KR101271160B1 - Method for Preparing glutaric acid using recombinant microorganism - Google Patents

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Abstract

본 발명은 재조합 대장균 균주를 이용한 라이신(lysine)으로부터 글루타릭산(glutaric acid)의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 재조합 대장균 균주를 델타-아미노발레라미다아제(delta-aminovaleramidase; DavA), 2-단일산화효소(lysine 2-monooxygenase; DavB), 5-아미노발레이트 아미노트렌스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT) 및 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(glutarate semialdehyde dehydrogenase; DavD) 유전자로 형질전환하여 제조한 재조합 균주에 의해 라이신으로부터 글루타릭산을 생산하는 방법에 관한 것이며, 상기 재조합 대장균 균주는 라이신으로부터 글루타릭산으로의 유의적인 전환 생산능이 있으므로, 상기 방법은 글루타릭산 저가의 대량 생산기술에 유용하게 이용될 수 있다.The present invention relates to a method for producing glutaric acid from lysine (lysine) using a recombinant E. coli strain. Transformed with lysine 2-monooxygenase (DaB), 5-aminovalerate aminotransferase (DavT) and glutarate semialdehyde dehydrogenase (DaD) gene The present invention relates to a method for producing glutaric acid from lysine by a recombinant strain prepared by the present invention, and the recombinant E. coli strain has a significant conversion production capacity from lysine to glutaric acid. It can be usefully used.

Description

재조합 미생물을 이용한 글루타릭산의 제조 방법{Method for Preparing glutaric acid using recombinant microorganism}Method for preparing glutaric acid using recombinant microorganism

본 발명은 재조합 미생물을 이용한 라이신(lysine)으로부터 글루타릭산(glutaric acid)의 제조 방법에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for preparing glutaric acid from lysine using recombinant microorganisms.

최근 전 세계적인 석유수급 불안과 석유자원 고갈에 대한 위기의식으로 최근에 산업 바이오 기술을 이용하여 바이오매스에서 유래한 대체 생산 방법이나 대체 화합물을 생산하기 위한 전 인류적인 노력이 바이오에너지, 바이오플라스틱, 바이오화합물 등의 다양한 분야에서 가시화되고 있다. 바이오매스를 활용하여 생산되는 바이오 플라스틱 시장의 경우 2002년 Natureworks사에 의해 상업화된 폴리유산 (Poly Lactic acid)이 연 14만 톤 규모로 생산되어 최근 시장이 급속히 확대되고 있다. PHA계 바이오플라스틱인 폴리-(3-하이드록시부틸레이트-코-3-하이드록시발레레이트{poly-(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalarate)}(P(3HB-co-3HV))도 Metabolix와 ADM의 합작회사인 Telles에 의해 5만 톤 규모의 공장이 2010년 완공되어 제품이 시판되고 있다. 또한, 듀폰사가 생산하고 있는 바이오매스 기반의 1,3-프로판디올을 이용하여 PTT 고분자 제품이 현재 상용화되어 있다. 이외에도 숙신산 기반의 PBS 등도 활발히 개발되고 있다.
In recent years, in response to the global oil supply instability and the crisis of depletion of petroleum resources, all human efforts to produce alternative production methods or alternative compounds derived from biomass using industrial biotechnology have recently been developed. It is visualized in various fields, such as a compound. The bioplastics market, which utilizes biomass, is produced in 140,000 tonnes of polylactic acid, commercialized by Natureworks in 2002, and is expanding rapidly. Poly- (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalarate)} (P (3HB-co-3HV)), a PHA-based bioplastic, is also metabolix. The product is being marketed by the Telles, a joint venture between ADM and ADM, with a production capacity of 50,000 tonnes completed in 2010. In addition, PTT polymer products are manufactured using biomass-based 1,3-propanediol produced by DuPont. In addition, SBS-based PBS is being actively developed.

나일론 4의 원료물질인 2-피롤리돈은 감마 부티로락톤(gamma butyrolactone)으로부터 생산될 수 있으며 4-아미노부틸산의 탈수 고리반응에 의해 생산될 수 있다. 4-아미노부틸산의 경우 감마-아미노부틸산(gamma-aminobutyric acid, GABA)이라고도 하는데, 체내에서는 신경전달물질 억제효과에 의한 저혈압 및 진통효과가 있다고 알려져, 현재 식품 및 의약품 소재로 활용되고 있다(Erlander et al., Neurochem Res. 16: 215-226, 1991). 이러한 GABA는 글루타메이트를 원료로 글루타메이트 디카르복실라아제(Glutamate decarboxylase)에 의해 제조될 수 있는데, 현재까지 다양한 글루타메이트 디카르복실라아제가 보고되어 있으며(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8491-8495, 1990; Protein Expression and Purification 8: 430-438, 1996; Biosci. Biotechnol. Biochem. 66(12): 2600-2605, 2002), 글루타메이트 디카르복실라아제를 이용하여 GABA를 생산하는 공정이 개발된바 있다. 나일론 4 이외에 최근에 나일론 5에 관한 관심 또한 높아지고 있다. 나일론 5의 모노머는 현재 라이신으로부터 유래된 다이아민인 카다베린(cadaverine)이 사용되고 있다.
2-pyrrolidone, a raw material of nylon 4, can be produced from gamma butyrolactone and can be produced by the dehydration ring reaction of 4-aminobutyl acid. 4-aminobutyric acid is also called gamma-aminobutyric acid (GABA), which is known to have hypotension and analgesic effects by neurotransmitter inhibitory effects, and is currently used as a food and pharmaceutical material ( Erlander et al., Neurochem Res. 16: 215-226, 1991). Such GABA can be prepared by glutamate decarboxylase based on glutamate, and various glutamate decarboxylases have been reported to date (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 8491-8495, 1990; Protein Expression and Purification 8: 430-438, 1996; Biosci.Biotechnol.Biochem. 66 (12): 2600-2605, 2002), a process for producing GABA using glutamate decarboxylase This has been developed. In addition to nylon 4, interest in nylon 5 has also increased recently. The monomer of nylon 5 is currently used cadaverine, a diamine derived from lysine.

