KR102597723B1 - Method for converting from 5-aminovaleric acid to glutaric acid - Google Patents
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Abstract
본 발명의 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환 방법은 GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질 발현 미생물 시스템을 이용한 5-아미노발레르산(5-aminovaleric acid)으로부터 글루타르산(glutaric acid)으로의 전환 방법으로서, 상기 미생물 시스템에 글루탐산염(glutamate)을 단계적으로 제공하는 것을 특징으로 한다.The method for converting 5-aminovaleric acid to glutaric acid of the present invention is to convert 5-aminovaleric acid to glutaric acid using a microbial system expressing GabD, GabT, Nox and Gox proteins. A conversion method characterized by providing glutamate to the microbial system in stages.
Description
본 발명은 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질 발현 미생물 시스템을 이용하여 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 효율적인 전환이 가능한 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a process for converting 5-aminovaleric acid to glutaric acid. More specifically, it relates to a method enabling efficient conversion of 5-aminovaleric acid to glutaric acid using a microbial system expressing GabD, GabT, Nox, and Gox proteins.
글루타르산은 C5 선형 다이카르복시산으로, 프탈레이트 기반의 가소제를 대체하기 위한 PA56 중합체화 및 환경 친화적 가소제 후보물질로 사용되는 바이오플라스틱 단량체에 적용될 수 있다.Glutaric acid is a C5 linear dicarboxylic acid that can be applied to polymerize PA56 to replace phthalate-based plasticizers and as a bioplastic monomer used as an environmentally friendly plasticizer candidate.
이러한 글루타르산의 생합성과 관련된 연구 결과들을 살펴보면, L-라이신(L-lysine)으로부터 라이신 모노옥시게나아제(lysine 2-monooxygenase, DavB)와 δ-아미노발레르아미다아제(δ-aminovaleramidase, DavA)가 작용하여 5-아미노발레르산(5-aminovaleric acid)으로의 전환이 이루어지고, 5-아미노발레르산은 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라아제(4-aminobutyrate aminotransferase, GabT)가 작용하여 글루타레이트 세미알데하이드(glutarate semialdehyde)로 전환되고, 여기에 숙시네이트 세미-알데하이드 디하이드로게나아제(succinate semi-aldehyde dehydrogenase, GabD)가 작용하여 최종산물인 글루타르산(glutaric acid)으로 전환된다.Looking at the research results related to the biosynthesis of glutaric acid, lysine monooxygenase (lysine 2-monooxygenase, DavB) and δ-aminovaleramidase (δ-aminovaleramidase, DavA) are derived from L-lysine. acts to convert it into 5-aminovaleric acid, and 5-aminovaleric acid is converted to glutarate semialdehyde by the action of 4-aminobutyrate aminotransferase (GabT). It is converted to glutarate semialdehyde, and succinate semi-aldehyde dehydrogenase (GabD) acts on it to convert it to glutaric acid, the final product.
이러한 전체 전환과정에서 5-아미노발레르산으로부터 글루타레이트 세미알데하이드로의 전환과정 중 α-케토글루타르산(α-ketoglutaric acid)이라는 조효소가 필수적으로 사용되며, 사용된 α-케토글루타르산은 글루탐산염(glutamate)으로 환원된다. 이때 글루타메이트 옥시다아제(glutamate oxidase, Gox)를 사용하면 글루탐산염을 α-케토글루타르산으로 전환함으로써 조효소의 순환을 가능하게 할 수 있다.In this entire conversion process, a coenzyme called α-ketoglutaric acid is essentially used during the conversion process from 5-aminovaleric acid to glutarate semialdehyde, and the α-ketoglutaric acid used is glutamic acid. It is reduced to salt (glutamate). At this time, glutamate oxidase (Gox) can be used to enable the circulation of coenzymes by converting glutamate into α-ketoglutarate.
이러한 방식과 관련하여 미생물 시스템에서 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로 전환하는 방법에 관한 연구가 이루어졌으나, 전환 효율이 기대에 미치지 못하거나 많은 비용이 소요되는 문제가 있어, 산업적으로 활용되지 못하고 있는 실정이다.In relation to this method, research has been conducted on how to convert 5-aminovaleric acid to glutaric acid in a microbial system, but the conversion efficiency does not meet expectations or is expensive, so it cannot be used industrially. There is a situation.
따라서 본 발명의 주된 목적은 미생물 시스템을 이용하여 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 효율적인 전환이 가능한 방법을 제공하는데 있다.Therefore, the main purpose of the present invention is to provide a method for efficient conversion of 5-aminovaleric acid to glutaric acid using a microbial system.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질 발현 미생물 시스템을 이용한 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환 방법으로서, 상기 미생물 시스템에 글루탐산염을 단계적으로 제공하는, 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환 방법을 제공한다.According to one aspect of the present invention, the present invention is a method for converting 5-aminovaleric acid to glutaric acid using a microbial system expressing GabD, GabT, Nox and Gox proteins, comprising providing glutamate to the microbial system step by step. , providing a method for converting 5-aminovaleric acid to glutaric acid.
본 발명의 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환 방법에 있어서, 상기 미생물 시스템은 대장균 시스템인 것이 바람직하다.In the method for converting 5-aminovaleric acid to glutaric acid of the present invention, the microbial system is preferably an Escherichia coli system.
