KR102628554B1 - 주입형 폴리 메틸 메타크릴레이트계 골시멘트 및 이의 제조방법 - Google Patents
주입형 폴리 메틸 메타크릴레이트계 골시멘트 및 이의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 폴리 메틸 메타크릴레이트-메틸 메타크릴레이트(Polymethyl methacrylate- methyl methacrylate) 페이스트 및 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜(Hyaluronic acid-polyethylene glycol) 수성 겔을 포함하는 주입형 폴리 메틸 메타크릴레이트계 골시멘트를 제공한다. 본 발명을 이용하면, 압축강도 및 탄성계수가 감소되어 생체 내 뼈 강성도에 근접한 골시멘트를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 주입형 폴리 메틸 메타크릴레이트계 골시멘트 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
종래에는 골절 등의 외상 또는 질환에 의한 골 결손 부위에 골 수복재로 폴리 메틸 메타 크릴레이트(Polymethyl methacrylate, PMMA) 분말에 액상의 단량체인 메틸 메타 크릴레이트(Methyl methacrylate, MMA)를 중축합하여 경화시킨 PMMA-MMA 시멘트를 주로 사용하여 왔다.
PMMA계 골시멘트는 골 조직의 결손된 영역을 수복하여 통증을 완화시켜주는 장점이 있으나, 부작용으로 인접한 척추 또는 뼈 부위의 골절을 야기시키고, 중합시 온도가 상승하여 조직을 괴사 시키는 문제점들이 있어왔다.
한편, 폴리에틸렌 글리콜은 소수성, 열전달 능력, 우수한 생체적합성 및 화학적 변형을 위한 반응성 부위로의 이용가능성과 같은 특성을 가지고 있으며, 폴리에틸렌 글리콜 유래 화합물은 약물 지속방출, 효소 고정화 및 상처치료에 적합하다고 알려져왔다.
히알루론산은 친수성 물질이며, 용액과 하이드로겔 형태 모두에서 고유한 생화학적 및 물리적 특성을 나타낼 있으며, 체내에서 연골과 관절을 부드럽게 하는 완충작용을 하고, 손상된 신체의 기능 회복에 도움을 줄 수 있다.
또한, 체내의 가수분해성 및 효소성 경로 모두에서 쉽게 분해되며 쿠션과 같은 움직임으로 시멘트 스캐폴드를 촉진하고 세포여과를 증가시키는 수화물 환경을 유지한다. 히알루론산과 같은 수성 성분의 중합체 결의 경우 용해되거나 분해되면서 기공을 형성하여 다공성 구조를 제공하므로 뼈의 경도와 근접한 감소된 경도를 갖는 골시멘트를 제공할 수 있다.
PMMA계 골시멘트는 골 조직의 결손된 영역을 수복하여 통증을 완화시켜주는 장점이 있으나, 부작용으로 인접한 척추 또는 뼈 부위의 골절을 야기시키고, 중합시 온도가 상승하여 조직을 괴사 시키는 문제점들이 있어왔다.
한편, 폴리에틸렌 글리콜은 소수성, 열전달 능력, 우수한 생체적합성 및 화학적 변형을 위한 반응성 부위로의 이용가능성과 같은 특성을 가지고 있으며, 폴리에틸렌 글리콜 유래 화합물은 약물 지속방출, 효소 고정화 및 상처치료에 적합하다고 알려져왔다.
히알루론산은 친수성 물질이며, 용액과 하이드로겔 형태 모두에서 고유한 생화학적 및 물리적 특성을 나타낼 있으며, 체내에서 연골과 관절을 부드럽게 하는 완충작용을 하고, 손상된 신체의 기능 회복에 도움을 줄 수 있다.
또한, 체내의 가수분해성 및 효소성 경로 모두에서 쉽게 분해되며 쿠션과 같은 움직임으로 시멘트 스캐폴드를 촉진하고 세포여과를 증가시키는 수화물 환경을 유지한다. 히알루론산과 같은 수성 성분의 중합체 결의 경우 용해되거나 분해되면서 기공을 형성하여 다공성 구조를 제공하므로 뼈의 경도와 근접한 감소된 경도를 갖는 골시멘트를 제공할 수 있다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 종래 기술의 문제점을 해결하는 것으로, 중합온도를 낮추는 것은 물론, 기계적 및 물리적 특성이 개선된 PMMA계 골시멘트를 제공하는 것이다.
본 발명은 폴리 메틸 메타크릴레이트-메틸 메타크릴레이트(Polymethyl methacrylate- methyl methacrylate) 페이스트 및 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜(Hyaluronic acid-polyethylene glycol) 수성 겔을 포함하는 주입형 폴리 메틸 메타크릴레이트계 골시멘트를 제공한다.
상기 골시멘트는, 전체 골시멘트 조성물 100 중량% 대비 5 내지 10 중량%의 상기 히알루론산을 포함할 수 있다.
상기 골시멘트의 경화시간은 19~25 분일 수 있다.
상기 골시멘트는, 경화 후 압축강도가 18.0 내지 31.0 MPa이고, 탄성계수가 85 내지 153 MPa일 수 있다.
상기 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜 수성 겔은, 경화 후 생분해되어 기공을 형성할 수 있다.
본 발명은 다른 실시예에 따라 (a) 폴리 메틸 메타크릴레이트-메틸 메타크릴레이트(PMMA-MMA) 페이스트를 제조하는 단계, (b) 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜(HP) 수성 겔을 제조하는 단계, 그리고 (c) 상기 수성 겔과 PMMA-MMA 페이스트를 혼합하는 단계를 를 포함하는 주입형 폴리 메틸 메타크릴레이트계 골시멘트의 제조방법을 제공한다.
상기 (a) 단계는, PMMA 분말과 MMA 용액을 제조하고, 1:0.5 고액비(g:ml)로 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 PMMA 분말은, PMMA 50 중량%, 벤조일 퍼옥사이드(Benzoyl peroxide) 1 중량%, 이산화지르코늄(Zirconium dioxide) 34 중량% 및 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 15 중량%를 혼합하여 제조되며, 상기 MMA 용액은, 하이드로퀴논(hydroquinone)을 포함하는 MMA 97.6 중량% 및 N,N-디메틸-p-톨루이딘(N, N-dimethyl-p-toluidine) 2.4중량%를 혼합하여 제조될 수 있다.
상기 (b) 단계는, 히알루론산과 폴리에틸렌 글리콜을 각각 탈이온수에 혼합하여 히알루론산 용액과 폴리에틸렌 글리콜 용액을 제조하는 과정 및 상기 히알루론산 용액과 폴리에틸렌 글리콜 용액을 혼합하는 과정을 포함할 수 있다.
상기 히알루론산 용액 내에 히알루론산의 함량은 5~10 중량%일 수 있다.
상기 골시멘트는, 전체 골시멘트 조성물 100 중량% 대비 5 내지 10 중량%의 상기 히알루론산을 포함할 수 있다.
상기 골시멘트의 경화시간은 19~25 분일 수 있다.
상기 골시멘트는, 경화 후 압축강도가 18.0 내지 31.0 MPa이고, 탄성계수가 85 내지 153 MPa일 수 있다.
상기 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜 수성 겔은, 경화 후 생분해되어 기공을 형성할 수 있다.
본 발명은 다른 실시예에 따라 (a) 폴리 메틸 메타크릴레이트-메틸 메타크릴레이트(PMMA-MMA) 페이스트를 제조하는 단계, (b) 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜(HP) 수성 겔을 제조하는 단계, 그리고 (c) 상기 수성 겔과 PMMA-MMA 페이스트를 혼합하는 단계를 를 포함하는 주입형 폴리 메틸 메타크릴레이트계 골시멘트의 제조방법을 제공한다.
