KR102602507B1 - 유전자 정제 및 이미징을 위한 방법 및 장치 - Google Patents

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Abstract

본 개시내용은 핵산 또는 단백질 정제 및 이미징을 위한 시스템, 디바이스 및 방법에 관한 것이다. 프로브와 각각 혼성화된 복수의 표적 분자를 포함하는 복수의 혼성화된 복합체 및 복수의 비혼성화된 프로브를 포함하는 샘플을 보유하도록 구성된 샘플 투입 영역을 포함하는 카트리지를 포함하는 시스템이 제공된다. 카트리지는 또한 샘플을 수용하고 결합하기 위해 제1 자성 비드를 갖도록 구성된 제1 결합 챔버, 제1 자성 비드를 수용하고 제1 자성 비드로부터 샘플을 용출시키도록 구성된 제1 용출 채널, 샘플을 수용하고 결합하기 위해 제2 자성 비드를 갖도록 구성된 제2 결합 챔버, 제2 자성 비드를 수용하고 제2 자성 비드로부터 샘플을 용출시키도록 구성된 제2 용출 채널, 및 용출된 샘플을 수용하고 이미징을 위해 분자를 보유하도록 구성된 결합 영역을 포함할 수 있다.

Description

유전자 정제 및 이미징을 위한 방법 및 장치{METHODS AND APPARATUSES FOR GENE PURIFICATION AND IMAGING}
관련 출원들에 대한 상호 참조
본 출원은 2014년 11월 24일에 출원된 미국 가출원 제62/083,681호에 대해 35 U.S.C. §119 하에 우선권을 주장한다. 앞서 언급된 출원의 내용은 그 전문이 본원에서 인용에 의해 포함된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 포맷으로 제출되었으며 그 전문이 본원에서 참고로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2015년 11월 23일에 생성된 상기 ASCII 카피는 NATE-023_ST25.txt로 명명되며 크기가 815 바이트이다.
발명의 분야
본 기술 혁신은 일반적으로 분자 샘플 디지털 계산을 다루며, 보다 구체적으로는, 핵산 및 단백질 샘플 정제 및 관련된 분자 바코드의 이미징을 위한 방법 및 장치를 포함한다.
그러나, 혁신에 대한 독자의 이해를 발전시키기 위해, 개시내용들은 이러한 혁신의 측면들이 어떻게 독립적으로 운영되고/거나, 개별 혁신 사이에서 상호 운용되고/거나, 집단적으로 협력할 수 있는지를 설명하고 밝히기 위해 하나의 설명으로 작성되었다. 본 출원은 여러 혁신 사이의 상호 관계 및 시너지 효과를 더 자세히 설명하며; 이들 모두는 35 U.S.C. §112에 따른다.
과학자들은 분자를 정제하고 검출하기 위해 복수의 방법을 사용한다. 종래의 시스템은 별도의 계측기(instrument)에서 유체 공학 및 분자 바코드의 이미징을 갖고, 방출 채널 당 하나의 조명 채널을 가지며, 정제 및 이미징 기계를 통해 샘플을 이동시키는 비효율적인 방법을 갖는다.
본 발명은 핵산 또는 단백질 정제 및 이미징을 위한 시스템, 디바이스 및 방법을 제공한다.
본 발명의 일 양태는 혼성화된 표적 분자 샘플을 정제하고 혼성화된 표적 분자를 이미징하도록 구성된 카트리지를 제공한다. 카트리지는 샘플 투입 영역, 제1 결합 챔버, 제1 용출 채널, 제2 결합 챔버, 제2 용출 채널, 및 결합 영역을 포함한다.
이 양태에서, 샘플 투입 영역은 표적 분자 샘플을 보유하도록 구성될 수 있으며, 예를 들어, 복수의 혼성화된 복합체(제1 프로브 및/또는 제2 프로브와 각각 혼성화된 복수의 표적 분자를 포함함), 복수의 비혼성화된 제1 프로브, 및 복수의 비혼성화된 제2 프로브를 포함한다. 제1 결합 챔버는 제1 친화성 매트릭스를 수용 및/또는 함유하고/거나 샘플을 수용하도록 구성될 수 있다. 제1 친화성 매트릭스는 제1의 기간 동안 샘플의 비혼성화된 제1 프로브 및/또는 혼성화된 복합체와 결합하도록 구성된 제1 분자로 작용화될 수 있다. 제1 결합 챔버는 샘플의 비혼성화된 제1 프로브 및/또는 혼성화된 복합체가 제1 친화성 매트릭스와 결합된 후 샘플로부터 비혼성화된 제2 프로브를 제거하기 위해 제1 버퍼를 수용하도록 부가적으로 구성될 수 있다. 제1 용출 채널은 제1의 기간 후에 제1 친화성 매트릭스를 수용하도록 구성될 수 있고/거나 제1 친화성 매트릭스를 가열하여 복수의 혼성화된 복합체 및/또는 복수의 비혼성화된 제1 프로브를 포함하는 제1의 용출 샘플을 용출시키도록 구성될 수 있다. 제2 결합 챔버는 제2 친화성 매트릭스를 수용 및/또는 함유하고/거나 제1의 용출 샘플을 수용하도록 구성될 수 있다. 제2 친화성 매트릭스는 제2의 기간 동안 혼성화된 복합체와 결합하도록 구성된 제2 분자로 작용화될 수 있다. 제2 결합 챔버는 적어도 비혼성화된 제1 프로브를 제거하기 위해 제2 버퍼를 수용하도록 부가적으로 구성될 수 있다. 제2 용출 채널은 제2의 기간 후에 제2 친화성 매트릭스를 수용하도록 구성될 수 있고/거나 제2 친화성 매트릭스를 가열하여 복수의 혼성화된 복합체를 포함하는 제2의 용출 샘플을 용출시키도록 구성될 수 있다. 결합 영역은 제2의 용출 샘플을 수용하고/거나 혼성화된 복합체와 결합하도록 구성된 활성 결합 표면을 가질 수 있다.
본 양태의 실시양태들에서, 표적 분자는 핵산 또는 단백질일 수 있다. 실시양태들에서, 제1 친화성 매트릭스 및/또는 제2 친화성 매트릭스는, 각각, 제1 세트의 자성 비드(예를 들어, 올리고뉴클레오티드-커플링된 자성 비드, 예를 들어, F 자성 비드) 및/또는 제2 세트의 자성 비드(예를 들어, 올리고뉴클레오티드-커플링된 자성 비드, 예를 들어, G 자성 비드)에 상응한다. 카트리지는 복수의 버퍼 투입 영역, 복수의 제1 결합 챔버, 복수의 폐기물 배출 영역, 및/또는 복수의 비드 패드를 더 포함할 수 있다. 버블 벤트(bubble vent)가 샘플 투입부 및/또는 제1 결합 챔버를 분리하도록 및/또는 기포를 제거하도록 구성될 수 있다. 실시양태들에서, 활성 결합 표면은 스트렙트아비딘, 아비딘(예를 들어, Neutravidin™), 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 실시양태들에서, 제1 프로브는 포획 프로브를 포함한다. 실시양태들에서, 제2 프로브는 리포터 프로브를 포함한다. 실시양태들에서, 카트리지는 유체 매니폴드 및/또는 복수의 폐기물 밸브에 작동가능하게 커플링된 복수의 오프-카드(off-card) 버퍼 투입 밸브에 작동가능하게 커플링될 수 있다. 실시양태들에서, 카트리지는 유체 매니폴드에 작동가능하게 커플링된 복수의 온-카드(on-card) 버퍼 투입 밸브를 더 포함한다. 복수의 오프-카드 버퍼 투입 밸브는 유체 매니폴드로부터 제1 버퍼 및/또는 제2 버퍼를 수용하고/거나 버퍼를 카트리지에 제공하도록 구성될 수 있다. 실시양태들에서, 제2의 용출 샘플의 결합 영역으로의 유동은 압력 프로파일에 기초하여 재배열될 수 있는 작은 단계들로 행해질 수 있다. 실시양태들에서, 결합 영역은 유동에 의해 연신한 후에 활성 결합 표면 상에 제2의 용출 샘플을 고정화하도록 제제화된 용액(예를 들어, G-후크(hook), 페이드 방지(anti-fade) 매체, 및/또는 피디셜(fiducial)을 포함함)을 수용하도록 추가적으로 구성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 혼성화된 표적 분자 샘플을 정제하고 혼성화된 표적 분자를 이미징하도록 구성된 카트리지를 제공한다. 카트리지는 버퍼 투입 영역, 버블 벤트, 제1 결합 챔버, 제1 용출 채널, 제2 결합 챔버, 제2 용출 채널, 및 결합 영역을 포함한다.
