KR102597362B1 - CRISPR-Cas13 composition and PCR kit for cutting SARS-CoV- 2 RNA - Google Patents
CRISPR-Cas13 composition and PCR kit for cutting SARS-CoV- 2 RNA Download PDFInfo
- Publication number
- KR102597362B1 KR102597362B1 KR1020210007715A KR20210007715A KR102597362B1 KR 102597362 B1 KR102597362 B1 KR 102597362B1 KR 1020210007715 A KR1020210007715 A KR 1020210007715A KR 20210007715 A KR20210007715 A KR 20210007715A KR 102597362 B1 KR102597362 B1 KR 102597362B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cov
- sars
- rna
- gene
- digital pcr
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 33
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 title description 2
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims abstract description 135
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 114
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 claims abstract description 51
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 60
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 36
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 14
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 12
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 7
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 6
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 claims description 5
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 5
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims 1
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 abstract description 7
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 53
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 10
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 8
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 7
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 6
- 238000011304 droplet digital PCR Methods 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 4
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 4
- 101100316897 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 E gene Proteins 0.000 description 4
- 101100240079 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 N gene Proteins 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 3
- 241000494545 Cordyline virus 2 Species 0.000 description 3
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 3
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 3
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 3
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 3
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 3
- 241000605894 Porphyromonas Species 0.000 description 3
- 101150016678 RdRp gene Proteins 0.000 description 3
- 241001478225 Riemerella Species 0.000 description 3
- 101150010882 S gene Proteins 0.000 description 3
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 241000589876 Campylobacter Species 0.000 description 2
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 2
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 241000186394 Eubacterium Species 0.000 description 2
- 241000589565 Flavobacterium Species 0.000 description 2
- 102100027377 HBS1-like protein Human genes 0.000 description 2
- 101800003471 Helicase Proteins 0.000 description 2
- 101800002870 Helicase nsp13 Proteins 0.000 description 2
- 101001009070 Homo sapiens HBS1-like protein Proteins 0.000 description 2
- 241001134638 Lachnospira Species 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 2
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 2
- 101800000934 Non-structural protein 13 Proteins 0.000 description 2
- 101150027577 ORF8 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000613708 Phaeodactylibacter Species 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 241000024426 Reichenbachiella Species 0.000 description 2
- 108091027981 Response element Proteins 0.000 description 2
- 241001474783 Sinomicrobium Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N puromycin Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C[C@H](N)C(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](N2C3=NC=NC(=C3N=C2)N(C)C)O[C@@H]1CO RXWNCPJZOCPEPQ-NVWDDTSBSA-N 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 239000012096 transfection reagent Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000701474 Alistipes Species 0.000 description 1
- 241000514673 Anaerosalibacter Species 0.000 description 1
- 102220542981 Ankyrin-1_R21T_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220493854 Archaemetzincin-2_H146Q_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000589941 Azospirillum Species 0.000 description 1
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 description 1
- 241000611351 Bergeyella Species 0.000 description 1
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 241000190890 Capnocytophaga Species 0.000 description 1
- 241000611330 Chryseobacterium Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 102220518444 Enhancer of filamentation 1_T29I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101800001768 Exoribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 241000178967 Filifactor Species 0.000 description 1
- 241000605909 Fusobacterium Species 0.000 description 1
- 102220605313 Gap junction beta-1 protein_Q57H_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000963438 Gaussia <copepod> Species 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 241000032681 Gluconacetobacter Species 0.000 description 1
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 1
- 241000589248 Legionella Species 0.000 description 1
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 description 1