상기 (a) 단계는, PMMA 분말과 MMA 용액을 제조하고, 1:0.5 고액비(g:ml)로 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 PMMA 분말은, PMMA 50 중량%, 벤조일 퍼옥사이드(Benzoyl peroxide) 1 중량%, 이산화지르코늄(Zirconium dioxide) 34 중량% 및 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 15 중량%를 혼합하여 제조되며, 상기 MMA 용액은, 하이드로퀴논(hydroquinone)을 포함하는 MMA 97.6 중량% 및 N,N-디메틸-p-톨루이딘(N, N-dimethyl-p-toluidine) 2.4중량%를 혼합하여 제조될 수 있다.
상기 (b) 단계는, 히알루론산과 폴리에틸렌 글리콜을 각각 탈이온수에 혼합하여 히알루론산 용액과 폴리에틸렌 글리콜 용액을 제조하는 과정 및 상기 히알루론산 용액과 폴리에틸렌 글리콜 용액을 혼합하는 과정을 포함할 수 있다.
상기 히알루론산 용액 내에 히알루론산의 함량은 5~10 중량%일 수 있다.
본 발명을 이용하면, 압축강도 및 탄성계수가 감소되어 생체 내 뼈 강성도에 근접한 골시멘트를 제공할 수 있다.
또한, 중합온도를 낮추어 열에 의한 조직 괴사를 감소시킬 수 있는 골시멘트를 제공할 수 있다.
또한, 다공성 구조를 형성하여 세포이동 및 세포 영양소의 수송율을 증가시키며, 혈관 및 뼈 형성율이 우수한 골시멘트를 제공할 수 있다.
또한, 중합온도를 낮추어 열에 의한 조직 괴사를 감소시킬 수 있는 골시멘트를 제공할 수 있다.
또한, 다공성 구조를 형성하여 세포이동 및 세포 영양소의 수송율을 증가시키며, 혈관 및 뼈 형성율이 우수한 골시멘트를 제공할 수 있다.
도 1은 종래의 PMMA-MMA 골시멘트와 본 발명의 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트를 예시적으로 비교한 것이다.
도 2a 내지 도 2d는 PMMA-MMA 골시멘트, PMMA-MMA 5% HP 골시멘트, PMMA-MMA 10% HP 골시멘트 및 PMMA-MMA 15% HP 골시멘트의 단면 SEM 이미지를 나타낸 것이고, 도 2e는 각 골시멘트의 경화시간을 나타낸 그래프이고, 도 2f 및 도 2g는 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 상이한 영역을 EDS 분석한 것이다.
도 3a는 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 XRD 분석 그래프이고, 도 3b는 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 FTIR 분석 그래프이다.
도 4는 시간에 따른 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 pH 변화를 나타낸 것이다.
도 5a는 시간에 따른 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 압축 강도를 나타낸 것이고, 도 5b는 시간에 따른 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 탄경계수의 변화를 나타낸 것이다.
도 6a 내지 도 6f는 시간에 따른 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 기공형성 변화를 나타낸 것이다(화살표는 다공성 영역을 표시).
도 7a 및 도 7b는 14일 후 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 인회석 형성을 확인한 SEM이미지이고, 도 7c는 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 아파타이트를 측정한 XRD 분석 그래프이다.
도 8a는 시간에 따른 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트에서 세포의 생존율을 분석한 것이고, 도 8b는 도 8a PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트 내의 세포핵을 관찰한 것이고, 도 8c 및 도 8d는 7일 후 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 세포 부착성을 확인한 것이다.
도 2a 내지 도 2d는 PMMA-MMA 골시멘트, PMMA-MMA 5% HP 골시멘트, PMMA-MMA 10% HP 골시멘트 및 PMMA-MMA 15% HP 골시멘트의 단면 SEM 이미지를 나타낸 것이고, 도 2e는 각 골시멘트의 경화시간을 나타낸 그래프이고, 도 2f 및 도 2g는 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 상이한 영역을 EDS 분석한 것이다.
도 3a는 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 XRD 분석 그래프이고, 도 3b는 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 FTIR 분석 그래프이다.
도 4는 시간에 따른 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 pH 변화를 나타낸 것이다.
도 5a는 시간에 따른 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 압축 강도를 나타낸 것이고, 도 5b는 시간에 따른 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 탄경계수의 변화를 나타낸 것이다.
도 6a 내지 도 6f는 시간에 따른 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 기공형성 변화를 나타낸 것이다(화살표는 다공성 영역을 표시).
도 7a 및 도 7b는 14일 후 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 인회석 형성을 확인한 SEM이미지이고, 도 7c는 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 아파타이트를 측정한 XRD 분석 그래프이다.
도 8a는 시간에 따른 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트에서 세포의 생존율을 분석한 것이고, 도 8b는 도 8a PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트 내의 세포핵을 관찰한 것이고, 도 8c 및 도 8d는 7일 후 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 세포 부착성을 확인한 것이다.
이하, 본 발명에 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 일 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 우선, 도면들 중, 동일한 구성요소 또는 부품들은 가능한 동일한 참조 부호를 나타내고 있음에 유의하여야 한다. 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명은 본 발명의 요지를 모호하지 않게 하기 위하여 생략한다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 약, 실질적으로 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용 오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명에서 사용되는 용어 “PMMA-MMA 5% HP”, “PMMA-MMA 10% HP”, “PMMA-MMA 15% HP”는 PMMA-MMA 계 골시멘트에 포함된 히알루론산의 함량을 의미한다.
도 1은 종래의 PMMA-MMA 골시멘트와 본 발명의 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트를 예시적으로 비교한 것이다.
본 발명의 주입형 폴리 메틸 메타크릴레이트계 골시멘트는 폴리 메틸 메타크릴레이트-메틸 메타크릴레이트(Polymethyl methacrylat-methyl methacrylate, PMMA-MMA) 페이스트 및 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜(Hyaluronic acid-polyethylene glycol, HP) 수성 겔(Gel)을 포함한다.
본 발명의 폴리 메틸 메타크릴레이트(PMMA)계 골시멘트는 생체에 주사가능한 점성을 갖으며, 비독성이고, 우수한 생체활성 및 생체적합성을 갖는다.
상기 골시멘트는, 경화 후 압축강도가 18.0 내지 31.0 MPa이고, 탄성계수가 85 내지 153 MPa일 수 있다.
본 발명의 폴리 메틸 메타크릴레이트(PMMA)계 골시멘트는 주사 가능한 채널을 통해 주입될 수 있고 일정 형태로 변형될 수 있다. 일정 시간이 지나면 경화되어 이식 부위의 모양으로 갖춰지고 새로운 뼈 조직의 재생을 도울 수 있다.
상기 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜은 수성 겔로서, PMMA 계 골시멘트에서 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜 수성 겔의 첨가는 골시멘트의 유동성을 증가시켜 주사 가능한 물성으로 변화시킬 수 있다. 또한, 상기 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜은 골시멘트의 압축강도 및 탄성계수를 감소시켜 골시멘트가 경화되었을 때 뼈와 유사한 강성도를 나타낼 수 있도록 한다.
상기 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜 수성 겔은, 경화 후 생분해되어 PMMA 계 골시멘트에서 기공을 형성할 수 있다. 구체적으로, 상기 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜은 중합온도를 낮추어 열에 의한 조직 괴사를 감소시키고(약 63 ℃로부터 약 52 ℃로 감소시킴) 생분해되어 기공을 형성시킴으로써, 뼈 결손 부위에 충진된 골시멘트의 다공성 구조를 유도할 수 있으며, 이를 통해 세포이동 및 세포 영양소의 수송율을 증가시키며 혈관 형성 및 뼈 조직 생성을 촉진할 수 있다.