이러한 양태에서, 버퍼 투입 영역은, 예를 들어, 복수의 혼성화된 복합체(복수의 표적 분자, 리포터 프로브, 및/또는 포획 프로브를 포함함), 복수의 비혼성화된 리포터 프로브, 및/또는 복수의 비혼성화된 포획 프로브를 포함하는, 표적 분자 샘플을 보유하도록 구성될 수 있다. 버블 벤트는 샘플 투입부와 제1 결합 챔버를 분리하고/거나 기포를 제거하도록 구성될 수 있다. 제1 결합 챔버는 F 자성 비드를 수용하고/거나 함유하도록 및/또는 샘플을 수용하도록 구성될 수 있다. 제1 결합 챔버는, 샘플의 비혼성화된 리포터 프로브 및/또는 혼성화된 복합체가 (제1의 기간 동안 샘플의 비혼성화된 리포터 프로브 및/또는 혼성화된 복합체와 결합하도록 구성된 제1 분자로 작용화될 수 있는) F 자성 비드와 결합된 후 샘플로부터 비혼성화된 리포터 프로브를 제거하기 위해 제1 버퍼를 수용하도록 부가적으로 구성될 수 있다. 제1 용출 채널은 제1의 기간 후에 F 자성 비드를 수용하도록 구성될 수 있고/거나 F 자성 비드를 가열하여 복수의 혼성화된 복합체 및/또는 복수의 비혼성화된 리포터 프로브를 포함하는 제1의 용출 샘플을 용출시키도록 구성될 수 있다. 제2 결합 챔버는 G 자성 비드를 수용하고/거나 함유하도록 및/또는 제1의 용출 샘플을 수용하도록 구성될 수 있다. 제2 결합 챔버는 적어도 비혼성화된 포획 프로브를 제거하기 위해 제2 버퍼를 수용하도록 부가적으로 구성될 수 있다. G 자성 비드는 제2의 기간 동안 혼성화된 복합체와 결합하도록 구성된 제2 분자로 작용화될 수 있다. 제2 용출 채널은 제2의 기간 후에 G 자성 비드를 수용하도록 구성될 수 있고/거나 G 자성 비드를 가열하여 복수의 혼성화된 복합체를 포함하는 제2의 용출 샘플을 용출하도록 구성될 수 있다. 결합 영역은 제2의 용출 샘플을 수용하도록 및/또는 혼성화된 복합체와 결합하도록 구성된 활성 결합 표면을 가질 수 있다. 카트리지는 유체 매니폴드에 작동가능하게 커플링된 복수의 오프-카드 버퍼 투입 밸브에 작동가능하게 커플링될 수 있다. 복수의 오프-카드 버퍼 투입 밸브는 제1 버퍼 및/또는 제2 버퍼를 유체 매니폴드로부터 수용하도록 및/또는 제1 및/또는 제2 버퍼를 카트리지에 제공하도록 구성될 수 있다. 복수의 폐기물 밸브는 제1 및/또는 제2 버퍼를 카트리지로부터 수집하도록 구성될 수 있다.
본 양태의 실시양태들에서, 표적 분자는 핵산 또는 단백질일 수 있다. 실시양태들에서, 활성 결합 표면은 스트렙트아비딘, 아비딘(예를 들어, Neutravidin™), 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 복수의 혼성화된 복합체를 이미징하기 위한 시스템을 제공한다. 이 시스템은 본원에 기재된 양태들 또는 실시양태들 중 어느 것의 카트리지, 시스템에 작동가능하게 커플링되고 카트리지를 보유하도록 구성된 카트리지 트레이, 카트리지에 작동가능하게 커플링된 제1 히터, 카트리지에 작동가능하게 커플링된 제2 히터, 카트리지 트레이 아래에서 이미징 디바이스에 작동가능하게 커플링된 자석, 카트리지 트레이 위에서 시스템에 작동가능하게 커플링되고 복수의 버퍼를 보유하도록 및/또는 이의 유동을 제어하도록 구성된 유체 매니폴드, 유체 매니폴드 및 카트리지에 작동가능하게 커플링된 복수의 오프-카드 버퍼 투입 밸브; 카트리지 트레이 위에서 시스템에 작동가능하게 커플링된 복수의 폐기물 밸브, 및 카트리지 트레이 위에서 이미징 디바이스에 작동가능하게 커플링된 이미징 기준 표면을 포함한다.
본 양태의 실시양태들에서, 제1 히터는 제1 용출 채널을 가열하도록 구성될 수 있다. 실시양태들에서, 제2 히터는 제2 용출 채널을 가열하도록 구성될 수 있다. 실시양태들에서, 자석은 제1 및/또는 제2 결합 챔버 및/또는 제1 및/또는 제2 용출 채널 내에서 제1 자성 비드 및/또는 제2 자성 비드를 이동시키도록 구성될 수 있다. 실시양태들에서, 자석은 카트리지 트레이에 평행하게 이동하도록 구성될 수 있다. 실시양태들에서, 복수의 오프-카드 버퍼 투입 밸브는 유체 매니폴드로부터 복수의 버퍼를 수용하도록 및/또는 복수의 버퍼를 카트리지에 제공하도록 구성될 수 있다. 실시양태들에서, 복수의 폐기물 밸브는 복수의 버퍼를 카트리지로부터 수집하도록 구성될 수 있다. 실시양태들에서, 시스템은, 이미징 디바이스에 작동가능하게 커플링되고 적어도 하나의 접촉 패드에 대해 사전 적재(preloading)를 허용하도록 구성된 캠 접촉 패드, 이미징 디바이스의 이동 클램프와 베이스 사이의 적어도 하나의 조정가능 접점, 적어도 하나의 조정가능 접점은 기준(datum) A의 조정을 허용하도록 구성됨, 및 이미징 디바이스에 작동가능하게 커플링되고 이동 클램프를 이동시키도록 구성된 클램프 모터를 더 포함한다. 실시양태들에서, 카트리지 트레이 위에서 시스템에 작동가능하게 커플링된 복수의 폐기물 밸브 및 복수의 오프-카드 버퍼 투입 밸브 중 적어도 하나는 공기압으로 제어될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 혼성화된 표적 분자 샘플을 정제하고 혼성화된 표적 분자를 이미징하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(a) 혼성화된 샘플을 수용하는 단계로서, 샘플이 제1 프로브 및 제2 프로브와 혼성화된 표적 분자를 포함하는 복수의 혼성화된 복합체, 복수의 비혼성화된 제1 프로브, 및 복수의 비혼성화된 제2 프로브를 포함하는 것인 단계,
(b) 제1의 기간 동안 샘플의 비혼성화된 제1 프로브 및 혼성화된 복합체를 제1 친화성 매트릭스에 결합시켜 제1 혼합물을 생성하는 단계,
(c) 샘플의 비혼성화된 제1 프로브 및 혼성화된 복합체가 제1 친화성 매트릭스와 결합된 후 제1 버퍼를 제1 혼합물에 유동시켜 비혼성화된 제2 프로브를 제1 혼합물로부터 제거하는 단계,
(d) 제1 혼합물을 가열하여 비혼성화된 제1 프로브 및 혼성화된 복합체를 제1 친화성 매트릭스로부터 유리시키고 복수의 혼성화된 복합체 및 복수의 비혼성화된 제1 프로브를 포함하는 제1의 용출 샘플을 용출시키는 단계,
(e) 제2의 기간 동안 제1의 용출 샘플의 혼성화된 복합체를 제2 친화성 매트릭스에 결합시켜 제2 혼합물을 생성하는 단계,
(f) 혼성화된 복합체가 제2 친화성 매트릭스와 결합된 후 제2 버퍼를 제2 혼합물에 유동시켜 비혼성화된 제1 프로브를 제1의 용출 샘플로부터 제거하는 단계,
(g) 제2 혼합물을 가열하여 혼성화된 복합체를 제2 친화성 매트릭스로부터 유리시켜 복수의 혼성화된 복합체를 포함하는 제2의 용출 샘플을 용출시키는 단계, 및
(h) 혼성화된 복합체를 이의 이미징을 위한 활성 결합 표면에 결합시키는 단계.
본 양태의 실시양태들에서, 표적 분자는 핵산 또는 단백질일 수 있다. 실시양태들에서, 제1 친화성 매트릭스 및 제2 친화성 매트릭스는, 각각, 제1 세트의 자성 비드 및 제2 세트의 자성 비드에 상응한다. 실시양태들에서, 활성 결합 표면은 스트렙트아비딘, 아비딘(예를 들어, Neutravidin™), 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가 양태는 혼성화된 표적 분자 샘플을 정제하고 혼성화된 표적 분자를 이미징하기 위한 방법을 제공한다. 이 방법은 하기 단계들을 포함한다:
(a) 본원에 기재된 양태들 또는 실시양태들 중 어느 것의 카트리지를 제공하는 단계,
(b) 혼성화된 샘플을 수용하는 단계로서, 샘플이 제1 프로브 및 제2 프로브와 혼성화된 표적 분자를 포함하는 복수의 혼성화된 복합체, 복수의 비혼성화된 제1 프로브, 및 복수의 비혼성화된 제2 프로브를 포함하는 것인 단계,
(c) 제1의 기간 동안 제1 결합 챔버에서 샘플의 비혼성화된 제1 프로브 및 혼성화된 복합체를 제1 친화성 매트릭스에 결합시키는 단계,
(d) 샘플의 비혼성화된 제1 프로브 및 혼성화된 복합체가 제1 친화성 매트릭스에 결합된 후 제1 버퍼를 제1 결합 챔버 내에 유동시켜 비혼성화된 제2 프로브를 샘플로부터 제거하는 단계,
(e) 제1 친화성 매트릭스를 제1 용출 채널로 향하게 하는 단계,
(f) 제1 친화성 매트릭스를 가열하여 복수의 혼성화된 복합체 및 복수의 비혼성화된 제1 프로브를 포함하는 제1의 용출 샘플을 용출시키는 단계,
(g) 제2의 기간 동안 제2 결합 챔버에서 제1의 용출 샘플의 혼성화된 복합체를 제2 친화성 매트릭스에 결합시키는 단계,
(h) 혼성화된 복합체가 제2 친화성 매트릭스와 결합된 후 제2 버퍼를 제2 결합 챔버 내에 유동시켜 비혼성화된 제1 프로브를 제1의 용출 샘플로부터 제거하는 단계,
(i) 제2 친화성 매트릭스를 가열하여 복수의 혼성화된 복합체를 포함하는 제2의 용출 샘플을 용출시키는 단계, 및
(j) 혼성화된 복합체를 이의 이미징을 위한 활성 결합 표면에 결합시키는 단계.
