체치료제와 화학요법제의 복합요법치료를 선호하고 있다. 현재 미국립보건원의 국가암센터에서는 다발성골수종의 치료 프로토콜로 보르테조밉을 1차 선택 약물로 선택하고, 여기에 두 가지 정도의 다른 타겟 치료제를 더하는 삼약 복합치료법이 다발성골수종 치료에 우수한 효과를 나타낸다고 공지하고 있다.
이러한 복합치료를 통해서 치료효과의 상승을 얻을 수 있지만, 동시에 부작용 또한 복합적인 상승을 가져오는 경우가 많다. 따라서 이러한 복합치료의 부작용을 줄일 수 있는 새로운 치료법의 개발이 이 분야 기술의 해결해야 할 과제라고 할 수 있다.
이러한 상황을 타개하기 위하여, 본 발명에서는 다발성골수종 세포의 프로테아좀 억제와 당대사과정을 억제하는 약물의 복합 전달체를 설계하고, 여기에 다발성골수종의 발병부위인 골수에 약물을 전달할 수 있는 타겟팅 기능을 추가한 고분자약물전달체를 설계하였다. 본 발명에서 선택한 보르테조밉은 다발성골수종의 1차 선택약물로 새포 내의 프로테아좀을 억제하는 항암제이며, 로니다민(Lonidamine)은 보르테조밉을 보조하는 증감제이다. 로니다민은 헥소키네이즈 2(Hexokinase 2)를 억제하는데, 이 효소는 해당과정의 첫 과정을 담당하며 다발성골수종에서 과발현 되어 있다. 뿐만 아니라, 모노카복시산 수용체(monocarboxylate transporters)도 억제하여 세포호흡 및 대사물질을 바탕으로 하는 신호체계를 방해함으로써 항암활성을 나타낸다. 본 발명에서는 이러한 약리기전을 가진 로니다민이 보르테조밉의 항암활성을 높이는 새로운 복합치료약물로 적용이 가능하다는 것을 확인하였다.
본 발명은 보르테조밉과 로니다민의 복합치료의 효율을 보다 더 극대화하기 위해서 다발성골수종의 발병부위인 골수를 타겟팅하는 기능을 약물전달체에 도입하였다. 이럴 위하여, 골수조직의 칼슘과 선택적인 결합이 가능하다고 알려진 알렌드로네이트(Alendronate)를 입자 표면에 화학적으로 결합시켰다.
알렌드로네이트는 비스포스포네이트 화합물로 파골세포 내로 들어가 파골세포의 분화 작용을 억제함으로써 척추 및 대퇴골 골밀도를 높이는 골다공증 치료제 약물이다. 비스포스포네이트 화합물은 골조직의 칼슘과 선택적으로 결합하는 것으로 알려져 있으며, 본 발명에서는 다발성골수종 치료약물인 보르테조밉의 골조직에 타겟팅 효과를 높이기 위한 목적으로 도입되었다.
따라서, 본 발명에서는 다발성골수종을 억제하는 약물전달체의 물질로써, 초분지 폴리글리세롤(hyperbranched polyglycerol, HPG)을 적용하였다. 초분지 폴리글리세롤은 덴드릭 고분자의 일종으로, 글리시돌(glycidol) 단분자의 고리열림 중합반응을 통해 제조할 수 있으며, 분자구조 내에 다량의 하이드록시기(-OH)가 존재하여 생체 내에서 매우 안전하게 사용할 수 있는 고분자 전달체이다.
본 발명에서는 초분지 폴리글리세롤에 알렌드로네이트, 로니다민, 보르테조밉을 순차적으로 결합시켜 최종 생성물인 초분지 폴리글리세롤-알렌드로네이트/로니다민/보르테조밉(HPG-ALV) 고분자 약물전달체를 제조하였다.
본 발명의 일 측면에서의 목적은 초분지 폴리글리세롤(HPG)을 기반으로 하는 고분자 약물전달체를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 일 측면에서의 목적은 초분지 폴리글리세롤(HPG)을 기반으로 하는 고분자 약물전달체의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 초분지 폴리글리세롤(HPG)에 알렌드로네이트 및 보르테조밉을 포함하면서, 알렌드로네이트 및 보르테조밉이 HPG에 결합된 복합체를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 초분지 폴리글리세롤(HPG)에 알렌드로네이트, 보르테조밉 및 로니다민을 포함하면서, 알렌드로네이트, 보르테조밉 및 로니다민이 HPG에 결합된 복합체를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다..
또한, 본 발명은 HPG에 알렌드로네이트를 결합하는 단계(단계 1); 및 알렌드로네이트가 결합된 HPG에 보르테조밉을 결합하는 단계(단계 2); 를 포함하는 알렌드로네이트 및 보르테조밉이 HPG에 결합된 복합체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 HPG에 알렌드로네이트를 결합하는 단계(단계 1); 알렌드로네이트가 결합된 HPG에 로니다민을 결합하는 단계(단계 2); 및 알렌드로네이트 및 로니다민이 결합된 HPG에 보르테조밉을 결합하는 단계(단계 3);를 포함하는 알렌드로네이트, 로니다민 및 보르테조밉이 HPG에 결합된 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 다발성골수종의 1차 선택 치료물질인 보르테조밉과 당대사억제물질인 로니다민을 동시에 탑재하고, 골수 타겟팅 물질인 알렌드로네이트를 통한 암 조직 타겟팅 효율을 증진한 초분지 폴리글리세롤(hyperbranched polyglycerol, HPG) 항암 복합약물전달체를 다발성골수종 치료에 사용할 경우, 다발성골수종의 치료 효율 상승과 부작용 경감의 효과를 얻을 수 있다.
도 1은 초분지 폴리글리세롤(HPG)의 핵자기공명스펙트럼(nuclear magnetic resonance, NMR) 그래프이다.
도 2는 초분지 폴리글리세롤(HPG)의 핵자기공명스펙트럼(nuclear magnetic resonance, NMR) 그래프이다.