상기 PMMA 계 골시멘트의 경화시간은 19~25 분일 수 있는 데 MMA와 HP의 비율에 따라 결정될 수 있다. 일예로 MMA의 함량이 감소되면, 경화시간이 짧아지고, MMA의 함량이 증가하면, 경화시간이 길어질 수 있으며, HP 수성 겔의 함량이 증가함에 따라 경화시간이 길어지고, HP 수성 겔의 함량이 감소하면 경화시간이 짧아진다.
상기 골시멘트는, 전체 골시멘트 조성물 100 중량% 대비 5 내지 10 중량%의 히알루론산을 포함할 수 있다.
본 발명의 PMMA 계 골시멘트는 5중량%의 HP가 포함될 경우 건조하고 응집력이 떨어지며, 15 중량% HP가 포함될 경우 수성이 강하고 끈적거리는 문제점이 있다. 따라서, 상기 PMMA 계 골시멘트는 10 중량%의 HP를 포함할 때 생체 적합한 경화시간 및 경도를 갖을 수 있다.
상기 HP의 함량이 10 중량%(w/w) 일 때 골시멘트의 높은 기공형성으로 인한 다공성 구조로 세포 이동과 더불어 세포 영양소의 수송이 원활하게 이루어져 내부 흡수성이 향상되어 골 재생을 촉진할 수 있다.
상기 HP의 함량이 10 중량%(w/w) 일 때 골시멘트의 세포증식과 세포부착성이 가장 높게 증가하여 우수한 생체적합성을 나타낼 수 있다.
본 발명은 다른 실시예에 따라 주입형 폴리 메틸 메타크릴레이트계 골시멘트의 제조방법을 제공한다.
상기 주입형 폴리 메틸 메타크릴레이트계 골시멘트의 제조방법은 (a) 폴리 메틸 메타크릴레이트-메틸 메타크릴레이트(PMMA-MMA) 페이스트를 제조하는 단계, (b) 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜(HP) 수성 겔을 제조하는 단계, 그리고 (c) 상기 수성 겔과 PMMA-MMA 페이스트를 혼합하는 단계 를 포함한다.
상기 (a) 단계는, PMMA 분말과 MMA 용액을 제조하고, 1:0.5 고액비(g:ml)로 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 PMMA 분말은, PMMA 50 중량%, 벤조일 퍼옥사이드(Benzoyl peroxide) 1 중량%, 이산화지르코늄(Zirconium dioxide) 34 중량% 및 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 15 중량%를 혼합하여 제조되며, 상기 MMA 용액은, 하이드로퀴논(hydroquinone)을 포함하는 MMA 97.6 중량% 및 N,N-디메틸-p-톨루이딘(N, N-dimethyl-p-toluidine) 2.4중량%를 혼합하여 제조된다.
상기 (b) 단계는, 히알루론산과 폴리에틸렌 글리콜을 각각 탈이온수에 혼합하여 히알루론산 용액과 폴리에틸렌 글리콜 용액을 제조하는 과정 및 상기 히알루론산 용액과 폴리에틸렌 글리콜 용액을 혼합하는 과정을 포함할 수 있다.
상기 히알루론산 용액 내에 히알루론산의 함량은 5~10 중량%일 수 있다.
이하, 구체적인 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
제조예 1: 히알루론산-에틸렌 글리콜 수성 겔의 제조
먼저, 0.5%(w/v) 히알루론산(Bioland Co. Ltd., Korea)을 탈이온수에 용해시켜 5 중량%, 10 중량% 및 15 중량%의 히알루론산 용액을 각각 제조하였다.
다음으로, 10%(w/w) 폴리에틸렌 글리콜(Sigma Aldrich, USA)을 탈이온수에 용해시켜 폴리에틸렌 글리콜 용액을 제조하였다.
다음으로, 제조된 히알루론산 용액을 각각 폴리에틸렌 글리콜 용액과 혼합하고, 10 시간 동안 교반하여 3 종(5% HP, 10% HP, 15% HP)의 히알루론산-폴리에티콜 글리콜(HP) 수성 겔을 제조하였다.
제조예 2: PMMA-MMA 페이스트의 제조
먼저, 50 중량%의 PMMA, 1 중량%의 벤조일 퍼옥사이드, 34 중량%의 이산화지르코늄(ZrO2) 및 15 중량%의 하이드록시아파타이트(HAp)를 막자사발에 투입하고, 균일하게 혼합하여 PMMA 분말(고체상)을 제조하였다.
다음으로, 20 ppm 농도의 하이드로퀴논을 갖는 97.6 중량%의 MMA에 2.4 중량%의 N,N-디메틸-p-톨루이딘을 참가하여 MMA 용액(액상)을 제조하였다.
마지막으로, 상기 PMMA 분말을 MMA 용액에 1:0.50(g:ml) 고액비로 첨가하고, 약수저로 1 분 동안 혼합하여 균질한 PMMA-MMA 시멘트 페이스트를 제조하였다.
실시예 1 내지 3
제조예 1의 5% HP, 10% HP 및 15% HP 수성 겔과 제조예 2의 PMMA-MMA 페이스트를 혼합하여 PMMA-MMA 5% HP(실시예 1), PMMA-MMA 10% HP(실시예 2) 및 PMMA-MMA 15% HP(실시예 3) 골시멘트를 각각 제조하였다.
비교예
제조예 1의 PMMA-MMA 페이스트를 준비하였다.
실험예 1: 골시멘트의 SEM 및 EDS 분석
실시예 1 내지 3 및 비교예에 따라 제조된 골시멘트의 표면 및 성분을 측정하여 비교하였다.
도 2a 내지 도 2d는 PMMA-MMA 골시멘트, PMMA-MMA 5% HP 골시멘트, PMMA-MMA 10% HP 골시멘트 및 PMMA-MMA 15% HP 골시멘트의 단면 SEM 이미지를 나타낸 것이고, 도 2e는 각 골시멘트의 경화시간을 나타낸 그래프이고, 도 2f 및 도 2g는 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 상이한 영역을 EDS 분석한 것이다. 또한, 도 2a의 흰색 화살표는 PMMA-MMA 골시멘트의 매트릭스를 나타내고 검은색 화살표는 충진제인 이산화지르코늄(ZrO2)과 하이드록시아파타이트(HAp)를 나타낸 것이다. 도 2b 내지 도 2d의 황색 화살표는 PMMA-MMA 골시멘트 상에 포함된 HP 수성 겔을 나타낸 것이다. 중합체가 PMMA-MMA 매트릭스에 완벽히 혼합하여 경화된 이미지
도 2a에서는 PMMA-MMA 골시멘트 상에 ZrO2 및 HAp 고체입자가 고루 분포되어 있는 것을 확인할 수 있다. 또한, PMMA-MMA 15% HP 골시멘트의 경우 수성이 강하고 끈적끈적한 반면, PMMA-MMA 5% HP의 경우 건조하고 응집력이 없었다.
또한, 도 2e에서는 PMMA-MMA, PMMA-MMA 5% HP, PMMA-MMA 10% HP 및 PMMA-MMA 15% HP 골시멘트의 경화시간을 확인할 수 있으며, 각각의 경화시간은 19±3, 14±2, 22±3 및 31±4 분을 나타냈다. 이는 MMA 액상 및 수성 겔 상의 비율이 골시멘트의 경도에 상당한 영향을 미친 결과로, MMA 액상이 감소되면 경화시간이 빨라지지만 수성 겔 상의 증가에 따라 골시멘트의 경화는 지연되었다.
결과적으로, 물리적 외관 및 경화시간을 기준으로 10%(w/w) HP 수성 겔을 포함하는 PMMA-MMA 골시멘트(PMMA-MMA 10% HP)가 주사 가능한 점도의 골시멘트로서 가장 적합함을 확인할 수 있다.