본 양태의 실시양태들에서, 표적 분자는 핵산 또는 단백질일 수 있다. 실시양태들에서, 제1 친화성 매트릭스 및 제2 친화성 매트릭스는, 각각, 제1 세트의 자성 비드(예를 들어, F 자성 비드) 및 제2 세트의 자성 비드(예를 들어, G 자성 비드)에 상응한다. 실시양태들에서, 활성 결합 표면은 스트렙트아비딘, 아비딘(예를 들어, Neutravidin™), 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 실시양태들에서, 제1 프로브는 리포터 프로브를 포함한다. 실시양태들에서, 제2 프로브는 포획 프로브를 포함한다. 실시양태들에서, 제1 결합 챔버는 F 결합 챔버일 수 있다. 실시양태들에서, 제1의 기간은 약 8분의 기간일 수 있다. 실시양태들에서, 제1 자성 비드는 약 7분간 약 47℃로 가열될 수 있다. 실시양태들에서, 제2 결합 챔버는 G 결합 챔버일 수 있다. 실시양태들에서, 제2 버퍼는 F-용출 유체일 수 있다. 실시양태들에서, 제2의 기간은 약 7분의 기간일 수 있다. 실시양태들에서, 제2 버퍼는 제2 결합 챔버에 전방향(forward) 2μL 및 후방향(backward) 1μL의 증분으로 첨가될 수 있다. 실시양태들에서, 제2 버퍼는 약 +2.8μL, +2μL, -1μL, +2μL, -1μL, +1.5μL, 및 7μL의 증분으로 첨가될 수 있다. 실시양태들에서, 제2 자성 비드는 약 7분간 약 47℃로 가열될 수 있다. 실시양태들에서, 이 방법은 소정량의 제1의 용출 샘플을 제1 방향 및 제2 방향으로 친화성 매트릭스 패드를 가로질러 이동시키는 단계를 더 포함한다. 실시양태들에서, 제1 버퍼는 샘플-비드 혼합물을 제1 비드 패드를 통해 제1 방향 및 제2 방향으로 이동시키기 위해 펌핑될 수 있다. 실시양태들에서, 제1 버퍼는 대략 +15μL, 및 -15μL의 증분으로 첨가될 수 있다. 상기 양태들 및 실시양태들 중 임의의 양태 또는 실시양태가 임의의 다른 양태 또는 실시양태와 조합될 수 있다.
달리 정의된 바가 없다면, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속한 분야의 일반적 지식을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서, 단수 형태는 문맥상 다르게 지시하지 않는 한 복수를 포함하며; 예로서, 용어들 "하나", "하나의" 및 "그것"은 단수 또는 복수인 것으로 이해되고 용어 "또는"은 포괄적인 것으로 이해된다. 예를 들어, "요소"는 하나 이상의 요소를 의미한다. 명세서 전반에 걸쳐, 단어 "포함하는", 또는 이의 변형어 예컨대 "포함하다" 또는 "포함하는"은 언급된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 포함하는 것을 의미하고, 임의의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들, 정수들 또는 단계들의 군을 배제하는 것이 아닌 것으로 이해될 것이다. 약은 언급된 값의 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 이내인 것으로 이해될 수 있다. 문맥상 명확하지 않다면, 본원에서 제공된 모든 수치는 용어 "약"에 의해 변경되어진다.
본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기에 기술된다. 본원에서 언급된 모든 공보, 특허 출원, 특허, 및 다른 문헌은 그 전문이 인용에 의해 포함된다. 본원에서 인용된 문헌은 청구된 발명에 대해 선행기술인 것으로 인정되는 것은 아니다. 충돌이 있는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 이외에, 재료, 방법, 및 실시예는 단지 설명을 위한 것이며 제한적인 것으로 의도되지 않는다. 본 발명의 다른 특징 및 이점은 하기 상세한 설명 및 청구범위로부터 명확해질 것이다.
본 특허 또는 출원 파일은 칼라로 작성된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 칼라 도면을 포함하는 본 특허 또는 특허 출원 공보 사본은 요청 및 필요한 수수료 납부시 관청으로부터 제공받게 될 것이다.
첨부된 부록들 및/또는 도면들은 본 명세서에 따른 다양한 비제한 예들, 혁신적인 양태들을 예시한다.:
도 1a는 일부 실시양태들에 따른 주요 공정들의 블록 다이어그램을 도시한다.
도 1b-e는 일부 실시양태들에 따른 기본적인 기초 화학을 보여주는 블록 다이어그램을 도시한다.
도 2는 일부 실시양태들에 따른 정제 및 이미징 공정을 보여주는 상세한 논리 흐름도를 도시한다.
도 3a는 유체 카트리지의 라벨링된 사진을 도시한다.
도 3b는 2번의 정제가 일어나는 유체층을 도시한다.
도 4는 일부 실시양태들에 따른 카트리지를 구축하기 위한 층 적층을 보여주는 도해(pictorial diagram)이다.
도 5는 유체학적 기능과 이미징 기능 둘다를 실행하는 기계를 보여주는 도해이다.
도 6a는 일부 실시양태들에 따라 샘플을 카트리지 내에 주입하는 것을 보여주는 도해이다.
도 6b는 (교차 오염을 방지하기 위해) 일부 실시양태에 따라 테이프를 샘플 투입 후 적용하고 버퍼 포트로부터 제거하는 것을 도시한다.
도 7-9b는 일부 실시양태들에 따른 계측기를 보여주는 도해이다.
도 10은 일부 실시양태들에 따른 이미징 카트리지를 보여주는 도해이다.
도 11-12는 일부 실시양태들에 따라 샘플을 정제하는 것을 보여주는 도해이다.
도 13a-14는 일부 실시양태들에 따라 샘플을 정제하는 것을 보여주는 도해이다.
도 15-17은 일부 실시양태들에 따라 샘플을 정제하는 것을 보여주는 도해이다.
도 18은 일부 실시양태들에 따라 정제된 샘플을 이미징 표면으로 이동시키는 것을 보여주는 도해이다.
도 19a-b는 일부 실시양태들에 따라 샘플을 이미징 표면에 첨가하는 것을 보여주는 그래프이다.
도 20-21은 일부 실시양태들에 따라 정제된 샘플을 이미징 표면에 결합시키는 것을 보여주는 도해이다.
도 22는 3개의 nCounter® 팬캔서(PanCancer) 패널에 대해 nCounter® 분석 시스템을 사용하여 얻어진 결과 및 본 발명의 일부 실시양태들에 따라 얻어진 결과를 비교하는 그래프를 도시한다.
도 23은 본 발명의 일부 실시양태들에 따라 얻어진 미분형(differential) 유전자 발현 데이터를 보여주는 그래프를 도시한다.
도 24는 총 RNA 또는 생세포 용해물의 검출을 보여주는 그래프를 도시한다.
도 25는 신선 냉동 조직으로부터 또는 포르말린-고정된 파라핀-포매된(FFPE) 조직으로부터 총 유전자 발현의 검출을 보여주는 그래프를 도시한다.
도 26은 팬캔서 프로그레션(Progression) 패널에 대해 nCounter® 분석 시스템을 사용하여 얻어진 결과 및 본 발명의 일부 실시양태들에 따라 얻어진 결과를 비교하는 그래프를 도시한다.
도 27은 휴먼 이뮤놀로지(Human Immunology) 패널에 대해 nCounter® 분석 시스템을 사용하여 얻어진 결과 및 본 발명의 일부 실시양태들에 따라 얻어진 결과를 비교하는 그래프를 도시한다.
도 28은 카피수 변동(CNV; copy number variation) 어세이에서 nCounter® 분석 시스템을 사용하여 얻어진 결과 및 본 발명의 일부 실시양태들에 따라 얻어진 결과를 비교하는 그래프를 도시한다.
도 29는 miRNA 분석에서 nCounter® 분석 시스템을 사용하여 얻어진 결과 및 본 발명의 일부 실시양태들에 따라 얻어진 결과를 비교하는 그래프를 도시한다.
도 30은 RNA-단백질 프로파일링 데이터에 대해 nCounter® 분석 시스템을 사용하여 얻어진 결과 및 본 발명의 일부 실시양태들에 따라 얻어진 결과를 비교하는 그래프를 도시한다.
도면 내의 각각의 참조 번호의 선두 번호는 그 참조 번호가 도입 및/또는 상세화되는 도면을 나타낸다. 이처럼, 참조 번호 101의 상세한 설명은 도 1에서 발견 및/또는 도입될 것이다. 참조 번호 201은 도 2에 도입되어 있으며, 나머지도 마찬가지이다.
본 개시내용의 일부 실시양태들이 상세히 기술되기 전에, 그러한 실시양태들은 개시된 특정 변형들로 제한되지 않고 물론 변경될 수 있음을 이해해야 한다. 기술된 실시양태들에 다양한 변경이 가해질 수 있고 등가물은 본원에 개시된 본 발명의 진정한 사상 및 범위를 벗어나지 않고 대체될 수 있다. 부가적으로, 특정 상황, 재료, 물질 조성, 공정, 공정 행위(들) 또는 단계(들)를 본 개시내용의 목적(들), 사상 또는 범위에 맞추기 위해 많은 변형이 이루어질 수 있다. 이러한 모든 변경은 본 개시내용에 의해 뒷받침되는 임의의 및 모든 청구범위의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
본 명세서에 열거된 방법들은 논리적으로 가능한 열거된 사건들의 임의의 순서 및 사건들의 열거된 순서로 수행될 수 있다. 나아가, 값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한과 하한 사이의 모든 개재 값 및 언급된 범위 내의 임의의 다른 명시된 또는 개재 값은 본 개시내용의 실시양태들에 포함되는 것으로 이해된다. 또한, 본원에 기술된 개시된 실시양태들 중 하나 및/또는 다른 실시양태들의 임의의 선택적 특징은 독립적으로 또는 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 특징들과 조합하여 제시되고 청구될 수 있는 것으로 의도된다.
