KR102608892B1 - 종양 진단 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
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Abstract
종양 진단 및 치료용 약학적 조성물을 개시한다. 상기 종양 진단 및 치료용 약학적 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함한다.
<화학식 1>
상기 화학식 1에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13은 각각 명세서에 개시된 바와 같다.
<화학식 1>
상기 화학식 1에서, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10, R11, R12, R13은 각각 명세서에 개시된 바와 같다.
Description
종양 진단 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
암은 21세기에 전 세계적으로 사망의 주원인이며 기대수명을 연장하는데 가장 큰 장벽으로 여겨지고 있다.
최근 진단과 광선치료가 결합된 기술로서 포토테라노틱스(phototheranostics)법이 주목받고 있다. 포토테라노틱스법은 치료가 필요한 영역의 실시간 모니터링을 통해 암치료에 대한 높은 선택성과 정확성을 갖고 있다. 포토테라노틱스제(Phototheranostics agents)는 광활성화 하에 진단 이미지와 광치료 효과를 동시에 제공할 수 있다. 진단 이미지는 비침습성, 높은 선택성, 및 최소화된 자동 형광을 갖는 침투 깊이가 깊은 근적외선(near-infrared) 형광 이미지를 통해 얻을 수 있다. 광치료는 광역학적 치료(Photodynamic therapy, PDT) 등을 포함하여 비침습성, 최소 침습, 보편적인 적용가능성, 및 적은 부작용 등을 나타내고 있다. 광역학적 치료는 광조사 하에 광감광제(PS)가 활성화되고, 여기된 광감각제는 산소분자와 상호작용하여 세포독성의 반응성 산소종(ROS)을 생성하며, 생체분자를 산화시켜 암세포를 사멸시킬 수 있다.
따라서 진단 외에 이러한 광역학적 치료(Photodynamic therapy, PDT)를 동시에 구현할 수 있으며 근적외선 형광 프로브이며 높은 생체적합성과 우수한 이미지 유도의 종양 표적화 능력을 갖는 종양 진단 및 치료용 약학적 조성물에 대한 요구가 있다.
J. Phys. Chem. C 2019, 123, 22793-22811
일 측면은 근적외선 형광 프로브이며 높은 생체적합성과 우수한 이미지 유도의 종양 표적화 능력을 갖는 종양 진단 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
일 측면에 따라,
하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 종양 진단 및 치료용 약학적 조성물이 제공된다:
<화학식 1>
식 중,
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R8, R9, R10, R11, R12, R13은 서로 독립적으로 수소, 중수소, 또는 치환 또는 비치환된 C1-C30 알킬기이며,
R7은 치환 또는 비치환된 C6-C30 아릴기이다.
상기 R1, R3, R4, R6, R8, R10, R11, R13은 서로 동일한 치환기를 가질 수 있다.
상기 R1, R3, R4, R6, R8, R10, R11, R13은 비치환된 C1-C10 알킬기일 수 있다.
상기 R7은 비치환된 C6-C20 아릴기일 수 있다.
상기 화합물은 화학식 2 및 화학식 3으로 표시되는 화합물 중 1종 이상을 포함할 수 있다:
<화학식 2>
<화학식 3>
상기 화합물은 페녹사진 유닛을 중심축으로 하여 보론-디피로메텐 유닛이 90°±1°로 트위스트된(highly twisted) 구조일 수 있다.
상기 화합물은 고분자 매트릭스에서 캡슐화된 나노 구조체일 수 있다.
상기 고분자 매트릭스는 1, 2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[비오티닐(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethylene glycol)-2000])를 포함할 수 있다.
상기 나노 구조체의 평균직경은 40 nm ~ 200 nm일 수 있다.
상기 화합물은 응집 유도 발광(aggregation-induced emission; AIE) 특성을 나타내는 염료일 수 있다.
상기 화합물은 암세포를 표적으로 하는 근적외선 형광 프로브일 수 있다.
상기 화합물은 600 nm ~ 620 nm 파장영역에서 발광피크를 나타낼 수 있다.
상기 조성물은 암의 광역학적 치료에 사용될 수 있다.
상기 조성물은 수용액, 유기용액, 또는 이들 혼합용액에서 단일항 산소(singlet oxygen)를 발생할 수 있다.
상기 암은 유방암, 신장암, 고환암, 전립선암, 난소암, 자궁암, 자궁 경부암, 질암, 난관암, 직장암, 폐암, 위암, 간암, 식도암, 소장암, 췌장암, 구강암, 흑색종, 또는 육종으로부터 선택될 수 있다.
일 측면에 따른 약학적 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함한다. 상기 화합물은 단일항-삼중항 에너지갭(singlet-triplet energy gap)이 낮으면서 입체장애를 갖는 신규한 구조의 화합물이다. 이러한 화합물을 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물은 근적외선 형광 프로브이며 높은 생체적합성과 우수한 이미지 유도의 종양 표적화 능력을 갖는다. 상기 약학적 조성물은 종양 진단 및 치료 용도로 사용되며 암의 광역학적 치료 용도에 사용된다.
도 1은 합성예 1에 의해 제조된 BDP-8 화합물의 입체구조를 나타낸 개략도이다.
도 2a는 비교되는 BDP-5 화합물의 ISC(intersystem crossing) 메커니즘을 나타낸 개략도이다.
도 2b는 합성예 1 및 합성예 2에 의해 제조된 BDP-8 화합물 및 BDP-9 화합물의 ISC(intersystem crossing) 메커니즘을 나타낸 개략도이다.
도 3은 제조예 1 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 및 BDP-9 나노입자의 형성과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자에 대한 입경 분포도 및 SEM 사진이다.
도 5a 및 도 5b는 각각 THF/물 혼합용매로 희석한 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액(10 μM) 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-9 나노입자 함유 샘플액(10 μM)에 대한 형광 발광 스펙트럼이다.
도 5c는 물로 희석한 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액(10 μM) 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-9 나노입자 함유 샘플액(10 μM)에 대한 형광 발광 스펙트럼이다.
도 6a는 클로로포름으로 희석한 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액(10 μM), 제조예 2에 의해 제조된 BDP-9 나노입자 함유 샘플액(10 μM), 및 샘플액, 대조군 광감응제 BDP-I2, 및 1O2 프로브로 1, 3-디페닐이소벤조퓨란(1, 3-diphenylisobenzofuran; DPBF)에 대하여 500 W 할로겐 램프(100 mW/cm2)를 조사한 후에 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼이다.
도 6b는 물로 희석한 제조예 1에 의해 제조된 나노입자 샘플액(10 μM), 제조예 2에 의해 제조된 BDP-9 나노입자 함유 샘플액(10 μM), 및 ROS 인디케이터(indicator)로 2,7-디클로로플루오레신 디아세테이트(dichlorofluorescin diacetate; DCFH-DA)에 대하여 녹색광(20 mW/cm2)을 조사한 후에 형광 발광 스펙트럼이다.
도 7a는 종양세포(4T1 세포) 및 정상(normal) 섬유아세포(fibroblast)(L929 세포)를 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액(20μM)에 노출시키고 0분에서 120분 동안 배양한 경우에 In vitro 형광 현미경 이미지이다.