실험예 2:PMMA-MMA 10% HP 시멘트의 상 분석
PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 XRD 패턴을 분석하여 비교하였다.
도 3a는 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 XRD 분석 그래프를 나타낸 것이다.
골시멘트의 상 조성 분석은 Cu Kα 방사선을 이용하는 X-선 회절(XRD, D/MAX-250, 일본, 리가쿠)을 이용하여 측정하였다. XRD는 30kV의 가속 전압 및 15mA의 전류에서 수행되었다. 10o 내지 55o 범위의 2θ 값에 대한 회절 빔 강도는 2o θ/분의 속도로 기록되었으며, PDXL 소프트웨어를 이용하는 PAN-ICSD 데이터 카드를 사용하여 상을 확인하였다.
도 3a를 참조하면, PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 XRD 패턴에서 경화 후 ZrO2와 HAp의 혼합물에서 XRD 회절 피크가 관찰되었고 상대적으로 낮은 함량의 HAp에서는 작은 회절 피크가 나타났다. 이처럼 XRD 패턴은 넓은 범위의 피크 없이 특징적인 피크를 나타냈는데, 이는 PMMA 표본에서 사슬 방향뿐만 아니라 무기 충전제의 구조가 동시에 유지되었음을 보여주며 혼합된 결정질 및 비정질 성질이 함께 존재한다는 것을 시사한다.
실험예 3:PMMA-MMA 10% HP 시멘트의 화학적 조성 분석
PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 화적적 조성을 분석하여 비교하였다.
도 3b는 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 FTIR 분석 그래프이다.
골시멘트의 화학적 조성은 푸리에(Fourier) 변환 적외선 분광법(FT-IR, C1000 열 사이클러)을 이용하여 분석되었다. 샘플의 적외선 스펙트럼은 600-4,000 cm-1의 파장 범위에서 측정되었다.
도 3b를 참조하면, PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 진동 밴드가 수성 겔 상에 존재한다는 것을 확인할 수 있다. 즉, PMMA-MMA 골시멘트에 히알루론산 및 폴리에틸렌 글리콜이 존재한다는 것을 알 수 있으며, PMMA-MMA 골시멘트에 존재하는 모든 진동 밴드가 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트에 나타나는데 이는 수성 겔 상이 진동 밴드의 작용기를 이용하여 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트에서 피크의 세기를 증가시킨 결과이다. 그 결과 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트는 1,500-1,000 cm-1 범위에서 PMMA-MMA 골시멘트보다 더 좁고 강한 피크가 나타났다.
또한, 폴리에틸렌 글리콜의 특징적인 O-H기의 피크는 3,541 cm-1에서 나타났고, 1450-1292 cm-1에서 C-H 신축 진동에 의한 날카로운 피크가 관찰되었다. 더불어, 히알루론산의 특징적인 C-O-C기 피크는 1,080 cm-1에서 나타났으며, C=O기 피크는 각각 대칭 및 비대칭으로 1,405 cm-1 및 1,606 cm-1에서 스트레칭되었다.
결과적으로, 히알루론산 및 폴리에틸렌 글리콜의 작용기의 대부분은 PMMA-MMA 골시멘트와 중복되지만 피크 세기와 선명도에서 확연한 차이로 HP 수성 겔 중합체가 PMMA-MMA 골시멘트에 완전히 분포되어 존재함을 확인하였다.
실험예 4: PMMA-MMA 10% HP 시멘트의 생체 내 안정성 평가
PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 생체 내 안정성을 평가하기 위하여 pH 변화를 측정하였다.
도 4는 시간에 따른 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 pH 변화를 나타낸 것이다.
인공 체액(SBF) 용액은 코쿠보(Kokubo) 등의 프로토콜에 따라 제조되었다. 37 ℃에서 10mL SBF에 각 샘플을 침지시켜 재충전하여 시험관내 침지 시험을 수행하였다. 소기의 기간 이후, 샘플을 탈이온수로 세척하고 공기 건조시킨 후 사용하였다. 상기 SBF 용액은 시멘트의 pH 변화 측정을 비롯하여 기계적 특성 평가, 기공변화 평가 및 인회석 광물화 평가에 사용되었다.
측정방법은 높이가 2 mm이고 직경이 6 mm인 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트를 37℃의 SBF 용액에 침지시켜 시간에 따른 pH 변화를 관찰하였다. 3주 동안 특정 시간 간격으로, 용액의 pH 값을 SBF 용액의 교체없이 pH 측정기(Thermo Scientific, Korea)를 사용하여 측정하였다.
도 4를 참조하면, PMMA-MMA 골시멘트의 침지 용액과 비교하였을 때 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트는 초기에 히알루론산을 배출하여 pH 값이 소폭 감소하였으며, 시간이 증가됨에 따라 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트 모두 pH 값이 약간 감소되었으나, 10일 후에 pH는 안정화되었으며 인체 적용에 적합한 범위였다.
즉, PMMA-MMA 골시멘트에 HP 수성 겔을 첨가하여도 pH 값에 영향을 미치지 않는다.
실험예 5: PMMA-MMA 10% HP 시멘트의 기계적 특성 분석
PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 기계적 특성을 분석하여 비교하였다.
도 5a는 시간에 따른 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 압축 강도를 나타낸 것이고, 도 5b는 시간에 따른 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 탄경계수의 변화를 나타낸 것이다.
기계적 특성 분석은 범용 시험기(R & B UNITECH-T)를 사용하여 수행하였으며, 크로스헤드의 속도를 0.5 mm/분으로 하여 압축강도 및 탄성계수(E)를 측정하였다. 기계적 특성 분석은 SBF 용액에서의 침지 후 건조 과정 없이 즉시 측정하였다.
도 5를 참조하면, PMMA-MMA 골시멘트의 압축강도는 7일, 14일 및 28일에서 각각 40±1.41, 32±¡¾1.41 및 29.5±¡¾2.12 MPa로 측정되었으며, PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 압축강도는 각각 29±1.41, 22.50±0.70 및 18.5±0.70 Mpa로 측정되었다. 또한, PMMA-MMA 골시멘트의 탄성계수는 7일, 14일 및 28일에서 각각 206.66±7.63, 158.33±12.58 및 124±5.29 MPa로 측정되었으며, PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 탄성계수는 각각 139±13.52, 121±10.06 및 100±15 Mpa로 측정되었다.
이러한 결과에서 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트가 낮은 압축강도와 낮은 탄성계수를 보여 뼈 이식재료로서의 적용에 매우 적합한 기계적 특성을 가진다는 것을 확인하였다.
실험예 6: PMMA-MMA 10% HP 시멘트의 다공성 구조 평가
PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 기공형성을 확인하기 위하여 7일, 14일 및 28일 동안 SBF 침지하고 주사전자현미경을 이용하여 이미지를 촬영하였다.
도 6a 내지 도 6f는 시간에 따른 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 기공형성 변화를 나타낸 것이다(화살표는 다공성 영역을 표시).
도 6을 참조하면, 7일, 14일 및 28일째 PMMA-MMA 골시멘트의 SEM 이미지(도 6a 내지 도6c)에서는 미세 구조의 변화가 나타나지 않았으나, PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 SEM 이미지(도 6d 내지 도6f)에서는 표면에 기공이 형성되어 있는 것을 확인할 수 있다. 이러한 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 다공성 구조의 형성은 세포의 여과를 증진시켜 이동성을 향상시키고, 세포 영양소의 수송을 원활히 하여 뼈 조직의 재생을 촉진시킨다.
실험예 7: PMMA-MMA 10% HP 시멘트의 인회석 광물화 평가
MMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 인회석 형성 능력을 분석하여 비교하였다.
도 7a 및 도 7b는 14일 후 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 인회석 형성을 확인한 SEM이미지이고, 도 7c는 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 아파타이트를 측정한 XRD 분석 그래프이다.