본 발명자들은 라이신(lysine)으로부터 유래될 수 있는 나일론 5의 또 다른 모노머로서 5-아미노발레르산(5-aminovaleric acid)을 생산하는 공정을 개발하기 위하여 연구한 결과, 대장균에 L-라이신(L-lysine)을 5-아미노발레르아미드(5-aminovaleramide)로 전환하는 라이신 2-단일산화효소(lysine 2-monooxygenase; DavB) 효소와 5-아미노발레르아미드를 5-아미노발레르산(5-aminovaleric acid)으로 전환하는 델타-아미노발레라미다아제(delta-aminovaleramidase; DavA) 효소를 증폭함으로써 라이신으로부터 5-아미노발레르산이 생산됨을 확인하였으므로, 상기 재조합 균주는 5-아미노발레르산을 저가로 대량 생산하는데 유용하게 사용할 수 있음을 밝힌바 있다. 또한, 대한민국 등록특허 10-0828625-0000에서는 재조합 대장균을 이용한 의학적 용도의 알파-케토-글루타메이트 및 만티톨의 제조방법이 기재되어 있고, Jouranl of Molecular Catalysis B: Enzymatic 65(2010) 58-21에서는 글루타릭산의 중간 물질인 5-아미노발레르산을 효과적으로 생산하는 방법이 기재되어 있으나, 재조합 미생물을 이용한 글루타릭산을 생산방법은 알려진바 없다.
The present inventors have studied to develop a process for producing 5-aminovaleric acid as another monomer of nylon 5 which may be derived from lysine, and thus L-lysine (L- lysine 2-monooxygenase (DabB) enzyme and 5-aminovaleramide to 5-aminovaleric acid to convert lysine to 5-aminovaleramide It was confirmed that 5-aminovaleric acid is produced from lysine by amplifying the delta-aminovaleramidase (DV-A) enzyme, which can be useful for mass production of low-cost 5-aminovaleric acid. It has been said. In addition, Korean Patent No. 10-0828625-0000 discloses a method for preparing alpha-keto-glutamate and mantitol for medical use using recombinant Escherichia coli, and described in Jouranl of Molecular Catalysis B: Enzymatic 65 (2010) 58-21. Although a method for effectively producing 5-amino valeric acid, which is an intermediate of rutaric acid, has been described, a method for producing glutaric acid using recombinant microorganisms is not known.

폴리머의 모노머로 사용될 수 있는 케미칼은 앞에 예를 든 것과 같이 C3의1,3-프로판디올, 말릭산, C4의 숙신산, 1,4-부탄디올, C5의 1,5-펜탄디올, 글루타릭산등의 다이올과 다이에시드이다.
Chemicals that can be used as monomers in polymers include C3 1,3-propanediol, malic acid, C4 succinic acid, 1,4-butanediol, C5 1,5-pentanediol, glutaric acid, etc. Diols and diesides.

이에 본 발명자들은 라이신(lysine)으로부터 유래될 수 있는 C5의 글루타릭산을 생산하는 공정을 개발하기 위하여 연구한 결과, 대장균에 L-라이신(L-lysine)을 5-아미노발레르아미드(5-aminovaleramide)로 전환하는 라이신 2-단일산화효소(lysine 2-monooxygenase; DavB) 효소와 5-아미노발레르아미드를 5-아미노발레르산(5-aminovaleric acid)으로 전환하는 델타-아미노발레라미다아제(delta-aminovaleramidase; DavA) 효소, 5-아미노발레르산을 글루타레이트 세미알데하이드(glutarate semialdehyde)로 전환하는 5-아미노발레이트 아미노트렌스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT 효소), 글루타레이트 세미알데하이드(glutarate semialdehyde)를 글루타레이트(glutarate)로 전환하는 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(glutarate semialdehyde dehydrogenase; DavD) 효소를 증폭한 결과, 라이신으로부터 5-아미노발레르산을 거쳐 글루타릭산이 생산됨을 확인하여, 상기 재조합 균주는 글루타릭산을 저가의 라이신으로부터 대량 생산하는데 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.
Therefore, the present inventors have studied to develop a process for producing glutathic acid of C5 which may be derived from lysine (lysine). Lysine 2-monooxygenase (DaB) enzyme and delta-aminovaleramidase to convert 5-aminovalericamide to 5-aminovaleric acid. DavA) enzyme, 5-aminovalerate aminotransferase (DaviT enzyme), which converts 5-aminovaleric acid to glutarate semialdehyde, glutarate semialdehyde Amplification of the glutarate semialdehyde dehydrogenase (DVD) enzyme, which converts c) to glutarate, By confirming that glutaric acid is produced via 5-amino valeric acid, the recombinant strain has completed the present invention by revealing that glutaric acid can be usefully used for mass production of low-cost lysine.

