CN112933227B - 一种基于声动力/免疫联合治疗的复合纳米制剂、其制备方法及应用 - Google Patents

一种基于声动力/免疫联合治疗的复合纳米制剂、其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于声动力/免疫联合治疗的新型复合纳米制剂、其制备方法及应用，其包括声敏剂、免疫激活剂、活性氧增强药物和脂质体，所述声敏剂和活性氧增强药物包载于所述脂质体磷脂双分子层中，所述免疫激活剂嵌于所述脂质体磷脂双分子层上。该方法包括步骤：①将所述声敏剂、肉桂醛衍生物、MPLA、卵磷脂和DSPE‑PEG5k配置成溶液；②将步骤①所得溶液中的溶剂蒸出后，将负载药物脂质薄膜分散在缓冲液中，得到负载药物的脂质体悬液；③将步骤②的溶液过聚碳酸酯膜，得复合纳米脂质体。该制剂可诱导抗肿瘤反应，不仅可以阻止原位实体瘤的发展，还可以防止肿瘤向远端组织转移。尤其适用于声动力治疗和免疫疗法的联合治疗制剂。

Description

一种基于声动力/免疫联合治疗的复合纳米制剂、其制备方法 及应用
技术领域
本发明属于多功能纳米材料技术领域，具体涉及一种基免疫疗法和声动力疗法相结合的新型复合纳米制剂的制备方法及其抗肿瘤应用。
背景技术
癌症对人类的生命健康造成严重威胁，根据世界卫生组织(WHO)的《2020年世界癌症报告》，在未来的二十年中，全世界的癌症病例数可能会增加60％。在中低收入国家中，增幅可能高达81％，癌症的有效治疗刻不容缓。现阶段癌症的临床治疗方式主要包括手术治疗、化疗、放疗等。然而，上述传统疗法不仅治疗效果有限，且易对身体产生极大负担，肿瘤一旦发生转移，更难以治愈。
声动力疗法SDT作为一种新兴肿瘤无创治疗方法，具有较强组织穿透能力、非电离性、高可控性和低成本等特点。在经典的SDT过程中，超声激活声敏剂产生的活性氧，通过凋亡或坏死途径诱导癌细胞死亡。
研究证实，在SDT过程中产生的活性氧可以诱导肿瘤细胞产生免疫原性细胞死亡(ICD)，即发生凋亡的肿瘤细胞表面上调某些特征蛋白(如钙网蛋白、高迁移率族蛋白B1等)作为“危险信号”，从而诱导未成熟的树突细胞发育为成熟的树突细胞，并将肿瘤抗原提呈给细胞毒性T细胞，最终启动对肿瘤细胞的特异性杀伤。但由SDT促进机体产生的抗肿瘤免疫应答程度还不足以完全有效地杀死残留肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞形成远端转移灶。因此SDT与免疫疗法的联合应用将为肿瘤治疗提供新思路：在杀伤原位实体瘤的同时打通抗肿瘤免疫应答环路，阻断各种免疫逃逸和克服免疫抑制从而起到最优的肿瘤治疗效果，并达到防止肿瘤转移和复发的目的。
叶绿素衍生物是一类重要的声敏剂，包括二氢卟吩e6及其衍生物,可以在超声诱导下产生活性氧，诱导肿瘤细胞凋亡或坏死，实现杀伤原位实体瘤的目的。但是由于二氢卟吩e6 及其衍生物水溶性差，体内分布缺乏肿瘤靶向性等缺点，因此借助纳米系统增强药物的靶向递送能力，提高其在肿瘤区域的蓄积量，实现药物的持续释放是一种有效的手段。
因此，构建一种新型纳米制剂来实现声动力和免疫疗法联合治疗，并通过多种机制达到协调抑制肿瘤的作用，对肿瘤新型疗法的探索具有重要意义。
发明内容
本发明构建了一种将声敏剂、免疫激活剂以及增强细胞活性氧水平的药物共递送脂质体的新型纳米制剂来实现声动力和免疫疗法联合治疗的目的。
