KR102605352B1 - 항체-약제 접합체 평가 방법 - Google Patents

항체-약제 접합체 평가 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 공지 방법들 보다 우수한 이점들을 제공하는 ADC 제품들의 DAR 평가 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 방법들은 높은 처리량 분야에서 및/또는 평가 중에 ADC 샘플들을 희석시키지 않고 사용될 수 있다.

Description

항체-약제 접합체 평가 방법 {METHODS OF ASSESSING ANTIBODY-DRUG CONJUGATES}
관련 출원들에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 9월 8일 출원된 미국 가특허 출원 제 62/556,153에 대한 우선권을 주장하며, 이의 내용은 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
배경
항체-약제-접합체 (ADCs)는 새로운 종류의 약제 분자이다. 특정 표적을 찾아서 효능있는 약제를 전달할 수 있는 이의 능력은 표적에 기반한 치료 제품을 개발함에 있어 매력적인 옵션이 된다. ADCs는 선택된 화학적 링커를 통해 단클론 항체에 효능 있는 약제 분자들을 화학적으로 연결시켜 생성된다. 단클론 항체에 접합되는 약제 분자들의 평균수를 약제-대-항체 비율 (“DAR”)이라 한다. DAR은 ADC 제품들의 중요한 질적 특성인데, 왜냐하면 이는 제품 효능, 안전성 및/또는 안정성에 영향을 줄 수 있기 때문이다. 따라서, 신뢰성 있고 높은 처리량 방식으로 ADC 제품들의 DAR을 평가하는 방법이 필요하다.
상세한 설명
본 발명은 공지 방법들 이상의 이점들을 제공하는 ADC 제품들의 DAR 평가 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 방법들은 높은 처리량 분야에서 및/또는 평가 중에 ADC 샘플들을 희석시키지 않고 사용될 수 있다.
UV-Vis 및 Beer-Lambert 법칙
DAR은 전통적으로 UV-Vis 분광법을 사용하여 측정되어 왔다 (예컨대, Chen, Methods Mol. Biol. 1045:267-73 (2013) 참고). 이러한 분석은 Beer-Lambert 법칙에 기반하는 것으로, 이는 물질의 흡광도와 농도 사이의 직접적인 비례 관계에 관한 것이다:
여기서 A는 흡광도이고, ε는 흡광 계수 (물질의 물리적 상수)이고, l은 분석물을 내포하는 세포를 통과하는 경로 길이이고, c는 농도이다.
UV-Vis 분광법을 사용하는 ADC 제품에 대한 DAR 측정은 항체에 대한 최대 흡광 (예컨대, 280 nm)과 약제에 대한 최대 흡광 (예컨대, 252 nm)의 차이에 의존한다. 예를 들면, 평균 DAR은 접합된 물질에 대해 280 nm 및 252 nm에서 측정된 흡광의 차이를 사용하여 계산될 수 있다. UV-Vis 방법은 산업에서 널리 사용되지만, 제제 스크리닝 연구에 필요한 처리량이 부족하다. 이는 또한 샘플 희석과 관련된 오차를 가져오는 샘플 희석없이 사용될 수 있다.
그러므로 본 발명은, 최소한 일부분은, 크기 배제 크로마토그래피 (예컨대, UPLC) 및 기울기 분광법을 사용하여 DAR을 측정하는 다른 방법들에 기반한다. 이러한 방법들은 재현성, 정밀도 및 민감도와 관련하여 특징화되었으며 UV-Vis 분광법과 비교되었다. 생성된 데이터는 전통적인 UV-Vis 방법들의 처리량 한계를 극복하기 위한 UPLC-기반 DAR 방법의 사용을 뒷받침한다 또한, 기울기 분광법 기반 방법을 사용하여 ADC 샘플들을 샘플 희석없이 분석할 수 있다.