도 7b는 종양세포(4T1 세포)를 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액(5μM)과 1시간 동안 배양하고, 10μM의 2,7-디클로로플루오레신 디아세테이트(dichlorofluorescin diacetate; DCFH-DA)를 30 분 동안 처리한 경우에 In vitro 형광 현미경 이미지(상단), 및 종양세포(4T1 세포)를 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액(5μM)으로 1시간 동안 처리한 후 녹색 LED(20 mW/cm2)를 20분 동안 조사하고 세포를 3μM의 칼 세인으로 이중염색한 경우에 In vitro 형광 현미경 이미지(하단)이다(AM: 살아있는 세포 마커, 프로피듐 요오드화물(PI): 죽은 세포마커).
도 8은 종양세포(4T1 세포)를 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액(0~80 μM)에 노출시키고 1 시간 동안 배양한 후 녹색 LED(20 mW/cm2)를 20분 동안 조사하여 MTT 분석한 세포 생존율 결과이다.
도 9는 100 ㎕의 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액(300 μM) 또는 생리 식염수를 마우스에 각각 정맥주사하고 72시간 후에 마우스의 In vivo 형광 이미지이다.
도 10은 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액으로 처리한 실험군(300 μM) 및 생리 식염수로 처리한 대조군에 대하여 각각 녹색 LED(20 mW/cm2, 20 분)로 조사하고 3주 후에 종양 섹션(section)의 H&E 염색 및 TUNEL 분석 결과이다.
도 2a는 비교되는 BDP-5 화합물의 ISC(intersystem crossing) 메커니즘을 나타낸 개략도이다.
도 2b는 합성예 1 및 합성예 2에 의해 제조된 BDP-8 화합물 및 BDP-9 화합물의 ISC(intersystem crossing) 메커니즘을 나타낸 개략도이다.
도 3은 제조예 1 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 및 BDP-9 나노입자의 형성과정을 나타낸 모식도이다.
도 4는 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자에 대한 입경 분포도 및 SEM 사진이다.
도 5a 및 도 5b는 각각 THF/물 혼합용매로 희석한 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액(10 μM) 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-9 나노입자 함유 샘플액(10 μM)에 대한 형광 발광 스펙트럼이다.
도 5c는 물로 희석한 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액(10 μM) 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-9 나노입자 함유 샘플액(10 μM)에 대한 형광 발광 스펙트럼이다.
도 6a는 클로로포름으로 희석한 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액(10 μM), 제조예 2에 의해 제조된 BDP-9 나노입자 함유 샘플액(10 μM), 및 샘플액, 대조군 광감응제 BDP-I2, 및 1O2 프로브로 1, 3-디페닐이소벤조퓨란(1, 3-diphenylisobenzofuran; DPBF)에 대하여 500 W 할로겐 램프(100 mW/cm2)를 조사한 후에 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼이다.
도 6b는 물로 희석한 제조예 1에 의해 제조된 나노입자 샘플액(10 μM), 제조예 2에 의해 제조된 BDP-9 나노입자 함유 샘플액(10 μM), 및 ROS 인디케이터(indicator)로 2,7-디클로로플루오레신 디아세테이트(dichlorofluorescin diacetate; DCFH-DA)에 대하여 녹색광(20 mW/cm2)을 조사한 후에 형광 발광 스펙트럼이다.
도 7a는 종양세포(4T1 세포) 및 정상(normal) 섬유아세포(fibroblast)(L929 세포)를 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액(20μM)에 노출시키고 0분에서 120분 동안 배양한 경우에 In vitro 형광 현미경 이미지이다.
도 7b는 종양세포(4T1 세포)를 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액(5μM)과 1시간 동안 배양하고, 10μM의 2,7-디클로로플루오레신 디아세테이트(dichlorofluorescin diacetate; DCFH-DA)를 30 분 동안 처리한 경우에 In vitro 형광 현미경 이미지(상단), 및 종양세포(4T1 세포)를 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액(5μM)으로 1시간 동안 처리한 후 녹색 LED(20 mW/cm2)를 20분 동안 조사하고 세포를 3μM의 칼 세인으로 이중염색한 경우에 In vitro 형광 현미경 이미지(하단)이다(AM: 살아있는 세포 마커, 프로피듐 요오드화물(PI): 죽은 세포마커).
도 8은 종양세포(4T1 세포)를 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액(0~80 μM)에 노출시키고 1 시간 동안 배양한 후 녹색 LED(20 mW/cm2)를 20분 동안 조사하여 MTT 분석한 세포 생존율 결과이다.
도 9는 100 ㎕의 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액(300 μM) 또는 생리 식염수를 마우스에 각각 정맥주사하고 72시간 후에 마우스의 In vivo 형광 이미지이다.
도 10은 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액으로 처리한 실험군(300 μM) 및 생리 식염수로 처리한 대조군에 대하여 각각 녹색 LED(20 mW/cm2, 20 분)로 조사하고 3주 후에 종양 섹션(section)의 H&E 염색 및 TUNEL 분석 결과이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명의 일 구현예에 따른 종양 진단 및 치료용 약학적 조성물에 관하여 상세히 설명하기로 한다. 이하는, 예시로서 제시되는 것으로서 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술할 특허청구범위의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 명세서에서 "포함"이라는 용어는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 추가 및/또는 개재할 수 있음을 나타내도록 사용된다.
본 명세서에서 "이들의 조합"이라는 용어는 기재된 구성요소들 하나 이상과의 혼합 또는 조합되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "및/또는"이라는 용어는 관련 기재된 하나 이상의 항목들의 임의의 조합 및 모든 조합을 포함하는 것을 의미한다. 본 명세서에서 "또는"이라는 용어는 "및/또는"을 의미한다. 본 명세서에서 구성요소들의 앞에 "적어도 1종", 또는 "하나 이상"이라는 표현은 전체 구성요소들의 목록을 수식할 수 있고 상기 기재의 개별 구성요소들을 수식할 수 있는 것을 의미하지 않는다.
본 명세서에서 "약학적으로 허용가능한 염"은 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 1 등으로 표시되는 화합물의 이로운 효능을 떨어뜨리지 않는 화학식 1 등으로 표시되는 화합물의 어떠한 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 이들 염은 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 질산, 황산, 과염소산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산, 옥살산, (D) 또는 (L) 말산, 말레산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 4-톨루엔술폰산, 살리실산, 시트르산, 벤조산 또는 말론산 등을 사용할 수 있다. 또한, 이들 염은 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염 등) 등을 포함한다. 예를 들어, 산부가염으로는 아세테이트, 아스파테이트, 벤즈에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포메이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루큐로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 바이벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로요오디드/요오디드, 이세티오네이트, 락테이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 2-나프실레이트, 니코티네이트, 나이트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/수소 포스페이트/이수소 포스페이트, 사카레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리플루오로아세테이트, 알루미늄, 알기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글라이신, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 올아민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, 아연염 등이 포함될 수 있으며, 이들 중 하이드로클로라이드 또는 트리플루오로아세테이트일 수 있다.
일 구현예에 따른 종양 진단 및 치료용 약학적 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함할 수 있다:
<화학식 1>
식 중,
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R8, R9, R10, R11, R12, R13은 서로 독립적으로 수소, 중수소, 또는 치환 또는 비치환된 C1-C30 알킬기일 수 있으며,
R7은 치환 또는 비치환된 C6-C30 아릴기일 수 있다.