단수 항목에 대한 언급은 동일한 항목이 복수 존재할 가능성을 포함한다. 보다 구체적으로, 본원에서 그리고 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "하나", "및", "상기" 및 "그것"은 문맥상 명확히 달리 지시하지 않는 한 복수형을 포함한다. 청구범위는 임의의 선택적 요소를 배제하도록 초안될 수 있음을 또한 유의해야 한다. 이처럼, 이러한 언급은 청구 요소들의 언급과 관련하여 "유일하게", "단지" 등과 같은 배타적 용어의 사용에 대해 또는 "부정적(소극적)" 제한의 사용에 대해 선행어(antecedent basis)로서 작용하는 것으로 의도된다. 달리 정의된 바가 없다면, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속한 분야의 일반적 지식을 가진 자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
일부 실시양태들에서, 샘플(예를 들어, 핵산 샘플)을 판독하는 사용자는 샘플을 정제 및 검출하기 위해 단일 디바이스를 사용하기를 원할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 두 목적을 위한 단일 디바이스의 사용은 처리 시간, 오염의 가능성, 이미징 분석 수행 비용, 전체 시스템 비용, 시간/단계에 대한 수고, 및/또는 여타의 것을 감소시킬 수 있다.
도 1a-e는 일부 실시양태들에 따른 정제 및 이미징 공정을 보여주는 블록 다이어그램을 도시한다. 예를 들면, 계측기의 사용자가 처리를 위해 샘플을 혼성화하고/거나 달리 준비할 수 있다. 도 1b를 참조하면, 일부 예에서, 사용자는, 예를 들어, 표적 핵산(114)에 결합하도록 구성되고, 자성 비드에 결합하도록 구성된 친화성 태그를 포함하는 프로브를 사용하여, 표적 핵산(114)을 혼성화하기를 원할 수 있다. 표적 핵산(114)은 모든 형태의 핵산(예를 들어, RNA, DNA, 마이크로RNA, 및/또는 여타의 것)을 포함할 수 있다. (예를 들어, 핵산 중간체를 통해 검출될 수 있는) 포획 및/또는 리포터 프로브에 부착될 수 있는 단백질, 및/또는 임의의 다른 분자가 또한 분석을 위해 혼성화될 수 있다. 예를 들면, 혼성화는 표적 핵산을 포획 프로브(116) 및 리포터 프로브(120)와 혼합하는 것을 수반할 수 있다. 포획 프로브(116)는 복합체를 이미징 표면에 결합시키는데 사용되는 비오틴 모이어티, 및/또는 F 자성 비드에 결합하도록 구성된 F 태그를 포함할 수 있다. 리포터 프로브(120)는 이미징 공정에 사용되는 형광 바코드, 및/또는 G 자성 비드에 결합하도록 구성된 G 태그를 포함할 수 있다. 표적 핵산(114)이 리포터 및 포획 프로브에 결합하는 경우, 이는 혼성화된 삼성분 복합체(124)를 생성할 수 있으며 추후 이미징 및/또는 유사 공정을 위해 정제될 수 있다.
도 1b에 도시된 바와 같이, 2개의 대략 50 염기쌍 프로브가 용액에서 각 표적 분자에 직접 혼성화되어 혼성화된 삼성분 복합체를 형성한다. 리포터 프로브는 특정 형광 바코드를 운반하고, 포획 프로브는, 추후 삼성분 복합체를 이미징 표면에 결합시키는 비오틴 모이어티를 함유한다. 두 프로브는 자성 비드-기반 정제 및 고정화를 위해 필요한 ("F" 또는 "G"로 불리는) 친화성 태그를 함유한다.
도 1a를 참조하면, 사용자는 (본 개시내용의 양태들/실시양태들에 의해 자동으로 취급될 수 있는) 계측기의 카트리지 트레이에 놓이도록 구성된 샘플 카트리지 내에 샘플(예를 들어, 혼성화된 핵산 샘플 및/또는 유사한 혼성화된 생물학적 샘플)을 피펫팅(102)할 수 있다. 혼성화된 생물학적 샘플은 또한 유전자에 결합하지 않을 수 있는 비혼성화된 프로브(예를 들어, 과량의 프로브)를 포함할 수 있다. 카트리지는 또한 자성 비드를 보유하도록 구성된 패드(예를 들어, 유리 섬유 패드)를 가질 수 있다. 자성 비드는 복수의 다양한 형태, 예컨대 F 비드, G 비드, 및/또는 이와 유사한 것일 수 있다. 일부 구현에서, F 비드는 포획 프로브 상에서 발견되는 반복된 서열의 역 상보체인 DNA 올리고뉴클레오티드에 커플링되는 자성 비드이며, 정제 동안 혼성화된 복합체 및 유리의 포획 및/또는 리포터 프로브를 분리하기 위해 친화성 매트릭스로서 사용된다. 자성 비드는 버퍼 및 당(예를 들어, 트레할로스)으로 건조시켜 비드를 안정화시키고 샘플에서의 현탁을 위해 준비될 수 있다. 카트리지는 또한 오프-카드 버퍼 밸브(예를 들어, 도 9a의 902 참조)로부터 버퍼를 수용하도록 구성된 온-카드 버퍼 투입 밸브, 및 결합 챔버, 용출 챔버, 및/또는 정제 공정을 위해 사용되는 유사한 영역 및 사용된 용출 유체를 보유하도록 구성된 폐기물 용기 사이의 흐름을 제어하도록 구성된 공기압 밸브를 갖도록 구성될 수 있다.
카트리지는 하기 컴포넌트를 포함하는 다층 카트리지(예를 들어, 도 4에서 402 참조)일 수 있다:
Figure 112017060451110-pct00001
도 1a를 참조하면, 샘플은, 혼성화된 샘플로부터 과량의 적어도 일 타입의 프로브(예를 들어, 리포터 프로브)를 제거하도록 구성된 건조 자성 비드(예를 들어, 포획 프로브 상의 반복부에 상보적인, 15-mer DNA 올리고뉴클레오티드, 5'-GCT GTG ATG ATA GAC-3'(서열 번호: 1)에 커플링되는 F 자성 비드(예를 들어, F 비드, 항-F 자성 비드))에 도입될 수 있다 (예를 들어, 도 1a의 104 참조). F 비드는 패드 상에서 5X SSPE 및 40% 트레할로스 중에서 건조될 수 있다 (예를 들어, 도 3a의 309 참조; 비드 패드는 버블 벤트 아래에 부분적으로 숨겨짐). 일부 실시양태들에서, F 비드 및 샘플은, F 비드의 혼성화된 삼성분 복합체 분자에의 결합을 촉진하도록 (예를 들어, 도 1c의 126 참조), 및 이러한 비혼성화된 프로브(예를 들어, 리포터 프로브)의 적어도 일부가 샘플로부터 세척되도록 (예를 들어, 도 1c의 128 참조) 비드를 세척하도록 구성된 결합 챔버(예를 들어, 도 3a 및 3b의 308 참조)에서 배합될 수 있다. 결합 챔버는, 비드가 가열되도록 할 수 있고 (예를 들어, 47℃까지) 샘플이 용출되도록 할 수 있는 (예를 들어, 도 1c의 130 참조) 용출 채널(예를 들어, 도 3a 및 3b의 310 참조)을 갖도록 구성될 수 있다.
샘플은 이후에 혼성화된 삼성분 복합체 분자의 리포터 프로브에 결합할 수 있는 또 다른 세트의 자성 비드(예를 들어, G 비드 및/또는 항-G 자성 비드로서 또한 알려진 G 자성 비드, 이는 리포터 프로브 상의 반복부에 상보적인 15-mer DNA 올리고뉴클레오티드, 5'-GGT CTG TGT GAT GTT -3'(서열 번호: 2)에 커플링됨)를 보유하도록 구성될 수 있는 제2 자성 비드 결합 챔버(예를 들어, 도 1a의 106 및 도 3a 및 3b의 314 참조)에 통과시킬 수 있다 (예를 들어, 도 1c의 132 참조). 제2 자성 비드 결합 챔버(예를 들어, 도 3a 및 3b의 314 참조)는 또한, 샘플을 세척하여 혼성화된 샘플로부터 또 다른 타입의 프로브(예를 들어, 포획 프로브)의 과량의 분자를 제거할 수 있다 (예를 들어, 도 1c의 134 참조). G 비드는 패드 상에서 20X SSPE 및 40% 트레할로스 중에서 건조될 수 있다 (예를 들어, 도 3a의 312 참조). G-비드 결합 챔버는 또한, 비드로부터 혼성화된 삼성분 복합체 분자의 용출(예를 들어, 47℃에서)을 촉진할 수 있는 (예를 들어, 도 1c의 136 참조) 용출 채널(예를 들어, 도 3a 및 3b의 315 참조)을 갖도록 구성될 수 있다.
도 1c에 도시된 바와 같이, 벤치톱 혼성화 후에, 샘플은 nCounter® 계측기로 옮겨진다. 과량의 프로브는 2회의 자성 비드-기반 정제를 통해 제거된다. 첫째 항-F 자성 비드가 삼성분 복합체뿐만 아니라 결합되지 않은(비결합된) 포획 프로브에 결합한다. 결합되지 않은 리포터 프로브는 세척에 의해 제거되고, 나머지 성분들은 용출된다. 두번째, 항-G 자성 비드가 리포터 프로브에 결합한다. 이 상태에서, 나머지 모든 리포터 프로브가 이들의 각각의 표적 핵산에 혼성화된다. 결합되지 않은 포획 프로브는 세척에 의해 제거된다. 최종 용출 단계는 오직 정제된 삼성분 복합체만 남긴다.
또 다른 예는 자성 비드 대신에 다공성 폴리머 매트릭스를 사용한다. 표면은 올리고뉴클레오티드를 부착시킴으로써 활성화될 수 있다. 이들 다공성 폴리머 재료는 매우 값싼 기재이며 자성 비드와 비교해서 상당한 비용 절감을 제공한다. 일 효과적인 다공성 폴리머 매트릭스는 공칭 25, 75 및 125 mm의 포어 크기를 갖는 고밀도 폴리에틸렌이다.