UPLC-기반 방법
한 구체예에서, 크기 배제를 사용하여 DAR을 결정한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에 개시된 방법들은 항체-약제 접합체를 포함하는 샘플을 크기-배제 크로마토그래피 기질에 처리하는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, 본 명세서에 개시된 방법들은 항체-약제 접합체를 포함하는 샘플을 크기-배제 크로마토그래피 기질에 처리하고 이를 통해 전개시키는 단계를 포함한다. 일부 구체예들에서, 분석을 위해 ADC 샘플의 전체 양이 크기 배제 기질에 처리된다. 예를 들면, 다음과 같은 UPLC-기반 방법을 사용하여 DAR을 평가하였다.
280 nm에서 수집된 데이터는 피크 숄더 탐지 기능이 있는 Empower의 Apex Track 통합법을 사용하여 통합되었다. 머무름 시간 통합 범위는 분자 의존적이지만, 통상적으로 3-9 분 이내이다. 최대 높이 및 면적을 가지는 피크는 "고유", "주요" 또는 "단량체" 피크로 분류되었다. “고유” 피크 보다 앞서 용리하는 임의의 피크들은 “HMW” 피크로 분류되었다. “고유 피크" 보다 차후에 용리하는 임의의 피크들은 “LMW” 피크로 분류되었다.
각 화학종들의 상대 백분율은 개개 피크들의 면적 대 모든 피크들의 총 면적의 비율로부터 계산되었다. 다음과 같은 상대 퍼센트 면적은 순도: % 총 HMW, % 고유 (또는 주요 또는 단량체), 및 % 총 LMW의 지표로서 기록되었다. 모든 피크들의 총 면적을 합하여 후속 DAR 계산에 사용되었다. 그러나, 일부 구체예들에서, 고유 피크의 면적만이 사용된다.
252 nm에서 수집된 데이터는 피크 숄더 탐지 기능이 있는 Empower의 Apex Track 통합법을 사용하여 통합되었다. 머무름 시간 통합 범위는 분자 의존적이지만, 통상적으로 3-9 분 이내이다. 모든 피크들의 총 면적을 합하여 후속 DAR 계산에 사용되었다. 그러나, 일부 구체예들에서, 고유 피크의 면적만이 사용된다.
DAR은 280 nm에서의 총 피크 면적 (ADC에 대한 A최대) 및 252 nm에서의 총 피크 면적 (약제에 대한 A최대)으로부터 결정되었다. 252 nm가 ADC에 사용되는 약제 접합체에 대한 통상적인 A최대이지만, 예컨대, 공지 방법을 사용하여 특정 접합체에 대한 적절한 파장이 선택될 수 있다. 항체에 결합되는 약제의 양은 적용가능한 경우 참고 표준으로 네이키드 항체를 사용하여, 이들 2개 파장들에서의 총 피크 면적 차이에 의해 결정될 수 있다.
다음과 같은 2개의 방정식 (이들은 Beer-Lambert 법칙으로부터 유도되었음)들이 확인되었으며 그 일관성이 입증되었다.
방정식 1:
방정식 1은 네이키드 항체 참고 표준의 사용을 필요로 하지 않는다. 그러나, 252 nm에서 항체 및 약제 모두에 대한 흡광 계수 (ε)의 체계적 결정은 필요하다. 주어진 파장에서의 흡광 계수는 알려진 농도를 갖는 항체 또는 약제의 용액을 사용하고 주어진 파장에서의 흡광도를 측정함으로써 Beer-Lambert 법칙으로부터 쉽게 계산 될 수 있다.
방정식 2:
방정식 2는 252 nm에서 항체에 대한 흡광 계수 결정을 필요로 하지는 않지만, 네이키드 항체 참고 표준에 대한 UPLC 데이터의 수집을 필요로 한다.
UPLC를 예로 들었으나, 본 명세서에 기재된 방법들에서 다른 크기 배제 크로마토그래피 기법들이 사용될 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피는 일반적으로 크기에 의한 분자들의 분별을 지칭하며, 이 때 크로마토그래피 용리 시간은 특정 분자에 대한 특성이 된다. 또 다른 방법들에는, 예컨대, SEC-HPLC, 역상 (RP) HPLC, RP-UPLC가 포함된다.