도 3은 초분지 폴리글리세롤(HPG), 초분지 폴리글리세롤-알렌드로네이트(HPG-A), 초분지 폴리글리세롤-알렌드로네이트/로니다민(HPG-AL), 초분지 폴리글리세롤-알렌드로네이트/로니다민/벨케이드(HPG-ALV)의 핵자기공명스펙트럼(nuclear magnetic resonance, NMR) 그래프이다.
도 4는 HPG, HPG-A, HPG-AL, HPG-ALV의 푸리에 변환 적외분광 분석(Fourier Transform Infrared Spectroscopy: FT-IR) 그래프이다.
도 5는 HPG, HPG-A, HPG-AL, HPG-ALV의 동적광산란(Dynamic light scattering; DLS) 분석을 통한 초분지 폴리글리세롤 약물전달체의 입자경 및 표면전하 분석 그래프이다.
도 6은 HPG, HPG-ALV을 주사전자현미경(Transmission electron microscopy; TEM)을 통하여 관찰한 그림이다.
도 7은 HPG-ALV의 X-선 표면 분석(Energy-dispersive X-ray spectroscopy: SEM-EDX) 그래프이다.
도 8은 등온적정 열량측정법(ITC; Isothermal titration calorimetry)을 통한 초분지 폴리글리세롤과 보르테조밉의 에스터화 반응 결합 특성을 나타내는 그래프이다.
도 9는 HPG-ALV의 UV-VIS 흡광도 분석을 통한 약물의 결합을 나타내는 그래프이다.
도 10은 형광분석법을 통한 초분지 폴리글리세롤-쿠마린의 형광발현 특성 평가 그래프이다.
도 11은 공초점 형광 이미징에 의한 HPG의 암세포 타케팅 능력을 나타내는 그림이다.
도 12는 WST assay를 이용한 초분지 폴리글리세롤의 세포독성시험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 13은 WST assay를 이용한 초분지 폴리글리세롤에 로니다민과 보르테조밉을 병용 사용한 경우 세포독성시험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 14는 알렌드로네이트 수식된 초분지 폴리글리세롤의 세포조직 타겟팅 효과를 나타내는 그림이다.
도 15는 알렌드로네이트 수식된 초분지 폴리글리세롤의 골수조직 타겟팅 효과를 나타내는 그림이다.
도 16은 다발성골수암종 이식 동물모델에서 종양의 중량 증가 억제 효과가 있음을 나타내는 그래프이다.
도 17은 다발성골수암종 이식 동물모델에서 종양의 크기 증가 억제 효과가 있음을 나타내는 그림이다.
도 18은 다발성골수암종 이식 동물모델에서 종양의 크기 증가 억제 효과가 있음을 나타내는 그래프이다.
도 19는 다발성골수암종 이식 동물모델에서 동물의 체중에 변화가 거의 없어 우려할만한 체내독성이 없음을 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
한편, 본 발명의 실시 형태는 여러가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 이하 설명하는 실시 형태로 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 실시 형태는 당해 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위해서 제공되는 것이다.
나아가, 명세서 전체에서 어떤 구성요소를 포함한다는 것은 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 일 측면은,
초분지 폴리글리세롤(HPG)에 알렌드로네이트 및 보르테조밉을 포함하면서, 알렌드로네이트 및 보르테조밉이 HPG에 결합된 복합체를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 측면은,
초분지 폴리글리세롤(HPG)에 알렌드로네이트, 보르테조밉 및 로니다민을 더 포함하면서, 알렌드로네이트, 보르테조밉 및 로니다민이 HPG에 결합된 복합체를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은,
HPG에 알렌드로네이트를 결합하는 단계(단계 1); 및
알렌드로네이트가 결합된 HPG에 보르테조밉을 결합하는 단계(단계 2); 를 포함하는 알렌드로네이트 및 보르테조밉이 HPG에 결합된 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일 측면은,
HPG에 알렌드로네이트를 결합하는 단계(단계 1);
알렌드로네이트가 결합된 HPG에 로니다민을 결합하는 단계(단계 2); 및
알렌드로네이트 및 로니다민이 결합된 HPG에 보르테조밉을 결합하는 단계(단계 3);를 포함하는 알렌드로네이트, 로니다민 및 보르테조밉이 HPG에 결합된 복합체의 제조방법을 제공한다.
초분지 폴리글리세롤-알렌드로네이트/로니다민/보르테조밉(HPG-ALV) 항암 복합약물전달체 혹은 폴리글리세롤-알렌드로네이트/보르테조밉(HPG-AV) 항암 복합약물전달체의 합성은 4가지 주요 단계로 구성된다.
첫째, 글리시돌 모노머의 고리열림 음이온 중합반응을 위하여, initiator-coinitiator 시스템 및 최적화된 1,4-디옥산을 용매로 하여 HPG 나노 입자를 합성하였다. 수득한 초분지 폴리글리세롤은 수용성이며, 50 nm 이하의 균일한 직경을 가지는 나노입자로 약물 전달 용도로 충분하다고 간주되었다.
둘째, 알렌드로네이트는 카바메이트 에스테르화 반응을 통해 HPG에 도입되었다.
셋째, 로니다민은 HPG와 에스테르 결합을 통해 도입되었으며, 일반적인 EDC/DMAP 에스테르화 반응을 통해 도입되었다.
마지막으로, 보르테조밉은 HPG의 1,2-diol 그룹에 자발적 결합을 통해 도입되었다.
본 발명에 따라 제조된 초분지 폴리글리세롤-알렌드로네이트/로니다민/보르테조밉(HPG-ALV) 항암 복합약물전달체 혹은 폴리글리세롤-알렌드로네이트/보르테조밉(HPG-AV) 항암 복합약물전달체는 다발성골수종에 일차적인 항암 치료제로 사용할 수 있으며, 이와 더불어 골수성 백혈병 등 골수에서 유래하는 혈액암 치료 목적으로 사용이 가능하다. 상기 혈액암은 백혈병, 악성림프종 및 다발성골수종으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 또한, 골수전이 유방암, 골수전이 폐암, 골수전이 대장암 및 간암 등 골수로 전이된 고형암의 치료에 적용이 가능하다.