인회석 형성 평가는 MMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트 SBF 용액에 14일 동안 침지시킨 후 꺼내어 탈이온수로 부드럽게 헹군 다음, 37 ℃에서 24 시간 동안 진공 건조시켰다. 침지 용액은 시간 간격을 두고 계속 바꿔주었다. 시료는 Cu Kα 방사선을 이용하는 X-선 회절법을 이용하여 측정하였다. 10°내지 55°범위의 2θ 값에 대한 회절 빔 강도는 2°θ/분의 속도로 기록하고, PDXL 소프트웨어를 이용하는 PAN-ICSD 데이터 카드를 사용하여 상을 확인하였다. 또한, 골시멘트의 인회석 표면은 SEM 이미지로 시각화하였다.
도 7을 참조하면, PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트에서 미네랄 인회석이 형성된 SEM 이미지를 확인할 수 있다. PMMA-MMA 10% HP의 경우, 수성 겔이 존재하여 광물화 구조가 완벽한 형태로 나타나지는 않았지만 골시멘트로의 적용을 위한 인회석의 형성에는 영향을 미치지 않았다.
PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트 모두 초기 단계와 비교하여 유사하게 인회석이 형성된 XRD 패턴에서 ZrO2와 HAp와 같은 무기물 충전제가 시멘트에 균질하게 분포되어 인회석을 형성하는 것에 기여하였음을 확인하였다(도 7c).
따라서, PMMA-MMA 10% HP 골시멘트는 광물화 능력에서 적합한 구조체의 골시멘트를 형성할 수 있고, PMMA-MMA 골시멘트와 비교하여 다른 생체 내 특성에서 우수한 조건으로 골시멘트로 이용할 수 있음을 시사한다.
실험예 8: PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 생체적합성 평가
PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 세포생존력 및 세포부착성을 분석하여 비교하였다.
도 8a는 시간에 따른 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트에서 세포의 생존율을 분석한 것이고, 도 8b는 도 8a PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트 내의 세포핵을 관찰한 것이다.
PMMA-MMA 10% HP 시멘트의 세포생존력 및 세포부착성을 확인하기 위해, 마우스 유래의 전조골세포(Preosteoblast) MC3T3E1를 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 보충된 최소 필수 배지 알파에서 배양 후 인큐베이터(37 ℃, 5% CO2)에서 유지시켰다. PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 시멘트를 UV에 조사하여 멸균하고 세포 접종 전 최종적으로 멸균 PBS 용액으로 세척하였다. 대략 1x104 세포/ml를 시멘트 위에 접종하였다.
8-1. 세포생존력 평가
24-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 100 mL의 MTT 용액 (PBS 중 5 mg/mL)을 첨가함으로써 스캐폴드 상의 1 및 7일 동안의 세포생존성(OD value)을 정량화하였다. 용액의 OD 값을 595 nm의 파장에서 ELISA 판독기 (EL, 312, Biokinetics 판독기; Bio-Tek 인스투루먼트)에 의해 측정하고, 세포핵을 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 염색한 후 공초점 현미경(Olympus FV 10i)에서 스캐폴드를 유리 슬라이드에 설치하고 FV10i-ASW 3.0 Viewer를 이용하여 시각화하였다.
도 8a에서는 세포가 두 시멘트 모두에서 7일동안 지속적으로 증식하는 한편, PMMA-MMA 10% HP 골시멘트에서는 보다 개선된 성장 및 증식을 확인할 수 있다.
도 8b에서는 PMMA-MMA 골시멘트에 비해 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 세포핵 증가가 우수한 것을 확인할 수 있다.
8-2. 세포부착성 평가
PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 시멘트에서 세포 배양 후, 세포를 2% 글루타르알데히드(DaeJung Co., 서울, 한국)에 고정시키고 에탄올(50%, 70%, 90% 및 100%)로 연쇄적으로 탈수시켰다. 탈수된 세포를 헥사메틸디실라잔(Deajung M. Korea) 중에서 건조시켰으며, 부착된 세포의 형태학적 특성을 SEM 이미지를 이용해 관찰하였다.
도 8c 및 도 8d는 7일 후 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 세포 부착성을 확인한 것이다.
PMMA-MMA 골시멘트와 비교했을 때 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트에서 보다 효과적으로 부착되었음을 관찰할 수 있다. 이는 히알루론산으로 인해 세포 부착 및 증식이 증가되었음을 나타내며 또한, 세포와 골시멘트 사이에 강한 상호작용을 보여주었다. 골시멘트가 세포의 일부분을 감싸기도 했는데, 이는 세포와 골시멘트 물질 사이의 상호작용이 개선되었다는 점을 시사한다.
결과적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 PMMA-MMA 계 골시멘트는 히알루론산-폴리에티콜 글리콜을 함유함으로써 주사가 가능한 것은 물론, 기계적 및 물리적 특성이 우수하고, 생체에 적합한 것을 확인할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 약, 실질적으로 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용 오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.
본 발명에서 사용되는 용어 “PMMA-MMA 5% HP”, “PMMA-MMA 10% HP”, “PMMA-MMA 15% HP”는 PMMA-MMA 계 골시멘트에 포함된 히알루론산의 함량을 의미한다.
도 1은 종래의 PMMA-MMA 골시멘트와 본 발명의 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트를 예시적으로 비교한 것이다.
본 발명의 주입형 폴리 메틸 메타크릴레이트계 골시멘트는 폴리 메틸 메타크릴레이트-메틸 메타크릴레이트(Polymethyl methacrylat-methyl methacrylate, PMMA-MMA) 페이스트 및 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜(Hyaluronic acid-polyethylene glycol, HP) 수성 겔(Gel)을 포함한다.
본 발명의 폴리 메틸 메타크릴레이트(PMMA)계 골시멘트는 생체에 주사가능한 점성을 갖으며, 비독성이고, 우수한 생체활성 및 생체적합성을 갖는다.
상기 골시멘트는, 경화 후 압축강도가 18.0 내지 31.0 MPa이고, 탄성계수가 85 내지 153 MPa일 수 있다.
본 발명의 폴리 메틸 메타크릴레이트(PMMA)계 골시멘트는 주사 가능한 채널을 통해 주입될 수 있고 일정 형태로 변형될 수 있다. 일정 시간이 지나면 경화되어 이식 부위의 모양으로 갖춰지고 새로운 뼈 조직의 재생을 도울 수 있다.
상기 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜은 수성 겔로서, PMMA 계 골시멘트에서 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜 수성 겔의 첨가는 골시멘트의 유동성을 증가시켜 주사 가능한 물성으로 변화시킬 수 있다. 또한, 상기 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜은 골시멘트의 압축강도 및 탄성계수를 감소시켜 골시멘트가 경화되었을 때 뼈와 유사한 강성도를 나타낼 수 있도록 한다.
상기 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜 수성 겔은, 경화 후 생분해되어 PMMA 계 골시멘트에서 기공을 형성할 수 있다. 구체적으로, 상기 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜은 중합온도를 낮추어 열에 의한 조직 괴사를 감소시키고(약 63 ℃로부터 약 52 ℃로 감소시킴) 생분해되어 기공을 형성시킴으로써, 뼈 결손 부위에 충진된 골시멘트의 다공성 구조를 유도할 수 있으며, 이를 통해 세포이동 및 세포 영양소의 수송율을 증가시키며 혈관 형성 및 뼈 조직 생성을 촉진할 수 있다.
상기 PMMA 계 골시멘트의 경화시간은 19~25 분일 수 있는 데 MMA와 HP의 비율에 따라 결정될 수 있다. 일예로 MMA의 함량이 감소되면, 경화시간이 짧아지고, MMA의 함량이 증가하면, 경화시간이 길어질 수 있으며, HP 수성 겔의 함량이 증가함에 따라 경화시간이 길어지고, HP 수성 겔의 함량이 감소하면 경화시간이 짧아진다.