본 발명의 목적은, SUMMARY OF THE INVENTION [0006]

라이신 2-단일산화효소(lysine 2-monooxygenase; DavB), 델타-아미노발레라미다아제(delta-aminovaleramidase; DavA) 효소, 5-아미노발레이트 아미노트렌스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT), 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(glutarate semialdehyde dehydrogenase; DavD)를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 미생물에 형질전환하여 제조된 글루타릭산(glutaric acid) 생산용 재조합 미생물을 제공하기 위한 것이다.Lysine 2-monooxygenase (DaB), delta-aminovaleramidase (Dava A) enzyme, 5-aminovalerate aminotransferase (DaT), gluta The present invention provides a recombinant microorganism for producing glutaric acid produced by transforming a microorganism into a recombinant vector containing a gene encoding a glutarate semialdehyde dehydrogenase (DVD).

본 발명의 또 다른 목적은, A further object of the present invention is to provide

1) 라이신 2-단일산화효소(DavB), 델타-아미노발레라미다아제(DavA) 효소, 5-아미노발레이트 아미노트렌스퍼라제(DavT) 효소 및 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(DavD) 효소를 코딩하는 유전자 중 1개 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;1) Lysine 2-monooxidase (DavB), delta-aminovaleramidase (DavA) enzyme, 5-aminovalate aminotransferase (DavT) enzyme and glutarate semialdehyde dehydrogenase (DavD) enzyme Preparing an expression vector comprising one or more genes of the gene encoding the;

2) 상기 단계 1)에서 제조한 1개 이상의 발현 벡터를 대장균에 형질전환시켜 DavB, DavA, DavT 및 DavD 유전자 모두가 포함된 글루타릭산(glutaric acid) 생산용 재조합 대장균 균주를 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.2) provides a method for producing a recombinant E. coli strain for the production of glutaric acid (glutaric acid) containing all of the DavB, DavA, DavT and DavD gene by transforming E. coli with one or more expression vectors prepared in step 1) It is to.

본 발명의 또 다른 목적은 DavB 효소, DavA 효소, DavT 효소 및 DavD 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환하여 제조된 재조합 대장균 균주를 이용하여 글루코스 및 라이신이 포함된 배지로부터 글루타릭산을 생산하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
Another object of the present invention is glutaric acid from the medium containing glucose and lysine using a recombinant E. coli strain prepared by transforming with a recombinant vector comprising a gene encoding DavB enzyme, DavA enzyme, DavT enzyme and DavD enzyme To provide a way to produce.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은In order to achieve the above object,

1) 라이신 2-단일산화효소(lysine 2-monooxygenase; DavB) 효소, 델타-아미노발레라미다아제(delta-aminovaleramidase; DavA) 효소, 5-아미노발레이트 아미노트렌스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT) 효소 및 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(glutarate semialdehyde dehydrogenase; DavD) 효소를 코딩하는 유전자 중 1개 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;1) Lysine 2-monooxygenase (DaB) enzyme, delta-aminovaleramidase (Dava A) enzyme, 5-aminovalerate aminotransferase (DaT) Preparing an expression vector comprising one or more genes encoding an enzyme and a glutarate semialdehyde dehydrogenase (DVD) enzyme;

2) 상기 단계 1)에서 제조한 1개 이상의 발현 벡터를 미생물에 형질전환시켜 DavB, DavA, DavT 및 DavD 유전자 모두가 포함된 재조합 미생물을 제조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 글루타릭산(glutaric acid) 생산용 재조합 미생물을 제공한다. 2) Glutaric acid prepared by the production method comprising the step of transforming the microorganisms of one or more expression vectors prepared in step 1) to produce a recombinant microorganism containing all of the DavB, DavA, DavT and DavD gene ( It provides a recombinant microorganism for the production of glutaric acid).

또한, 본 발명은In addition,

1) 라이신 2-단일산화효소(lysine 2-monooxygenase; DavB), 델타-아미노발레라미다아제(delta-aminovaleramidase; DavA) 효소, 5-아미노발레이트 아미노트렌스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT) 효소 및 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(glutarate semialdehyde dehydrogenase; DavD) 효소를 코딩하는 유전자 중 1개 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;1) Lysine 2-monooxygenase (DaB), delta-aminovaleramidase (Dava A) enzyme, 5-aminovalerate aminotransferase (DaT) enzyme And preparing an expression vector comprising one or more genes of a gene encoding a glutarate semialdehyde dehydrogenase (DVD) enzyme;

2) 상기 단계 1)에서 제조한 1개 이상의 발현 벡터를 대장균에 형질전환시켜 DavB, DavA, DavT 및 DavD 유전자 모두가 포함된 글루타릭산(glutaric acid) 생산용 재조합 대장균 균주를 제조하는 방법을 제공한다.2) provides a method for producing a recombinant E. coli strain for the production of glutaric acid (glutaric acid) containing all of the DavB, DavA, DavT and DavD gene by transforming E. coli with one or more expression vectors prepared in step 1) do.