일부 구체예들에서, ADC 샘플은 크기 배제 크로마토그래피 (예컨대, HPLC 또는 UPLC)로 분석하기 전에 희석되지 않는다. 일부 구체예들에서, ADC 샘플의 전체 양이 크기 배제 크로마토그래피 기질에 처리되기 때문에 ADC 샘플은 크기 배제 크로마토그래피로 분석하기 전에 희석을 필요로 하지 않는다. 일부 구체예들에서, 약 1 μg/μL 내지 약 500 μg/μL ADC를 내포하는 샘플이 분석된다.
기울기 분광법-기반 방법
일부 구체예들에서, DAR은 ADC 샘플에서 항체 및 약제의 농도를 계산함으로써 결정된다. 예를 들면, 기울기 분광법은 다양한 경로 길이들에서 용액의 흡광도를 결정하는 공지된 방법이다. 이후 Beer-Lambert 법칙에 기반하여 다양한 경로 길이들에서 흡광도 값을 사용하여, 용액 중의 화합물의 농도를 계산할 수 있다. 기울기 분광법을 이용하는 방법 및 시스템들은 공지이며 (예컨대, US 공개특허 20120130649 참고) 상업적으로 이용가능하다 (예컨대, SoloVPE (C Technologies, Inc., Bridgewater, NJ) 참고). 이러한 방법 및 시스템들은 ADC 제재에서 항체와 약제의 농도를 측정하기 위해 조정되었으며, 이러한 농도로부터 DAR이 결정되었다.
예를 들면, ADC 샘플을 용기에 넣을 수 있고; 프로브가 프로브가 용기 바닥과 접촉되도록 용기에 대해 프로브가 이동될 수 있으며; 프로브가 사전결정된 증분만큼 샘플을 통해 용기의 바닥으로부터 이동하도록 프로브가 용기에 대해 이동되어, 용액을 통과하는 사전선택된 경로 길이를 얻을 수 있고; 항체에 대한 흡광 최대값에서 흡광도를 판독할 수 있으며; 프로브는 샘플에 대해 반복적으로 이동될 수 있고 측정이 이루어질 수 있으며; 흡광도 및 경로 길이로부터 회귀선을 생성하여, 회귀선의 기울기를 얻을 수 있고; 회귀선의 기울기를 항체의 흡광 계수로 나누어 항체의 농도를 결정할 수 있다. 이후 약제에 대한 흡광 최대값을 사용하여 상기 단계들을 반복하여 약제의 농도를 결정할 수 있다. DAR은 결정된 약제 농도 및 항체 농도로부터 계산될 수 있다.
일부 구체예들에서, ADC 샘플은 기울기 분광법으로 분석하기 전에 희석되지 않는다. 일부 구체예들에서, 약 0.1 μg/μL 내지 약 500 μg/μL ADC를 내포하는 샘플이 분석된다.
항체-약제 접합체
본 명세서에서 사용되는 용어 “항체-약제 접합체”는, 생물학적 활성 세포독성 페이로드 (payload) 또는 약제에 항체를 연결시킴으로써 생성되는 단백질을 지칭한다. 항체-약제 접합체 (ADC)는 일반적으로 헤딩 분야의 숙련된 기술자들에게 공지된 화학적 변형/커플링을 통해 생성된다. 임의의 항체-약제 접합체는 본 명세서에 기재된 방법들을 사용하여 분석될 수 있다.
일부 구체예들에서, 항체-약제 접합체는 항-종양 항체를 포함한다 (예컨대, Adler 외, Hematol. Oncol. Clin. North Am. 26:447-81 (2012); Li 외, Drug Discov. Ther. 7:178-84 (2013); Scott 외, Cancer Immun. 12:14 (2012); 및 Sliwkowski 외, Science 341:1192-1198 (2013) 참고). 표 1은 공지의, 이용가능한 항체 물질들 (antibody agents)에 의해 표적되는 특정 인간 폴리펩티드 항원들의 비-포괄적 목록을 나타내며, 해당 항체 물질들이 유용한 것으로 제안되었던 특정 암 적응증들을 표시한다. 표 1의 항체들은 본 발명의 방법들을 사용하여 평가되는 항체-약제 접합체에 포함될 수 있다.