본 발명의 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환 방법에 있어서, 상기 글루탐산염은 글루탐산 모노나트륨인 것이 바람직하다.In the method for converting 5-aminovaleric acid to glutaric acid of the present invention, the glutamate is preferably monosodium glutamate.
본 발명의 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환 방법에 있어서, 상기 글루탐산염을 단계적으로 제공하는 것은, 글루탐산염을 20 내지 28시간의 간격으로 2회 이상 제공하는 것임이 바람직하다.In the method for converting 5-aminovaleric acid to glutaric acid of the present invention, it is preferable that glutamate is provided in stages at least twice at intervals of 20 to 28 hours.
본 발명의 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환 방법에 있어서, 상기 글루탐산염을 단계적으로 제공하는 것은, 글루탐산염을 20 내지 28시간의 간격으로 5회 이상 제공하는 것임이 보다 바람직하다.In the method for converting 5-aminovaleric acid to glutaric acid of the present invention, it is more preferable to provide glutamate in stages at least 5 times at intervals of 20 to 28 hours.
본 발명의 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환 방법에 있어서, 상기 미생물 시스템에 사용된 5-아미노발레르산의 1/20 내지 5/20 몰농도 수준의 글루탐산염을 단계적으로 분할하여 제공하는 것이 바람직하다.In the method for converting 5-aminovaleric acid to glutaric acid of the present invention, glutamate at a molar concentration level of 1/20 to 5/20 of 5-aminovaleric acid used in the microbial system is provided by dividing in stages. It is desirable to do so.
본 발명에 따르면 미생물 시스템을 이용하여 5-아미노발레르산을 글루타르산으로 효율적으로 전환시킬 수 있다. 특히, 본 발명에 따르면 α-케토글루타르산 대신 글루탐산염과 Gox 단백질 발현 미생물 시스템을 사용하면서도 α-케토글루타르산을 사용하는 경우에 가까운 전환율을 나타낼 수 있어, 글루타르산 생산 비용을 크게 줄일 수 있으며, 이에 따라 생물전환을 이용한 글루타르산 생산의 산업적/상업적 적용에 크게 기여할 수 있을 것으로 기대된다.According to the present invention, 5-aminovaleric acid can be efficiently converted to glutaric acid using a microbial system. In particular, according to the present invention, while using a microbial system expressing glutamate and Gox protein instead of α-ketoglutaric acid, a conversion rate close to that when using α-ketoglutaric acid can be achieved, significantly reducing the cost of glutaric acid production. It is expected that this will greatly contribute to the industrial/commercial application of glutaric acid production using bioconversion.
도 1은 GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질의 작용에 따라 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로 전환되는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 Gox 단백질 발현 미생물 시스템에서 시간에 따른 글루탐산염으로부터 α-케토글루타르산으로의 전환량을 나타낸 것이다. Whole cell, 전세포 반응; Crude enzyme, 조효소 반응.
도 3은 GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질 발현 미생물 시스템을 이용한 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환에서 α-케토글루타르산을 사용한 경우와 글루탐산염을 사용한 경우의 전환률을 비교하여 나타낸 것이다. A, α-케토글루타르산을 사용한 경우의 결과; B, 글루탐산염을 사용한 경우의 결과.
도 4는 GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질 발현 미생물 시스템을 이용한 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환에서 글루탐산염의 단계적인 제공에 따른 전환률을 나타낸 것이다.Figure 1 shows the process of conversion from 5-aminovaleric acid to glutaric acid according to the actions of GabD, GabT, Nox, and Gox proteins.
Figure 2 shows the amount of conversion from glutamate to α-ketoglutarate over time in a Gox protein-expressing microbial system. Whole cell, whole cell reaction; Crude enzyme, coenzyme reaction.
Figure 3 shows a comparison of the conversion rates between α-ketoglutarate and glutamate in the conversion from 5-aminovaleric acid to glutaric acid using a microbial system expressing GabD, GabT, Nox, and Gox proteins. will be. A, results using α-ketoglutarate; B, Results with glutamate.
Figure 4 shows the conversion rate of glutamate from 5-aminovaleric acid to glutaric acid using a microbial system expressing GabD, GabT, Nox, and Gox proteins.
본 발명에서, GabD 단백질은 숙시네이트 세미-알데하이드 디하이드로게나아제(succinate semi-aldehyde dehydrogenase)를 의미하는 것으로, NAD(P)+를 사용하여 글루타레이트 세미알데하이드(glutarate semialdehyde)로부터 글루타르산(glutaric acid)으로의 전환을 촉매할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, GabD 단백질은 대장균(Escherichia coli) 유래의 것이다.In the present invention, GabD protein refers to succinate semi-aldehyde dehydrogenase, which converts glutaric acid (from glutarate semialdehyde) using NAD(P) + It can catalyze the conversion to glutaric acid. In one embodiment of the invention, the GabD protein is from Escherichia coli .