아울러, 본 발명은 In addition,

1) 라이신 2-단일산화효소(DavB), 델타-아미노발레라미다아제(DavA) 효소, 5-아미노발레이트 아미노트렌스퍼라제(DavT) 효소 및 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(DavD) 효소를 코딩하는 유전자 중 1개 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;1) Lysine 2-monooxidase (DavB), delta-aminovaleramidase (DavA) enzyme, 5-aminovalate aminotransferase (DavT) enzyme and glutarate semialdehyde dehydrogenase (DavD) enzyme Preparing an expression vector comprising one or more genes of the gene encoding the;

2) 상기 단계 1)에서 제조한 1개 이상의 발현 벡터를 대장균 균주에 형질전환시켜 DavB, DavA, DavT 및 DavD 유전자 모두가 포함된 재조합 대장균 균주를 제조하는 단계;2) transforming the E. coli strain with one or more expression vectors prepared in step 1) to prepare a recombinant E. coli strain comprising all of the DavB, DavA, DavT and DavD genes;

3) 단계 2)의 재조합 대장균 균주를 글루코스(glucose) 및 라이신(lysine)을 포함하는 배지에 배양하는 단계; 및3) culturing the recombinant E. coli strain of step 2) in a medium containing glucose and lysine; And

4) 단계 3)의 배양액으로부터 글루타릭산을 수득하는 단계를 포함하는 글루타릭산 생산방법을 제공한다.
4) It provides a glutaric acid production method comprising the step of obtaining glutaric acid from the culture medium of step 3).

본 발명은 L-라이신(L-lysine)을 5-아미노발레르아미드(5-aminovaleramide)로 전환하는 라이신 2-단일산화효소(lysine 2-monooxygenase; DavB)와 5-아미노발레르아미드를 5-아미노발레르산(5-aminovaleric acid)으로 전환하는 델타-아미노발레라미다아제(delta-aminovaleramidase; DavA) 효소, 5-아미노발레르산을 글루타레이트 세미알데하이드(glutarate semialdehyde)로 전환하는 5-아미노발레이트 아미노트렌스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT), 글루타레이트 세미알데하이드를 글루타레이트(glutarate)로 전환하는 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(glutarate semialdehyde dehydrogenase; DavD) 효소가 증폭된 재조합 미생물에 관한 것으로, 상기 재조합 미생물을 라이신이 함유된 배지에서 배양할 경우 글루타릭산을 대량생산 할 수 있으므로 글루타릭산 대량생산 산업화기술개발에 유용하게 이용될 수 있다.
The present invention is a 5-aminovaleryl lysine 2-monooxygenase (DabB) and 5-aminovaleramide that converts L-lysine to 5-aminovaleramide. Delta-aminovaleramidase (DavaA) enzyme, which converts to 5-aminovaleric acid, 5-aminovalate aminotransform, which converts 5-aminovaleric acid to glutarate semialdehyde 5-aminovalerate aminotransferase (DavT), a glutarate semialdehyde dehydrogenase (DVD) enzyme that converts glutarate semialdehyde to glutarate When the recombinant microorganism is cultured in a lysine-containing medium, glutaric acid can be mass-produced, which is useful for the development of glutaric acid mass production industrialization technology. Can be used.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은,According to the present invention,

1) 라이신 2-단일산화효소(lysine 2-monooxygenase; DavB) 효소, 델타-아미노발레라미다아제(delta-aminovaleramidase; DavA) 효소, 5-아미노발레이트 아미노트렌스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT) 효소 및 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(glutarate semialdehyde dehydrogenase; DavD) 효소를 코딩하는 유전자 중 1개 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;1) Lysine 2-monooxygenase (DaB) enzyme, delta-aminovaleramidase (Dava A) enzyme, 5-aminovalerate aminotransferase (DaT) Preparing an expression vector comprising one or more genes encoding an enzyme and a glutarate semialdehyde dehydrogenase (DVD) enzyme;

2) 상기 단계 1)에서 제조한 1개 이상의 발현 벡터를 미생물에 형질전환시켜 DavB, DavA, DavT 및 DavD 유전자 모두가 포함된 재조합 미생물을 제조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 글루타릭산(glutaric acid) 생산용 재조합 미생물을 제공한다.2) Glutaric acid prepared by the production method comprising the step of transforming the microorganisms of one or more expression vectors prepared in step 1) to produce a recombinant microorganism containing all of the DavB, DavA, DavT and DavD gene ( It provides a recombinant microorganism for the production of glutaric acid).

상기 미생물은 대장균인 것이 바람직하고, BL21 codon plus인 것이 보다 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
The microorganism is preferably E. coli, and more preferably BL21 codon plus, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 In addition,

1) 라이신 2-단일산화효소(lysine 2-monooxygenase; DavB), 델타-아미노발레라미다아제(delta-aminovaleramidase; DavA) 효소, 5-아미노발레이트 아미노트렌스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT) 효소 및 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(glutarate semialdehyde dehydrogenase; DavD) 효소를 코딩하는 유전자 중 1개 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;1) Lysine 2-monooxygenase (DaB), delta-aminovaleramidase (Dava A) enzyme, 5-aminovalerate aminotransferase (DaT) enzyme And preparing an expression vector comprising one or more genes of a gene encoding a glutarate semialdehyde dehydrogenase (DVD) enzyme;

2) 상기 단계 1)에서 제조한 1개 이상의 발현 벡터를 대장균에 형질전환시켜 DavB, DavA, DavT 및 DavD 유전자 모두가 포함된 글루타릭산(glutaric acid) 생산용 재조합 대장균 균주를 제조하는 방법을 제공한다.2) provides a method for producing a recombinant E. coli strain for the production of glutaric acid (glutaric acid) containing all of the DavB, DavA, DavT and DavD gene by transforming E. coli with one or more expression vectors prepared in step 1) do.