예를 들어, R1, R3, R4, R6, R8, R10, R11, R13은 서로 동일한 치환기를 가질 수 있다. 예를 들어, 상기 R1, R3, R4, R6, R8, R10, R11, R13은 비치환된 C1-C10 알킬기일 수 있다.
예를 들어, 상기 R7은 비치환된 C6-C20 아릴기일 수 있다.
예를 들어, 하기 화합물은 화학식 2 및 화학식 3으로 표시되는 화합물 중 1종 이상을 포함할 수 있다:
<화학식 2>
<화학식 3>
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 중원소, 예를 들어, 중 할로겐원소 (heavy halogen atoms)를 도입하지 않은 구조이다. 이렇게 중원소를 도입하지 않은 화학식 1로 표시되는 화합물은 독성, 비분해, 및 비용 문제를 극복할 수 있어 높은 생체 적합성을 갖고 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 페녹사진 유닛을 중심으로 하여 보론-디피로메텐 유닛이 2개 결합되어 있는 입체구조이다. 보다 구체적으로, 상기 화합물은 페녹사진 유닛을 중심축으로 하여 보론-디피로메텐 유닛이 90°±1°로 트위스트된(highly twisted) 구조이다.
도 1은 합성예 1에 의해 제조된 BDP-8 화합물의 입체구조를 나타낸 개략도이다. 도 1을 참조하면, 합성예 1에 의해 제조된 BDP-8 화합물은 페녹사진 유닛을 중심축으로 하여 보론-디피로메텐 유닛이 89°로 트위스트된 구조이며 아울러 페녹사진 유닛의 N과 연결된 나프탈렌기가 88.6°로 트위스트된 구조이다. 도면에 도시하지 않았지만, 합성예 2에 의해 제조된 BDP-9 화합물은 페녹사진 유닛을 중심축으로 하여 보론-디피로메텐 유닛이 90°로 트위스트된 구조이며 아울러 페녹사진 유닛의 N과 연결된 페닐기도 90°로 트위스트된 구조이다. 이렇게 트위스트된 입체구조를 갖는 화합물은 단일항-삼중항 에너지갭(singlet-triplet energy gap)을 낮추기에 원하는 근적외선 파장 영역에서 효율적인 S1/S2-T3/T4 상태간 교차 프로세스(intersystem crossing; ISC)를 갖게 한다.
도 2a는 비교되는 BDP-5 화합물의 ISC(intersystem crossing) 메커니즘을 나타낸 개략도이다. 도 2b는 합성예 1 및 합성예 2에 의해 제조된 BDP-8 화합물 및 BDP-9 화합물의 ISC(intersystem crossing) 메커니즘을 나타낸 개략도이다.
도 2a를 참조하면, 비교되는 BDP-5 화합물은 SOCT-ISC(spin-orbit charge transfer-ISC) 속도상수(ISC rate constant)가 RP-ISC(radical pair-ISC) 속도상수와 비교하여 크기 때문에 El-Sayed rule에 따라 SOCT-ISC 메커니즘을 따른다. 도 2b를 참조하면, 합성예 1 및 합성예 2에 의해 제조된 BDP-8 화합물 및 BDP-9 화합물은 S1/S2-T3/T4 상태로 인해서 매우 작은 ISC 갖게 되기에 RP-ISC 메커니즘을 따른다. 이로 인해, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 우수한 단일항 산소(1O2) 발생능을 가질 수 있으며 우수한 이미지 유도의 종양 표적화 능력을 가질 수 있다.
상기 화합물은 고분자 매트릭스에서 캡슐화된 나노 구조체일 수 있다. 예를 들어, 상기 고분자 매트릭스는 1, 2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[비오티닐(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethylene glycol)-2000]; DSPE-PEG-biotin)를 포함할 수 있다.
도 3은 제조예 1 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 및 BDP-9 나노입자의 형성과정을 나타낸 모식도이다.
도 3을 참조하면, DSPE-PEG-biotin 고분자는 친수성과 소수성을 모두 갖는 양쪽성 고분자 구조이다. BDP-8 화합물 및 BDP-9 화합물은 소수성을 갖는다. 이러한 DSPE-PEG-biotin 고분자와 BDP-8 화합물 또는 BDP-9 화합물을 THF와 H2O 혼합용매에서 혼합하여 24시간 이상 방치할 경우에 DSPE-PEG-biotin 고분자의 소수성 부분이 BDP-8 화합물 또는 BDP-9 화합물을 감싸게 되어 고분자 매트릭스에서 캡슐화된 나노구조체인 나노입자를 형성한다. 상기 나노입자는 구형 또는 구형에 가까운 형상을 갖는다.
상기 나노 구조체의 평균직경은 40 nm ~ 200 nm일 수 있다. 상기 평균직경은 D50을 의미하며, 입자크기가 가장 작은 입자부터 가장 큰 입자순서로 누적시킨 분포 곡선에서, 전체 입자개수를 100%로 했을 때 가장 작은입자로부터 50%에 해당되는 입경의 값을 의미한다. 평균직경(D50)은 당업자에게 널리 공지된 방법으로 측정될 수 있으며, 예를 들어, 입도 분석기(Particle size analyzer)로 측정하거나, 또는 TEM 사진 또는 SEM 사진으로부터 측정할 수도 있다. 다른 방법으로는, 동적광산란법(dynamic Light-scattering)을 이용한 측정장치를 이용하여 측정하고, 데이터 분석을 실시하여 각각의 입자 사이즈 범위에 대하여 입자수를 카운팅한 후, 이로부터 계산을 통하여 평균직경(D50)값을 쉽게 얻을 수 있다. 예를 들어, 상기 나노 구조체의 평균직경은 40 nm ~ 150 nm일 수 있거나, 40 nm ~ 120 nm일 수 있거나, 또는 60 nm ~ 120 nm일 수 있다.
상기 화합물은 응집 유도 발광(aggregation-induced emission; AIE) 특성을 나타내는 염료일 수 있다.
상기 화합물은 암세포를 표적으로 하는 근적외선 형광 프로브일 수 있다.
상기 화합물은 600 nm ~ 620 nm 파장영역에서 발광피크를 나타낼 수 있다.
상기 약학적 조성물은 용매, 버퍼 용액 또는 이들의 혼합물에 전술한 화합물을 첨가하고, 여기에 산, 및/또는 염기를 첨가하여 준비될 수 있다. 또한 상기 약학적 조성물은 당해 기술분야에서 사용할 수 있는 다른 첨가제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물이 포함하는 용매, 산, 염기, 및 버퍼 용액의 함량은 요구되는 성능에 따라 적절히 조절될 수 있다. 또는 상기 약학적 조성물은 시료(sample)와 혼합될 수 있다. 상기 시료는 미생물(microorganism), 세포(cell), 및 조직(tissue) 중에서 선택된 하나 이상을 포함하는 생물학적 시료일 수 있으나, 반드시 이들로 한정되지 않으며 당해 기술분야에서 생물학적 시료로 사용할 수 있는 것이라면 모두 가능하다.
상기 조성물은 암의 광역학적 치료에 사용될 수 있다.
상기 조성물은 수용액, 유기용액, 또는 이들 혼합용액에서 단일항 산소(singlet oxygen)를 발생할 수 있다.
상기 암은 유방암, 신장암, 고환암, 전립선암, 난소암, 자궁암, 자궁 경부암, 질암, 난관암, 직장암, 폐암, 위암, 간암, 식도암, 소장암, 췌장암, 구강암, 흑색종, 또는 육종으로부터 선택될 수 있다.