本发明构建的脂质体系统可以改善二氢卟吩e6及其衍生物的水溶性，提高其在肿瘤组织中的蓄集能力，实现药物的可控释放，增强SDT对原位实体瘤的杀伤效果。免疫激活剂单磷酰脂质A(MPLA)是一种toll样受体-4(TLR4)的激动剂，由于其脂质结构，可巧妙地嵌于脂质体磷脂双分子层中，释放后可激活树突状细胞并促进肿瘤相关抗原的呈递、增加肿瘤浸润淋巴细胞，从而激活免疫应答。肉桂醛(CA)已被证实可通过消耗细胞内硫醇提高线粒体活性氧水平以增强氧化应激，并介导线粒体通透性转变和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活化，从而促进细胞凋亡，因此具有增强SDT的肿瘤杀伤效果。
基于以上目的，本发明首先提供了一种复合纳米脂质体，所述复合纳米脂质体中包括：大豆卵磷脂(SPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5000(DSPEm-PEG5k)、声敏剂二氢卟吩e6三甲酯(Ce6Me3)、肉桂醛衍生物(CA derivatives)和免疫激活剂单磷酰脂质 A(MPLA)。此复合纳米脂质体制剂的结构示意图如图1。
另一方面，本发明还提供上述复合纳米脂质体的制备方法，该方法包括如下步骤：
①将所述声敏剂、肉桂醛衍生物、MPLA、卵磷脂和DSPE-PEG5k配置成溶液，按质量比为1：(1-5)：(0.01-0.5)：(5-30)：(1-8)均匀混合；所述的溶剂选自氯仿、乙醇或甲醇；
②将步骤①所得溶液中的溶剂蒸出后，将负载药物脂质薄膜分散在PBS或水中，得到负载药物的脂质体悬液；
③将步骤②的溶液过聚碳酸酯膜，得复合纳米脂质体。
进一步地，本发明证明了将声敏剂、免疫佐剂和活性氧增强药物通过纳米载体共递送可以诱导抗肿瘤反应，这不仅可以阻止原位实体瘤的发展，还可以防止肿瘤向远端组织转移。上述肿瘤包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肾癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫癌、胃癌和直肠癌。同时选用纳米载体系统改善药物水溶性，实现静脉注射，增强药物疗效，降低毒副作用。此外，联合免疫治疗策略提供了长期的免疫记忆功能，其可以防止原位肿瘤消除后的再次复发。
因此，本发明提供了一种基于免疫疗法的无创肿瘤治疗模式的肿瘤联合疗法，尤其适用于声动力治疗和免疫疗法的联合治疗制剂。
附图说明
图1是纳米脂质体Lip-Ce6Me3-CA-MPLA制备过程及结构示意图。
图2是纳米脂质体Lip-Ce6Me3-CA-MPLA的基本表征结果图；其中，(a)图是Lip-Ce6Me3-CA-MPLA的透射电镜图像，比例尺，100nm；(b)图是经动态光散射(DLS) 测定的Lip-Ce6Me3-CA-MPLA的粒径分布图；(c)图是Lip-Ce6Me3-MPLA和 Lip-Ce6Me3-CA-MPLA的15天粒径稳定性测试结果；(d)图是Lip-Ce6Me3-CA-MPLA、 Ce6Me3和CA衍生物在二甲亚砜中吸收图；(e)图是Lip-Ce6Me3-CA-MPLA和Ce6Me3在 PBS中吸收图；(f)图是分别与PBS、Ce6Me3和Lip-Ce6Me3-CA-MPLA纳米脂质体共孵育的条件下，经超声处理后DPBF的荧光强度随时间的变化折线图。
图3是是体外细胞实验结果；其中，(a)是纳米脂质体Lip-Ce6Me3和Lip-Ce6Me3-CA在超声和不超声的情况下对4T1细胞毒性测试结果；(b)是纳米脂质体Lip-Ce6Me3和Lip-Ce6Me3-CA在超声处理后ROS的产生情况。(c)是纳米脂质体Lip-Ce6Me3-CA-MPLA 在体外诱导树突细胞的成熟情况。