상기 단계 1)의 발현 벡터는, The expression vector of step 1),

라이신 2-단일산화효소(DavB) 및 델타-아미노발레라미다아제(DavA) 효소를 코딩하는 유전자를 발현벡터 내로 삽입한 재조합 벡터; 및A recombinant vector incorporating a gene encoding a lysine 2-monooxidase (DavB) and delta-aminovaleramidase (DavA) enzyme into an expression vector; And

5-아미노발레이트 아미노트렌스퍼라제(DavT) 효소 및 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(DavD) 효소를 코딩하는 유전자를 발현벡터 내로 삽입한 재조합 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.Preferably, the recombinant vector is a recombinant vector in which a gene encoding a 5-aminovalate aminotransferase (DavT) enzyme and a glutarate semialdehyde dehydrogenase (DavD) enzyme are inserted into an expression vector.

상기 DavB는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.DavB preferably has a nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.

상기 DavA는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.DavA preferably has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.

상기 DavT는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.The DavT preferably has a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.

상기 DavD는 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.DavD preferably has a nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.

상기 대장균 균주는 모든 종류의 대장균 균주가 적용될 수 있으나, BL21 codon plus인 것이 보다 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
The E. coli strains may be applied to all kinds of E. coli strains, more preferably BL21 codon plus, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은, Further, according to the present invention,

1) 라이신 2-단일산화효소(DavB), 델타-아미노발레라미다아제(DavA) 효소, 5-아미노발레이트 아미노트렌스퍼라제(DavT) 효소 및 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(DavD) 효소를 코딩하는 유전자 중 1개 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;1) Lysine 2-monooxidase (DavB), delta-aminovaleramidase (DavA) enzyme, 5-aminovalate aminotransferase (DavT) enzyme and glutarate semialdehyde dehydrogenase (DavD) enzyme Preparing an expression vector comprising one or more genes of the gene encoding the;

2) 상기 단계 1)에서 제조한 1개 이상의 발현 벡터를 대장균 균주에 형질전환시켜 DavB, DavA, DavT 및 DavD 유전자 모두가 포함된 재조합 대장균 균주를 제조하는 단계;2) transforming the E. coli strain with one or more expression vectors prepared in step 1) to prepare a recombinant E. coli strain comprising all of the DavB, DavA, DavT and DavD genes;

3) 단계 2)의 재조합 대장균 균주를 글루코스(glucose) 및 라이신(lysine)을 포함하는 배지에 배양하는 단계; 및3) culturing the recombinant E. coli strain of step 2) in a medium containing glucose and lysine; And

4) 단계 3)의 배양액으로부터 글루타릭산을 수득하는 단계를 포함하는 글루타릭산 생산방법을 제공한다.4) It provides a glutaric acid production method comprising the step of obtaining glutaric acid from the culture medium of step 3).

상기 단계 1)의 발현 벡터는, The expression vector of step 1),

라이신 2-단일산화효소 및 델타-아미노발레라미다아제(DavA) 효소를 코딩하는 유전자를 발현벡터 내로 삽입한 재조합 벡터; 및A recombinant vector incorporating a gene encoding a lysine 2-monooxidase and delta-aminovaleramidase (DavA) enzyme into an expression vector; And

5-아미노발레이트 아미노트렌스퍼라제(DavT) 효소 및 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(DavD) 효소를 코딩하는 유전자를 발현벡터 내로 삽입한 재조합 벡터인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.Preferably, the recombinant vector is a recombinant vector in which a gene encoding a 5-aminovalate aminotransferase (DavT) enzyme and a glutarate semialdehyde dehydrogenase (DavD) enzyme are inserted into an expression vector.

상기 단계 3)의 배지는 대장균 균주의 배양에 이용되는 어떠한 배지도 사용가능하나, LB배지가 보다 바람직하나 이에 한정하지 않는다.As the medium of step 3), any medium used for the culture of E. coli strains may be used, but the LB medium is more preferably but not limited thereto.

상기 단계 3)의 배양은 48 내지 96 시간인 것이 바람직하고 96 시간인 것이 보다 바람직하며, 배양온도는 20 내지 40℃인 것이 바람직하고, 37℃인 것이 보다 바람직하나 이에 한정하지 않는다. The culture of step 3) is preferably 48 to 96 hours, more preferably 96 hours, the culture temperature is preferably 20 to 40 ℃, more preferably 37 ℃ but not limited thereto.

상기 단계 4)의 글루타릭산 수득은 배양액을 분무 건조하여 저농도의 글루타릭산-함유 분말을 대량으로 얻을 수 있고, 배양액을 감압 증발기를 이용하여 농축한 후 동결건조를 진행하여 고농도의 글루타릭산 수득도 가능하며, 또한 이온교환수지를 이용한 정제방법을 사용한 후 농축 및 건조 공정을 수행하여 고순도의 글루타릭산의 수득할 수 있으나 이에 한정하지 않으며, 상기 글루타릭산은 온도 및 pH의 변화에 크게 영향을 받지 않고, 공정 안정성이 있기 때문에 회수 공정상의 제한이 없다. Glutaric acid obtained in step 4) can be obtained by spray-drying the culture solution to obtain a large amount of low concentration glutaric acid-containing powder. It is also possible to obtain a high purity glutaric acid by using a purification method using an ion exchange resin followed by a concentration and drying process, but is not limited thereto. Unaffected and there is no limitation on recovery process because of process stability.