다른 일 구현예에 따른 광역학 치료방법은 전술한 약학적 조성물을 인간 제외 포유류의 대상체와 접촉시키는 단계; 상기 약학적 조성물이 목표 세포 내에 분포되기 위한 시간을 허용하는 단계; 및 상기 대상체의 목표 세포 부위에 광을 조사하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 광역학 치료방법은 시공간 선택성, 비침습성, 및 부작용의 감소와 같은 잇점을 나타낼 수 있다.
본 명세서에서, 치환기는 치환되지 않는 모그룹(mother group)에서 하나 이상의 수소가 다른 원자나 작용기를 교환됨에 의하여 유도된다. 다르게 기재하지 않으면, 어떠한 작용기가 "치환된"것으로 여겨질 때, 그것은 상기 작용기가 탄소수 1 내지 40의 알킬기, 탄소수 2 내지 40의 알케닐기, 탄소수 2 내지 40의 알키닐기, 탄소수 3 내지 40의 시클로알킬기, 탄소수 3 내지 40의 시클로알케닐기, 탄소수 7 내지 40의 아릴기에서 선택된 하나 이상의 치환기로 치환됨을 의미한다. 작용기가 "선택적으로 치환된다"고 기재되는 경우에, 상기 작용기가 상술한 치환기로 치환될 수 있다는 것을 의미한다.
본 명세서에서, "탄소수 a 내지 b"의 a 및 b는 특정 작용기(group)의 탄소수를 의미한다. 즉, 상기 작용기는 a 부터 b까지의 탄소원자를 포함할 수 있다. 예를 들어, "탄소수 1 내지 4의 알킬렌기"는 1 내지 4의 탄소를 가지는 알킬렌기, 즉, -CH2-, -CH2CH2-, -CH2CH2CH2-, -(CH3)2C-, -CH2CH2CH2CH2-, -CH2CH2CH(CH3)- and -(CH3)2C-를 의미한다.
본 명세서에서, 본 명세서에서, "알킬"이라는 용어는 분지된 또는 분지되지 않은 지방족 탄화수소를 의미한다. 일 구현예에서 알킬기는 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 알킬기는 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, tert-부틸기, 펜틸기, 헥실기, 시클로프로필기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기, 시클로헵틸기 등을 포함하나 반드시 이들로 한정되지 않으며, 이들 각각은 선택적으로 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 일 구현예에서 알킬기는 1 내지 6의 탄소원자를 가질 수 있다. 예를 들어, 탄소수 1 내지 6의 알킬기는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소-부틸, sec-부틸, 펜틸, 3-펜틸, 헥실 등일 수 있으나 반드시 이들로 한정되지 않는다.
본 명세서에서, "알케닐"이라는 용어는 적어도 하나의 탄소-탄소 이중결합을 갖는 분지형 또는 비분지형 탄화수소를 의미한다. 알케닐기의 비제한적인 예로는 비닐, 알릴, 부테닐, 이소프로페닐, 또는 이소부테닐 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, "알키닐"이라는 용어는 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중결합을 갖는 분지형 또는 비분지형 탄화수소를 말한다. 알키닐기의 비제한적인 예로는 에티닐, 부티닐, 이소부티닐, 이소프로피닐 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, "시클로알킬"이라는 용어는 1가 포화 탄화수소 모노시클릭을 의미한다. 시클로알킬기의 비제한적인 예로는 시클로프로필기, 시클로부틸기, 시클로펜틸기, 시클로헥실기, 시클로헵틸기 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, "시클로알케닐"이라는 용어는 1가 모노시클릭으로서, 고리 내에 적어도 하나의 이중 결합을 가지거나, 방향족성(aromaticity)을 갖지 않는 것을 의미한다. 시클로알케닐기의 비제한적인 예로는 시클로펜테닐기, 시클로헥세닐기, 시클로헵테닐기 등을 들 수 있다.
본 명세서에서, "아릴"이라는 용어는 고리 골격이 오직 탄소만을 포함하는 방향족 고리, 고리 시스템(즉, 2개의 인접하는 탄소 원자들을 공유하는 2 이상의 융합된(fused) 고리), 또는 복수의 방향족 고리가 단일결합, -O-, -S-, -C(=O)-, -S(=O)2-, -Si(Ra)(Rb)-(Ra 및 Rb는 서로 독립적으로 탄소수 1 내지 10의 알킬기), 할로겐으로 치환 또는 비치환된 탄소수 1 내지 10의 알킬렌기, 또는 -C(=O)-NH-에 의하여 서로 연결된 고리를 의미한다. 아릴기가 고리 시스템이면, 상기 시스템에서 각각의 고리는 방향족이다. 예를 들어, 아릴기는 페닐기, 비페닐기, 나프틸기, 페날트레닐기(phenanthrenyl), 나프타세닐기(naphthacenyl) 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 상기 아릴기는 치환되거나 치환되지 않을 수 있다.
본 명세서에서, "헤테로아릴"이라는 용어는 N, O, P 또는 S 중에서 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 포함하고, 나머지 고리원자가 탄소인 모노시클릭(monocyclic) 또는 바이시클릭(bicyclic) 유기 화합물을 의미한다. 상기 헤테로아릴기는 예를 들어 1-5개의 헤테로원자를 포함할 수 있고, 5-10 고리 멤버(ring member)를 포함할 수 있다. 상기 S 또는 N은 산화되어 여러가지 산화 상태를 가질 수 있다.
"헤테로아릴"의 비제한적인 예로는, 티에닐, 푸릴, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 티아졸릴, 이소티아졸릴, 1,2,3-옥사디아졸릴, 1,2,4-옥사디아졸릴, 1,2,5-옥사디아졸릴, 1,3,4-옥사디아졸릴기, 1,2,3-티아디아졸릴, 1,2,4-티아디아졸릴, 1,2,5-티아디아졸릴, 1,3,4-티아디아졸릴, 이소티아졸-3-일, 이소티아졸-4-일, 이소티아졸-5-일, 옥사졸-2-일, 옥사졸-4-일, 옥사졸-5-일, 이소옥사졸-3-일, 이소옥사졸-4-일, 이소옥사졸-5-일, 1,2,4-트리아졸-3-일, 1,2,4-트리아졸-5-일, 1,2,3-트리아졸-4-일, 1,2,3-트리아졸-5-일, 테트라졸릴, 피리드-2-일, 피리드-3-일, 2-피라진-2일, 피라진-4-일, 피라진-5-일, 2- 피리미딘-2-일, 4- 피리미딘-2-일, 또는 5-피리미딘-2-일 등을 들 수 있다.