상기 골시멘트는, 전체 골시멘트 조성물 100 중량% 대비 5 내지 10 중량%의 히알루론산을 포함할 수 있다.
본 발명의 PMMA 계 골시멘트는 5중량%의 HP가 포함될 경우 건조하고 응집력이 떨어지며, 15 중량% HP가 포함될 경우 수성이 강하고 끈적거리는 문제점이 있다. 따라서, 상기 PMMA 계 골시멘트는 10 중량%의 HP를 포함할 때 생체 적합한 경화시간 및 경도를 갖을 수 있다.
상기 HP의 함량이 10 중량%(w/w) 일 때 골시멘트의 높은 기공형성으로 인한 다공성 구조로 세포 이동과 더불어 세포 영양소의 수송이 원활하게 이루어져 내부 흡수성이 향상되어 골 재생을 촉진할 수 있다.
상기 HP의 함량이 10 중량%(w/w) 일 때 골시멘트의 세포증식과 세포부착성이 가장 높게 증가하여 우수한 생체적합성을 나타낼 수 있다.
본 발명은 다른 실시예에 따라 주입형 폴리 메틸 메타크릴레이트계 골시멘트의 제조방법을 제공한다.
상기 주입형 폴리 메틸 메타크릴레이트계 골시멘트의 제조방법은 (a) 폴리 메틸 메타크릴레이트-메틸 메타크릴레이트(PMMA-MMA) 페이스트를 제조하는 단계, (b) 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜(HP) 수성 겔을 제조하는 단계, 그리고 (c) 상기 수성 겔과 PMMA-MMA 페이스트를 혼합하는 단계 를 포함한다.
상기 (a) 단계는, PMMA 분말과 MMA 용액을 제조하고, 1:0.5 고액비(g:ml)로 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 PMMA 분말은, PMMA 50 중량%, 벤조일 퍼옥사이드(Benzoyl peroxide) 1 중량%, 이산화지르코늄(Zirconium dioxide) 34 중량% 및 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 15 중량%를 혼합하여 제조되며, 상기 MMA 용액은, 하이드로퀴논(hydroquinone)을 포함하는 MMA 97.6 중량% 및 N,N-디메틸-p-톨루이딘(N, N-dimethyl-p-toluidine) 2.4중량%를 혼합하여 제조된다.
상기 (b) 단계는, 히알루론산과 폴리에틸렌 글리콜을 각각 탈이온수에 혼합하여 히알루론산 용액과 폴리에틸렌 글리콜 용액을 제조하는 과정 및 상기 히알루론산 용액과 폴리에틸렌 글리콜 용액을 혼합하는 과정을 포함할 수 있다.
상기 히알루론산 용액 내에 히알루론산의 함량은 5~10 중량%일 수 있다.
이하, 구체적인 실시예 및 실험예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
제조예 1: 히알루론산-에틸렌 글리콜 수성 겔의 제조
먼저, 0.5%(w/v) 히알루론산(Bioland Co. Ltd., Korea)을 탈이온수에 용해시켜 5 중량%, 10 중량% 및 15 중량%의 히알루론산 용액을 각각 제조하였다.
다음으로, 10%(w/w) 폴리에틸렌 글리콜(Sigma Aldrich, USA)을 탈이온수에 용해시켜 폴리에틸렌 글리콜 용액을 제조하였다.
다음으로, 제조된 히알루론산 용액을 각각 폴리에틸렌 글리콜 용액과 혼합하고, 10 시간 동안 교반하여 3 종(5% HP, 10% HP, 15% HP)의 히알루론산-폴리에티콜 글리콜(HP) 수성 겔을 제조하였다.
제조예 2: PMMA-MMA 페이스트의 제조
먼저, 50 중량%의 PMMA, 1 중량%의 벤조일 퍼옥사이드, 34 중량%의 이산화지르코늄(ZrO2) 및 15 중량%의 하이드록시아파타이트(HAp)를 막자사발에 투입하고, 균일하게 혼합하여 PMMA 분말(고체상)을 제조하였다.
다음으로, 20 ppm 농도의 하이드로퀴논을 갖는 97.6 중량%의 MMA에 2.4 중량%의 N,N-디메틸-p-톨루이딘을 참가하여 MMA 용액(액상)을 제조하였다.
마지막으로, 상기 PMMA 분말을 MMA 용액에 1:0.50(g:ml) 고액비로 첨가하고, 약수저로 1 분 동안 혼합하여 균질한 PMMA-MMA 시멘트 페이스트를 제조하였다.
실시예 1 내지 3
제조예 1의 5% HP, 10% HP 및 15% HP 수성 겔과 제조예 2의 PMMA-MMA 페이스트를 혼합하여 PMMA-MMA 5% HP(실시예 1), PMMA-MMA 10% HP(실시예 2) 및 PMMA-MMA 15% HP(실시예 3) 골시멘트를 각각 제조하였다.
비교예
제조예 1의 PMMA-MMA 페이스트를 준비하였다.
실험예 1: 골시멘트의 SEM 및 EDS 분석
실시예 1 내지 3 및 비교예에 따라 제조된 골시멘트의 표면 및 성분을 측정하여 비교하였다.
도 2a 내지 도 2d는 PMMA-MMA 골시멘트, PMMA-MMA 5% HP 골시멘트, PMMA-MMA 10% HP 골시멘트 및 PMMA-MMA 15% HP 골시멘트의 단면 SEM 이미지를 나타낸 것이고, 도 2e는 각 골시멘트의 경화시간을 나타낸 그래프이고, 도 2f 및 도 2g는 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 상이한 영역을 EDS 분석한 것이다. 또한, 도 2a의 흰색 화살표는 PMMA-MMA 골시멘트의 매트릭스를 나타내고 검은색 화살표는 충진제인 이산화지르코늄(ZrO2)과 하이드록시아파타이트(HAp)를 나타낸 것이다. 도 2b 내지 도 2d의 황색 화살표는 PMMA-MMA 골시멘트 상에 포함된 HP 수성 겔을 나타낸 것이다. 중합체가 PMMA-MMA 매트릭스에 완벽히 혼합하여 경화된 이미지
도 2a에서는 PMMA-MMA 골시멘트 상에 ZrO2 및 HAp 고체입자가 고루 분포되어 있는 것을 확인할 수 있다. 또한, PMMA-MMA 15% HP 골시멘트의 경우 수성이 강하고 끈적끈적한 반면, PMMA-MMA 5% HP의 경우 건조하고 응집력이 없었다.
또한, 도 2e에서는 PMMA-MMA, PMMA-MMA 5% HP, PMMA-MMA 10% HP 및 PMMA-MMA 15% HP 골시멘트의 경화시간을 확인할 수 있으며, 각각의 경화시간은 19±3, 14±2, 22±3 및 31±4 분을 나타냈다. 이는 MMA 액상 및 수성 겔 상의 비율이 골시멘트의 경도에 상당한 영향을 미친 결과로, MMA 액상이 감소되면 경화시간이 빨라지지만 수성 겔 상의 증가에 따라 골시멘트의 경화는 지연되었다.
결과적으로, 물리적 외관 및 경화시간을 기준으로 10%(w/w) HP 수성 겔을 포함하는 PMMA-MMA 골시멘트(PMMA-MMA 10% HP)가 주사 가능한 점도의 골시멘트로서 가장 적합함을 확인할 수 있다.
실험예 2:PMMA-MMA 10% HP 시멘트의 상 분석
PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 XRD 패턴을 분석하여 비교하였다.
도 3a는 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 XRD 분석 그래프를 나타낸 것이다.