본 발명의 구체적인 실시예에 있어서, 대장균 균주를 라이신 2-단일산화효소(DavB), 5-아미노발레르아미드(5-aminovaleramide)를 5-아미노발레르산(5-aminovaleric acid)으로 전환하는 델타-아미노발레라미다아제(DavA) 효소, 5-아미노발레이트 아미노트렌스퍼라제(DavT) 효소 및 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(DavD)를 코딩하는 유전자를 함유한 재조합 벡터로 형질전환하여 형질전환된 대장균 균주를 라이신이 포함된 배지에서 배양한 후 글루타릭산 전환 생산능을 확인한 결과, 글루타릭산의 유의적인 전환 생산능을 확인하였다(표 1 참조).In a specific embodiment of the present invention, E. coli strain delta-amino to convert lysine 2-monooxidase (DavB), 5-aminovaleramide to 5-aminovaleric acid Transformed by transformation with a recombinant vector containing genes encoding valeramidase (DavA) enzyme, 5-aminovalate aminotransferase (DavT) enzyme, and glutarate semialdehyde dehydrogenase (DavD) E. coli strains were cultured in a medium containing lysine, and then glutaric acid conversion production capacity was confirmed.

따라서, 본 발명의 재조합 대장균 균주는 글루타릭산을 생산하는데 유용하게 사용될 수 있다.
Therefore, the recombinant E. coli strain of the present invention can be usefully used to produce glutaric acid.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail by way of examples.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
However, the following examples are illustrative of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

<< 실시예Example 1>  1> DavADavA 및  And DavBDavB , 및 , And DavTDavT 및  And DavDDavD 유전자 발현을 위한 발현 벡터의 제조 Preparation of Expression Vectors for Gene Expression

L-라이신(L-lysine)을 5-아미노발레르아미드(5-aminovaleramide)로 전환하는 라이신 2-단일산화효소(lysine 2-monooxygenase; DavB)와 5-아미노발레르아미드를 5-아미노발레르산(5-aminovaleric acid)으로 전환하는 델타-아미노발레라미다아제(delta-aminovaleramidase; DavA) 효소, 5-아미노발레르산을 글루타레이트 세미알데하이드(glutarate semialdehyde)로 전환하는 5-아미노발레이트 아미노트렌스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT), 글루타레이트 세미알데하이드를 글루타레이트(glutarate)로 전환하는 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(glutarate semialdehyde dehydrogenase; DavD) 효소를 발현하는 재조합 E. coli BL21 codon plus를 제조하여, 상기 재조합 대장균 내에서 라이신으로부터 글루타릭산 생산능을 확인하기 위하여, DavA, DavB, DavT 및 DavD 유전자를 발현하는 벡터를 제작하였다. Lysine 2-monooxygenase (DabB) and 5-aminovaleramide convert L-lysine to 5-aminovaleramide to 5-aminovaleric acid (5 delta-aminovaleramidase (DavaA) enzyme, which converts to -aminovaleric acid, and 5-aminovalate aminotransferase, which converts 5-aminovaleric acid to glutarate semialdehyde. 5-aminovalerate aminotransferase; DavT), a recombinant E. coli BL21 codon plus that expresses the glutarate semialdehyde dehydrogenase (DVD) enzyme, which converts glutarate semialdehyde to glutarate. To prepare a vector expressing the DavA, DavB, DavT and DavD gene in order to confirm the production of glutaric acid from lysine in the recombinant E. coli.

구체적으로, 발현용 벡터 pKE12-MCS와 pKA32-MCS는 LacIO promoter를 보유한 발현벡터로서(Park et al. (2011) Appl. Microbiol. Biotechnol. DOI: 10.1007/s00253-011-3530-x), pKE12-MCS에 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)의 DavA 유전자를 EcoRI/KpnI으로 절단하고 삽입하여, pKE12DavA를 제조하였고, pKE12DavA에 슈도모나스 푸티다의 DavB 유전자를 KpnI/BamHI으로 절단하고 삽입하여, pKE12DavAB를 제조하였다. 또한 pKA32-MCS에 슈도모나스 푸티다의 DavT 유전자를 EcoRI/KpnI으로 절단하고 삽입하여, pKA12DavT를 제조하였고, pKA32DavT에 슈도모나스 푸티다의 DavD 유전자를 KpnI/BamHI으로 절단하고 삽입하여, pKA32DavTD를 제조하였다. 그런 다음, 상기 제조된 벡터를 대장균에 형질전환 하여 E. coli BL21 codon plus(pKE12DavAB + pKA32DavTD)를 제작하였다.
Specifically, expression vectors pKE12-MCS and pKA32-MCS are expression vectors having a LacIO promoter (Park et al. (2011) Appl. Microbiol. Biotechnol. DOI: 10.1007 / s00253-011-3530-x), pKE12- PKE12DavA was prepared by cleaving and inserting the DavA gene of Pseudomonas putida with EcoRI / KpnI in MCS, and preparing pKE12DavA, and cutting and inserting the DavB gene of Pseudomonas putida in pKE12DavA with KpnI / BamHI to prepare pKE12DavAB. In addition, pKA32DavT was cut and inserted into PKA32-MCS with Pseudomonas putida with EcoRI / KpnI to prepare pKA12DavT, and pKA32DavT was cut and inserted into PKA32DavT with PDP32 and DavD of Pseudomonas putida into pKA32DavTD. Then, E. coli BL21 codon plus (pKE12DavAB + pKA32DavTD) was produced by transforming the prepared vector into E. coli .