图4是小鼠体内免疫疗法和声动力疗法联合抗肿瘤实验结果图；其中，(a)是不同治疗组4T1荷瘤小鼠肺部肿瘤转移情况照片；(b)是不同治疗组肺部肿瘤结节个数柱状图；(c) 是治疗结束后，不同治疗组小鼠肿瘤及肺部切片的H&E染色显微镜照片；(d)是治疗结束后，不同治疗组小鼠体内细胞毒性T淋巴细胞的激活情况；(e)是治疗结束后，不同治疗组小鼠体内树突细胞的激活情况。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的内容作进一步的说明：
本发明提供一种复合纳米脂质体，其包括：大豆卵磷脂(SPC)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇5k(DSPE-mPEG5k)、声敏剂、肉桂醛衍生物和单磷酰脂质A。
具体的实施方式之一，所述的声敏剂为式I的化合物(Ce6Me3)：
Figure BDA0002938586330000031
所述的肉桂醛衍生物为式II的化合物(CA derivatives)：
Figure BDA0002938586330000041
所述的复合纳米脂质体通过薄膜水化法制备，所述方法包括如下步骤：
步骤1.将声敏剂溶液、免疫激动剂溶液、肉桂醛衍生物溶液、卵磷脂溶液和DSPE-PEG 溶液混合均匀，去除溶剂，得到负载药物的脂质体薄膜；所述的溶剂选自氯仿、乙醇或甲醇，优选为氯仿；所述声敏剂、肉桂醛衍生物、免疫激动剂、卵磷脂和DSPE-PEG的质量比为1：(1-5)：(0.01-0.5)：(5-30)：(1-8)，优选为1：(1.2-1.8):(0.05)：(15-20):(4-5)。
步骤2.将负载药物脂质薄膜分散在PBS或水中，得到负载药物的脂质体悬液；对负载药物的脂质体悬液于水浴中进行水化；所述水化的时间为0.5-2.5h，优选为1.5-1.8h。
步骤3.在水浴中过0.45μm和0.22μm的聚碳酸酯膜，得到负载药物的脂质体纳米制剂。
优选的，所述步骤2、3中所述的水浴温度为45-55℃。
实施例1
对比组1：脂质体产品Ⅰ的制备
(1)精密称取大豆卵磷脂20mg，DSPE-PEG5k 5mg，声敏剂Ce6Me3 1mg于50ml圆底烧瓶中，用5ml氯仿溶解，直至完全溶解后，于旋转蒸发仪上减压蒸发成膜，真空干燥箱过夜，完全干燥。
(2)加入4ml的PBS水化，在氮气保护的状态下，用磁力搅拌器(400转/分)于50℃水浴中搅拌1.5h。
(3)将所得的溶液在50℃水浴下经挤压器依次通过0.45μm和0.22μm的聚碳酸酯膜，得到脂质体产品Ⅰ:脂质体包裹的声敏剂(Lip-Ce6Me3)。
对比组2：脂质体产品Ⅱ的制备
(1)精密称取大豆卵磷脂20mg，DSPE-mPEG5k 5mg，声敏剂Ce6Me3 1mg，肉桂醛衍生物1.5mg于50ml圆底烧瓶中，用5ml氯仿溶解，直至完全溶解后，于旋转蒸发仪上减压蒸发成膜，真空干燥箱过夜，完全干燥。
(2)加入4ml的PBS水化，在氮气保护的状态下，用磁力搅拌器(400转/分)于50℃水浴中搅拌1.5h。
(3)将所得的溶液在50℃水浴下经挤压器依次通过0.45μm和0.22μm的聚碳酸酯膜，得到脂质体产品Ⅱ:脂质体包裹的声敏剂和肉桂醛衍生物(Lip-Ce6Me3-CA)。
实验组：脂质体产品Ⅲ的制备
(1)精密称取大豆卵磷脂20mg，DSPE-mPEG5k 5mg，声敏剂Ce6Me3 1mg，肉桂醛衍生物1.5mg于50ml圆底烧瓶中，用5ml氯仿溶解，完全溶解后，加入50uL MPLA溶液 (1mg/mL溶于氯仿)，于旋转蒸发仪上30℃水浴减压蒸发成膜，真空干燥箱过夜，完全干燥。