골시멘트의 상 조성 분석은 Cu Kα 방사선을 이용하는 X-선 회절(XRD, D/MAX-250, 일본, 리가쿠)을 이용하여 측정하였다. XRD는 30kV의 가속 전압 및 15mA의 전류에서 수행되었다. 10o 내지 55o 범위의 2θ 값에 대한 회절 빔 강도는 2o θ/분의 속도로 기록되었으며, PDXL 소프트웨어를 이용하는 PAN-ICSD 데이터 카드를 사용하여 상을 확인하였다.
도 3a를 참조하면, PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 XRD 패턴에서 경화 후 ZrO2와 HAp의 혼합물에서 XRD 회절 피크가 관찰되었고 상대적으로 낮은 함량의 HAp에서는 작은 회절 피크가 나타났다. 이처럼 XRD 패턴은 넓은 범위의 피크 없이 특징적인 피크를 나타냈는데, 이는 PMMA 표본에서 사슬 방향뿐만 아니라 무기 충전제의 구조가 동시에 유지되었음을 보여주며 혼합된 결정질 및 비정질 성질이 함께 존재한다는 것을 시사한다.
실험예 3:PMMA-MMA 10% HP 시멘트의 화학적 조성 분석
PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 화적적 조성을 분석하여 비교하였다.
도 3b는 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 FTIR 분석 그래프이다.
골시멘트의 화학적 조성은 푸리에(Fourier) 변환 적외선 분광법(FT-IR, C1000 열 사이클러)을 이용하여 분석되었다. 샘플의 적외선 스펙트럼은 600-4,000 cm-1의 파장 범위에서 측정되었다.
도 3b를 참조하면, PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 진동 밴드가 수성 겔 상에 존재한다는 것을 확인할 수 있다. 즉, PMMA-MMA 골시멘트에 히알루론산 및 폴리에틸렌 글리콜이 존재한다는 것을 알 수 있으며, PMMA-MMA 골시멘트에 존재하는 모든 진동 밴드가 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트에 나타나는데 이는 수성 겔 상이 진동 밴드의 작용기를 이용하여 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트에서 피크의 세기를 증가시킨 결과이다. 그 결과 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트는 1,500-1,000 cm-1 범위에서 PMMA-MMA 골시멘트보다 더 좁고 강한 피크가 나타났다.
또한, 폴리에틸렌 글리콜의 특징적인 O-H기의 피크는 3,541 cm-1에서 나타났고, 1450-1292 cm-1에서 C-H 신축 진동에 의한 날카로운 피크가 관찰되었다. 더불어, 히알루론산의 특징적인 C-O-C기 피크는 1,080 cm-1에서 나타났으며, C=O기 피크는 각각 대칭 및 비대칭으로 1,405 cm-1 및 1,606 cm-1에서 스트레칭되었다.
결과적으로, 히알루론산 및 폴리에틸렌 글리콜의 작용기의 대부분은 PMMA-MMA 골시멘트와 중복되지만 피크 세기와 선명도에서 확연한 차이로 HP 수성 겔 중합체가 PMMA-MMA 골시멘트에 완전히 분포되어 존재함을 확인하였다.
실험예 4: PMMA-MMA 10% HP 시멘트의 생체 내 안정성 평가
PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 생체 내 안정성을 평가하기 위하여 pH 변화를 측정하였다.
도 4는 시간에 따른 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 pH 변화를 나타낸 것이다.
인공 체액(SBF) 용액은 코쿠보(Kokubo) 등의 프로토콜에 따라 제조되었다. 37 ℃에서 10mL SBF에 각 샘플을 침지시켜 재충전하여 시험관내 침지 시험을 수행하였다. 소기의 기간 이후, 샘플을 탈이온수로 세척하고 공기 건조시킨 후 사용하였다. 상기 SBF 용액은 시멘트의 pH 변화 측정을 비롯하여 기계적 특성 평가, 기공변화 평가 및 인회석 광물화 평가에 사용되었다.
측정방법은 높이가 2 mm이고 직경이 6 mm인 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트를 37℃의 SBF 용액에 침지시켜 시간에 따른 pH 변화를 관찰하였다. 3주 동안 특정 시간 간격으로, 용액의 pH 값을 SBF 용액의 교체없이 pH 측정기(Thermo Scientific, Korea)를 사용하여 측정하였다.
도 4를 참조하면, PMMA-MMA 골시멘트의 침지 용액과 비교하였을 때 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트는 초기에 히알루론산을 배출하여 pH 값이 소폭 감소하였으며, 시간이 증가됨에 따라 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트 모두 pH 값이 약간 감소되었으나, 10일 후에 pH는 안정화되었으며 인체 적용에 적합한 범위였다.
즉, PMMA-MMA 골시멘트에 HP 수성 겔을 첨가하여도 pH 값에 영향을 미치지 않는다.
실험예 5: PMMA-MMA 10% HP 시멘트의 기계적 특성 분석
PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 기계적 특성을 분석하여 비교하였다.
도 5a는 시간에 따른 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 압축 강도를 나타낸 것이고, 도 5b는 시간에 따른 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 탄경계수의 변화를 나타낸 것이다.
기계적 특성 분석은 범용 시험기(R & B UNITECH-T)를 사용하여 수행하였으며, 크로스헤드의 속도를 0.5 mm/분으로 하여 압축강도 및 탄성계수(E)를 측정하였다. 기계적 특성 분석은 SBF 용액에서의 침지 후 건조 과정 없이 즉시 측정하였다.
도 5를 참조하면, PMMA-MMA 골시멘트의 압축강도는 7일, 14일 및 28일에서 각각 40±1.41, 32±¡¾1.41 및 29.5±¡¾2.12 MPa로 측정되었으며, PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 압축강도는 각각 29±1.41, 22.50±0.70 및 18.5±0.70 Mpa로 측정되었다. 또한, PMMA-MMA 골시멘트의 탄성계수는 7일, 14일 및 28일에서 각각 206.66±7.63, 158.33±12.58 및 124±5.29 MPa로 측정되었으며, PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 탄성계수는 각각 139±13.52, 121±10.06 및 100±15 Mpa로 측정되었다.
이러한 결과에서 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트가 낮은 압축강도와 낮은 탄성계수를 보여 뼈 이식재료로서의 적용에 매우 적합한 기계적 특성을 가진다는 것을 확인하였다.
실험예 6: PMMA-MMA 10% HP 시멘트의 다공성 구조 평가
PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 기공형성을 확인하기 위하여 7일, 14일 및 28일 동안 SBF 침지하고 주사전자현미경을 이용하여 이미지를 촬영하였다.
도 6a 내지 도 6f는 시간에 따른 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 기공형성 변화를 나타낸 것이다(화살표는 다공성 영역을 표시).
도 6을 참조하면, 7일, 14일 및 28일째 PMMA-MMA 골시멘트의 SEM 이미지(도 6a 내지 도6c)에서는 미세 구조의 변화가 나타나지 않았으나, PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 SEM 이미지(도 6d 내지 도6f)에서는 표면에 기공이 형성되어 있는 것을 확인할 수 있다. 이러한 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 다공성 구조의 형성은 세포의 여과를 증진시켜 이동성을 향상시키고, 세포 영양소의 수송을 원활히 하여 뼈 조직의 재생을 촉진시킨다.
실험예 7: PMMA-MMA 10% HP 시멘트의 인회석 광물화 평가
MMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 인회석 형성 능력을 분석하여 비교하였다.
도 7a 및 도 7b는 14일 후 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 인회석 형성을 확인한 SEM이미지이고, 도 7c는 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 아파타이트를 측정한 XRD 분석 그래프이다.