본 발명에 따라 제조된 초분지 폴리글리세롤-알렌드로네이트/로니다민/보르테조밉(HPG-ALV) 항암 복합약물전달체 혹은 폴리글리세롤-알렌드로네이트/보르테조밉(HPG-AV) 항암 복합약물전달체는 일반적인 고형암 또는 혈액암에 적용이 가능하다.
이때, 상기 고형암은 간암, 폐암, 대장암, 위암, 유방암, 결장암, 골암, 췌장암, 두부 또는 경부암, 자궁암, 난소암, 직장암, 식도암, 소장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 전립선암, 방광암, 신장암, 수뇨관암, 신장세포암종, 신장골반암종 및 중추신경계 종양으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 암은 가성점액종, 간내 담도암, 간모세포종, 간암, 갑상선암, 결장암, 고환암, 골수이형성증후군, 교모세포종, 구강암, 구순암, 균상식육종, 급성골수성백혈병, 급성림프구성백혈병, 기저세포암, 난소상피암, 난소생식세포암, 남성유방암, 뇌암, 뇌하수체선종, 다발성골수종, 담낭암, 담도암, 대장암, 만성골수성백혈병, 만성림프구백혈병, 망막모세포종, 맥락막흑색종, 바터팽대부암, 방광암, 복막암, 부갑상선암, 부신암, 비부비동암, 비소세포폐암, 설암, 성상세포종, 소세포폐암, 소아뇌암, 소아림프종, 소아백혈병, 소장암, 수막종, 식도암, 신경교종, 신우암, 신장암, 심장암, 십이지장암, 악성 연부조직 암, 악성골암, 악성림프종, 악성중피종, 악성흑색종, 안암, 외음부암, 요관암, 요도암, 원발부위불명암, 위림프종, 위암, 위유암종, 위장관간질암, 윌름스암, 유방암, 육종, 음경암, 인두암, 임신융모질환, 자궁경부암, 자궁내막암, 자궁육종, 전립선암, 전이성 골암, 전이성뇌암, 종격동암, 직장암, 직장유암종, 질암, 척수암, 청신경초종, 췌장암, 침샘암, 카포시 육종, 파제트병, 편도암, 편평상피세포암, 폐선암, 폐암, 폐편평상피세포암, 피부암, 항문암, 횡문근육종, 후두암, 흉막암, 및 흉선암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 초분지 폴리글리세롤-알렌드로네이트/로니다민/보르테조밉(HPG-ALV) 항암 복합약물전달체 혹은 폴리글리세롤-알렌드로네이트/보르테조밉(HPG-AV) 항암 복합약물전달체는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 가하거나 단일 화합물로 비경구 투여 제제로 사용할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.
이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 약학적으로 허용가능한 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
또한 본 발명에 따라 제조된 초분지 폴리글리세롤 항암 복합약물전달체는 암병소 부위나 근거리 부위에 직접 주사하여 약물을 방출하도록 설계된 하이드로젤 형태의 주사제로도 제제화할 수 있다. 하이드로젤 형태의 주사제로 개발할 경우, HPG 자체의 하이드로젤 특성을 사용하거나 다양한 점증제 혹은 부형제를 첨가할 수 있다. 점증제 혹은 부형제를 사용할 수 있는 고분자로는 히알루론산, 젤라틴, 키토산, 셀룰로오스 계열의 다당고분자, 폴리비닐알코올 등 하이드로젤을 형성할 수 있고 약학적으로 사용이 가능한 것으로 알려진 다양한 고분자를 선택하여 사용할 수 있다.
또한 본 발명에 따라 제조된 초분지 폴리글리세롤 항암 복합약물전달체는 경구투여용 제형으로 개발할 수 있다. 경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염 등과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제 및 감미제를 함유할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예 및 실험예를 하기에 구체적으로 예시하여 설명한다. 다만, 후술하는 실시예 및 실험예는 본 발명의 일부를 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
1. 실험 준비
알렌드로네이트 나트륨 삼수화물은 Pharmapia Co., Ltd. 에서 구입하였다. 메탄올, 에탄올, 디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 아세톤, 디클로로메탄(DCM), 에테르, 테트라히드로퓨란(THF), 1M 염산(HCl) (aq), 1M 수산화나트륨(NaOH) (aq), 수산화칼륨(KOH)은 Duksan Company 에서 구입하였다. 글리시돌, 칼륨 메톡사이드, 1,1,1-트리스(히드록시메틸)프로판, 아지드화 나트륨(NaN3), 4Å분자체(molecular sieves), 1,4-디옥산, 암모늄 몰리브데이트, 4-디메틸아미노피리딘(DMAP), 산화중수소(D2O), L-(+)-아스코르브산, 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드염산염(EDC.HCl)은 Sigma-Aldrich Corporation 에서 구입하였다. 4-니트로페닐클로로포르메이트, 3-(브로모아세틸)쿠마린, 염화 아연(ZnCl2)은 Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. 에서 구입하였다. 로니다민은 Canspec Inc. 에서 구입하였다. 보르테조밉은 LC Laboratories에서 구입하였다. 트라이페닐포스핀은 Junsei Chemical Co., Ltd. 에서 구입하였다. DMSO-d6는 Acros Organics 에서 구입하였다. 증류수는 Merck Millipore 의 Milli-Q® Direct Water Purification System에 의해 생산되었다. Cellu-Sep® 투석 튜브 (분자량 cut off: 1kDa)는 Membrane Filtration Products, Inc. 에서 구입하였다. RPMI1640 및 DMEM 고혈당 세포 배양 배지는 Welgene Inc. 에서 구입하였다. EZ-Cytox® WST 분석 키트는 DoGenBio Company 에서 구입하였다. 재조합 인간 sRANK 리간드 (RANKL)는 PeproTech, Inc. 에서 구입하였다.
2. 분석 방법
(1) 핵자기공명스펙트럼(nuclear magnetic resonance, NMR)
1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼은 중수소화된 용매 DMSO-d6 또는 D2O를 사용하여 400MHz의 작동 주파수로 Bruker Bioscience Corporation의 DIGITAL AVANCE III® 장비를 사용하여 측정하였다.