(2)加入4ml的PBS水化，在氮气保护的状态下，用磁力搅拌器(400转/分)于50℃水浴中搅拌1.5h。
(3)将所得的溶液在50℃水浴下经挤压器依次通过0.45μm和0.22μm的聚碳酸酯膜，得到脂质体产品Ⅲ:脂质体负载声敏剂，肉桂醛衍生物和免疫激动剂 (Lip-Ce6Me3-CA-MPLA)。
实施例2
对实施例1制得的纳米脂质体进行基本表征
(1)性能测试实验1：脂质体Lip-Ce6Me3-CA-MPLA的形貌分析
通过透射电镜(TEM，HT7700EXALENS)获得脂质体Lip-Ce6Me3-CA-MPLA的TEM 图像，如图2中(a)所示。取1mL脂质体溶液Lip-Ce6Me3-CA-MPLA，通过Zeta电位与粒径分析仪(Malvern Zetasizer，Nanozs90)测得水合粒径为149.1nm，多分散系数(Poly DiversityIndex，“PDI”)为0.168，粒径分布图如图2中(b)所示。通过相同方法测得Lip-Ce6Me3-MPLA和Lip-Ce6Me3-CA-MPLA在15天内的粒径变化图，如图2中(c)所示，说明纳米脂质体在15天内较为稳定。
(2)性能测试实验2：脂质体Lip-Ce6Me3-CA-MPLA的吸收光谱测试
在3ml石英比色皿中加入溶于二甲亚砜的各样品溶液，用紫外可见分光光度计(PerkinElmer，Lambda 750S)测试样品的吸收曲线。如图2中(d)所示，CA衍生物在265nm 处存在吸收峰，Ce6Me3在400nm、500nm和665nm处存在三个吸收峰，而 Lip-Ce6Me3-CA-MPLA在265nm、400nm、500nm和665nm处存在四个吸收峰，说明脂质体成功负载药物。在3ml石英比色皿中加入溶于PBS的各样品溶液，用紫外可见分光光度计测试样品的吸收曲线，如图2中(e)所示。说明脂质体成功改变Ce6Me3的水溶性。
(3)性能测试实验3：脂质体Lip-Ce6Me3-CA-MPLA在溶液中超声后活性氧的产生
分别将实施例1提供的脂质体纳米溶液配制成浓度为10μmol/L和20μmol/L的PBS分散液，然后将PBS和脂质体纳米颗粒分别与10μmol/L的1,3二苯基异苯并呋喃(DPBF)荧光探针混合后，进行超声，并在不同时间取样,每次100ul,置于96孔板中。用多功能酶标仪(Tecan Spark)检测DPBF的荧光强度，记录超声10min后的荧光强度，绘制折线图，如图2(f)，说明超声可以诱导活性氧的产生。
实施例3
(1)MTT测试纳米脂质体体外细胞毒性及体外抗肿瘤疗效
为了评估体外细胞毒性，用96孔板培养乳腺癌细胞4T1，取对数生长期的4T1细胞，每孔加入8×103个细胞，37℃培养箱孵育过夜，加入不同浓度梯度的Lip-Ce6Me3， Lip-Ce6Me3-CA(Ce6Me3：10μg/mL，30μg/mL，50μg/mL，100μg/mL，200μg/mL；)，对比超声毒性和未超声毒性大小，即：Lip-Ce6Me3,Lip-Ce6Me3(+US)，Lip-Ce6Me3-CA， Lip-Ce6Me3-CA(+US)。加药后，孵育4h，用预冷过的PBS洗掉药物，重新加入完全培养基，对Lip-Ce6Me3(+US)，Lip-Ce6Me3-CA(+US)组进行超声处理，超声强度为3W/cm2，10min。将96孔板放入细胞培养箱中孵育24h后，吸弃96孔板中的培养液，加入100μL 0.5mg/ml 的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐(噻唑蓝，MTT)溶液，37℃培养箱孵育 4h后，生成紫色晶体-甲臜，吸弃96孔板中溶液，每孔加入150μL的二甲基亚砜(DMSO)，用多功能酶标仪(Tecan Spark)于37℃震荡至晶体完全溶解，测每孔在570nm(OD dye)的吸光度值，测定结果如图3所示。用以下公式计算细胞存活率:细胞存活率(％)＝OD dye/OD blank。