본 발명에서, GabT 단백질은 4-아미노부티레이트 아미노트랜스퍼라아제(4-aminobutyrate aminotransferase)를 의미하는 것으로, α-케토글루타르산(α-ketoglutaric acid)을 사용하여 5-아미노발레르산(5-aminovaleric acid)으로부터 글루타레이트 세미알데하이드로의 전환을 촉매할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, GabD 단백질은 대장균 유래의 것이다.In the present invention, GabT protein refers to 4-aminobutyrate aminotransferase, which uses α-ketoglutaric acid to form 5-aminovaleric acid. It can catalyze the conversion of glutarate to semialdehyde. In one embodiment of the invention, the GabD protein is from E. coli.
본 발명에서, Nox 단백질은 NADPH 옥시다아제(NADPH oxidase)를 의미하는 것으로, NAD(P)H로부터 NAD(P)+로의 전환을 촉매할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, Nox 단백질은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 유래의 것이다.In the present invention, Nox protein refers to NADPH oxidase and can catalyze the conversion from NAD(P)H to NAD(P) + . In one embodiment of the invention, the Nox protein is from Bacillus subtilis .
본 발명에서, Gox 단백질은 글루타메이트 옥시다아제(glutamate oxidase)를 의미하는 것으로, 글루탐산염(glutamate)으로부터 α-케토글루타르산으로의 전환을 촉매할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, Gox 단백질은 스트렙토마이세스 모바라엔시스(Streptomyces mobaraensis) 유래의 것이다.In the present invention, Gox protein refers to glutamate oxidase and can catalyze the conversion from glutamate to α-ketoglutarate. In one embodiment of the invention, the Gox protein is from Streptomyces mobaraensis .
본 발명에서, GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질 발현 미생물 시스템은 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 가지며 배양 과정에서 또는 상기 유전자의 발현을 유도하는 물질을 제공함으로써 상기 단백질을 발현할 수 있는 미생물 시스템을 의미한다.In the present invention, the microbial system expressing GabD, GabT, Nox and Gox proteins refers to a microbial system that has genes encoding the proteins and can express the proteins during cultivation or by providing substances that induce expression of the genes. do.
본 발명에서, GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질 발현 미생물 시스템은 하나의 개체에서 GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질 모두를 발현할 수 있는 미생물 또는 하나의 개체에서 GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질 중 일부의 단백질을 발현하는 미생물들의 조합으로서 조합에 의해 GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질 모두를 발현할 수 있는 미생물의 조합일 수 있다.In the present invention, the GabD, GabT, Nox and Gox protein expression microbial system refers to a microorganism capable of expressing all of GabD, GabT, Nox and Gox proteins in one entity or some of GabD, GabT, Nox and Gox proteins in one entity. It is a combination of microorganisms that express proteins, and may be a combination of microorganisms that can express all of the GabD, GabT, Nox, and Gox proteins by combination.
본 발명의 일 실시형태에서, GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질 발현 미생물 시스템은, 하나의 개체에서 GabD, GabT 및 Nox 단백질을 발현할 수 있는 미생물과 하나의 개체에서 Gox 단백질을 발현할 수 있는 미생물의 조합이다.In one embodiment of the present invention, the GabD, GabT, Nox and Gox protein expressing microbial system includes a microorganism capable of expressing GabD, GabT and Nox proteins in one individual and a microorganism capable of expressing Gox protein in one individual. It is a combination of
본 발명의 일 실시형태에서, 단백질 발현 미생물 시스템은, 바람직하게는, 단백질 발현 대장균 시스템이다. 대장균 시스템은 가장 많이 연구된 단백질 발현 미생물 시스템 중 하나로, 이를 이용하면 보다 용이한 실시가 가능하며, 비용 효율적인 측면에서도 이점을 기대할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 상기 대장균은 E. coli BL21(DE3)이다.In one embodiment of the invention, the protein-expressing microbial system is preferably a protein-expressing Escherichia coli system. The E. coli system is one of the most studied protein expression microbial systems, and its use allows for easier implementation and can be expected to be cost-effective. In one embodiment of the present invention, the E. coli is E. coli BL21 (DE3).
본 발명에서, GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질 모두를 발현할 수 있는 미생물 또는 GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질 중 일부의 단백질을 발현하는 미생물은 각 단백질을 암호화하는 유전자를 발현 가능한 상태로 미생물에 도입하는 통상적인 분자유전학적 방법을 사용하여 제작할 수 있다. 예를 들어, 단백질을 암호화하는 유전자를 적합한 벡터(예를 들어, 발현 벡터)에 삽입하고, 이것으로 미생물을 형질전환시키는 방법을 사용할 수 있다.In the present invention, microorganisms capable of expressing all of GabD, GabT, Nox, and Gox proteins or microorganisms expressing some of GabD, GabT, Nox, and Gox proteins are provided to microorganisms capable of expressing genes encoding each protein. It can be produced using conventional molecular genetic methods. For example, a method of inserting a gene encoding a protein into a suitable vector (eg, expression vector) and transforming a microorganism with this can be used.
GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질을 암호화하는 유전자에 관한 정보는 GenBank 데이터베이스 등의 유전정보 데이터베이스로부터 쉽게 얻을 수 있으므로, 이를 각 단백질 발현 미생물 제작에 이용할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, GabD를 암호화하는 유전자 및 GabT를 암호화하는 유전자는 대장균 유래의 유전자이고, Nox를 암호화하는 유전자는 바실러스 서브틸리스 유래의 유전자이고, Gox를 암호화하는 유전자는 스트렙토마이세스 모바라엔시스 유래의 유전자이다.Information about genes encoding GabD, GabT, Nox, and Gox proteins can be easily obtained from genetic information databases such as the GenBank database, so this can be used to create microorganisms that express each protein. In one embodiment of the present invention, the gene encoding GabD and the gene encoding GabT are genes from E. coli, the gene encoding Nox is a gene from Bacillus subtilis, and the gene encoding Gox is from Streptomyces. It is a gene derived from Mobaraensis.