표 1:
일부 구체예들에서, 항체-약제 접합체는, 예를 들면, 구체적으로 바람직하지 않은 세포 증식과 연관된 하나 이상의 질병, 장애 또는 병태들을 치료함에 있어서의 사용에 이용되는 및/또는 제안되는 물질들을 포함하는 하나 이상의 세포사멸-촉진, 세포억제 및/또는 세포독성제인 약제를 포함한다. 많은 구체예들에서, 약제는 암 치료에 유용한 화학치료제이다. 일부 구체예들에서, 화학요법제는 하나 이상의 알킬화제, 하나 이상의 안트라사이클린, 하나 이상의 세포골격 붕괴제 (예컨대, 미세관 표적화제, 가령, 탁세인, 메이탄신 및 이의 유사체), 하나 이상의 에포틸론, 하나 이상의 히스톤 탈아세틸화효소 억제제 (HDACs), 하나 이상의 국소이성화효소 억제제 (예컨대, 국소이성화효소 I 및/또는 국소이성화효소 II의 억제제), 하나 이상의 키나제 억제제, 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 또는 뉴클레오티드 전구물질 유사체, 하나 이상의 펩티드 항생제, 하나 이상의 백금계 물질, 하나 이상의 레티노이드, 하나 이상의 빈카 알칼로이드, 및/또는 다음 중 하나 이상 (즉, 관련 항-증식 활성을 공유하는)의 하나 이상의 유사체 이거나 이를 포함할 수 있다. 일부 특정 구체예들에서, 화학요법제는 악티노마이신, 모든-트랜스 레티노산, 아우리스타틴, 아자시티딘, 아자티오프린, 블레오마이신, 보르테조밉, 카르보플라틴, 카페시타빈, 시스플라틴, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 쿠르쿠민, 사이타라빈, 다우노루비신, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 에피루비신, 에포틸론, 에토포시드, 플루오로우라실, 젬시타빈, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이마티닙, 이리노테칸, 메이탄신 및/또는 이의 유사체 (예컨대, DM1), 메클로레타민, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 메이탄시노이드, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 테니포시드, 티오구아닌, 토포테칸, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 및 이의 조합 중 하나 이상이거나 이를 포함할 수 있다.
일부 구체예들에서, 본 발명의 방법을 사용하여 평가되는 항체-약제 접합체는 hLL1-독소루비신, hRS7-SN-38, hMN-14-SN-38, hLL2-SN-38, hA20-SN-38, hPAM4-SN-38, hLL1-SN-38, hRS7-Pro-2-P-Dox, hMN-14-Pro-2-P-Dox, hLL2-Pro-2-P-Dox, hA20-Pro-2-P-Dox, hPAM4-Pro-2-P-Dox, hLL1-Pro-2-P-Dox, P4/D10-독소루비신, 젬투주맙 오조가미신, 브렌툭시맙 베도틴, 트라스투주맙 엠탄신, 이노투주맙 오조가미신, 글렘바투모맙 베도틴, SAR3419, SAR566658, BIIB015, BT062, CMC-544, SAR3419, CDX-011, SGN-75, SGN-CD19A, AMG-172, AMG-595, BAY-94-9343, ASG-5ME, ASG-22ME, ASG-16M8F, MDX-1203, MLN-0264, 항-PSMA ADC, RG-7450, RG-7458, RG-7593, RG-7596, RG-7598, RG-7599, RG-7600, RG-7636, ABT-414, IMGN-853, IMGN-529, IMGN-901, 보르세투주맙 마포도틴, 또는 로르보투주맙 메르탄신이다 (예컨대, Sassoon 외, Methods Mol. Biol. 1045:1-27 (2013); Bouchard 외, Bioorganic Med. Chem. Lett. 24: 5357-5363 (2014) 참고).