도 1 및 도 2의 결과를 통하여 본 발명에 따라 제조한 초분지 폴리글리세롤이 50% 이상의 초분지 특성을 가지며 분자구조 내에 다수의 다이올을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 3의 결과를 통하여 본 발명에서 제시한 제조법을 따를 경우 HPG-A, HPG-AL, HPG-ALV을 성공적으로 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다.
(2) 푸리에 변환 적외분광 분석(Fourier Transform Infrared Spectroscopy: FT-IR)
발영에 따라 제조한 초분지 폴리글리세롤 약물전달체의 특성을 푸리에 변환 적외분광 분석은 퍼킨엘머사(PerkinElmer, Inc.)의 Spectrum Two®를 사용하여 파수 400 - 4000 cm-1 에서 제조한 시료의 FT-IR 스펙트럼을 얻었다.
도 4의 결과에 의하면 HPG-A, HPG-AL, HPG-ALV에 약물이 카바메이트 내지는 에스테르 결합으로 붙었음을 보여주며(카바메이트, 에스테르의 C=O 결합), 보르테조밉의 특징적인 amide peak(amide의 C=O 결합)을 통해 HPG-ALV에 보르테조밉이 수식되어 있음을 증빙한다.
(3) 동적광산란(Dynamic light scattering; DLS) 분석을 통한 초분지 폴리글리세롤 약물전달체의 입자경 및 표면전하 분석
Malvern Panalytical Ltd. 의 Zetasizer® Nano ZSP를 사용하여 hydrodynamic diameter 및 zeta potential 분포를 측정하였다.
도 5에서 확인할 수 있듯이 HPG의 경우 10 내지 100 nm의 입도분포를 보이며 평균입자는 30nm 내외였으나, HPG-ALV의 경우 약물결합 후 입도가 늘어나는 것을 확인하였다. 표면전하의 경우도 마이너스 표면전하가 변화, 상승하는 것을 확인하였다.
(4) 주사전자현미경(Transmission electron microscopy; TEM) 관찰
제시된 발명에 따라 제조한 초분지 폴리글리세롤 복합약물 전달체의 TEM 이미지는 Philips Company의 CM200를 사용하여 측정하였다. 7 μL의 시료를 취하여 TEM grid에 건조시킨 후, 120 kV의 가속 전압을 인가하여 배율 3.3k, 8.3k 및 19k의 TEM 이미지를 얻었다.
도 6의 결과를 보면 HPG와 HPG-ALV는 균일한 입자경을 가진 것으로 확인하였고, 본 결과는 DLS 분석 결과와 동일하였다.
(5) X-선 표면 분석 (Energy-dispersive X-ray spectroscopy: SEM-EDX)
HPG-A를 이용하여 SEM-EDX 이미지 및 원소 분석을 하였다. 분석은 Hitachi Company의 Thermal FE-SEM® S-4300SE를 사용하여 수행하였다.
도 7의 결과에서 볼 수 있듯이 HPG-A에 알렌드로네이트가 붙어있음을 보이며 이때 Na와 P의 비율이 1:2임을 확인할 수 있었다. 이는 분자 내에 인이 존재한다는 것과 동시에 나트륨염과의 구성비를 통해 알론드로네이트의 성분이 HPG에 성공적으로 수식되었다는 것을 증명해주고 있다.
(6) 등온적정 열량측정법(ITC; Isothermal titration calorimetry)을 통한 초분지 폴리글리세롤과 보르테조밉의 에스터화 반응 결합의 평가
본 실험은 보르테조밉이 초분지 폴리글리세롤과 자발적인 다이올 에스터 본드를 형성한다는 것을 증명하기 위해 실시하였다. 보르테조밉이 초분지 폴리글리세롤과 자발적인 다이올 에스터 결합을 이룰 경우 열량의 변화가 일어나며 이를 TA Instruments, Inc. 의 Nano ITC®를 사용하여 등온적정 열량측정법을 통하여 측정하였다.
도 8의 결과에 따르면 HPG와 보르테조밉이 약 1:10 비율로 자발적으로 결합함을 보인다. 결합상수(Ka2) 값이 1,000 M-1이므로, 결합반응이 해리반응보다 1천배 더 많이 일어남을 의미하며 화학양론적 결합비율(n2값)이 10.040이므로 HPG 한 분자당 보르테조밉 분자는 평균 10.040개가 붙음을 의미하며 결합친화도(ΔG)가 음수인 것은(-15.94 kJ/mol) 에스터화 결합반응이 자발적 반응임을 의미한다.
(7) UV-VIS 흡광도 분석을 통한 약물의 결합 평가
HPG-ALV에 로니다민과 보르테조밉이 결합하여 존재하는지 정성적 검출하기 위하여 UV-VIS 흡광도법을 사용하였다. UV-VIS 흡광도는 Molecular Devices, LLC의 SpectraMax® Plus 384를 사용하여 200 ~ 400 nm 범위에서 측정하였다.
도 9의 결과에 따르면 각 약물들의 특징적인 UV 피크가 HPG-ALV에서 모두 검출되었으며 HPG-AL에 로니다민과 보르테조밉을 정성적으로 검출하였음을 확인하였다.
(8) 형광분석법을 통한 초분지 폴리글리세롤-쿠마린의 형광발현 특성 평가
HPG에 쿠마린으로 형광 레이블링이 되었는지 파악하기 위해 형광분석법을 수행하였다. 형광의 방출 강도는 Scinco Corporation의 FluoroMate® FS-2를 사용하여 측정하였다.
도 10의 결과에 따르면 HPG-C 및 HPG-QAC에서 쿠마린의 특이파장을 확인하여 HPG에 쿠마린이 결합하였다는 것을 확인하였다.