인회석 형성 평가는 MMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트 SBF 용액에 14일 동안 침지시킨 후 꺼내어 탈이온수로 부드럽게 헹군 다음, 37 ℃에서 24 시간 동안 진공 건조시켰다. 침지 용액은 시간 간격을 두고 계속 바꿔주었다. 시료는 Cu Kα 방사선을 이용하는 X-선 회절법을 이용하여 측정하였다. 10°내지 55°범위의 2θ 값에 대한 회절 빔 강도는 2°θ/분의 속도로 기록하고, PDXL 소프트웨어를 이용하는 PAN-ICSD 데이터 카드를 사용하여 상을 확인하였다. 또한, 골시멘트의 인회석 표면은 SEM 이미지로 시각화하였다.
도 7을 참조하면, PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트에서 미네랄 인회석이 형성된 SEM 이미지를 확인할 수 있다. PMMA-MMA 10% HP의 경우, 수성 겔이 존재하여 광물화 구조가 완벽한 형태로 나타나지는 않았지만 골시멘트로의 적용을 위한 인회석의 형성에는 영향을 미치지 않았다.
PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트 모두 초기 단계와 비교하여 유사하게 인회석이 형성된 XRD 패턴에서 ZrO2와 HAp와 같은 무기물 충전제가 시멘트에 균질하게 분포되어 인회석을 형성하는 것에 기여하였음을 확인하였다(도 7c).
따라서, PMMA-MMA 10% HP 골시멘트는 광물화 능력에서 적합한 구조체의 골시멘트를 형성할 수 있고, PMMA-MMA 골시멘트와 비교하여 다른 생체 내 특성에서 우수한 조건으로 골시멘트로 이용할 수 있음을 시사한다.
실험예 8: PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 생체적합성 평가
PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 세포생존력 및 세포부착성을 분석하여 비교하였다.
도 8a는 시간에 따른 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트에서 세포의 생존율을 분석한 것이고, 도 8b는 도 8a PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트 내의 세포핵을 관찰한 것이다.
PMMA-MMA 10% HP 시멘트의 세포생존력 및 세포부착성을 확인하기 위해, 마우스 유래의 전조골세포(Preosteoblast) MC3T3E1를 10% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)이 보충된 최소 필수 배지 알파에서 배양 후 인큐베이터(37 ℃, 5% CO2)에서 유지시켰다. PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 시멘트를 UV에 조사하여 멸균하고 세포 접종 전 최종적으로 멸균 PBS 용액으로 세척하였다. 대략 1x104 세포/ml를 시멘트 위에 접종하였다.
8-1. 세포생존력 평가
24-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 100 mL의 MTT 용액 (PBS 중 5 mg/mL)을 첨가함으로써 스캐폴드 상의 1 및 7일 동안의 세포생존성(OD value)을 정량화하였다. 용액의 OD 값을 595 nm의 파장에서 ELISA 판독기 (EL, 312, Biokinetics 판독기; Bio-Tek 인스투루먼트)에 의해 측정하고, 세포핵을 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)로 염색한 후 공초점 현미경(Olympus FV 10i)에서 스캐폴드를 유리 슬라이드에 설치하고 FV10i-ASW 3.0 Viewer를 이용하여 시각화하였다.
도 8a에서는 세포가 두 시멘트 모두에서 7일동안 지속적으로 증식하는 한편, PMMA-MMA 10% HP 골시멘트에서는 보다 개선된 성장 및 증식을 확인할 수 있다.
도 8b에서는 PMMA-MMA 골시멘트에 비해 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 세포핵 증가가 우수한 것을 확인할 수 있다.
8-2. 세포부착성 평가
PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 시멘트에서 세포 배양 후, 세포를 2% 글루타르알데히드(DaeJung Co., 서울, 한국)에 고정시키고 에탄올(50%, 70%, 90% 및 100%)로 연쇄적으로 탈수시켰다. 탈수된 세포를 헥사메틸디실라잔(Deajung M. Korea) 중에서 건조시켰으며, 부착된 세포의 형태학적 특성을 SEM 이미지를 이용해 관찰하였다.
도 8c 및 도 8d는 7일 후 PMMA-MMA 및 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트의 세포 부착성을 확인한 것이다.
PMMA-MMA 골시멘트와 비교했을 때 PMMA-MMA 10% HP 골시멘트에서 보다 효과적으로 부착되었음을 관찰할 수 있다. 이는 히알루론산으로 인해 세포 부착 및 증식이 증가되었음을 나타내며 또한, 세포와 골시멘트 사이에 강한 상호작용을 보여주었다. 골시멘트가 세포의 일부분을 감싸기도 했는데, 이는 세포와 골시멘트 물질 사이의 상호작용이 개선되었다는 점을 시사한다.
결과적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 PMMA-MMA 계 골시멘트는 히알루론산-폴리에티콜 글리콜을 함유함으로써 주사가 가능한 것은 물론, 기계적 및 물리적 특성이 우수하고, 생체에 적합한 것을 확인할 수 있다.
Claims (10)
- 폴리 메틸 메타크릴레이트-메틸 메타크릴레이트(Polymethyl methacrylate- methyl methacrylate) 페이스트 및 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜(Hyaluronic acid-polyethylene glycol) 수성 겔을 포함하고,
상기 히알루론산은 0.5%(w/v)이며,
상기 폴리에틸렌 글리콜은 10%(w/w)이며,
상기 히알루론산은 전체 골시멘트 조성물 100 중량% 대비 5 내지 10 중량%인 것을 특징으로 하는, 주입형 폴리 메틸 메타크릴레이트계 골시멘트. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 골시멘트의 경화시간은 19~25 분인 것을 특징으로 하는, 주입형 폴리 메틸 메타크릴레이트계 골시멘트. - 제1항에 있어서,
상기 골시멘트는,
경화 후 압축강도가 18.0 내지 31.0 MPa이고,
탄성계수가 85 내지 153 MPa인 것을 특징으로 하는, 주입형 폴리 메틸 메타크릴레이트계 골시멘트. - 제1항에 있어서,
상기 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜 수성 겔은,
경화 후 생분해되어 기공을 형성하는 것을 특징으로 하는, 주입형 폴리 메틸 메타크릴레이트계 골시멘트. - (a) 폴리 메틸 메타크릴레이트-메틸 메타크릴레이트(PMMA-MMA) 페이스트를 제조하는 단계,
(b) 0.5%(w/v)의 히알루론산과 10%(w/w)의 폴리에틸렌 글리콜을 각각 탈이온수에 혼합하여 상기 히알루론산의 함량이 5~10 중량%인 히알루론산 용액과 폴리에틸렌 글리콜 용액을 제조 후 혼합하여 히알루론산-폴리에틸렌 글리콜(HP) 수성 겔을 제조하는 단계, 그리고
(c) 상기 수성 겔과 PMMA-MMA 페이스트를 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 주입형 폴리 메틸 메타크릴레이트계 골시멘트의 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 (a) 단계는,
PMMA 분말과 MMA 용액을 제조하고, 1:0.5 고액비(g:ml)로 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 주입형 폴리 메틸 메타크릴레이트계 골시멘트의 제조방법. - 제6항에 있어서,
상기 PMMA 분말은,
PMMA 50 중량%, 벤조일 퍼옥사이드(Benzoyl peroxide) 1 중량%, 이산화지르코늄(Zirconium dioxide) 34 중량% 및 하이드록시아파타이트(hydroxyapatite) 15 중량%를 혼합하여 제조되며,
상기 MMA 용액은,
하이드로퀴논(hydroquinone)을 포함하는 MMA 97.6 중량% 및 N,N-디메틸-p-톨루이딘(N, N-dimethyl-p-toluidine) 2.4중량%를 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 하는, 주입형 폴리 메틸 메타크릴레이트계 골시멘트의 제조방법. - 삭제
- 삭제
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