도 1a를 참조하면, (과량의 프로브 분자가 정제될 수 있는) 샘플이 이후에 이미징 표면(108)(예를 들어, 스트렙트아비딘 표면)으로 전달되어 이미징을 위해 연신되고 고정화될 수 있다(110). 예를 들면, 도 1d를 참조하면, 삼성분 복합체 내의 포획 프로브 중의 비오틴 모이어티가 이미징 표면에 결합할 수 있다(138). 계측기는 이후에 마이크로유체 카트리지의 이미징 표면 상에 버퍼 및/또는 유사 유체를 유동시켜 (140) (예를 들어, 도 3a의 316 참조) 상기 표면 상에서 복합체를 신장 및 정렬할 수 있다. 일부 구현에서 버퍼 및/또는 유사 유체는 또한, 삼성분 복합체 중의 리포터 프로브의 이미징 표면에의 결합을 촉진할 수 있는 분자(예를 들어, 비오티닐화된 항-G 올리고뉴클레오티드 및/또는 유사 분자)를 함유할 수 있다(142). 계측기는 이후에, 샘플 중의 복합체를 검출하여 검출된 분자의 최종 그래픽 및/또는 수치 표현을 발생시킬 수 있다(112). 예를 들면, 계측기는, 삼성분 복합체 중의 리포터 프로브의 형광 바코드를 카운트하고, 샘플 중의 분자를 확인하기 위해 카운트를 상응하는 분자 표적에 매칭시키도록 구성된 에피형광 현미경을 포함할 수 있다 (예를 들어, 도 1e 참조).
도 1d에 도시된 바와 같이, 정제 후에, 샘플은, 스트렙트아비딘으로 코팅된 이미징 표면으로 이동한다. 각 포획 프로브 상의 비오틴 모이어티가 이미징 표면에 결합한다. 미세유체 카트리지 내의 유동이 이후에 삼성분 복합체를 신장 및 정렬한다. 고정화 버퍼는 리포터 프로브를 이미징 표면에 고정시키는 비오티닐화된 항-G 올리고뉴클레오티드를 함유한다.
도 1e에 도시된 바와 같이, 샘플은 nCounter® 계측기를 갖는 에피형광 현미경에 의해 이미징된다. 바코드가 카운팅되고 이들의 상응하는 표적과 매칭된다. 각 표적에 대한 카운트는 콤마로 분리된 값 파일에 엑스포트된다.
도 2는 일부 실시양태들에 따른 정제 및 이미징 공정을 보여주는 논리 흐름도를 도시한다. 예를 들면, 사용자는 대략 65℃에서 샘플(예를 들어, 생물학적 샘플; 도 1b의 114 참조)을 과량의 포획 및 리포터 프로브와 혼성화시킬 수 있다(202). 사용자는 이후에, 생물학적 샘플을 보유하도록 구성된 샘플 투입 영역(예를 들어, 또한 도 3a의 302, 도 6a의 602 참조) 내에 (예를 들어, 혼성화된 샘플의 일부를 피펫팅함으로써) 혼성화된 샘플을 배치할 수 있다(204). 샘플 투입 영역의 샘플 투입 포트는 피펫팅을 쉽게 할 수 있도록 원추형일 수 있다. 사용자는 샘플을 옮기기 위해 단일-채널 또는 멀티-채널 피펫을 사용할 수 있다. 일부 실시양태들에서, 사용자는 (예를 들어, 도 6b의 604에 도시된 투명 테이프를 사용하여) 샘플 투입부를 시일링할 수 있고 계측기로부터 버퍼를 수용하도록 구성된 버퍼 투입 영역(예를 들어, 도 3a의 304 참조)으로부터 시일(예를 들어, 도 6b의 606에 도시된 바와 같은 불투명 테이프)을 제거할 수 있다.
사용자는 계측기에서 카트리지 트레이(예를 들어, 도 7에서 트레이(702)) 상에 카트리지를 적재할 수 있다(206). 도 8-9b는 카트리지를 보유하고, 이동시키고, 가열하기 위해, 뿐만 아니라 카트리지 상의 샘플을 이미징하고 카트리지에 그리고 카트리지로부터 유체를 전달하기 위해 클램프 모터 및/또는 다른 메카니즘을 도시한다. 예를 들면, 카트리지 트레이는 트레이가 디바이스 내부에서 움직일 때 계측기 네스트 내에 적재될 수 있고, 카트리지 위에 작동 가능하게 연결된 유체 매니폴드 및 이미징 기준 표면에 연결될 수 있으며, 이때 히터 및 하부 접촉 지점이 카트리지 아래에 위치하고 카트리지를 유체 매니폴드 및 이미징 기준 지점에 대해 캠 메카니즘 및 스프링을 사용하여 위로 푸시하도록 구성된다 (예를 들어, 도 8 및 도 9b 참조). 부가적으로, 계측기는, 카트리지에 연결되어 각각, 유체를 카트리지에 제공하거나 사용된 유체를 카트리지로부터 제거할 수 있는 오프-카드 버퍼 투입 밸브(902) 및 폐기물 밸브(904)에 작동가능하게 커플링되는 유체 매니폴드(906)를 포함할 수 있다.
디바이스는 카트리지가 정확하게 적재되었는지를 자동으로 결정할 수 있고, 또한 시약(예를 들어, 버퍼) 및 폐 보틀(waste bottle)(예를 들어, 도 5에서 502)이 카트리지에 정확하게 연결되도록, 그리고 시약 보틀이 충분한 수준의 버퍼 및/또는 유사 유체를 가지도록 보장할 수 있다. 일부 실시양태들에서, (예를 들어, 도 5의 스크린(504)을 통해) 더 많은 유체가 요구되는 경우 및/또는 그 밖의 경우에, 사용자는 시약 보틀을 교체하도록 촉구될 수 있다.
계측기는 이후에, 샘플을 버퍼로부터 분리하기 위해 기포를 갖도록 구성된 버블 벤트 및/또는 트랩(예를 들어, 소수성 멤브레인; 도 3a에서 306 참조)을 통해, 유동(예를 들어, 30 μL)을 매개로 샘플 투입 영역으로부터 샘플을 이동시킬 수 있다. 이러한 버블은 두 액체를 분리함으로써 샘플 분산을 방지한다. 일부 구현에서 결합 챔버(예를 들어, F 결합 챔버 및 G 결합 챔버)는 샘플의 정제를 위해 자성 비드 및/또는 다른 분자-결합 장치를 보유할 수 있다. F 결합 챔버는 혼성화된 샘플 중의 과량의 프로브 분자(예를 들어, 과량의 리포터 프로브 분자)에 결합하도록 구성될 수 있는 건조한 F 자성 비드를 보유할 수 있다(예를 들어, 도 1c의 126 참조). 계측기는 과량의 포획 프로브로 및 샘플 분자로의 F 비드의 결합 및 재현탁을 보다 잘 촉진하기 위해 펌프를 사용하여 다공성 비드 패드 위로 샘플 및 비드를 (예를 들어, 15 μL 전후로 반복적으로) 이동시킬 수 있다 (210) (예를 들어, 도 11 참조). F 비드는 용액으로부터 침전될 수 있으며; 따라서 이들이 용액 중에 현탁된 상태로 유지되도록 운동이 요구될 수 있다. 버블 벤트(예를 들어, 도 10에서 1002 참조)가 샘플 투입 영역(예를 들어, 도 10에서 1004 참조)과 F-결합 챔버(예를 들어, 도 3a 및 3b에서 308 참조) 사이에 물리적으로 위치할 수 있고, 혼합 및 결합이 마무리된 후 버블, 특히 샘플과 버퍼 사이의 큰 버블을 제거하도록 구성될 수 있다. 그러나, 샘플과 버퍼 사이의 버블은, 버블 벤트를 통해 공기를 끌어당기는 대신 샘플을 뒤로 끌어당기는 데 충분한 배압을 유지하기 위해 이 혼합 과정 동안 버블 벤트를 통과하지 않는 것이 중요하다.
일부 실시양태들에서는, 샘플을 유동에 의해 전후로 이동시키는 대신에 자석 쌍을 챔버를 가로 질러 전후로 이동시키는 것이 수행될 수 있다. 자석은 쌍으로 사용되어 혼합에 적합한 복합 자기장을 생성할 수 있다. 자석 위 및 자석 사이의 사점(dead spot)은 양호한 혼합에 중요할 수 있다. 자석 속도는 챔버 사이즈 및 비드 양과 관련될 수 있다 (예를 들면).
결합 공정은 일부 실시양태들에서, 적어도 8분간 지속될 수 있다 (예를 들면). 버블 벤트로부터의 버블은 혼성화된 샘플을 F 비드에 혼합하는 동안 제거될 수 있다 (212). 카트리지에 평행하게 이동하도록 구성된 계측기에서 자석(예를 들어, F 자석; 도 12에서 1202 참조)은, F 비드를 수집하고(214), 버퍼 투입 영역으로부터 첨가된 용출 버퍼로 세척될 때(216) 이들을 제 위치에 고정시키기 위해 F 결합 챔버 아래에서 이동될 수 있다. 용출 버퍼는 F 비드로부터 적어도 일 타입의 비혼성화된 프로브(예를 들어, 비혼성화된 리포터 또는 포획 프로브; (예를 들어, 도 1c의 128 참조))의 제거를 촉진할 수 있다. 멀티스테이지 세척 단계 동안, 비드는 자석(예를 들어, 도 13a에서 1302 참조)을 이동시킴으로써 F 결합 챔버 내에서 이동될 수 있다. 비드의 이러한 이동 및 스프레딩은 포획된 비드의 더 나은 세척을 허용할 수 있다.