<실시예 1> 초분지 폴리글리세롤-알렌드로네이트/보르테조밉(HPG-AV) 약물전달체의 합성
단계 1: 초분지 폴리글리세롤(HPG)의 합성
칼륨 메톡사이드 96 mg, 1,1,1-트리스(히드록시메틸)프로판 2,415 mg 및 교반 막대를 열건조 및 N2-purged 된 둥근 바닥 플라스크에 넣었다. 메탄올은 4 Å분자체와 함께 밤새 실온에서 건조되었다. 플라스크에 무수 메탄올 16 mL를 넣고 격렬하게 교반하면서 75℃에서 2시간 동안 환류시켰다. 이어서 메탄올을 40분 동안 가능한 많이 진공 건조하여 점성 용융물을 얻었다. 1,4-다이옥산 16 mL를 첨가하여 백색 불투명 혼합물을 만들고, 온도를 95℃까지 올렸다. 글리시돌 20 mL를 주사기를 사용하여 20시간 동안 점진적으로 주입하였다. 글리시돌을 주입하고 5시간이 지난 후, 25시간 반응시키고 증류수 20 mL 이상을 넣어 quenching하고 완전히 용해시켰다. 반응 물질을 증류수로 48시간 동안 8번 투석하였다 (투석 튜브의 분자량 cut-off 1kDa). 2일 또는 3일 동안 동결 건조하여 ca. 5,000mg의 투명하고 끈적거리고 딱딱한 물질을 수득하였다.
실험을 통해 분석한 초분지 폴리글리세롤의 FT-IR 스펙트럼은 초분지 폴리글리세롤이 1600 cm-1 피크를 포함하지 않는다는 점을 제외하고는 참조 문헌과 거의 동일하였다. 초분지 폴리글리세롤에 대한 FT-IR 분석 결과 3360 cm-1 의 알코올성 O-H, 2900 cm-1 전후의 알킬 C-H, 1250 ~ 1500 cm-1 의 H-C-H, 1040 ~ 1080 cm-1 의 C-O-C 피크가 검출되었으며, 이는 초분지 폴리글리세롤의 특징적인 FT-IR 피크들이다.
1H-NMR 스펙트럼은 참조 문헌과 거의 동일하였고, 코어 부분 양성자 피크가 검출되었으며, 에테르성 양성자 및 알코올성 양성자의 피크가 유의미하게 크고 넓게 split 되어있음을 통해 초분지 폴리글리세롤임을 판단할 수 있었다. 0.7 ~ 1.5 ppm 의 trimethylolpropane C-H는 전체 대비 개수가 적으므로 피크가 매우 작았다. 3.3 ~ 4.0ppm의 O-C-H 피크와 4.4 ~ 4.8 ppm의 O-H 피크는 수소결합 및 고분자 내 위치 차이로 인한 전자분포 차이로 인해 넓어지고 split 되어있었다.
13C-NMR 스펙트럼은 수지상 탄소 피크(64ppm, 71 - 73ppm)를 나타내고 분기 정도(DB)를 계산하여 초분지 구조를 확인하였다. DB는 다음 식을 통하여 50.06%으로 계산되었다.
13C-NMR 스펙트럼에서, Linear 1,3 unit(L13)은 알콕사이드 음이온이 2차 히드록시기에 도입된 선형 탄소를 의미한다. Linear 1,4 unit(L14)은 L13과 유사하지만, 1차 히드록시기가 propagation 중에 사용된 것을 의미한다. 수지상 단위(D)는 1차 및 2차 히드록시 그룹과 글리시돌의 이중 반응에 의하여 생성된다. 말단 단위(T)는 중합이 종료된 후, 디올의 형성에 의하여 생성된다. 피크 면적을 측정하였고(L13: 1.0, L14: 3.15, D: 2.08, T: 5.08), 병합된 2L14, 2D+2T, L13+L14 피크뿐만 아니라, 피크의 위치를 통하여 초분지 폴리글리세롤의 초분지 특성을 확인한 문헌과 일치함을 확인할 수 있었다.
DLS를 이용한 입도측정 및 제타전위 측정 결과, 초분지 폴리글리세롤의 평균 유체역학적 반경은 29 nm이며 90%의 입자가 60nm 이하였으며 평균 제타전위는 약 -9 mV였다.
단계 2: 초분지 폴리글리세롤의 히드록시기 활성화
초분지 폴리글리세롤-(4-니트로페닐)카보네이트 에스테르 (HPG-NPC)는 초분지 폴리글리세롤에 알렌드로네이트에 결합시키기 위한 중간체로 합성되었다. HPG 800 mg을 sonication 처리를 통해 피리딘 90 mL에 완전히 용해시켰다. 4-니트로페닐클로로포르메이트 100 mg을 피리딘 25mL에 녹인 용액도 준비하였다. 라운드 플라스크에 마그네틱 바를 넣고 질소를 충진시켰다. 플라스크에 HPG 용액 및 DMAP 80 mg를 넣고, 4-니트로페닐클로로포르메이트 용액을 0℃에서 천천히 첨가하여 다음날까지 교반시켰다.
단계 3: 초분지 폴리글리세롤-알렌드로네이트 카바메이트 에스테르(HPG-A)의 합성
알렌드로네이트 나트륨 삼수화물(Alendronate sodium trihydrate) 수용액을 동결 건조하여 알렌드로네이트 나트륨 무수물(Alendronate sodium anhydrous)을 제조하였다. 알렌드로네이트 나트륨 무수물 60 mg을 단계 2의 HPG-NPC 반응기에 첨가하고 질소 환경을 유지하였다. 반응기의 온도를 80℃로 올려서 밤새 반응시켰다. 반응 후, 회전증발기를 (100 rpm, bath 45℃냉각수 5℃45 분) 통해 피리딘을 제거하고, 증류수 60 mL 및 1M NaOH 100 μL를 이용하여 나머지 고체를 용해시켰다. 아세톤 1 : THF 1의 혼합물을 첨가해 침전을 만들고 원심 분리로 분리하였다. DMSO 20 mL로 다시 고체를 녹이고, 남은 고체는 원심 분리로 제거하였다. 과량의 아세톤으로 생성물을 침전시키고, 진공 건조시켰다.