응용
본 발명의 방법은 다양한 응용들을 가지며, 예컨대, 약제 물질 또는 약제 제품의 상이한 제작 단계들에서, 약제 물질 또는 약제 제품 제작 전 및/또는 제작 완료 후 (예컨대, 충진/마감 환경 또는 시설로의 분배 전 또는 후) ADC 제재의 분석, 약제 물질 또는 약제 제품을 상업적으로 출시하기 전 또는 후 (예컨대, 약국, 간병인, 환자 또는 다른 최종 사용자에게 분배하기 전) 의 품질 관리를 포함한다. 일부 예들에서, ADC 제재는 약제 물질 (활성 제약학적 성분 또는 “API”) 또는 약제 제품 (인간 환자와 같은 대상체에서 사용하기 위해 제제화된 API)이다. 일부 예들에서, ADC 제재는 의료 제공자 또는 다른 최종 사용자에게 출시하기 전; 개별 투약형, 가령, 주사기, 펜, 바이얼, 또는 다회-용량 바이얼로 포장하기 전; 배치가 상업적으로 출시될 수 있는지 결정하기 전, 시험 인증서, 제품 안전 데이터 시트 (MSDS) 또는 제재의 분석 성적서 (CofA) 제작 전인, 제작 또는 사용 단계로부터 얻는다.
본 명세서에 기재된 방법들에 의한 평가들은 ADC 제재를 제조, 분배, 및 모니터하는 그리고 이의 안전하고 효능있는 사용을 제공하는 과정에서 수많은 활동 또는 단계들을 안내, 통제 또는 구현함에 유용하다. 그러므로, 한 구체예에서, 예컨대, 평가에 대한 응답으로, 예컨대, 기준을 만족시키는지 여부 (예컨대, 특정 DAR, 평균 DAR, 및/또는 DAR 범위)에 따라, 결정 또는 단계가 선택된다. 본 명세서에 기재된 방법들은 다음과 같은 결정을 하는 것을 포함할 수 있다: (a) ADC 제재가 약제 물질 또는 약제 제품으로 제제화될 수 있는지에 관하여; (b) ADC 제재가 재가공될 수 있는지에 관하여 (예컨대, 상기 제재가 이전 가공 단계에서 반복처리 될 수 있는지); 및/또는 (c) ADC 제재가 약제 물질 또는 약제 제품으로 제제화하기에 적합하지 않는지. 일부 예들에서, 방법들은 다음 단계들을 포함한다: 단계 (a)에서 언급되는 바와 같은 제형화 단계, 단계 (b)에서 언급되는 바와 같은 재가공 단계, 또는, 예컨대, 단계 (c)에서 언급되는 바와 같이, 제재에 라벨을 붙이거나 또는 파기하여 제재를 상업적 출시에 사용할 수 없도록 만드는 단계.

Claims (10)

  1. 다음 단계들을 포함하는, 항체-약제 접합체를 포함하는 조성물의 샘플에서 약제 대 항체 비율 (DAR) 결정 방법:
    샘플을 용기에 넣는 단계;
    프로브를 용기의 바닥에 접촉시키는 단계;
    사전결정된 증분만큼 샘플을 통해 용기의 바닥으로부터 프로브를 이동시켜, 샘플을 통과하는 사전선택된 빛의 경로 길이를 얻는 단계;
    제 1 광 파장 (λ1)에서 샘플의 흡광도를 탐지하는 단계로서, 여기서 상기 제 1 광 파장은 항체의 사전결정된 최대 흡광도인 단계;
    프로브를 샘플에 대해 이동시키고 제 1 광 파장에서 측정하는 것을 반복하는 단계;
    제 1 광 파장에서의 흡광도 및 경로 길이로부터 회귀선을 생성하여 회귀선의 기울기를 얻는 단계;
    회귀선의 기울기를 제 1 광 파장에서의 항체의 흡광 계수로 나누어 항체의 농도를 결정하는 단계;
    제 2 광 파장 (λ2)에서 샘플의 흡광도를 탐지하는 단계로서, 여기서 상기 제 2 광 파장은 약제의 사전결정된 최대 흡광도인 단계;
    프로브를 샘플에 대해 이동시키고 제 2 광 파장에서 측정하는 것을 반복하는 단계;
    제 2 광 파장에서의 흡광도 및 경로 길이로부터 회귀선을 생성하여 회귀선의 기울기를 얻는 단계;
    회귀선의 기울기를 제 2 광 파장에서의 약제의 흡광 계수로 나누어 약제의 농도를 결정하는 단계; 및
    결정된 약제의 농도 및 결정된 항체의 농도를 사용하여 DAR을 계산하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, DAR에 기초하여,
    (i) 조성물을 약제 물질 또는 약제 제품으로 제제화하는 단계;
    (ii) 조성물을 재가공하는 단계; 또는
    (iii) 조성물을 상업적 출시에 사용할 수 없도록 만드는 단계
    를 포함하는 DAR 결정 방법.