<< 실시예Example 2>  2> 글루타릭산Glutaric acid 생산능Production capacity 확인 Confirm

상기 <실시예 1>에서 제작한 E. coli BL21 codon plus(pKE12DavAB + pKA32DavTD)를 이용하여 글루타릭산 생산능을 확인하기 위하여, E. coli BL21 codon plus를 LB배지 및 글루코스 10 g/L와 라이신 10 g/L가 함유된 LB 및 MR 배지에서 배양하였다. 단백질의 발현을 위하여 OD가 0.4일 때 IPTG 1 mM를 첨가하였다. 상기 MR 배지는(pH 6.9) 1리터당 하기와 같은 조성으로 구성하였다: 6.67 g KH2PO4, 4 g(NH4)2HPO4,0.8 g MgSO47H2O, 0.8g 시트르산(citric acid), 5 ml 트레이스 금속 용액(trace metal solution). 상기 트레이스 금속 용액는 1리터당 하기와 같은 조성으로 구성하였다(0.5 M HCl): 10 g FeSO47H2O, 2 g CaCl2, 2.2gZnSO47H2O, 0.5 g MnSO44H2O, 1 g CuSO45H2O, 0.1 g(NH4)6Mo7O244H2O, 0.02 g Na2B4O710H2O. E. coli BL21 codon plus using the E. coli BL21 codon plus (pKE12DavAB + pKA32DavTD) prepared in <Example 1>, E. coli BL21 codon plus LB medium and glucose 10 g / L and lysine Cultured in LB and MR medium containing 10 g / L. 1 mM of IPTG was added when the OD was 0.4 for the expression of the protein. The MR medium (pH 6.9) consisted of the following composition per liter: 6.67 g KH 2 PO 4 , 4 g (NH 4 ) 2 HPO 4 , 0.8 g MgSO 4 7H 2 O, 0.8 g citric acid , 5 ml trace metal solution. The trace metal solution consisted of the following composition per liter (0.5 M HCl): 10 g FeSO 4 7H 2 O, 2 g CaCl 2 , 2.2 gZnSO 4 7H 2 O, 0.5 g MnSO 4 4H 2 O, 1 g CuSO 4 5H 2 O, 0.1 g (NH 4 ) 6 Mo 7 O 24 4H 2 O, 0.02 g Na 2 B 4 O 7 10H 2 O.

그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이 LB배지에서 E. coli BL21 codon plus (pKE12DavAB + pKA32DavTD)를 배양했을 때 라이신으로부터 글루타릭산이 유의적으로 생산되는 것을 확인하였다(표 1). 또한, MR배지에서 배양하였을 때에는 글루타릭산의 생성은 확인되지 않았다.
As a result, as shown in Table 1, it was confirmed that glutaric acid was significantly produced from lysine when E. coli BL21 codon plus (pKE12DavAB + pKA32DavTD) was cultured in LB medium (Table 1). In addition, the production of glutaric acid was not confirmed when cultured in MR medium.

시간time 글루타릭산 (g/L)Glutaric Acid (g / L) 10 초10 seconds 00 24 시간24 hours 0.10.1 48 시간48 hours 0.20.2 72 시간72 hours 0.10.1 96 시간96 hours 0.50.5

서열목록 전자파일 첨부Attach an electronic file to a sequence list

Claims (11)