从图3(a)中可以看出，在一定浓度范围内实施例1提供的脂质体纳米颗粒对细胞没有明显杀伤性，这说明实施例1提供的纳米脂质体纳米颗粒具有良好的生物安全性，而超声后有明显的细胞死亡，说明Ce6Me3在超声情况下可以诱导细胞凋亡，而 Lip-Ce6Me3-CA(+US)组比Lip-Ce6Me3(+US)组效果好。
(2)细胞内活性氧产生实验
为评估肉桂醛衍生物增强ROS产生，用96孔板培养乳腺癌细胞4T1，取对数生长期的4T1 细胞，每孔加入8×103个细胞，37℃培养箱孵育过夜，将实施例1提供的脂质体纳米颗粒溶液配制成Ce6Me3浓度为30μg/mL和的培养基分散液，然后将PBS和脂质体纳米颗粒分别与 20μmol/L的2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针混合后，加入96孔板中孵育 4h，用预冷过的PBS洗掉药物，重新加入完全培养基，分成超声和不超声组，即：PBS，CA 衍生物，Lip-Ce6Me3,Lip-Ce6Me3(US+)，Lip-Ce6Me3-CA，Lip-Ce6Me3-CA(US+)。对 Lip-Ce6Me3(US+)和Lip-Ce6Me3-CA(US+)组进行超声处理，超声强度为3W/cm2，10min，用倒置荧光显微镜(Leica,Digital Microscopes Inverted)检测DCFH-DA的荧光强度。结果如图3(b) 所示，对比Lip-Ce6Me3(US+)和Lip-Ce6Me3-CA(US+)组的效果，Lip-Ce6Me3-CA(US+)组效果较好，说明超声可以诱导纳米脂质体产生活性氧，肉桂醛衍生物可以增强活性氧的产生。
(3)体外诱导DC细胞成熟实验
从8周龄BALB/c小鼠骨髓中分离培养出树突细胞(DCs),以100ng/ml的脂多糖(LPS)为阳性对照，加入实施例1中纳米脂质Lip-Ce6Me3-CA-MPLA和MPLA后，孵育12h,用流式细胞仪(Thermo Fisher，Attune NxT)分析anti-CD11c PE-Cy7、anti-CD80 FITC和anti-CD86 APC 染色的树突细胞。结果如图3(c)所示，说明负载MPLA的纳米脂质体可以诱导树突细胞的成熟。
实施例4
纳米脂质体体内抗肿瘤疗效实验
随机抽取雌性BALB/c小鼠(6-8周)分为4组，每组3只重复，包括：(1)对照组(+US)，(2)Lip-Ce6Me3(+US)，(3)Lip-Ce6Me3-CA(+US)和(4)Lip-Ce6Me3-CA-MPLA(+US)。右侧乳腺皮下注射4T1细胞(1×106)。七天后，肿瘤达到约100mm3。在实验之前，对照组静脉注射PBS，其他组小鼠静脉注射Lip-Ce6Me3，Lip-Ce6Me3-CA和 Lip-Ce6Me3-CA-MPLA，Ce6Me3剂量8mg/kg。注射后4小时进行超声辐照(9.9MHz，2 W/cm2，30分钟)。隔天治疗一次，连续治疗21天后，解剖取肺部拍照，观察肺转移情况，并统计肺部肿瘤结节个数，如图4(a)和(b)所示；对肿瘤和肺部进行H&E染色，如图 4(c)所示。可以看出Lip-Ce6Me3-CA-MPLA(+US)组肿瘤结节数明显比其他治疗组少，说明脂质体Lip-Ce6Me3-CA-MPLA对肿瘤的肺转移有明显抑制效果。