이하 본 발명의 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 일 실시예일뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
모든 제조 및 분석은 불활성 질소 분위기 하에 수행되었다. 모든 화학약품은 Sigma-Aldrich사 또는 Tokyo Chemical Industry(TCI)사로부터 구입한 후 추가 정제없이 사용하였다. PXZ-Nap, PXZ-Ph, 및 BODIPY-I2는 J. Am. Chem. Soc. 2016, 138 (35), 11399-11407 문헌 및 J. Am. Chem. Soc. 2017, 139 (23), 7831-7842 문헌에 개시된 제조공정에 따라 합성하였다. 중수소화 용매는 Cambridge Isotope Laboratories를 사용하였다. 모든 1H-NMR 및 13C-NMR 스펙트럼은 Bruker AM 300 분광기(1H: 300.13 MHz, 13C: 75.48 MHz)로 수행하였다. 동적 광산란(DLS)은 Nano-ZS (Malvern)을 사용하여 측정하였다. SEM 이미지는 JSM-6700F 전계 방출 주사 전자 현미경 (JEOL)을 사용하여 얻었다. Calcein-AM 및 피리듐 아이도다이드(Pyridium iodide; PI)는 Thermo Fisher Scientific사 및 Sigma-Aldrich사로부터 구입하였다. 흡수 및 형광 스펙트럼은 Thermo Scientific Evolution 201 UV-Visible 분광광도계 및 Scinco FS-2 분광형광계로 각각 기록하였다. 형광 이미지는 Olympus Fluoview FV1200 공초점 레이저 스캐닝 현미경(CLSM)으로 수행하였다.
하기 합성예 1, 2에 의해 제조된 화합물 BDP-8 및 BDP-9에 대한 반응스킴 1은 다음과 같다:
<반응스킴 1>
(i) 4-bromo-2,6-dimethylbenzaldehyde, Pd(OAc)2, t-Bu3PHBF4, 및 K2CO3, toluene
(ii) DMF, POCl3
(iii) 2,4-dimethypyrrole, trifluoroacetic acid (TFA), p-chloranil, Et3N, 및 BF3.OEt2, CH2Cl2
합성예 1: BDP-8 화합물
(1) PXZ-Nap 화합물 합성
페녹사진 (0.5 g, 2.73 mmol), 1-브로모나프탈렌 (0.47 g, 2.27 mmol), Pd (OAc)2 (0.03 g, 0.14 mmol), t-Bu3PHBF4 (0.12 g, 0.41 mmol), 및 NaOtBu (0.43 g, 4.47 mmol)을 톨루엔 (15ml)에 용해하고 질소분위기 하에 24 시간 동안 환류시켰다. 그리고나서, 조(crude) 생성물을 DCM (20 ml x 3)으로 추출하였다. 유기층을 합쳐 무수 MgSO4로 건조하고 용매를 감압하에 증발시켰다. 생성된 화합물을 용리액으로 디클로로메탄/헥산 (1:20, v/v)을 사용하는 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 PXZ-Nap, 백색결정 (0.43 g, 50.93 %)을 얻었다.
(2) PXZ-Nap-CHO 화합물 합성
상기 (1) PXZ-Nap (0.47 g, 1.52mmol) 및 건조 DMF (1.45mL, 18.06mmol)를 얼음 수조에서 건조 1,2-디클로로에탄 (10mL)에 첨가하였다. 10 ℃ 이하의 용액에 POCl3 (9.17 mL, 0.10 mol)을 천천히 첨가하여 반응시켰다. 반응 혼합물을 실온에서 교반하고 90 ℃에서 24 시간 동안 가열 환류시켰다. 그리고나서, 조(crude) 용액을 묽은 NaOH (aq)로 ??칭하고 pH 종이를 사용하여 pH 7임을 확인하였다. 유기용액을 DCM (20 ml x 3)으로 추출하고 무수 MgSO4로 건조시킨다음, 용매를 감압하에 증발시켰다. 생성된 화합물을 용리액으로 디클로로메탄을 사용하는 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 정제하여 PXZ-Nap-CHO, 황색결정 (0.27 g, 48.63 %)을 얻었다.
1H NMR (CDCl3): δ 9.68 (s, 2H), 8.06 (dd, J = 14.2, 8.3 Hz, 2H), 7.96 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.71 (dd, J = 8.3, 7.3 Hz, 1H), 7.65 - 7.50 (m, 4H), 7.27 (d, J = 1.8 Hz, 2H), 7.05 (dd, J = 8.3, 1.8 Hz, 2H), 5.83 (d, J = 8.2 Hz, 2H). 13C NMR (CDCl3): δ 189.8, 144.2, 144.2, 138.4, 135.7, 133.0, 131.8, 130.5, 130.1, 130.1, 129.3, 128.3, 128.2, 128.2, 127.5, 127.0, 122.4, 115.1, 114.0.
(3) BDP-8 화합물 합성
상기 (2) PXZ-Nap-CHO (0.18g, 0.49mmol) 및 2,4-디메틸피롤 (0.2g, 2.10mmol)을 질소분위기 하에 건조 CH2Cl2 (20 ml)에 용해시켜 반응액을 제조하였다. 그리고나서 트리플루오로아세트산 (TFA) 1 방울을 첨가하고 상기 반응액을 실온에서 3 시간 동안 교반하여 반응 혼합물을 수득하였다. p-클로라닐 (0.27 g, 1.10 mmol)을 상기 반응 혼합물에 첨가하고 1 시간 동안 교반하였다. 그리고나서, 트리에틸아민 (TEA) (0.75 mL, 0.545 g, 5.39 mmol)을 첨가하고 30분 후 BF3. OEt2 (0.78 mL, 0.90 g, 6.37 mmol)를 천천히 첨가하였다. 용매를 진공에서 제거하였다. 잔류물을 용리액으로서 에틸아세테이트/헥산 (1:4, v/v)으로 크로마토그래피하여 순수한 BDP-8, 적색결정 (0.12 g, 30.39 %)을 얻었다.
1H NMR (CDCl3): δ 8.09 - 7.94 (m, 3H), 7.76 - 7.42 (m, 4H), 6.61 (d, J = 1.9 Hz, 2H), 6.41 (dd, J = 8.2, 1.9 Hz, 2H), 5.97 (dd, J = 7.6, 1.0 Hz, 4H), 5.87 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 2.53 (s, 12H), 1.75 (s, 6H), 1.65 (s, 6H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 155.5, 146.5, 144.1, 142.9, 140.6, 136.0, 134.3, 134.1, 131.6, 131.5, 129.8, 129.2, 129.2, 128.2, 127.4, 127.0, 126.7, 123.6, 122.7, 115.5, 114.2, 15.1, 14.7. ESI-MS calcd. for C48H42B2F4N5O [M+H]+: 802.3512, found: 802.3515.
합성예 2: BDP-9 화합물
(1) PXZ-Ph 화합물 합성
페녹사진 (0.5 g, 2.73 mmol), 1-브로모벤젠 (0.36 g, 2.29 mmol), Pd(OAc)2 (0.03 g, 0.14 mmol), t-Bu3PHBF4 (0.12g, 0.41mmol), 및 NaOtBu (0.43g, 4.47mmol)을 사용하여 상기 합성예 1 (1) PXZ-Nap 합성과 동일한 절차에 따라 합성하였다. 생성된 화합물을 용리액으로 DCM/헥산 (1:20, v/v)을 사용하는 실리카겔 컬럼크로마토 그래피로 정제하여 PXZ-Ph, 백색결정 (0.45 g, 63.59 %)을 얻었다.
(2) PXZ-Ph-CHO 화합물 합성
상기 (1) PXZ-Ph (0.32 g, 1.23 mmol), 건조 DMF (1.90 mL, 24,60 mmol), 건조 1,2-디클로로에탄 (10 mL), 및 POCl3 (9.17 mL, 0.10 mol)을 사용하여 상기 합성예 1 (2) PXZ-Nap-CHO 합성과 동일한 절차에 따라 합성하여 PXZ-Ph-CHO, 황색결정 (0.09 g, 23.13 %)을 얻었다.