상기 벡터로는 해당 미생물에서 단백질을 발현시키기 위한 용도로 사용되는 발현 벡터를 사용할 수 있으며, 다양한 종류의 상업화된 발현 벡터를 입수하여 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시형태에서, 벡터는, 바람직하게는, pET 시리즈 및 pCDFDuet 시리즈의 벡터이며, 보다 바람직하게는, pET24 벡터 및 pCDFDuet-1 벡터이다.The vector can be an expression vector used to express a protein in the corresponding microorganism, and various types of commercial expression vectors can be obtained and used. In one embodiment of the present invention, the vector is preferably a vector of the pET series and pCDFDuet series, and more preferably a pET24 vector and a pCDFDuet-1 vector.
본 발명의 일 실시형태에서, 글루탐산염은, 바람직하게는, 글루탐산 모노나트륨(monosodium glutamate, MSG)이다. 글루탐산 모노나트륨은 글루탐산염 중에서도 쉽게 입수할 수 있고 비용 또한 저렴한 것이므로, 이를 사용하면 실시의 용이성, 비용 효율성 등의 측면에서의 이점을 기대할 수 있다.In one embodiment of the invention, the glutamate is preferably monosodium glutamate (MSG). Monosodium glutamate is easily available and inexpensive among glutamates, so its use can be expected to provide advantages in terms of ease of implementation and cost-effectiveness.
본 발명의 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환 방법은, GabD, GabT 및 Nox 단백질 발현 미생물 시스템을 이용하여 5-아미노발레르산을 글루타르산으로 전환시키는데 있어서, GabT의 촉매 작용을 위해 α-케토글루타르산을 사용하는 대신 글루탐산염과 Gox 단백질 발현 미생물 시스템을 사용하는 것을 특징으로 하며, 글루탐산염을 단계적으로 제공하는 것을 특징으로 한다.The method for converting 5-aminovaleric acid to glutaric acid of the present invention converts 5-aminovaleric acid to glutaric acid using a microbial system expressing GabD, GabT and Nox proteins, for the catalytic action of GabT. Instead of using α-ketoglutarate, it is characterized by using a microbial system expressing glutamate and Gox protein, and is characterized by providing glutamate in stages.
특히, 본 발명에 따르면, 글루탐산염을 단계적으로 제공하는 방식을 사용함으로써, 전환에 필요한 글루탐산염을 초기에 전부 제공하는 방식에 비해 월등히 높으며, 같은 수준(예를 들어, 같은 몰농도)의 α-케토글루타르산을 사용하는 경우에 가까운 전환율을 나타낼 수 있다. 이는 연구를 통해 입증된 결과를 바탕으로 한다.In particular, according to the present invention, by using a method of providing glutamate in stages, it is significantly higher than the method of initially providing all of the glutamate required for conversion, and the α- at the same level (e.g., same molar concentration) The conversion rate can be close to that when using ketoglutaric acid. This is based on results proven through research.
글루탐산염, 특히 글루탐산 모노나트륨(MSG)의 단가는 α-케토글루타르산의 1/10 수준에 불과하므로, 본 발명에 따라 글루타르산 생산 비용을 크게 절감할 수 있게 되는 것이다.Since the unit price of glutamate, especially monosodium glutamate (MSG), is only 1/10 of that of α-ketoglutarate, the cost of producing glutaric acid can be greatly reduced according to the present invention.
본 발명에서, 단계적으로 제공한다는 것은, 미생물 시스템을 이용한 전환 과정 중에 적어도 2회 이상으로 나누어 제공한다는 것을 의미한다. 바람직하게는, 3회 이상, 보다 바람직하게는, 4회 이상, 보다 바람직하게는, 5회 이상으로 나누어 제공한다.In the present invention, providing in stages means providing at least two times during the conversion process using a microbial system. Preferably, it is divided into 3 or more times, more preferably, 4 or more times, and more preferably, 5 or more times.
본 발명에서, 글루탐산염의 단계적 제공 시, 20 내지 28시간의 간격으로 제공하는 것이 바람직하다. 이는 Gox 단백질 발현 미생물의 글루탐산염으로부터 α-케토글루타르산으로의 전환 특성을 조사한 연구 결과를 바탕으로 하는 것으로, 이러한 시간 간격에 따르면 보다 효율적으로 전환을 수행할 수 있다. 보다 바람직하게는 20 내지 24시간의 간격으로 글루탐산염을 제공한다.In the present invention, when providing glutamate in stages, it is preferable to provide it at intervals of 20 to 28 hours. This is based on the results of a study investigating the conversion characteristics of glutamate to α-ketoglutarate in Gox protein-expressing microorganisms, and according to this time interval, the conversion can be performed more efficiently. More preferably, glutamate is provided at intervals of 20 to 24 hours.