- 241001453171 Leptotrichia Species 0.000 description 1
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001291960 Myroides Species 0.000 description 1
- NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N N-[2-oxo-2-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 NIPNSKYNPDTRPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150051014 NSP2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000588653 Neisseria Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 102220537350 Neural retina-specific leucine zipper protein_S50L_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000135938 Nitratifractor Species 0.000 description 1
- 101800000935 Non-structural protein 12 Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101150001656 ORF3a gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012124 Opti-MEM Substances 0.000 description 1
- 241000740708 Paludibacter Species 0.000 description 1
- 241001386753 Parvibaculum Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000605861 Prevotella Species 0.000 description 1
- 241001647888 Psychroflexus Species 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101800001554 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101800004575 RNA-directed RNA polymerase nsp12 Proteins 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010057190 Respiratory tract infections Diseases 0.000 description 1
- 241000605947 Roseburia Species 0.000 description 1
- 241000192026 Ruminococcus flavefaciens Species 0.000 description 1
- 101000667982 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 101001024637 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 241000949716 Sphaerochaeta Species 0.000 description 1
- 102220590693 Spindlin-1_G75V_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220590690 Spindlin-1_T76I_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220599418 Spindlin-1_V1176F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 241000123710 Sutterella Species 0.000 description 1
- 108010076818 TEV protease Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 102100029290 Transthyretin Human genes 0.000 description 1
- 241000589886 Treponema Species 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 1
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 1
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000005560 droplet transmission Effects 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108010027225 gag-pol Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010457 gene scissor Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229950010131 puromycin Drugs 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 102200057183 rs104894424 Human genes 0.000 description 1
- 102200024354 rs1057519548 Human genes 0.000 description 1
- 102220223279 rs1060502343 Human genes 0.000 description 1
- 102220231020 rs1064793355 Human genes 0.000 description 1
- 102220252601 rs1382257949 Human genes 0.000 description 1
- 102220258705 rs187767340 Human genes 0.000 description 1
- 102200027875 rs199475571 Human genes 0.000 description 1
- 102200051957 rs2472553 Human genes 0.000 description 1
- 102200021399 rs267606957 Human genes 0.000 description 1
- 102220024392 rs267607495 Human genes 0.000 description 1
- 102200118179 rs35914488 Human genes 0.000 description 1
- 102220081228 rs372168541 Human genes 0.000 description 1
- 102200087428 rs397514540 Human genes 0.000 description 1
- 102220028756 rs398123245 Human genes 0.000 description 1
- 102200008503 rs74315403 Human genes 0.000 description 1
- 102220001216 rs74315456 Human genes 0.000 description 1
- 102200006408 rs746834149 Human genes 0.000 description 1
- 102220092172 rs753180642 Human genes 0.000 description 1
- 102220242497 rs761003289 Human genes 0.000 description 1
- 102200038213 rs767568897 Human genes 0.000 description 1
- 102220059026 rs786201684 Human genes 0.000 description 1
- 102220006433 rs80356495 Human genes 0.000 description 1
- 102220083436 rs863224678 Human genes 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
- C12N2310/10—Type of nucleic acid
- C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host
Abstract
SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단용 CRISPR-Cas13 포함하는 조성물 및 이를 이용한 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트에 관한 것으로 SARS-CoV-2 진단 검사 또는 크리스퍼 유전자 교정 분야의 응용에 유용하게 활용될 수 있다. It relates to a composition containing CRISPR-Cas13 for cutting SARS-CoV-2 specific gene RNA and a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 using the same, which is useful for applications in the field of SARS-CoV-2 diagnostic testing or CRISPR gene editing. It can be utilized.
Description
SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA를 절단하기 위한 CRISPR-Cas13 시스템을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트에 관한 것이다. It relates to a composition containing the CRISPR-Cas13 system for cutting SARS-CoV-2 specific gene RNA and a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 using the same.
코로나 바이러스(Corona Virus)는 RNA 바이러스의 한 종류로서, 유전 정보가 리보핵산(RNA)으로 이루어진 바이러스로, 사람과 동물의 호흡기와 소화기 계통의 감염을 유발한다. 코로나 바이러스는 주로 점막 전염, 비말 전파 등을 통해 쉽게 감염될 수 있으며, 사람에게는 일반적으로 경미한 호흡기 감염을 일으키나, 드물게 치명적 감염을 일으켜 사망에 이르게 하기도 한다.Corona Virus is a type of RNA virus whose genetic information is made up of ribonucleic acid (RNA) and causes infection in the respiratory and digestive systems of humans and animals. Coronavirus can be easily infected mainly through mucosal transmission and droplet transmission, and generally causes mild respiratory infections in humans, but in rare cases, it can cause fatal infections and even lead to death.