NMR 및 FT-IR을 통해 HPG-A가 합성되었음을 확인하였다. HPG-A의 1H-NMR 스펙트럼에서 3.3 ~ 4.0ppm의 O-C-H 피크면적에 대한 4.4 ~ 4.8 ppm의 -OH 피크면적이 HPG의 경우에 비해 줄어들었는데, 이는 히드록시기를 알렌드로네이트가 소비하기 때문이다. FT-IR 스펙트럼에서도 HPG에 없던 1705 cm-1 의 carbamate C=O 피크가 새로 나타났다.
SEM-EDX를 사용하여 HPG-A에 존재하는 알렌드로네이트를 정성평가하였다. SEM-EDX를 통해 HPG-A의 원자 구성비율을 조사한 결과, 거의 1:2 At % (원자 수 백분율) 비율로 나트륨과 인의 피크가 모두 나타났다. 이것은 알렌드로네이트 나트륨의 화학적 조성에 해당하므로, 알렌드로네이트 나트륨이 존재함을 알 수 있다.
단계 4: 초분지 폴리글리세롤-알렌드로네이트/보르테조밉 에스테르(HPG-AV)의 합성
단계 3에서 수득한 초분지 폴리글리세롤-알렌드로네이트 150 mg을 무수 DMF 15 mL에 고르게 분산시켰다. 실온에서 30분 동안 분산액을 교반하면서 보르테조밉 15 mg을 첨가하였다. 아세톤 65mL 첨가하고, 원심 분리(RCF 3200g, 40 분)로 펠렛을 제조한 후, 투명한 상등액은 버렸다. 펠렛의 진공 건조를 통하여 아세톤 잔류물을 제거하였다.
<실시예 2> 초분지 폴리글리세롤-알렌드로네이트/쿠마린 카바메이트 에스테르 (HPG-AC) 및 초분지 폴리글리세롤-쿠마린 카바메이트 에스테르 (HPG-C)의 합성
단계 1: 3-글리실쿠마린(Coumarin-NH 2 )의 합성
쿠마린-NH2는 3-(브로모아세틸)쿠마린에서 Staudinger 반응을 통해 합성하였다. 먼저 DMSO 30 mL에 3-(브로모아세틸)쿠마린 538 mg을 녹이고, 실온에서 교반하였다. NaN3 158 mg을 첨가하여 짙은 녹색으로 색을 변화시키고, 45분 동안 교반하였다. 다음으로 트리페닐포스핀 630 mg을 넣고 2시간 동안 반응을 진행하였다. 증류수 2 mL를 주입하고 밤새 인큐베이션하여 암갈색의 물질을 얻었다. 마지막으로 염수 30 mL를 첨가하여 즉시 침전을 얻었다. 진공 여과로 고체를 분리하였다. 이를 300 mL 에탄올에 녹인 후, ZnCl2 100 mg을 첨가하였다. 진공 여과 후 갈색의 맑은 액체가 나오고, 회전 증발(100 rpm, bath 37 ℃냉각 5 ℃을 통해 부피를 감소시켰다. 이 액을 역상 MPLC를 통해 정제하였다.
단계 2: 초분지 폴리글리세롤-알렌드로네이트/쿠마린 카바메이트 에스테르 (HPG-AC) 및 HPG-쿠마린 카바메이트 에스테르 (HPG-C)의 합성
HPG 60mg을 HPG 4-니트로페닐 카보네이트 에스테르 (HPG-NPC) 합성에 의해 활성화하였다. 활성화 후, 정제는 수행하지 않았다. 알렌드로네이트 나트륨 무수물 7 mg 및 쿠마린-NH2 6 mg을 반응 용기에 첨가하였다. 혼합물을 N2 조건하에 80℃에서 밤새 교반하였다. 그 후, 추가 단계는 상기 기재한 HPG-A 합성 방법을 따른다. HPG-C는 알렌드로네이트 나트륨이 첨가되지 않은 것을 제외하고는 HPG-AC 합성과 동일한 방법으로 합성하였다.
<실시예 3> 초분지 폴리글리세롤-알렌드로네이트/로니다민/보르테조밉 (HPG-ALV) 약물전달체의 합성
단계 1: 초분지 폴리글리세롤-알렌드로네이트/로니다민 에스테르 (HPG-AL)의 합성
HPG-AL은 EDC/DMAP Steglich 에스테르화 반응을 통하여 합성하였다. HPG-A 200 mg을 열건조된 N2-purge 유리 바이알에 넣고, 무수 DMF 18 mL 및 sonication 처리로 분산시켰다. 로니다민 15 mg, EDC.HCl 12 mg, DMAP 11 mg을 실온에서 밤새 교반하면서 첨가하였다. n-헥산 16 mL를 첨가하였다. 침전물을 원심 분리(RCF 3200 g, 20분)로 분리하였다. 펠렛을 메탄올 2mL에 분산시켰다. 아세톤 13 mL를 처리한 후, 원심 분리 및 진공 건조를 수행하여 갈색 끈적한 덩어리 형태를 합성하였다.
알렌드로네이트를 결합시킨 HPG에 로니다민 또한 성공적으로 결합시켰음을 NMR과 FT-IR로 확인하였다. HPG-AL의 NMR 스펙트럼에선 로니다민에 특이적인 7.0 ~ 8.2 ppm의 방향족 피크 밴드를 확인할 수 있었다. FT-IR 스펙트럼에서는 1705cm-1 피크가 강화되어 있는데, 이로부터 Alendronate carbamate C=O와 Lonidamine ester C=O가 중첩되어 있음을 추론할 수 있다.
단계 2: 초분지 폴리글리세롤-알렌드로네이트/로니다민/보르테조밉 (HPG-ALV) 약물전달체의 합성
HPG-ALV는 보로네이트 에스테르 합성 반응을 통해 합성하였다. HPG-AL 150 mg을 무수 DMF 15 mL에 고르게 분산시켰다. 실온에서 30분 동안 분산액을 교반하면서 보르테조밉 15 mg을 첨가하였다. 아세톤 65mL 첨가하고, 원심 분리 (RCF 3200g, 40 분)로 펠렛을 제조한 후, 투명한 상청액은 버렸다. 펠렛의 진공 건조를 통하여 아세톤 잔류물을 제거하였다.