  3. 제1항에 있어서, 샘플은 0.1 μg/μL 내지 500 μg/μL의 항체-약제 접합체(ADC)를 포함하는 것인 DAR 결정 방법.
  4. 제1항에 있어서, 항체는 항-종양 항체인 DAR 결정 방법.
  5. 제1항에 있어서, 약제는 세포사멸-촉진, 세포억제 또는 세포독성제인 DAR 결정 방법.
  6. 제2항에 있어서, 조성물을 상업적 출시에 사용할 수 없도록 만드는 단계는 조성물에 라벨을 붙이거나 조성물을 파기하는 것을 포함하는 것인 DAR 결정 방법.
  7. 제1항에 있어서, 약제는 화학요법제를 포함하는 것인 DAR 결정 방법.
  8. 제7항에 있어서, 화학요법제는 미세관 표적화제, 에포틸론, 히스톤 탈아세틸화효소 억제제, 국소이성화효소 억제제, 키나제 억제제, 뉴클레오티드 유사체, 뉴클레오티드 전구물질 유사체, 펩티드 항생제, 백금계 제제, 레티노이드, 또는 빈카 알칼로이드를 포함하는 것인 DAR 결정 방법.
  9. 제7항에 있어서, 화학요법제는 악티노마이신, 모든-트랜스 레티노산, 아우리스타틴, 아자시티딘, 아자티오프린, 블레오마이신, 보르테조밉, 카르보플라틴, 카페시타빈, 시스플라틴, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 쿠르쿠민, 사이타라빈, 다우노루비신, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 에피루비신, 에포틸론, 에토포시드, 플루오로우라실, 젬시타빈, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이마티닙, 이리노테칸, 메이탄신, 메클로레타민, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 메이탄시노이드, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉세드, 테니포시드, 티오구아닌, 토포테칸, 발루비신, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 또는 비노렐빈을 포함하는 것인 DAR 결정 방법.
  10. 제1항에 있어서, 항체는 아데카투무맙, 아도트라스투주맙 엠탄신, 알렘투주맙, 아나투모맙, 아폴리주맙, 바비툭시맙, 베바시주맙, 벡투모맙, 블리나투모맙, 브렌툭시맙 베도틴, 칸투주맙, 카투막소맙, 세툭시맙, 다라투무맙, 데노수맙, 에드로콜로맙, 에피투모맙, 에타라시주맙, 파를레투주맙, 젬투주맙 오조가미신, 글렘바투무맙, 이필리무맙, 이브리투모맙, 라베투주맙, 로르보투주맙, 루카투무맙, 마파투무맙, 밀라투주맙, 민레투모맙, 니모투주맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 오레고보맙, 파니투무맙, 펨투모맙, 페르투주맙, 리툭시맙, 시브로투주맙, 토시투모맙, 트라스투주맙, 벨투주맙 또는 볼로식시맙을 포함하는 것인 DAR 결정 방법.
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