이후, 비드는 자석을 통해 F 용출 채널(예를 들어, 또한 도 3a 및 3b의 310 참조) 내에 푸시될 수 있으며(218), 이는 F 비드로부터 샘플 분자를 용출시키기 위해(예를 들어, 도 1c의 130 참조) F 비드를 (예를 들어, 4분간 47℃까지) 가열하도록 구성될 수 있는 히터(예를 들어, F 히터; 도 13b에서 1304 참조)에 연결될 수 있다(220). 제2 세트의 건조 자성 비드(예를 들어, G 자성 비드)의 혼성화된 삼성분 복합체 분자에의 결합을 촉진하도록 구성된 제2 결합 챔버(예를 들어, G 결합 챔버; 도 3a 또는 3b의 314 참조) 내로 용출된 샘플이 이동할 때(224) F 비드는, 가열 공정 이후에, F 결합 챔버(예를 들어, 도 14 참조)로 되돌려질 수 있다(222).
적절한 비드 재현탁 및 샘플 결합을 달성하기 위해 단계적 유체 도입 및 유동 혼합 공정이 G 자성 비드 및 용출된 샘플과 함께 이용될 수 있다(226). G 자성 비드는 샘플 분자에 여전히 부착될 수 있는 리포터 프로브 및/또는 다른 프로브에 결합할 수 있다 (예를 들어, 도 1c의 132 참조). 예를 들면, G 결합 챔버 내로의 F-용출된 샘플의 도입은 전방향 2μL 이후 후방향 1μL의 반복된 작은 단계들로 수행될 수 있다. 유체의 전후는 G 비드를 재현탁하는 것을 도울 수 있고 시스템이 비드 패드/비드 포켓 크기의 작은 차이에 둔감해질 수 있도록 할 수 있다. 이러한 전후 혼합은 다공성 패드를 통해 일어날 수 있다. 일부 실시양태들에서, 정확한 유량 프로필은 +5μL, -4μL, +5μL, -4μL, +5μL일 수 있다. 또 다른 7 μL가 도입되기 이전에 결합은 지정된 기간 동안 일어날 수 있다. 일부 실시양태들에서 (예를 들어, 도 15 참조), 용출은 모든 용출물이 레인(1504)으로 흘러들 때까지 시간(1502)에서 한 레인으로 흐를 수 있다 (예를 들어, 공정은 7분이 소요될 수 있다).
한편, 이미징 챔버는 분자(예를 들어, 트레할로스 및 유리 아비딘)를 제거하기 위해 세척(228)될 수 있는 반면에, G 비드는 용출된 샘플에 결합된다. 자석(예를 들어, G 자석; 도 12에서 1204 참조)은 히터(예를 들어, F 히터)가 F 결합 및 용출 챔버를 (예를 들어, 35℃까지) 가열할 때(232) 모든 G 비드를 수집하고 이들을 보유하기 위해 G 비드 챔버 아래에서 이동될 수 있다(230). 한편 (예를 들어, 히터에 의해 데워진) 용출 버퍼는 G 비드로부터 과량의 비혼성화된 포획 프로브의 제거를 촉진하기 위해 G 비드 상에서 세척될 수 있다 (예를 들어, 도 1c의 134 참조). 비드는 이후에 자석을 통해 G 용출 챔버(예를 들어, 도 3a 및 3b에서 315 및 도 16에서 1602 및 1604 참조)로 이동(234)될 수 있어, 정제된 샘플(예를 들어 삼성분 복합체)을 G 비드로부터 유리시키도록 구성된 제2 히터(예를 들어, G 히터; 도 13b에서 1306 및 도 17에서 1702 참조)가 착수될 수 있다(236).
G 히터는 47℃에서 4분간 실행되어 비드로부터 샘플을 유리시킬 수 있다 (예를 들어, 도 1c의 136 참조). 이후, 자석은 G 비드를 결합 챔버로 역으로 이동시킬 수 있고(238), 정제된 샘플은 SA 표면(예를 들어, 도 3a 및 3b에서 316 참조)의 결합 영역 내로 이동(240)(예를 들어, 도 18 참조)될 수 있다. 챔버 내로의 유속은 챔버의 약 절반 부피 또는 그 이하인 단계들로 수행될 수 있다(예를 들어, 대략 0.25 μL 매 78초). 작은 용출 부피와 제어된 흐름(중력 대신 시린지 펌프 사용)은보다 빠르고 보다 효율적인 결합을 가능하게 한다.
일부 실시양태들에서, SA 표면에 결합하는 용출된 샘플의 유동 부피를 균등하게 하기 위해 12 레인의 동적 시퀀싱을 수행할 수 있다. 예를 들면, 각 레인에서 76 초마다 대략 0.25μL 씩 흐를 수 있다. 스테핑은 순차적으로 수행될 수 있다: 시퀀스(예를 들어, 레인 1 내지 12)에서 레인 당 6.3 초마다 0.25μL 단계가 수행될 수 있으며, 이는 0.25μL 단계마다 12*6.3=75.6초의 각 레인 대기 시간을 초래할 수 있다. 12개의 밸브가 12개의 개별 레인에서 순서대로 열리고 닫히며 겨우 작은 부피(볼륨)로 움직일 수 있기 때문에, 각 개개 밸브의 변위 부피는 레인에서 레인까지의 리포터 카운트 변동에 영향을 줄 수 있다. 펌프 자체의 변위량 부피 변화가 변동성에 영향을 미치지 않을 수도 있다; 그러나 밸브로 인한 변위 부피의 차이는 변동성에 큰 영향을 미칠 수 있다. 각각의 밸브의 변위는 밸브의 폐쇄 대 개방 상태의 압력 판독 차이를 이용하여 추정될 수 있다 (예컨대, 도 19a에서 1902 참조). 레인-레인 가변성의 최소화는 레인을 재정렬함으로써 변위 부피 가변성의 최소화를 요구할 수 있다. 가변성을 최소화하기 위해, 계측기는 최대 변위 부피를 갖는 밸브로부터 푸시를 시작한 다음 두 번째로 가장 높은 것 등으로 하여 가장 작은 것으로 끝낼 수 있다. 가장 작은 것부터 가장 큰 것으로의 이행이 가장 부정적인 영향을 줄 수 있다; 이를 보정하기 위해, 계측기는 그 단일 레인에서 추가 0.083μL를 푸시하도록 구성될 수 있다 (예를 들어, 0.25 μL 대신에 0.333 μL; 도 19b의 1904 참조).
일부 실시양태들에서 (예를 들어, 도 20에서), SA 표면은 스트렙트아비딘으로 코팅된 표면일 수 있고, 샘플 중의 혼성화된 프로브에 결합할 수 있다(2002) (예를 들어, 또한 도 1d에서 138 참조). 거기에서, 정제된 2차-용출된 샘플 내의 분자는, 예를 들어, 적어도 G 후크(비오티닐화된 항-G 15mer 올리고), 마운팅 매체(페이드 방지) 및 피디셜(멀티스펙트럼 비오티닐화된 형광 100 nm 비드, 즉, 회절이 제한됨)을 포함하는 단일 용액을 통해, SA 표면 상에 연신되고 고정화될 수 있고(242)(예를 들어, 도 21의 2102 및 도 1d의 140 및 142 참조), 특정 유속으로 SA 표면에 첨가될 수 있다 (예를 들어, 이용될 수 있는 유속을 나타내는 그래프인 도 21에서 2104 참조). G 후크는 연신 동안 리포터의 제2 단부를 고정화시키기 위해 사용된다. 마운팅 매체는 DNA의 광 표백 및 광 파괴를 방지하기 위해 존재한다 (염료와의 광 상호 작용으로 인해 DNA 백본을 파괴할 수 있는 자유 라디칼이 생성되기 때문). 피디셜은 이미지를 정렬하는 데 사용되는 형광 신호(모든 채널에서)를 생성한다. G-후크, 마운팅 매체, 피디셜, 및 연신 버퍼는 전술한 일렉트로스트레칭 기반 고정화 공정에서는 별도의 용액 중에 있을 것이 요구되었다. 일부 실시양태들에서, 본 공정은 4개의 버퍼를 대체할 수 있으며 전극 및 전원 공급 장치의 필요성을 없애줄 수 있다. 이는 또한, 이전의 설계에서 전극에 슬리킹되고 후속 샘플 실행으로 이어지는 G-후크로 인해 야기되는 G-후크 오염으로 인한 문제를 제거할 수 있다. 이후, 계측기는 카트리지상의 SA 표면으로부터 연신된 분자를 검출하고 사용자에 대한 출력(예를 들어, 이미지, 보고 등)을 생성할 수 있다(244) (예를 들어, 도 1e의 144 참조). 일부 실시양태들에서, 계측기는 3개의 LED 조명 시스템을 사용하는 저비용 광학 하위 구성 요소를 가질 수 있다.
계측기는 또한 밀도에 기초하여 결합 구배 및 면적 최적화를 수행할 수 있다. 스트렙트아비딘 표면에의 결합은 채널을 통해 리포터 결합 구배를 생성할 수 있으며 - 한쪽 말단(입구)의 밀도가 높아지고 나머지 말단(출구)쪽으로 점차 감소한다. 초기 스캐닝 조사에 의해 결정된 리포터 밀도에 기초하여, 최적의 데이터 수집을 위해 이미징 영역의 위치가 선택될 수 있다. (입구 단부에 가까운) 고밀도 측에서 최종 스캔 영역을 선택하면 일반적으로 더 많은 데이터를 수집할 수 있다. 그러나, 너무 높은 결합 밀도의 경우에, 스캔 영역을 입구 단부로부터 더 멀리 이동시킴으로써 덜 치밀한 영역으로부터 스캔이 시작될 수 있다. 이 방법은 샘플 농도의 동적 범위를 증가시킨다.