상기 코로나 바이러스의 일종인 중증 급성 호흡기 증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2)는 중국 우한에서 출현하여 전 세계로 빠르게 확산되었으며, 세계보건기구(WHO)는 해당 바이러스에 감염된 질환을 COVID-19로 명명하였다.Severe acute respiratory syndrome-coronavirus-2 (SARS-CoV-2), a type of the above-mentioned coronavirus, emerged in Wuhan, China and spread rapidly around the world, and the World Health Organization (WHO) classifies diseases infected with the virus as COVID-2. It was named 19.
중증급성호흡기증후군 코로나바이러스-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)는 약 3만개의 염기쌍으로 이루어진 단일가닥의 양성 RNA 게놈을 가진 바이러스이다. Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is a virus with a single-stranded positive RNA genome consisting of approximately 30,000 base pairs.
코로나바이러스감염증-19(코로나19) 팬데믹을 발생시킨 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)는 숙주세포에 들어와 RNA 유전체를 복제하고 다양한 하위유전체를 발현시킨다. 특히 하위유전체는 RNA-의존 RNA 중합효소(RNA dependent RNA polymerase, RdRp), 외피(E, M, N, S), 비구조 단백질 등을 합성하며 바이러스 입자가 조립되어 세포 밖으로 빠져나간다. 이러한 감염병을 유발하는 병원균의 진단, 치료영역에서 기존의 qPCR 방법보다 개선된 디지털 PCR의 적용과 크리스퍼 유전자 가위와 같은 새로운 기술적 진보가 필요하다. Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), which caused the coronavirus disease 19 (COVID-19) pandemic, enters host cells, replicates the RNA genome, and transmits various subgenomes. manifest. In particular, the subgenome synthesizes RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), envelope (E, M, N, S), and non-structural proteins, and viral particles are assembled and exit the cell. In the field of diagnosis and treatment of pathogens that cause these infectious diseases, new technological advancements such as the application of digital PCR, which is improved over the existing qPCR method, and CRISPR gene scissors are needed.
본 발명의 목적은 진핵세포에서 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA를 절단하기 위한 CRISPR-Cas13를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다. The purpose of the present invention is to provide a composition containing CRISPR-Cas13 for cutting SARS-CoV-2 specific gene RNA in eukaryotic cells.
본 발명의 다른 목적은 진핵세포에서 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA를 절단하기 위한 CRISPR-Cas13을 포함하는 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2, which includes a composition containing CRISPR-Cas13 for cutting SARS-CoV-2 specific gene RNA in eukaryotic cells.
본 발명의 다른 목적은 진핵세포에서 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA를 절단하기 위한 CRISPR-Cas13 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트를 이용한 분석 방법을 이용한 SARS-CoV-2 검출진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is a composition containing CRISPR-Cas13 for cutting SARS-CoV-2 specific gene RNA in eukaryotic cells, SARS-CoV-2 using an analysis method using a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 containing the composition. -It provides a method of providing the information necessary for CoV-2 detection and diagnosis.
상기 목적을 해결하기 위해서 본 발명은 SARS-CoV-2 특정 유전자의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1벡터; 및In order to solve the above object, the present invention provides a first vector containing a nucleic acid encoding the guide RNA of a SARS-CoV-2 specific gene; and
Cas13 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2벡터;A second vector containing nucleic acid encoding Cas13 protein;
를 포함하는 진핵세포에서 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단용 CRISPR-Cas13을 포함하는 조성물을 제공한다. Provides a composition containing CRISPR-Cas13 for cutting SARS-CoV-2 specific gene RNA in eukaryotic cells.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 특정 유전자는, SARS-CoV-2의 RdRp, S, E, M 및 N 정상 유전자 및 상기 SARS-CoV-2의 돌연변이 유전자를 포함하는 유전자 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상 일 수 있다. In one example of the present invention, the SARS-CoV-2 specific gene is a gene sequence comprising the RdRp, S, E, M and N normal genes of SARS-CoV-2 and the mutant gene of SARS-CoV-2. It may be any one or more selected from the group consisting of.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 가이드 RNA는 단일 사슬 가이드 RNA인 sgRNA 일 수 있다. In one example of the present invention, the guide RNA may be sgRNA, which is a single-chain guide RNA.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 Cas13 단백질은 Cas13a, Cas13b, Cas13c 또는 Cas13d로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다. In one example of the present invention, the Cas13 protein may be any one selected from the group consisting of Cas13a, Cas13b, Cas13c, or Cas13d.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 제1벡터 또는 제2벡터는 서로 동일하지 않으며, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있다. In one example of the present invention, the first vector or the second vector are not identical to each other and may be plasmid vectors or viral vectors.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트를 제공한다. The present invention provides a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 comprising the composition.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트는 디지털 PCR용 프라이머 세트 및 디지털 PCR용 프로브를 더 포함할 수 있다. In one example of the present invention, the digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 may further include a primer set for digital PCR and a probe for digital PCR.