1) 라이신 2-단일산화효소(lysine 2-monooxygenase; DavB) 효소, 델타-아미노발레라미다아제(delta-aminovaleramidase; DavA) 효소, 5-아미노발레이트 아미노트렌스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT) 효소 및 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(glutarate semialdehyde dehydrogenase; DavD) 효소를 코딩하는 유전자 중 1개 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 제조한 1개 이상의 발현 벡터를 미생물에 형질전환시켜 DavB, DavA, DavT 및 DavD 유전자 모두가 포함된 재조합 미생물을 제조하는 단계를 포함하는 제조방법으로 제조된 글루타릭산(glutaric acid) 생산용 재조합 미생물.
1) Lysine 2-monooxygenase (DaB) enzyme, delta-aminovaleramidase (Dava A) enzyme, 5-aminovalerate aminotransferase (DaT) Preparing an expression vector comprising one or more genes encoding an enzyme and a glutarate semialdehyde dehydrogenase (DVD) enzyme;
2) Glutaric acid prepared by the production method comprising the step of transforming the microorganisms of one or more expression vectors prepared in step 1) to produce a recombinant microorganism containing all of the DavB, DavA, DavT and DavD gene ( glutaric acid) Recombinant microorganism for production.
제 1항에 있어서, 상기 미생물은 대장균은 것을 특징으로 하는 글루타릭산 생산용 재조합 미생물.
The recombinant microorganism for producing glutaric acid according to claim 1, wherein the microorganism is Escherichia coli.
제 1항에 있어서, 상기 단계 1)의 발현 벡터는
라이신 2-단일산화효소(DavB) 효소 및 델타-아미노발레라미다아제(DavA) 효소를 코딩하는 유전자를 발현벡터 내로 삽입한 재조합 벡터; 및
5-아미노발레이트 아미노트렌스퍼라제(DavT) 효소 및 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(DavD) 효소를 코딩하는 유전자를 발현벡터 내로 삽입한 재조합 벡터인 것을 특징으로 하는 글루타릭산(glutaric acid) 생산용 재조합 미생물.
According to claim 1, wherein the expression vector of step 1)
A recombinant vector incorporating a gene encoding a lysine 2-monooxidase (DavB) enzyme and a delta-aminovaleramidase (DavA) enzyme into an expression vector; And
Glutaric acid, characterized in that it is a recombinant vector inserted into the expression vector gene encoding the 5-aminovalate aminotransferase (DavT) enzyme and glutarate semialdehyde dehydrogenase (DavD) enzyme ) Recombinant microorganisms for production.
제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 DavB는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 글루타릭산 생산용 재조합 미생물.
The recombinant microorganism for producing glutaric acid according to claim 1 or 3, wherein the DavB has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1.
제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 DavA는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 글루타릭산 생산용 재조합 미생물.
The recombinant microorganism for producing glutaric acid according to claim 1 or 3, wherein DavA has a nucleotide sequence as set forth in SEQ ID NO: 2.
제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 DavT는 서열번호 3으로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 글루타릭산 생산용 재조합 미생물.
The recombinant microorganism for producing glutaric acid according to claim 1 or 3, wherein the DavT has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3.
제 1항 또는 제 3항에 있어서, 상기 DavD는 서열번호 4로 기재되는 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 글루타릭산 생산용 재조합 미생물.
The recombinant microorganism for producing glutaric acid according to claim 1 or 3, wherein the DavD has a nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4.
1) 라이신 2-단일산화효소(lysine 2-monooxygenase; DavB) 효소, 델타-아미노발레라미다아제(delta-aminovaleramidase; DavA) 효소, 5-아미노발레이트 아미노트렌스퍼라제(5-aminovalerate aminotransferase; DavT) 효소 및 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(glutarate semialdehyde dehydrogenase; DavD) 효소를 코딩하는 유전자 중 1개 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 제조한 1개 이상의 발현 벡터를 대장균에 형질전환시켜 DavB, DavA, DavT 및 DavD 유전자 모두가 포함된 글루타릭산(glutaric acid) 생산용 재조합 대장균 균주를 제조하는 방법.
1) Lysine 2-monooxygenase (DaB) enzyme, delta-aminovaleramidase (Dava A) enzyme, 5-aminovalerate aminotransferase (DaT) Preparing an expression vector comprising one or more genes encoding an enzyme and a glutarate semialdehyde dehydrogenase (DVD) enzyme;
2) A method for preparing a recombinant E. coli strain for producing glutaric acid (glutaric acid) containing all of the DavB, DavA, DavT and DavD gene by transforming E. coli with one or more expression vectors prepared in step 1).
1) 라이신 2-단일산화효소(DavB) 효소, 델타-아미노발레라미다아제(DavA) 효소, 5-아미노발레이트 아미노트렌스퍼라제(DavT) 효소 및 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(DavD) 효소를 코딩하는 유전자 중 1개 또는 그 이상의 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 제조한 1개 이상의 발현 벡터를 대장균 균주에 형질전환시켜 DavB, DavA, DavT 및 DavD 유전자 모두가 포함된 재조합 대장균 균주를 제조하는 단계;
3) 단계 2)의 재조합 대장균 균주를 글루코스(glucose) 및 라이신(lysine)을 포함하는 배지에 배양하는 단계; 및
4) 단계 3)의 배양액으로부터 글루타릭산을 수득하는 단계를 포함하는 글루타릭산 생산방법.
1) Lysine 2-monooxidase (DavB) enzyme, delta-aminovaleramidase (DavA) enzyme, 5-aminovalate aminotransferase (DavT) enzyme and glutarate semialdehyde dehydrogenase (DavD) Preparing an expression vector comprising one or more genes of a gene encoding an enzyme;
2) transforming the E. coli strain with one or more expression vectors prepared in step 1) to prepare a recombinant E. coli strain comprising all of the DavB, DavA, DavT and DavD genes;
3) culturing the recombinant E. coli strain of step 2) in a medium containing glucose and lysine; And
4) Glutaric acid production method comprising the step of obtaining glutaric acid from the culture medium of step 3).
제 9항에 있어서, 상기 단계 1)의 발현 벡터는
라이신 2-단일산화효소(DavB) 효소 및 델타-아미노발레라미다아제(DavA) 효소를 코딩하는 유전자를 발현벡터 내로 삽입한 재조합 벡터; 및
5-아미노발레이트 아미노트렌스퍼라제(DavT) 효소 및 글루타레이트 세미알데하이드 디하이드로게나아제(DavD) 효소를 코딩하는 유전자를 발현벡터 내로 삽입한 재조합 벡터인 것을 특징으로 하는 글루타릭산 생산방법.
The method of claim 9, wherein the expression vector of step 1)
A recombinant vector incorporating a gene encoding a lysine 2-monooxidase (DavB) enzyme and a delta-aminovaleramidase (DavA) enzyme into an expression vector; And
A method for producing glutaric acid, characterized in that it is a recombinant vector in which a gene encoding a 5-aminovalate aminotransferase (DavT) enzyme and a glutarate semialdehyde dehydrogenase (DavD) enzyme are inserted into an expression vector.
제 9항에 있어서, 상기 단계 3)의 배양은 48 내지 96 시간 동안 20 내지 40℃에서 실시하는 것을 특징으로 하는 글루타릭산 생산방법.



10. The method for producing glutaric acid according to claim 9, wherein the culturing of step 3) is performed at 20 to 40 ° C for 48 to 96 hours.



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