이미징 동안, 마운팅 매체는 광 파괴를 최소화하고 유리 리포터를 제거함으로써 잔류 비기능성 리포터의 비특이적 결합을 최소화하기 위해 교환될 수 있다. 임의의 유리 리포터가 이미징 챔버에서 자유롭게 부유한 상태로 남는다면, 이미징 버퍼의 흐름이 그들을 씻어내어, 용액 중의 G-후크를 통한 결합을 방지한다.
본 발명에 관한 추가의 교시가 하기 문헌들 중 하나 이상에 기재되어 있다: 미국 공보 2011/0086774, 미국 공보 2011/0145176, 미국 공보 2011/0201515, 미국 공보 2011/0229888, 미국 공보 2013/0004482, 미국 공보 2013/0017971, 미국 공보 2013/0178372, 미국 공보 2013/0230851, 미국 공보 2013/0337444, 미국 공보 2013/0345161, 미국 공보 2014/0005067, 미국 공보 2014/0017688, 미국 공보 2014/0037620, 미국 공보 2014/0087959, 미국 공보 2014/0154681, 미국 공보 2014/0162251, 미국 공보 2014/0371088, 미국 공보 2015/0072021, 미국 공보 2015/0252440, 미국 특허 7,473,767, 미국 특허 7,919,237, 미국 특허 7,941,279, 미국 특허 8,148,512, 미국 특허 8,415,102, 미국 특허 8,492,094, 미국 특허 8,519,115, 미국 특허 8,986,926, 미국 특허 9,066,963, 및 미국 특허 9,181,588, 이들 각각은 그 전문이 본원에서 인용에 의해 포함된다.
하기 실시예는 제한이 아닌 예시의 방식으로 제공된다.
실시예
본 개시내용의 실시양태는 유전자 발현 및 단백질 합성의 우수한 검출 및 정량화를 제공한다.
도 22에 도시된 바와 같이, 실시양태들은 3종류 nCounter® 팬캔서(PanCancer) 패널: 팬캔서 패스웨이즈(Pathways) 패널, 팬캔서 프로그레션(Progression) 패널, 및 팬캔서 면역 프로파일링(Immune Profiling) 패널로부터 표적을 효과적으로 검출한다. 여기서, ("nCounter SPRINT 프로파일러"로서 표시된) 실시양태들로부터 얻어진 데이터는 nCounter® 분석 시스템에서 얻어진 데이터와 연관성이 있다. 도 23에 도시된 바와 같이, 실시양태들은 림프종 샘플에서 차별적으로 발현되는 유전자의 동정을 가능하게 한다. 도 24에 도시된 바와 같이, 실시양태들은 정제된 총 RNA 또는 생세포 용해물에서의 유전자 발현을 검출할 수 있다; 어세이는 제한된 샘플 준비가 요구되는 것이 주목된다. 도 25에 도시된 바와 같이, 실시양태들은 신선 냉동 조직 및 포르말린-고정된 파라핀-포매된(FFPE) 조직(이에 한정되지 않음)을 포함하는 다양한 샘플 유형으로 유전자 발현의 신빙성 있는, 신뢰가능한 검출을 제공한다. 도 26에 도시된 바와 같이, 실시양태들은 팬캔서 프로그레션 패널에 대한 유전자 발현을 효과적으로 그리고 nCounter® 분석 시스템으로 얻은 결과와 관련하여 매우 연관성 있는 결과를 검출한다. 본 발명의 실시양태들("SPRINT"로 표시됨)은 nCounter® 분석 시스템("분석 시스템"으로 표시됨)에서 사용되는 샘플 투입량의 절반(중량 기준)을 사용했다는 것이 주목할 만하다. 도 27에 도시된 바와 같이, 실시양태들은 휴먼 이뮤놀로지 패널에서 표적을 효과적으로 검출한다. 여기서, ("nCounter SPRINT 프로파일러"로서 표시된) 실시양태들에서 얻어진 데이터는 nCounter® 분석 시스템에서 얻어진 데이터와 연관성이 있다. 도 28에 도시된 바와 같이, 실시양태들은 카피수 변화(CNV) 어세이에서 표적을 효과적으로 정량화한다. 본 발명의 실시양태("nCounter SPRINT 프로파일러"로서 표시됨) 및 nCounter® 분석 시스템에서의 DNA 샘플 실행에 대해 유사한 카피수 데이터가 수득되었다. 여기서, 각 유전자에 대한 카피수 데이터는 X축 상의 체크 표시 바로 위에 있다. 따라서, 사각형(본 발명의 실시양태들로부터의 데이터) 및 원형 (nCounter® 분석 시스템으로부터의 데이터)을 포함하는 수직-관련 쌍은 특정 유전자에 대한 데이터를 나타낸다. 도 29에 도시된 바와 같이, 실시양태들은 miRNA 표적을 효과적으로 검출한다. 여기서, 실시양태들로부터 얻어진 데이터는 nCounter® 분석 시스템에서 얻어진 데이터와 연관성이 있다. 도 30에 도시된 바와 같이, 실시양태들은 RNA 및 단백질 표적을 효과적으로 검출한다. 여기서, 실시양태들("nCounter SPRINT 프로파일러"로서 표시됨)에서 얻어진 데이터는 nCounter® 분석 시스템에서 얻어진 데이터와 연관성이 있다.
본 출원에 제시된 특허, 특허 출원, 기사, 웹 페이지, 서적 등(이에 한정되지 않음)을 포함하는 출판물 또는 기타 문헌에 대한 임의의 및 모든 언급은 그 주제가 본 개시내용의 실시양태들의 것과 충돌하는 경우를 제외하고(이 경우 본 명세서가 우선한다) 그 전문이 본원에서 인용에 의해 포함된다. 언급된 항목은 본 출원의 출원일 이전에 그들의 공개를 위해서만 제공된다. 본원에 개시된 임의의 발명이 선행 발명에 의해 이러한 재료에 선행하는 자격이 없다고 인정하는 것으로 해석되는 것은 아니다.
본 명세서에서 디바이스, 시스템 및 방법의 예시적인 실시양태들이 기재되어 있지만, 다른 수정이 가능하다. 다른 곳에서 언급된 바와 같이, 이들 실시양태는 단지 예시적인 목적으로 기술되었으며 제한적이지 않다. 다른 실시양태들이 가능하고 본 개시내용에 의해 커버되며, 이는 본원에 포함된 교시로부터 명백해질 것이다. 따라서, 본 개시내용의 폭 및 범위는 전술한 실시양태들 중 어느 것에 의해서도 제한되어서는 안되며, 단지 본 개시내용 및 그 등가물에 의해 뒷받침되는 청구범위에 따라서만 정의되어야 한다. 부가적으로, 상기 개시내용 및/또는 첨부된 도면에 도시된 임의의 논리 흐름은 바람직한 결과를 달성하기 위해 도시된 특정 순서 또는 순차 순서를 요구하지 않을 수 있다. 게다가, 본 개시의 실시양태들은 유전자 정제 및 이미징에 상응하는 임의의 및 모든 요소를 포함하여 임의의 다른 개시된 방법, 시스템 및 디바이스로부터의 임의의 및 모든 요소를 더 포함할 수 있는 방법, 시스템 및 디바이스를 포함할 수 있다. 다시 말해, 하나 및/또는 다른 개시된 실시양태들부터의 요소는 다른 개시된 실시양태들로부터의 요소로 교환 가능할 수있다. 부가적으로, 개시된 실시양태들의 하나 이상의 특징부/요소가 제거될 수 있고 여전히 특허 가능한 대상이 된다 (따라서, 본 개시내용의 또 다른 실시양태들에 이른다). 부가적으로, 본 개시내용의 일부 실시양태들은 선행 기술에 개시된 하나 및/또는 다른 특징부를 명시적으로 요구하지 않는 선행 기술과 구별될 수 있다 (예를 들어, 일부 실시양태들은 부정적 제한을 포함할 수 있다). 본원에 개시된 실시양태들 중 일부는 제시될 수 있는 본 개시내용에 의해 뒷받침되는 하기의 다수의 청구범위의 적어도 일부의 범위 내에 있다.
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Claims (54)

  1. 하기를 포함하는, 혼성화된 표적 분자 샘플을 정제하고 혼성화된 표적 분자를 이미징하도록 구성된 카트리지:
    표적 분자 샘플을 보유하도록 구성된 샘플 투입 영역으로서, 샘플이
    제1 프로브 및 제2 프로브와 각각 혼성화된 복수의 표적 분자를 포함하는 복수의 혼성화된 복합체,
    복수의 비혼성화된 제1 프로브, 및
    복수의 비혼성화된 제2 프로브
    를 포함하는 것인 샘플 투입 영역;
    제1 친화성 매트릭스를 수용 및/또는 함유하고 샘플을 수용하도록 구성된 제1 결합 챔버로서, 제1 친화성 매트릭스는 제1의 기간 동안 샘플의 비혼성화된 제1 프로브 및 혼성화된 복합체와 결합하도록 구성된 제1 분자로 작용화되고, 제1 결합 챔버는 샘플의 비혼성화된 제1 프로브 및 혼성화된 복합체가 제1 친화성 매트릭스와 결합한 이후에 샘플로부터 비혼성화된 제2 프로브를 제거하기 위해 제1 버퍼를 수용하도록 부가적으로 구성되는 것인 제1 결합 챔버;
    제1 히터에 작동가능하게 구성되고, 제1의 기간 후에 제1 친화성 매트릭스를 수용하도록 구성되며 제1 친화성 매트릭스를 가열하여 복수의 혼성화된 복합체 및 복수의 비혼성화된 제1 프로브를 포함하는 제1의 용출 샘플을 용출시키도록 구성된 제1 용출 채널;
    제2 친화성 매트릭스를 수용 및/또는 함유하고 제1의 용출 샘플을 수용하도록 구성된 제2 결합 챔버로서, 제2 친화성 매트릭스는 제2의 기간 동안 혼성화된 복합체와 결합하도록 구성된 제2 분자로 작용화되고, 제2 결합 챔버는 적어도 비혼성화된 제1 프로브를 제거하기 위해 제2 버퍼를 수용하도록 부가적으로 구성되는 것인 제2 결합 챔버;
    제2 히터에 작동가능하게 구성되고, 제2의 기간 후에 제2 친화성 매트릭스를 수용하도록 구성되며 제2 친화성 매트릭스를 가열하여 복수의 혼성화된 복합체를 포함하는 제2의 용출 샘플을 용출시키도록 구성된 제2 용출 채널; 및
    제2의 용출 샘플을 수용하고 혼성화된 복합체와 결합하도록 구성된 활성 결합 표면을 가진 결합 영역.