1H NMR (CDCl3): δ 9.70 (s, 2H), 7.73 - 7.66 (m, 2H), 7.63 - 7.57 (m, 1H), 7.39 - 7.33 (m, 2H), 7.21 (d, J = 1.8 Hz, 2H), 7.15 (dd, J = 8.3, 1.8 Hz, 2H), 6.02 (d, J = 8.2 Hz, 2H). 13C NMR (CDCl3): δ 189.7, 144.0, 138.4, 136.8, 131.7, 131.6, 129.8, 127.8, 115.0, 113.6.
(3) BDP-9 화합물 합성
질소분위기 하에 상기 (2) PXZ-ph-CHO (0.20 g, 0.63 mmol) 및 2,4-디메틸피롤 (0.26 g, 2.77 mmol)을 건조 CH2Cl2 (20ml)에 용해시키고 트리플루오로아세트산 (TFA) 한 방울을 첨가하여 상기 합성예 1 (3) BDP-8 합성과 동일한 절차에 따라 합성하였다. 잔류물을 용리액으로 에틸아세테이트/헥산 (1:4, v/v)으로 크로마토그래피하여 순수한 BDP-9, 적색결정 (0.04 g, 8.39 %)을 얻었다.
제조예 1: BDP-8 나노입자
합성예 1에 의해 제조된 BDP-8 화합물 (1.0 mg) 및 1, 2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[비오티닐(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethylene glycol)-2000]; DSPE-PEG(2000) Biotin, 5 mg)을 1 ml 테트라히드로퓨란 (THF)에 용해시켜 유기 혼합물을 수득하였다. 상기 유기 혼합물을 탈 이온수 (DW) 10 ml에 천천히 적가하여 혼합액을 수득하였다. 상기 혼합액을 밤새 교반하였다. 그리고나서, 상기 혼합액을 0.20 ㎛ 일회용 멤브레인을 통해 여과하여 BDP-8 여과액을 수득하였다. 그리고나서, 상기 BDP-8 여과액을 30분동안 원심분리한 다음, 상층액을 제거하였다. 추가사용을 위해 남은 침전물에 200 μL DW를 첨가하여 DSPE-PEG(2000) Biotin 매트릭스에 캡슐화된 BDP-8 나노입자를 얻었다.
제조예 2: BDP-9 나노입자
합성예 2에 의해 제조된 BDP-9 화합물 (1.0 mg)를 사용한 것을 제외하고는, 제조예 1과 동일한 방법을 수행하여 DSPE-PEG(2000) Biotin 매트릭스에 캡슐화된 BDP-9 나노입자를 얻었다.
분석예 1: 동적 광산란 (DLS) 실험 및 SEM 사진
제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자에 대하여 동적 광산란 장치(Nano-ZS, Malvern)를 이용하여 입경을 측정하였고 SEM 이미지 실험(200 kV, JEOL-2100F)을 수행하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4를 참조하면, 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자의 평균입경은 약 70 nm이고 구 형상을 나타냄을 확인할 수 있다.
분석예 2: 자외선-가시광선 흡수 및 형광 스펙트럼
제조예 1 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 및 BDP-9 나노입자에 대하여 형광 발광 스펙트럼 및 자외선 가시광 흡수(UV-vis absorption) 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 5a, 도 5b, 도 5c, 도 6a, 및 도 6b에 각각 나타내었다. 형광 발광 스펙트럼 및 자외선 가시광 흡수(UV-vis absorption) 분석을 위해, 실온에서 저장액(1.0 mM)으로부터 THF/물 혼합용매(도 5a, 도 5b), 물(도 5c, 도 6b), 또는 클로로포름(도 6a)으로 희석한 제조예 1 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 및 BDP-9 나노입자 함유 샘플액(10 μM)을 준비하고 1 cm 석영 큐벳을 사용하였다.
(1) 광학특성 및 광 활성 분석
0, 40, 60, 80, 90, 99 부피%의 물의 체적분율(fw)에서 THF/물 혼합용매로 희석한 제조예 1 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 및 BDP-9 나노입자 함유 샘플액 10 μM에 대하여 광발광(PL) 스펙트럼 분석을 수행하여 도 5a, 도 5b에 나타내었다.
도 5a, 도 5b를 참조하면, THF/물 혼합용매로 희석한 제조예 1 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 및 BDP-9 나노입자 함유 샘플액은 모두 형광 스펙트럼에서 물의 체적분율이 높아질수록 광발광(PL) 피크강도가 세지고 약 610 nm 파장에서 발광피크를 나타내었다.
또한 물로 희석한 제조예 1 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 및 BDP-9 나노입자 함유 샘플액 10 μM에 대하여 광발광(PL) 스펙트럼 분석을 수행하여 도 5c에 나타내었다.
도 5c를 참조하면, 물로 희석한 제조예 1 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 및 BDP-9 나노입자 샘플액도 약 610 nm 파장에서 발광피크를 나타내었다. 또한 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액이 제조예 2에 의해 제조된 BDP-9 나노입자 함유 샘플액과 비교하여 발광 피크강도가 컸다.
이로부터, THF/물 혼합용매 또는 물로 희석한 제조예 1 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 및 BDP-9 나노입자 함유 샘플액은 응집 유도 발광(aggregation-induced emission; AIE) 특성을 나타내는 염료 역할을 하며 근적외선 파장영역에서도 바이오 이미징에 적용할 수 있음을 알 수 있다.
(2) 단일항 산소(1O2) 발생능 분석
단일항 산소(1O2) 발생능을 측정하기 위하여 대조군 광감응제로 BDP-I2 및 1O2 프로브로 1, 3-디페닐이소벤조퓨란(1, 3-diphenylisobenzofuran; DPBF)을 사용하였다. 실온에서 저장액(1.0 mM)으로부터 클로로포름으로 희석한 제조예 1 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 및 BDP-9 나노입자 샘플액(10 μM)을 공기-포화된(air-saturated) 유기용매가 들어있는 큐벳에 넣고 흡광도가 안정될 때까지 용액을 어둡게 유지한 다음 연속적인 빛을 조사하였다. 414 nm에서 DPBF 흡수를 5초 간격으로 기록하여 0~20 초간 감광공정의 붕괴율을 얻었다. 500 W 할로겐 램프(100 mW/cm2)를 사용하여 측정하였다. 그 결과를 도 6a에 나타내었다.
도 6a를 참조하면, 제조예 1 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 및 BDP-9 나노입자 함유 샘플액은 대조군 광감응제 BDP-I2와 비교하여 유사한 단일항 산소(1O2) 발생능을 나타내었다. 이로부터, 클로로포름으로 희석한 제조예 1 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 및 BDP-9 나노입자 함유 샘플액은 RP-ISC(radical pair-intersystem crossing)를 통해 유도되어 단일항 산소(1O2) 발생능을 나타냄을 알 수 있다.
또한 물로 희석한 제조예 1 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 및 BDP-9 나노입자 샘플액의 단일항 산소(1O2) 발생능을 측정하기 위하여 ROS 인디케이터(indicator)로 2,7-디클로로플루오레신 디아세테이트(dichlorofluorescin diacetate; DCFH-DA)를 사용하여 녹색광(20 mW/cm2)을 조사하였다. 10 μM 제조예 1 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 및 BDP-9 나노입자 샘플액과, 50 μM DCFH-DA 샘플액을 포함하는 큐벳을 준비하였다. 녹색광을 조사하지 않고 형광강도를 측정한 다음 녹색광 조사를 5분 간격으로 큐벳에 노출시켜 0~20 분간 형광강도를 측정하였다. 그 결과를 도 6b에 나타내었다.