본 발명에서, 글루탐산염의 단계적 제공 시, 미생물 시스템에 사용된 5-아미노발레르산의 1/20 내지 5/20 몰농도 수준의 글루탐산염을 단계적으로 분할하여 제공하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 미생물 시스템에 200mM의 5-아미노발레르산이 사용된 경우, 200mM의 1/20 몰농도 수준인 10mM 내지 200mM의 5/20 몰농도 수준인 50mM의 글루탐산염을 2회 이상으로 나누어 제공할 수 있다. 보다 바람직하게는 미생물 시스템에 사용된 5-아미노발레르산의 2/20 내지 4/20 몰농도 수준의 글루탐산염을 단계적으로 분할하여 제공한다.In the present invention, when providing glutamate in stages, it is preferable to provide glutamate in stages at a molar concentration level of 1/20 to 5/20 of 5-aminovaleric acid used in the microbial system. For example, if 200mM of 5-aminovaleric acid is used in the microbial system, glutamate of 10mM, which is 1/20 molar concentration level of 200mM, to 50mM, which is 5/20 molar concentration level of 200mM, can be provided in two or more doses. You can. More preferably, glutamate is provided in stages at a molar concentration level of 2/20 to 4/20 of 5-aminovaleric acid used in the microbial system.
이때 글루탐산염을 분할하여 제공함에 있어서, 바람직하게는 각 회수별 몰농도의 차이가 ±10% 이내의 차이인 것이 바람직하다. 예를 들어, 어느 한 회수차의 글루탐산염 제공 몰농도가 6mM인 경우, 다른 회수차의 글루탐산염 제공 몰농도는 5.4mM 내지 6.6mM 사이인 것이 바람직하다. 이에 따르면, 보다 효율적으로 전환을 수행할 수 있다.At this time, when providing glutamate by dividing it, it is preferable that the difference in molar concentration for each number of times is within ±10%. For example, if the molar concentration of glutamate provided by one recovery vehicle is 6mM, the molar concentration of glutamate provided by the other recovery vehicle is preferably between 5.4mM and 6.6mM. According to this, conversion can be performed more efficiently.
본 발명에서, GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질 발현 미생물 시스템을 이용한 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환은, GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질을 발현하는 미생물(하나의 개체에서 4종의 단백질 모두를 발현하는 미생물 또는 4종의 단백질 중 일부를 발현하는 미생물들의 조합일 수 있음)을 배양하여 세포를 얻고 이 세포를 완충액 중에서 5-아미노발레르산, NAD+ 및 글루탐산염과 접촉시키는 방식으로 실시할 수 있다. 완충액은 바람직하게는 Tris-HCl 완충액이며, 바람직하게는 pH 8 내지 9의 완충액이다. 전환 반응의 온도는 예를 들어 대장균 시스템인 경우 28 내지 32℃로 수행할 수 있다.In the present invention, the conversion from 5-aminovaleric acid to glutaric acid using a microbial system expressing GabD, GabT, Nox and Gox proteins is achieved by microorganisms expressing GabD, GabT, Nox and Gox proteins (4 types in one individual). A method of obtaining cells by culturing microorganisms that express all of the proteins or a combination of microorganisms that express some of the four proteins and contacting these cells with 5-aminovaleric acid, NAD + and glutamate in a buffer solution. It can be carried out. The buffer solution is preferably Tris-HCl buffer, and is preferably a buffer solution with a pH of 8 to 9. The temperature of the conversion reaction can be carried out at 28 to 32° C., for example, in the case of an E. coli system.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. Since these examples are merely for illustrating the present invention, the scope of the present invention is not to be construed as limited by these examples.
[실시예][Example]
1. Gox 단백질 발현 미생물 시스템에서 시간에 따른 글루탐산염으로부터 α-케토글루타르산으로의 전환량 조사1. Investigation of the amount of conversion from glutamate to α-ketoglutarate over time in a Gox protein-expressing microbial system
Gox 단백질 발현 미생물 시스템으로 E. coli BL21(DE3) pET24ma ::: gox 균주(이하, 'gox 발현 균주'라 한다)를 사용하였으며, 글루탐산염으로 MSG(monosodium glutamate)를 사용하였다. 이 시스템에서 MSG로부터 α-케토글루타르산(α-ketoglutaric acid)으로의 전환량을 조사하였다. E. coli BL21(DE3) pET24ma ::: gox strain (hereinafter referred to as ' gox expression strain') was used as a microbial system for expressing Gox protein, and monosodium glutamate (MSG) was used as glutamate. In this system, the amount of conversion from MSG to α-ketoglutaric acid was investigated.
이때, gox 발현 균주는 gox 유전자를 pET24ma 벡터(T7 프로모터, lac 오페론, 카나마이신 저항성 유전자)에 BglII/XhoI 제한효소 부위를 이용하여 삽입하고 이 벡터로 E. coli BL21(DE3)을 형질전환한 재조합 균주이며, gox 유전자는 스트렙토마이세스 모바라엔시스(Streptomyces mobaraensis)로부터 표 1의 프라이머를 사용한 PCR로 얻었다.At this time, the gox expression strain was created by inserting the gox gene into the pET24ma vector (T7 promoter, lac operon, kanamycin resistance gene) using Bgl II/ Xho I restriction enzyme sites and transforming E. coli BL21(DE3) with this vector. It is a recombinant strain, and the gox gene was obtained from Streptomyces mobaraensis by PCR using the primers in Table 1.