  2. 제1항에 있어서, 카트리지는
    버블 벤트;
    복수의 버퍼 투입 영역;
    복수의 제1 결합 챔버;
    복수의 폐기물 배출 영역; 및
    복수의 비드 패드
    를 더 포함하고,
    경우에 따라, 복수의 버퍼 투입 영역은 유체 매니폴드에 작동가능하게 커플링된 복수의 오프-카드(off-card) 버퍼 투입 밸브이고, 복수의 오프-카드 버퍼 투입 밸브는, 유체 매니폴드로부터 제1 버퍼 및 제2 버퍼를 수용하고 제1 및 제2 버퍼를 카트리지에 제공하도록 구성되며, 복수의 폐기물 배출 영역은 카트리지로부터 제1 및 제2 버퍼를 수집하도록 구성된 복수의 폐기물 밸브인 카트리지.
  3. 제2항에 있어서, 버블 벤트는, 샘플 투입부 및 제1 결합 챔버를 분리하고 기포를 제거하도록 구성되는 것인 카트리지.
  4. 제1항에 있어서, 카트리지는
    유체 매니폴드에 작동가능하게 커플링된 복수의 오프-카드 버퍼 투입 밸브; 및
    복수의 폐기물 밸브
    에 작동가능하게 커플링되는 것인 카트리지.
  5. 제1항에 있어서, 카트리지는
    유체 매니폴드에 작동가능하게 커플링된 복수의 온-카드(on-card) 버퍼 투입 밸브
    를 더 포함하는 것인 카트리지.
  6. 제1항에 있어서, 결합 영역은, 유동에 의해 연신한 후에 활성 결합 표면 상에 제2의 용출 샘플을 고정화하도록 제제화된 용액을 수용하도록 추가적으로 구성되는 것인 카트리지.
  7. 하기를 포함하는, 복수의 혼성화된 복합체를 이미징하기 위한 시스템:
    제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 카트리지;
    시스템에 작동가능하게 커플링되고 카트리지를 보유하도록 구성된 카트리지 트레이;
    카트리지 트레이 아래에서 이미징 디바이스에 작동가능하게 커플링된 자석;
    카트리지 트레이 위에서 시스템에 작동가능하게 커플링되고 복수의 버퍼를 보유하고 이의 유동을 제어하도록 구성된 유체 매니폴드;
    유체 매니폴드 및 카트리지에 작동가능하게 커플링된 복수의 오프-카드 버퍼 투입 밸브;
    카트리지 트레이 위에서 시스템에 작동가능하게 커플링된 복수의 폐기물 밸브; 및
    카트리지 트레이 위에서 이미징 디바이스에 작동가능하게 커플링된 이미징 기준 표면.
  8. 제7항에 있어서,
    이미징 디바이스에 작동가능하게 커플링되고 적어도 하나의 접촉 패드에 대한 사전 적재(preloading)를 허용하도록 구성된 캠 접촉 패드;
    이미징 디바이스의 이동 클램프와 베이스 사이에서, 기준 A의 조정을 허용하도록 구성된 적어도 하나의 조정가능 접점; 및
    이미징 디바이스에 작동가능하게 커플링되고 이동 클램프를 이동시키도록 구성된 클램프 모터
    를 더 포함하는 시스템.
  9. 제7항에 있어서, 카트리지 트레이 위에서 시스템에 작동가능하게 커플링된 복수의 폐기물 밸브 및 복수의 오프-카드 버퍼 투입 밸브 중 적어도 하나가 공기압으로 제어되는 것인 시스템.
  10. 하기 단계를 포함하는, 혼성화된 표적 분자 샘플을 정제하고 혼성화된 표적 분자를 이미징하는 방법:
    제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 카트리지를 제공하는 단계;
    혼성화된 샘플을 수용하는 단계로서, 샘플이 제1 프로브 및 제2 프로브와 혼성화된 표적 분자를 포함하는 복수의 혼성화된 복합체, 복수의 비혼성화된 제1 프로브, 및 복수의 비혼성화된 제2 프로브를 포함하는 것인 단계;
    제1 결합 챔버에서 제1의 기간 동안 샘플의 비혼성화된 제1 프로브 및 혼성화된 복합체를 제1 친화성 매트릭스에 결합시키는 단계;
    샘플의 비혼성화된 제1 프로브 및 혼성화된 복합체가 제1 친화성 매트릭스와 결합한 이후에 제1 버퍼를 제1 결합 챔버로 유동시켜 비혼성화된 제2 프로브를 샘플로부터 제거하는 단계;
    제1 친화성 매트릭스를 제1 용출 채널로 보내는 단계;
    제1 친화성 매트릭스를 가열하여 복수의 혼성화된 복합체 및 복수의 비혼성화된 제1 프로브를 포함하는 제1의 용출 샘플을 용출시키는 단계;
    제2 결합 챔버에서 제2의 기간 동안 제1의 용출 샘플의 혼성화된 복합체를 제2 친화성 매트릭스에 결합시키는 단계;
    혼성화된 복합체가 제2 친화성 매트릭스와 결합한 이후에 제2 버퍼를 제2 결합 챔버로 유동시켜 비혼성화된 제1 프로브를 제1의 용출 샘플로부터 제거하는 단계;
    제2 친화성 매트릭스를 가열하여 복수의 혼성화된 복합체를 포함하는 제2의 용출 샘플을 용출시키는 단계; 및
    혼성화된 복합체를 이의 이미징을 위한 활성 결합 표면에 결합시키는 단계.
  11. 제10항에 있어서,
    소정량의 제1의 용출 샘플을 친화성 매트릭스 패드를 통해 제1 방향 및 제2 방향으로 이동시키는 단계
    를 더 포함하는 방법.
  12. 제10항에 있어서, 제1 버퍼는 샘플-비드 혼합물을 제1 비드 패드를 통해 제1 방향 및 제2 방향으로 이동시키도록 펌핑되는 것인 방법.
  13. 제10항에 있어서, 표적 분자는 핵산 또는 단백질인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 제1 친화성 매트릭스 및 제2 친화성 매트릭스는 각각 제1 세트의 자성 비드 및 제2 세트의 자성 비드에 상응하는 것인 카트리지.
  15. 제1항에 있어서, 활성 결합 표면은 스트렙트아비딘, 아비딘, 및 올리고뉴클레오티드 중 하나를 포함하는 것인 카트리지.
  16. 제10항에 있어서, 제1 프로브는 포획 프로브를 포함하는 것인 방법.
  17. 제10항에 있어서, 제2 프로브는 리포터 프로브를 포함하는 것인 방법.
  18. 제14항에 있어서, 제1 자성 비드는 올리고뉴클레오티드-커플링된 자성 비드를 포함하는 것인 카트리지.
  19. 제18항에 있어서, 올리고뉴클레오티드-커플링된 자성 비드는 F 자성 비드를 포함하는 것인 카트리지.
  20. 제14항에 있어서, 제2 자성 비드는 올리고뉴클레오티드-커플링된 자성 비드를 포함하는 것인 카트리지.
  21. 제20항에 있어서, 올리고뉴클레오티드-커플링된 자성 비드는 G 자성 비드를 포함하는 것인 카트리지.
  22. 제10항에 있어서, 카트리지는
    유체 매니폴드에 작동가능하게 커플링된 복수의 오프-카드 버퍼 투입 밸브; 및
    복수의 폐기물 밸브
    에 작동가능하게 커플링되고,
    복수의 오프-카드 버퍼 투입 밸브는, 유체 매니폴드로부터 제1 버퍼 및 제2 버퍼를 수용하고 상기 버퍼를 카트리지에 제공하도록 구성되는 것인 방법.
  23. 제10항에 있어서, 제2의 용출 샘플의 결합 영역으로의 유동은 압력 프로파일에 기초하여 재배열되는 작은 단계들로 행해지는 것인 방법.
  24. 제10항에 있어서, 결합 영역은, 유동에 의해 연신한 후에 활성 결합 표면 상에 제2의 용출 샘플을 고정화하도록 제제화된 용액을 수용하도록 추가적으로 구성되고,
    용액은 G-후크, 페이드 방지(anti-fade) 매체, 및 피디셜(fiducial)을 포함하는 것인 방법.
  25. 제10항에 있어서, 제1 친화성 매트릭스 및 제2 친화성 매트릭스는 각각 제1 세트의 자성 비드 및 제2 세트의 자성 비드에 상응하는 것인 방법.
  26. 제10항에 있어서, 활성 결합 표면은 스트렙트아비딘, 아비딘, 및 올리고뉴클레오티드 중 하나를 포함하는 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 제1 자성 비드는 올리고뉴클레오티드-커플링된 자성 비드를 포함하는 것인 방법.
  28. 제27항에 있어서, 올리고뉴클레오티드-커플링된 자성 비드는 F 자성 비드를 포함하는 것인 방법.
  29. 제25항에 있어서, 제2 자성 비드는 올리고뉴클레오티드-커플링된 자성 비드를 포함하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 올리고뉴클레오티드-커플링된 자성 비드는 G 자성 비드를 포함하는 것인 방법.
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