초분지 폴리글리세롤과 보르테조밉의 결합반응을 평가하기 위하여 등온적정 열량측정(ITC; Isothermal titration calorimetry)을 수행하였다. ITC는 리간드와 수용체의 결합엔탈피를 측정하는 실험으로, 초분지 폴리글리세롤과 보르테조밉이 결합할 때 발생하는 열량을 측정한다. 초분지 폴리글리세롤의 풍부한 1,2-diol 그룹은 보르테조밉의 보론산 그룹과 1:1로 탈수축합하여 보로닉 에스테르를 형성한다. 이를 통해 초분지 폴리글리세롤과 보르테조밉이 결합한다. 초분지 폴리글리세롤과 보르테조밉이 결합할 때 출입하는 열량을 ITC로 측정하고 분석함으로서 결합친화도, 화학양론적 결합비율 등 열역학적인 변수를 알 수 있다. 시간에 따른 열 흐름을 몰수비에 따른 결합반응 엔탈피로 환산하고, 일대다 결합반응 모델을 적용하여 결합친화도, 화학양론적 결합비율, 깁스 자유에너지 변화를 계산하였다.
참고 문헌들은 공통적으로 보르테조밉 에스테르 형성 성분으로 만니톨 등 저분자 당 알코올이 사용됨을 특징으로 한다. 이러한 보르테조밉 에스테르 형성 성분을 보르테조밉 대비 적어도 10배 몰 과잉으로 사용해야 한다. 그러나, 본 발명에서는 초분지 폴리글리세롤에 1,2-diol이 풍부하고 서로 공간상으로 밀집되어 있으므로, ITC 분석결과 1:10 정도의 결합 몰비가 가능하다. 그러므로 적은 양으로도 반응 평형을 에스테르 쪽으로 치우치게 할 수 있다는 장점이 있고, 체내에서도 안정한 전달체로 제조할 수 있다는 장점이 있다.
또한, 본 발명은 고분자인 초분지 폴리글리세롤을 활용하므로, 초분지 폴리글리세롤에 다른 약물을 결합하는 등 기능을 추가한 약물전달체로서의 응용이 가능하다. 고분자이면서 점도 증가가 거의 없는 구형 고분자이고, 유체역학적 크기가 60nm 이하이고, 수용액 상에서 적어도 1년 간 안정하게 존재하므로 주사 제제에 활용할 수 있다.
NMR 및 FT-IR을 통하여 HPG-ALV에서 로니다민과 보르테조밉의 존재를 확인하였다. HPG-ALV에서 방향족 양성자(7 ~ 10 ppm) 피크 밴드를 확인할 수 있었다. FT-IR을 통하여 카보닐 C=O 영역(1705cm-1)에서 HPG에 비하여 더 강한 피크를 확인하였다. 또한, 보르테조밉의 아미드 C=O 피크(1655cm-1)를 확인하였다.
DLS 및 TEM을 통하여 크기를 측정하였다. 유체역학적 지름은 HPG에 비해 약간 큰 크기(40nm)인 것으로 측정되었다. TEM 이미지에서도 입자 크기가 HPG에 비해 늘어난 것이 관찰되었다.
Zeta potential는 약 -6 mV로 측정되었다.
HPG-ALV에서 알렌드로네이트의 정성, 정량평가를 위하여 인산정량법을 수행하였다. 인산기는 아스코르브산과 같은 환원제의 존재 하에서 몰리브덴산암모늄과 반응하여 파란색 복합체를 형성하는데, 인산기의 농도에 비례하여 복합체가 생성되므로 흡광도와 인산기 농도가 비례하게 된다. 인산기를 함유하고 있는 알렌드로네이트의 경우, 그 농도와 740 nm 흡광도 사이에 명확한 선형성이 있었다. 흡광도 데이터를 바탕으로 HPG-ALV의 흡광도를 내삽한 결과, 알렌드로네이트 함량은 HPG-ALV에서 3.3%로 나타났다.
HPG-ALV에서 로니다민과 보르테조밉의 존재를 확인하기 위하여 UV 흡광도를 측정하였다. HPG-ALV의 UV 흡광도 스펙트럼에서 270 nm(보르테조밉) 및 300 nm(로니다민) 피크가 검출되었다. 이를 통해 로니다민과 보르테조밉을 확인하였다.
<실험예 1> 공초점 형광 이미징을 통한 알론드로네이트로 수식한 초분지 폴리글리세롤의 암세포 타겟팅 능력 평가
알렌드로네이트로 수식된 형광발현 초분지 폴리글리세롤 고분자(HPG-AC 및 HPG-C)의 세포 내제화 타겟팅 평가를 수행하였다. 세포는 파골세포로 유도화된 RAW264.7 세포를 사용하였다. HPG-AC 및 HPG-C 고분자 입자의 세포내 업테이크 실험은 24시간 동안 실시하였다. 24시간 인큐베이션 후 세포를 냉각된 PBS로 세척하고 4% 파라포름알데히드 용액으로 고정시킨 후 공초점 형광 이미징을 통해 세포내 형광 정도를 비교 평가하였다. 공초점 형광 이미징은 IX81® 전동 도립 현미경이 장착된 FV1000® 공초점 시스템으로 수행하였고 Fluoview® 4.0a 소프트웨어를 통해 영상을 획득하였다.
도 11의 결과를 통하여 볼 때, 알렌트로네이트로 수식된 HPG의 세포내 타겟팅이 HPG보다 월등하게 우수하다는 것을 확인할 수 있었다.
<실험예 2> 초분지 폴리글리세롤 항암 복합약물전달체의 세포사멸효과 평가
초분지 폴리글리세롤, 약물 및 초분지 폴리글리세롤 항암 복합약물전달체의 세포 독성은 WST 분석법을 통하여 평가하였다. HCT-116 및 MOPC-315.BM 세포를 적절한 배지(각각 RPMI1640, DMEM high glucose)에서 96-well plate에 접종하였다. 각 웰에 5 x 104 개의 세포와 100 μL 배지를 5% CO2, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 실험시료를 실험계획에 따라 농도별로 각 웰에 가하고, 72시간 동안 인큐베이션을 하였다. 인큐베이션 후 각 웰에 10 μL WST 용액을 첨가하였다. 추가로 37℃5% CO2하에서 30분 동안 인큐베이션 후, 450 nm에서 각 웰의 흡광도를 xMark® microplate spectrophotometer로 측정하였다.