도 6b를 참조하면, 제조예 1 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 및 BDP-9 나노입자 샘플액은 모두 녹색광을 조사함에 따라 점차 형광강도가 세짐을 확인할 수 있다. 이로부터, 물로 희석한 제조예 1 및 제조예 2에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 및 BDP-9 나노입자 함유 샘플액도 단일항 산소(1O2) 발생능을 나타냄을 알 수 있다.
분석예 3:
In vitro
세포 이미징 및 세포 생존율
(1) In vitro 세포 이미징 분석 - 형광 현미경
제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액에 대하여 형광 현미경으로 In vitro 세포 이미징을 분석하였다. 그 결과를 도 7a 및 도 7b에 나타내었다.
In vitro 세포 이미징 분석은 다음과 같은 방법으로 실험하였다.
상기 샘플액이 시험관 내 영상화제로 사용할 수 있는지 여부에 대해 4T1 세포에서 예비적으로 평가하였다. 세포흡수 및 검출을 분석하기 위해 4T1 세포 (ATCC® CRL-2539™) 및 L929 세포 (ATCC® CCL-1™)를 사용하였다. 4T1 세포는 마우스 유선종양에서 유래된 대표적인 종양세포로 선택하였고 L929 세포는 대표적인 마우스 정상(normal) 섬유아세포(fibroblast)로 선택하였다. 4T1 세포 및 L929 세포를 각각 웰 당 5.0 x 104 세포의 밀도로 24-웰 조직 배양 플레이트(Eppendorf, Hamburg, Germany)에 시딩(seeding)하였다. 상기 세포들을 37℃ 및 5% CO2 조건 하에 가습챔버에서 10% 소 태아혈청(FBS; Gibco, NY, USA) 및 1X 항생-항진균제(Antibiotic-Antimycotic, Gibco, NY, USA)가 보충된 RPMI 1640 배지(Gibco, NY, USA)에서 배양하였다. 24시간 안정화한 다음, 80% 컨플루언시(confluency)를 가진 세포를 최종농도가 20 μM인 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액에 노출시키고 0분, 30분, 60분, 120분 동안 배양하였다. 4T1 세포 및 L929 세포는 모두 현미경 Eclipse TI-E 5.01(일본 도쿄 니콘), 카메라 Zyla sCMOS(Andor Technology, Belfast, UK), 및 소프트웨어 NIS-Elements Advanced Research 4.13.01(니콘, 도쿄, 일본)을 사용하였다. 현미경에는 DAPI, FITC, 및 TRICT용 필터가 포함된 TI-FL Epi-fl 조명기 (일본 도쿄, Nikon)가 장착되었으며 TRICT 필터를 사용하여 세포를 검사하였다.
도 7a를 참조하면, 4T1 종양세포에서 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액의 형광방출은 배양시간이 증가함에 따라 크게 증가하였다. 이와 비교하여, 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액을 정상 섬유아세포 L929 세포에서 배양한 경우에는 형광의 증가가 관찰되지 않았다. 이렇게 정상 섬유 아세포 L929 세포 대비 4T1 종양세포에서 더 많은 세포 흡수효율을 갖는 것은 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액에 포함된 DSPE-PEG(2000) Biotin에 기한 것으로 여겨진다.
또한 녹색 LED 조사 하에 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액에 의한 4T1 종양세포 내 ROS 생성을 분석하기 위해 DCFH-DA를 세포 내 ROS 프로브로 사용하였다. 4T1 종양세포의 세포사멸은 calcein-AM 및 PI를 사용하여 시각화하여 확인하였다.
생세포와 죽은 세포를 시각화하고 세포 내 총 활성산소종(ROS)을 분석하기 위해, 4T1 종양세포를 웰 당 5.0 x 104 세포의 밀도로 4-웰 세포배양접시(Nunc, Roskilde, Denmark)에 시딩하고 전술한 바와 동일한 방법으로 배양하였다. 생 염색(live staining) 및 죽은 염색(dead staining)의 경우, 4T1 종양세포를 5μM의 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액으로 1시간 동안 처리한 후, 녹색 LED(20 mW/cm2)를 20분 동안 조사하고 세포를 3μM의 칼 세인으로 이중염색하였다. AM은 살아있는 세포마커로, 2 μM의 프로피듐 요오드화물(PI)은 죽은 세포마커로 사용하였다. 세포 내 총 ROS의 평가를 위해 4T1 종양세포를 5μM의 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액과 함께 1시간 동안 배양하고, 10μM의 2,7- 디클로로플루오레신 디아세테이트(dichlorofluorescin diacetate; DCFH-DA)를 30 분 동안 처리하였다. Dulbecco의 인산 완충식염수(DPBS; Gibco, NY, USA)로 세포를 세척한 후, 20분 동안 녹색 LED(20 mW/cm2)로 조사하였다. 프로브된 세포는 FITC 및 TRICT 필터를 사용하여 세포를 검사하였다.
도 7b를 참조하면, 4T1 종양세포는 녹색 LED 조사 하에 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액에 의해 4T1 종양세포 내에 ROS가 효율적으로 생성되었음을 확인할 수 있다.
(2) 세포 생존율(%) 분석
제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액의 항암효과를 확인하기 위하여 4T1 종양세포 생존력에 대한 MTT 분석을 하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
4T1 종양세포 생존율은 다음과 같은 방법으로 분석하였다.
4T1 종양세포를 96-웰 조직 배양 플레이트(Eppendorf, Hamburg, Germany)에 웰 당 1.0 x 104 세포 밀도로 시딩하고 상기 "(1) In vitro 세포 이미징 분석 - 형광 현미경"과 동일한 방법으로 배양하였다. 그리고나서 24시간 안정화한 후 80% 컨플루언시(confluency)를 가진 세포를 0~80 μM 농도 범위의 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액에 노출시키고 1 시간 동안 배양하였다. 배지를 새로 교체한 후 세포에 녹색 LED(20 mW/cm2)를 20분 동안 조사하여 MTT 분석을 하였다.
MTT 분석을 위해, 배양배지를 완전히 제거하고 세포를 200μL의 0.5 mg/ml 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT; Sigma, MO, USA) 용액을 37 ℃에서 4시간 동안 인산염 완충 식염수(PBS; Gibco, NY, USA)에 용해하였다. 그리고나서, MTT 용액 100 ㎕를 제거하고 100 ㎕의 디메틸설폭사이드(DMSO; Sigma, MO, USA)를 각 웰에 첨가한 후, 플레이트를 10분동안 부드럽게 흔들어 완전히 용해하였다. 생성된 용액의 엘리쿼트(aliquot)를 새로운 96-웰 플레이트로 옮기고 Epoch Microplate Spectrophotometer(Bio-Tek, VT, USA)를 사용하여 570nm에서 흡광도를 기록하였따. 처리되지 않은 세포의 생존율은 100 % 살아있는 것으로 계산하였다. 이 때, *은 p < 0.05이고 **은 p < 0.01이고 ***은 p < 0.001이었다.