切除脾与anti-CD11c PE-Cy7、anti-CD86 APC和anti-CD80 FITC共染色用流式细胞仪 (Thermo Fisher，Attune NxT)进行分析细胞毒性T淋巴细胞激活情况，如图4(d)所示，说明实验组均可以激活细胞毒性T淋巴细胞，但Lip-Ce6Me3-CA-MPLA效果最好。切除引流淋巴结与anti-CD11c PE-Cy7、anti-CD86 APC和anti-CD80 FITC共染色用流式细胞仪(Thermo Fisher，Attune NxT)分析树突细胞激活情况，如图4(e)所示，说明 Lip-Ce6Me3-CA-MPLA可以诱导树突细胞成熟。
从图4的(a)-(e)可以看出复合纳米脂质体制剂Lip-Ce6Me3-CA-MPLA(+US)可以激活机体的免疫系统，对肿瘤的肺转移有明显的抑制作用。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

Claims (8)

1.一种基于声动力/免疫联合治疗的复合纳米制剂，其特征在于，包括声敏剂、免疫激活剂、活性氧增强药物和脂质体，所述声敏剂和活性氧增强药物包载于所述脂质体磷脂双分子层中，所述免疫激活剂嵌于所述脂质体磷脂双分子层上；其中：
所述声敏剂为二氢卟吩e6三甲酯，其结构式如式Ⅰ：
Figure DEST_PATH_IMAGE002A
Ⅰ
所述的活性氧增强药物为肉桂醛衍生物，其结构式如式Ⅱ：
Figure DEST_PATH_IMAGE004A
II
所述免疫激活剂是单磷酰脂质A。
2.根据权利要求1所述的复合纳米制剂，其特征在于，所述复合脂质体纳米粒子的粒径为50-400nm。
3.根据权利要求1所述的复合纳米制剂，其特征在于，所述复合脂质体纳米粒子的粒径为120-180nm。
4.如权利要求1-3任一项所述的复合纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将声敏剂、活性氧增强药物、免疫激活剂和脂质体溶液混合均匀，除去溶剂，加入水或PBS，得到脂质体纳米制剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)将声敏剂溶液、免疫激活剂溶液、活性氧增强药物溶液、卵磷脂溶液和DSPE-PEG溶液混合均匀，去除溶剂，得到负载药物的脂质体薄膜；
(b)将负载药物脂质薄膜分散在PBS或水中，得到负载药物的脂质体悬液；
(c)对负载药物的脂质体悬液于水浴中进行水化；然后在水浴中过0.45μm或0.22μm的聚碳酸酯膜，得到负载药物的脂质体纳米制剂。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(a)中，所述的溶剂选自氯仿、乙醇或甲醇；所述声敏剂、活性氧增强药物、免疫激动剂、卵磷脂和DSPE-PEG的质量比为1：(1-5)：(0.01-0.5)：(5-30)：(1-8)。
7.一种治疗肿瘤的药物，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的复合纳米制剂。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、肝癌、肾癌、肺癌、结肠癌、膀胱癌、胰腺癌、子宫癌、胃癌或直肠癌。
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