도 12 및 도 13의 결과에 따르면 캐리어로 사용한 HPG, HPG-A는 세포독성을 나타내지 않았으나, 세포 사멸에 대한 시너지 효과는 로니다민 및 보르테조밉(velcade®) 처리군과 초분지 폴리글리세롤 항암 복합약물전달체에서 확인할 수 있었다.
<실험예 3> 다발성골수종 암동물 모델에서 초분지 폴리글리세롤 항암 복합약물전달체의 암조직 및 골수 조직에 대한 타겟팅 효과
4주령 balb/c mouse를 구매하여 1주일간 사육하여 환경에 적응시킨 후 다음과 같이 다발성골수종 암모델을 유도하여 본 실험에 사용하였다. 배양한 생쥐 다발성골수종암세포 (MOPC cell)를 trypsin 처리하여 탈리, 수집한 후 1.0X106 수의 암세포를 PBS 0.2 ml에 부유하여 balb/c mouse의 등쪽 피하에 주사하였다. 암세포 주사 후 시간 경과에 따라서 암종의 크기를 digital caliper로 측정하였으며, 2주일 경과 시 200 mm3 정도의 크기로 암종이 형성된 생쥐를 실험에 사용하였다. 초분지 폴리글리세롤 항암 복합약물전달체의 암조직으로 타겟팅 효과는 시험시료를 꼬리정맥에 주사한 후 일정 시간 간격으로 암조직을 조직에서 분리하여 형광영상을 획득하여 형광의 강도를 비교, 평가하였다.
골수조직에 대한 타겟팅 효과는 4주령 balb/c mouse를 구매하여 1주일간 사육하여 환경에 적응시킨 후 별도의 암조직 발현 과정 없이 초분지 폴리글리세롤 항암 복합약물전달체를 꼬리정맥에 주사하고 경시적으로 장기와 대퇴골을 취하여 장기조직 형광영상 분석을 하였다.
도 14의 결과에 따르면 알렌트로네이트 수식된 혈광발현 초분지 폴리글리세롤(HPG-AC)의 암세포조직 타겟팅 효과가 일반 형광발현 초분지 폴리글리세롤 (HPG-C)보다 우수하여 조직 중 형광 강도가 높은 것으로 나타났으며, 도 15의 결과에서도 알렌트로네이트 수식된 혈광발현 초분지 폴리글리세롤(HPG-AC)의 골수조직 타겟팅 효과가 더 우수한 것을 확인하였다.
<실험예 4> 다발성골수종 암동물 모델에서 초분지 폴리글리세롤 항암 복합약물전달체의 암성장 억제 효과
상기 실험예 3에 서술된 방법에 따라 다발성골수종 암유발 생쥐 모델을 제작하였고 초분지 폴리글리세롤 항암 복합약물전달체를 꼬리정맥에 주사하고 시간에 따른 암성장 억제효과를 관찰하였다.
도 16 내지 도 18에서 확인할 수 있듯이 초분지 폴리글리세롤 항암 복합약물전달체(HPG-ALV)가 암성장 억제 효과가 가장 우수한 것으로 나타났으며, 이는 실험 종료 후 적출한 암조직의 무게에서도 매우 확실하게 알 수 있었다. 도 19는 투여기간중 생쥐의 몸무게 변화를 나타낸 곡선으로 초분지 폴리글리세롤 항암 복합약물전달체가 우려할 만한 체내독성이 없다는 것을 증빙한다.

Claims (12)

  1. 초분지 폴리글리세롤(hyperbranched polyglycerol, HPG)에 알렌드로네이트(Alendronate), 로니다민(Lonidamine) 및 보르테조밉(Bortezomib)이 결합된 복합체를 유효성분으로 함유하는 다발성골수종 선택적 약물 전달체 조성물로서,
    상기 알렌드로네이트의 아민(-NH2)은 카바메이트(carbamate) 결합으로 초분지 폴리글리세롤(HPG)의 하이드록실(-OH) 그룹과 결합되어 초분지 폴리글리세롤(HPG)-알렌드로네이트 결합 고분자 전달체가 제조되고,
    상기 로니다민의 카르복실(-COOH)은 에스테르(ester) 결합을 통하여 상기 초분지 폴리글리세롤(HPG)-알렌드로네이트 결합 고분자 전달체에 결합되고,
    상기 보르테조밉의 보론산(boronic acid)은 보로닉 에스테르(boronic ester) 결합을 통하여 초분지 폴리글리세롤(HPG)의 다이올(diol)그룹에 결합되어 복합체를 이루는 것을 특징으로 하는, 다발성골수종 선택적 약물 전달체 조성물.
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  4. 초분지 폴리글리세롤(hyperbranched polyglycerol, HPG)은 알렌드로네이트(Alendronate)와 카바메이트(carbamate) 결합을 형성하는 단계(단계 1);
    알렌드로네이트가 결합된 HPG은 로니다민(Lonidamine)과 에스테르 결합을 형성하는 단계(단계 2); 및
    알렌드로네이트 및 로니다민이 결합된 HPG은 단순한 혼합 및 진탕을 통해서 보르테조밉과 보로닉 에스테르(boronic ester) 결합을 형성하는 단계(단계 3);를 포함하는 것을 특징으로 하는 제 1항의 초분지 폴리글리세롤(HPG)에 알렌드로네이트, 로니다민 및 보르테조밉이 결합된 복합체의 제조방법.
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  7. 제 1항에 있어서, 상기 약물 전달체 조성물은 혈관을 통하여 주입하거나, 또는 병소부위에 직접 주사할 수 있도록 제조한 하이드로젤 제형인 것을 특징으로 하는 다발성골수종 선택적 약물 전달체 조성물.
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  9. 제 1항에 있어서, 상기 약물 전달체 조성물은 경구투여 제형인 것을 특징으로 하는 다발성골수종 선택적 약물 전달체 조성물.

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