도 8을 참조하면, 4T1 종양세포 생존력은 녹색 LED 조사 하에 0.02 μM ~ 5 μM 범위의 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액에 의해 현저하게 감소하였다.
분석예 4:
In vivo
형광 이미징
100 ㎕의 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액(300 μM) 또는 생리 식염수를 마우스에 각각 정맥주사하고 72시간 후에 마우스의 In vivo 형광 이미지를 분석하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
In vivo 형광 이미징 분석은 다음과 같은 방법으로 실험하였다.
실험동물취급을 위한 모든 작업절차는 건국대학교 동물실험 관리위원회(IACUC)(IACUC 허가 번호: KU19212)의 동물 실험지침에 따라 수행되고 승인되었다. 4주령 수컷 BALB/c nu/nu 누드 마우스는 오리엔트 바이오(경기도, 대한민국)에서 구입하여 1주일 동안 실험조건에 적응시켰다. 100 ㎕의 세포 현탁액 중 약 2 x 106 개의 4T1 종양세포를 100 ㎕의 Matrigel 356234 (BD Biosciences, NJ, USA)와 혼합한 다음, 상기 혼합물을 5주령 마우스의 등에 피하주사로 접종하였다. 종양의 부피가 약 100 mm3에 도달하면 상기 마우스를 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액으로 처리한 실험군과 생리 식염수로 처리한 대조군(각각 n=5)을 포함하여 무작위로 두 그룹으로 나누었다. 실험군은 100 ㎕의 300 μM 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액을 투여하였고 대조군은 100 ㎕의 생리 식염수를 정맥 내로 투여하였다. 상기 샘플액 및 생리 식염수를 투여하고 72시간 후에, 동물 광학이미징 시스템 IVIS(Caliper Life Sciences, MA, USA)를 사용하여 생체 내 형광 이미지를 캡처하였다. 동물을 유도하기 위해 5% 이소플루란으로 마취하고 유지를 위해 2.5%를 마취한 다음, 465 nm에서 여기하고 690 nm에서 모니터링하였다.
도 9를 참조하면, 정맥주사된 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자는 마우스의 피하 종양부위 및 690 nm 파장에서 강한 적색 형광을 나타내었다. 이와 비교하여, 생리 식염수로 정맥주사된 경우에 전혀 형광을 나타내지 않았다.
또한 조직 병리학적 변화를 분석하기 위하여, 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액으로 처리한 실험군(300 μM) 및 생리 식염수로 처리한 대조군에 대하여 각각 녹색 LED(20 mW/cm2, 20 분)로 조사하고 3주 후에 종양 섹션(section)의 H&E 염색 및 TUNEL 분석을 하였다. 그 결과를 도 10에 나타내었다. 세포 사멸핵은 TUNEL(빨간색)로 염색되었다.
조직 병리학적 변화의 분석은 다음과 같은 방법으로 실험하였다.
모든 동물을 CO2 챔버 내에서 희생한 후 종양을 새로 절제하고 24시간 동안 10 % 중화된 인산염 완충 포르말린으로 고정시켰다. 그리고나서, 조직은 Tissue-Tek® VIP™ 5 Jr Tissue Processor(SAKURA, Staufen, Germany)를 사용하여 일상적인 조직 기술로 처리하고 HistoCore Arcadia(Leica, Wetzlar, Germany)를 사용하여 파라핀에 내장하였다. 파라핀이 내장된 표본을 4 μm 두께의 섹션으로 절단하였다. 상기 절단된 섹션을 슬라이드(Marienfeld, Lauda-Konigshofen, Germany)에 장착하고 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 상기 염색된 슬라이드에 대해 전술한 바와 동일한 방법으로 카메라 DS-Ri2(Nikon, Tokyo, Japan)를 사용하였다. DAPI, FITC 및 TRICT 필터를 사용하여 전술한 바와 동일한 방법으로 면역 조직 화학 및 TUNEL 염색 실험군 및 대조군을 분석하였다. TUNEL 분석을 위해 TUNEL-양성세포(positive cells)는 DAPI-양성 일반세포에 대한 세포 사멸세포로 특성화하였다.
도 10을 참조하면, 제조예 1에 의해 제조된 BDP-8 나노입자 함유 샘플액으로 처리하고 녹색 LED로 조사한 실험군에서 괴사가 관찰되었고 세포 사멸은 TUNEL 염색을 사용하여 확인하였다. 이와 비교하여, 생리 식염수로 처리하고 녹색 LED로 조사한 대조군은 무시할 만한 변화를 나타내었다.
Claims (15)
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 종양 진단 또는 치료용 약학적 조성물:
<화학식 1>
식 중,
R1, R2, R3, R4, R5, R6, R8, R9, R10, R11, R12, R13은 서로 독립적으로 수소, 중수소, 또는 비치환된 C1-C10 알킬기이며,
R7은 비치환된 C6-C20 아릴기이다. - 제1항에 있어서,
상기 R1, R3, R4, R6, R8, R10, R11, R13은 서로 동일한 치환기를 갖는 종양 진단 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 R1, R3, R4, R6, R8, R10, R11, R13은 비치환된 C1-C10 알킬기인 종양 진단 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 R7은 비치환된 C6-C20 아릴기인 종양 진단 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
하기 화합물은 화학식 2 및 화학식 3으로 표시되는 화합물 중 1종 이상을 포함하는 종양 진단 또는 치료용 약학적 조성물:
<화학식 2>
<화학식 3>
- 제1항에 있어서,
상기 화합물은 페녹사진 유닛을 중심축으로 하여 보론-디피로메텐 유닛이 90°±1°로 트위스트된(highly twisted) 구조인 종양 진단 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 화합물은 고분자 매트릭스에서 캡슐화된 나노 구조체인 종양 진단 또는 치료용 약학적 조성물. - 제7항에 있어서,
상기 고분자 매트릭스가 1, 2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-[비오티닐(폴리에틸렌 글리콜)-2000] (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[biotinyl(polyethylene glycol)-2000])를 포함하는 종양 진단 또는 치료용 약학적 조성물. - 제7항에 있어서,
상기 나노 구조체의 평균직경이 40 nm ~ 200 nm인 종양 진단 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 화합물은 응집 유도 발광(aggregation-induced emission; AIE) 특성을 나타내는 염료인 종양 진단 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 화합물은 암세포를 표적으로 하는 근적외선 형광 프로브인 종양 진단 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 화합물이 600 nm ~ 620 nm 파장영역에서 발광피크를 나타내는 종양 진단 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 암의 광역학적 치료에 사용되는 종양 진단 또는 치료용 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 수용액, 유기용액, 또는 이들 혼합용액에서 단일항 산소(singlet oxygen)를 발생하는 종양 진단 또는 치료용 약학적 조성물. - 제13항에 있어서,
상기 암이 유방암, 신장암, 고환암, 전립선암, 난소암, 자궁암, 자궁 경부암, 질암, 난관암, 직장암, 폐암, 위암, 간암, 식도암, 소장암, 췌장암, 구강암, 흑색종, 또는 육종으로부터 선택되는 종양 진단 또는 치료용 약학적 조성물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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-
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ACS APPL. MATER. INTERFACES, 11, 47, PP.43928~43935, 2019.11.04 |
| J. PHYS. CHEM. C, 123, 37, 22793~22811, 2019.08.27 |
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| Publication number | Publication date |
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