* F, 정방향 프라이머(forward primer); R, 역방향 프라이머(reverse primer)*F, forward primer; R, reverse primer
gox 발현 균주를 LB 배지(pET24ma 벡터의 선별마커인 카나마이신 함유)에서 37℃ 및 250rpm으로 전배양하였다. 전배양 후 LB 배지에서 30℃ 및 200rpm에서 18 내지 24시간 동안 배양하여 O.D600값이 0.4 내지 0.6일 때, IPTG(0.005mM)를 사용하여 발현을 유도하였다. 배양액을 4,000rpm에서 15분간 원심분리하여 세포(gox 발현 균주의 세포)를 얻고, 1M Tris-HCl(pH 8.5)로 2회 세척하였다. The gox expression strain was pre-cultured in LB medium (containing kanamycin, a selection marker for the pET24ma vector) at 37°C and 250 rpm. After pre-culture, the cells were cultured in LB medium at 30°C and 200 rpm for 18 to 24 hours, and when the OD 600 value was 0.4 to 0.6, expression was induced using IPTG (0.005mM). The culture medium was centrifuged at 4,000 rpm for 15 minutes to obtain cells (cells of the gox expression strain) and washed twice with 1M Tris-HCl (pH 8.5).
MSG(30mM)가 함유된 500mM Tris 완충액(pH 8.5)을 반응 매체로 준비하고, 준비된 gox 발현 균주 세포(O.D600 = 40)를 첨가한 다음 30℃ 및 200rpm에서 120시간 동안 반응시켰다(전세포 반응).500mM Tris buffer (pH 8.5) containing MSG (30mM) was prepared as a reaction medium, and the prepared gox expression strain cells (OD 600 = 40) were added and reacted at 30°C and 200rpm for 120 hours (whole cell reaction) ).
또한, 비교를 위해 세포(gox 발현 균주의 세포)를 파쇄하여 조효소물(crude enzyme)을 준비하고 이를 세포 대신 사용(위의 반응에 사용된 세포와 동량의 세포의 파쇄물을 사용)하여 반응을 수행하였다(조효소 반응).Additionally, for comparison, cells (cells of a gox expression strain) were disrupted to prepare crude enzyme and used instead of the cells (the same amount of cell lysate as the cells used in the above reaction was used) to perform the reaction. (coenzyme reaction).
조효소물은 위에서 준비한 gox 발현 균주 세포를 Tris-HCl(pH 8.5)에서 소니케이터를 사용하여 세포막을 파쇄하는 방법으로 준비하였다.The crude enzyme was prepared by disrupting the cell membrane of the gox- expressing strain cells prepared above in Tris-HCl (pH 8.5) using a sonicator.
이후, 각 시간 경과에 따른 반응액 중의 α-케토글루타르산의 농도를 HPLC로 측정하였다. RID(refractive index detector) 및 Bio-RAD의 Aminex HPX-87H 컬럼(300x7.8㎜)이 장착된 HPLC를 사용하였으며, 유속은 0.6㎖/분, 컬럼 오븐 온도는 60℃로 유지시켰다. 이동상은 0.008N H2SO4를 사용하였다.Afterwards, the concentration of α-ketoglutaric acid in the reaction solution over time was measured by HPLC. HPLC equipped with a refractive index detector (RID) and Bio-RAD's Aminex HPX-87H column (300x7.8 mm) was used, the flow rate was 0.6 mL/min, and the column oven temperature was maintained at 60°C. The mobile phase was 0.008NH 2 SO 4 .
이의 결과, 조효소를 사용한 반응에서는 시간이 경과할수록 글루탐산염으로부터 α-케토글루타르산으로의 전환량이 증가하였으나, 전세포 반응에서는 약 24시간까지는 조효소 반응에서와 유사한 양상을 보이다가 이후 전환량이 감소하는 것으로 나타났다(도 2).As a result, in the reaction using coenzyme, the amount of conversion from glutamate to α-ketoglutarate increased over time, but in the whole-cell reaction, it showed a similar pattern to that in the coenzyme reaction until about 24 hours, and then the amount of conversion decreased. It was found that (Figure 2).
2. GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질 발현 미생물 시스템을 이용한 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환에서 α-케토글루타르산을 사용한 경우와 글루탐산염을 사용한 경우의 전환률 비교2. Comparison of conversion rates between α-ketoglutarate and glutamate in the conversion of 5-aminovaleric acid to glutaric acid using a microbial system expressing GabD, GabT, Nox, and Gox proteins.
GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질 발현 미생물 시스템으로 E. coli BL21(DE3) pCDFDuet-1 ::: gabDT ::: nox 균주(gabD, gabT 및 nox 발현 균주, 이하 'gabDTnox 발현 균주'라 한다)와 E. coli BL21(DE3) pET24ma ::: gox 균주(gox 발현 균주, 상기 1번 항목 참조)를 사용하였으며, 글루탐산염으로 MSG를 사용하였다. 이들 두 균주를 사용한 전세포 전환으로 5-아미노발레르산(5-aminovaleric acid)으로부터 글루타르산(glutaric acid)으로의 전환을 시도하였다.As a microbial system expressing GabD, GabT, Nox and Gox proteins, E. coli BL21(DE3) pCDFDuet-1 ::: gabDT ::: nox strain (gabD, gabT and nox expression strain, hereinafter referred to as ' gabDTnox expression strain') E. coli BL21(DE3) pET24ma::: gox strain ( gox expression strain, see item 1 above) was used, and MSG was used as glutamate. Conversion from 5-aminovaleric acid to glutaric acid was attempted through whole-cell conversion using these two strains.
gabDTnox 발현 균주는 gabD, gabT 및 nox 유전자를 pCDFDuet-1 벡터(T7 프로모터, lac 오페론, 스트렙토마이신 저항성 유전자)에 각각 EcoRI/SacI, SacI/HindIII 및 BglII/XhoI 제한효소 부위를 이용하여 삽입하고 이 벡터로 E. coli BL21(DE3)을 형질전환한 재조합 균주이며, gabD 및 gabT 유전자는 대장균으로부터, nox 유전자는 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)로부터 각각 표 2의 프라이머를 사용한 PCR로 얻었다. The gabDTnox expression strain was created by inserting the gabD , gabT and nox genes into the pCDFDuet-1 vector (T7 promoter, lac operon, streptomycin resistance gene) with EcoR I/ Sac I, Sac I/ Hind III and Bgl II/ Xho I restriction enzyme sites, respectively. It is a recombinant strain inserted using this vector and transformed into E. coli BL21 (DE3). The gabD and gabT genes are from E. coli, and the nox gene is from Bacillus subtilis . PCR using the primers in Table 2, respectively. got it with
* F, 정방향 프라이머(forward primer); R, 역방향 프라이머(reverse primer)*F, forward primer; R, reverse primer
gabDTnox 발현 균주 및 gox 발현 균주를 각각 LB 배지(각각의 선별마커 항생제를 함유)(gabDTnox 발현 균주의 배양은 스트렙토마이신, gox 발현 균주의 배양은 카나마이신을 함유)에서 37℃ 및 250rpm으로 전배양하였다. 전배양 후 LB 배지에서 30℃ 및 200rpm에서 18 내지 24시간 동안 배양하여 O.D600값이 0.4 내지 0.6일 때, IPTG(pET24ma = 0.005mM, pCDFDuet-1 = 0.1mM)를 사용하여 발현을 유도하였다. 배양액을 4,000rpm에서 15분간 원심분리하여 세포(gabDTnox 발현 균주의 세포 및 gox 발현 균주의 세포)를 얻고, 1M Tris-HCl(pH 8.5)로 2회 세척하였다. The gabDTnox -expressing strain and the gox- expressing strain were pre-cultured at 37°C and 250 rpm in LB medium (containing each selection marker antibiotic) (streptomycin for the culture of the gabDTnox -expressing strain and kanamycin for the culture of the gox -expressing strain). After pre-culture, the cells were cultured in LB medium at 30°C and 200 rpm for 18 to 24 hours, and when the OD 600 value was 0.4 to 0.6, expression was induced using IPTG (pET24ma = 0.005mM, pCDFDuet-1 = 0.1mM). The culture medium was centrifuged at 4,000 rpm for 15 minutes to obtain cells (cells of the gabDTnox expression strain and cells of the gox expression strain), and washed twice with 1M Tris-HCl (pH 8.5).
5-아미노발레르산(200mM), NAD+(5mM), 및 α-케토글루타르산(30mM) 또는 MSG(30mM)가 함유된 500mM Tris 완충액(pH 8.5)을 반응 매체로 준비하고, 준비된 gabDTnox 발현 균주 세포(O.D600 = 40) 및 gox 발현 균주 세포(O.D600 = 40)를 첨가한 다음 30℃ 및 200rpm에서 120시간 동안 반응시켰다.500mM Tris buffer (pH 8.5) containing 5-aminovaleric acid (200mM), NAD + (5mM), and α-ketoglutarate (30mM) or MSG (30mM) was prepared as reaction medium, and the prepared gabDTnox expression Strain cells (OD 600 = 40) and gox- expressing strain cells (OD 600 = 40) were added and reacted at 30°C and 200 rpm for 120 hours.
이후, 각 시간 경과에 따른 반응액 중의 글루타르산 및 α-케토글루타르산의 농도를 상기 1번 항목과 같은 방법을 사용하여 HPLC로 측정하였다.Thereafter, the concentrations of glutaric acid and α-ketoglutaric acid in the reaction solution over time were measured by HPLC using the same method as item 1 above.
200mM의 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환에서 조효소인 α-케토글루타르산을 0시간째에 30mM로 투입한 결과와 같은 양의 MSG를 0시간째에 투입한 결과를 비교한 결과, α-케토글루타르산을 사용하였을 때는 약 122mM의 글루타릭산으로(도 3A), MSG를 사용하였을 때는 약 70mM의 글루타릭산으로 전환되었다(도 3B). 이는 MSG를 사용한 전환이 α-케토글루타르산을 사용한 전환에 비해 전환률이 낮으며, MSG를 사용한 경우가 α-케토글루타르산을 사용한 경우의 약 57% 정도에 불과하다는 것을 나타낸다.The results of comparing the results of adding 30mM of coenzyme α-ketoglutaric acid at 0 hours in the conversion of 200mM 5-aminovaleric acid to glutaric acid with the results of adding the same amount of MSG at 0 hours. , when α-ketoglutaric acid was used, it was converted to about 122mM glutaric acid (Figure 3A), and when MSG was used, it was converted to about 70mM glutaric acid (Figure 3B). This indicates that conversion using MSG has a lower conversion rate than conversion using α-ketoglutaric acid, and the conversion rate when using MSG is only about 57% of the conversion rate when using α-ketoglutaric acid.
3. GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질 발현 미생물 시스템을 이용한 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환에서 글루탐산염의 단계적인 제공에 따른 전환률 조사3. Investigation of the conversion rate of 5-aminovaleric acid to glutaric acid by stepwise provision of glutamate using a microbial system expressing GabD, GabT, Nox and Gox proteins
상기 2번 항목과 같은 GabD, GabT, Nox 및 Gox 단백질 발현 미생물 시스템을 사용하여, 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환을 시도하되, MSG 모두(30mM)를 0시간째에 투입하지 않고, 0, 24, 48, 72 및 96시간째에 1회에 6mM씩 투입(총 30mM)하였다.Using the same microbial system expressing GabD, GabT, Nox, and Gox proteins as in item 2 above, conversion from 5-aminovaleric acid to glutaric acid was attempted, but without adding all of the MSG (30mM) at 0 hours. , 6mM was administered at a time at 0, 24, 48, 72, and 96 hours (total 30mM).
이의 결과, 상기 2번 항목에서와 같이, MSG 모두(30mM)를 0시간째에 투입한 경우는 약 70mM의 글루타르산으로 전환된 반면(도 3B), MSG를 단계적으로 투입한 경우는 약 103mM의 글루타르산으로 전환되었다(도 4). 또한, MSG를 단계적으로 투입한 결과를, 상기 2번 항목에서와 같이 α-케토글루타르산을 0시간째에 30mM로 투입한 결과(도 3A)와 비교하더라도, 약 19mM의 차이만을 보였다.As a result, as in item 2 above, when all of the MSG (30mM) was added at 0 hours, it was converted to about 70mM glutaric acid (Figure 3B), whereas when MSG was added stepwise, it was converted to about 103mM. was converted to glutaric acid (Figure 4). In addition, when comparing the results of gradually adding MSG to the results of adding 30mM of α-ketoglutaric acid at 0 hours as in item 2 above (Figure 3A), there was only a difference of about 19mM.
이는 전환 초기에 MSG를 모두 투입하는 기존의 일반적인 방식과 비교하여 MSG를 단계적으로 제공하는 방식이 훨씬 효율적임을 나타내며, 또한 MSG가 α-케토글루타르산의 약 1/10 가격인 점을 고려하면, MSG의 단계적인 제공 방식에 따라 글루타르산의 생산 비용을 획기적으로 절감할 수 있음을 나타낸다.This indicates that the method of providing MSG in stages is much more efficient compared to the existing general method of adding all MSG at the beginning of conversion. Also, considering that MSG is about 1/10 the price of α-ketoglutarate, This shows that the production cost of glutaric acid can be dramatically reduced by following the step-by-step provision method of MSG.
Claims (6)
상기 미생물 시스템에 글루탐산염을 단계적으로 제공하는, 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환 방법.A method for converting 5-aminovaleric acid to glutaric acid using a microbial system expressing GabD, GabT, Nox and Gox proteins, comprising:
A method for converting 5-aminovaleric acid to glutaric acid, stepwise providing glutamate to the microbial system.
상기 미생물 시스템은 대장균 시스템인, 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환 방법.According to paragraph 1,
A method for converting 5-aminovaleric acid to glutaric acid, wherein the microbial system is an Escherichia coli system.
상기 글루탐산염은 글루탐산 모노나트륨인, 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환 방법.According to paragraph 1,
A method for converting 5-aminovaleric acid to glutaric acid, wherein the glutamate is monosodium glutamate.
상기 글루탐산염을 단계적으로 제공하는 것은, 글루탐산염을 20 내지 28시간의 간격으로 2회 이상 제공하는 것인, 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환 방법.According to paragraph 1,
The method of converting 5-aminovaleric acid into glutaric acid, wherein the stepwise provision of glutamate involves providing glutamate two or more times at intervals of 20 to 28 hours.
상기 글루탐산염을 단계적으로 제공하는 것은, 글루탐산염을 20 내지 28시간의 간격으로 5회 이상 제공하는 것인, 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환 방법.According to paragraph 1,
The method of converting 5-aminovaleric acid into glutaric acid, wherein the stepwise provision of glutamate involves providing glutamate five or more times at intervals of 20 to 28 hours.
상기 미생물 시스템에 사용된 5-아미노발레르산의 1/20 내지 5/20 몰농도 수준의 글루탐산염을 단계적으로 분할하여 제공하는, 5-아미노발레르산으로부터 글루타르산으로의 전환 방법.According to paragraph 1,
A method for converting 5-aminovaleric acid to glutaric acid, providing stepwise division of glutamate at a molar concentration level of 1/20 to 5/20 of 5-aminovaleric acid used in the microbial system.
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