본 발명은 This invention
1) SARS-CoV-2의 특정 유전자가 포함된 패키징 재조합 벡터를 제조하는 단계;1) Preparing a packaging recombinant vector containing a specific gene of SARS-CoV-2;
2) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질 주입 및 농축하여 SARS-CoV-2 유사체를 제조하는 단계;2) preparing SARS-CoV-2 analogs by transfecting and concentrating the recombinant vector into host cells;
3) 상기 SARS-CoV-2 유사체를 진핵세포에 감염시키는 단계3) Infecting eukaryotic cells with the SARS-CoV-2 analogue
4) 상기 진핵세포에서 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단하기 위한 CRISPR-Cas13이 포함된 조성물에 따른 상기 3) 단계의 진핵세포에 형질주입하여 세포내 발현 및 RNA 절단 유도하는 단계; 및4) transfecting the eukaryotic cells of step 3) with a composition containing CRISPR-Cas13 to cleave SARS-CoV-2 specific gene RNA in the eukaryotic cells to induce intracellular expression and RNA cleavage; and
5) 상기 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트를 이용하여 디지털 PCR을 수행하는 단계;5) performing digital PCR using the digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2;
를 포함하는 분석 방법을 이용한 SARS-CoV-2 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. Provides a method of providing information necessary for SARS-CoV-2 diagnosis using an analysis method including.
본 발명에 따른 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단용 CRISPR-Cas13을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트는 RNA 절단 효율에 따라 디지털 PCR을 기반으로 검출함으로써 진단의 정확도와 민감도를 향상시킬 수 있다. The composition containing CRISPR-Cas13 for cutting SARS-CoV-2 specific gene RNA according to the present invention and the digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 using the same provide diagnostic accuracy by detecting based on digital PCR according to RNA cutting efficiency. and sensitivity can be improved.
또한 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단용 CRISPR-Cas13을 포함하는 조성물 또는 상기 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트를 이용한 분석 방법은, 정확하고 신뢰성 있으며, 민감도가 개선된 SARS-CoV-2의 분석 정보를 제공할 수 있다. In addition, the analysis method using a composition containing CRISPR-Cas13 for cutting SARS-CoV-2 specific gene RNA or a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 containing the composition is accurate, reliable, and has improved sensitivity for SARS. -Can provide analysis information on CoV-2.
또한 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단용 CRISPR-Cas13을 포함하는 조성물 및 이를 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트는 RNA 절단 효율에 따라 디지털 PCR을 기반으로 검출하여 정확하게 SARS-CoV-2 검출이 가능하다. In addition, the composition containing CRISPR-Cas13 for cutting SARS-CoV-2 specific gene RNA according to the present invention and the digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 containing the same accurately detects based on digital PCR according to RNA cutting efficiency. SARS-CoV-2 detection is possible.
또한 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 키트 또는 상기 SARS-CoV-2 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 의해, 크리스퍼 유전자 교정 분야의 응용이 유용하게 활용될 수 있다. In addition, the kit for detecting SARS-CoV-2 according to the present invention or the method for providing the information necessary for diagnosing SARS-CoV-2 can be usefully utilized in the field of CRISPR gene editing.
또한 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 키트 또는 상기 SARS-CoV-2 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은 정밀한 유전자 변이 측정이 가능하여 정밀 분자진단분야에 유용하게 활용될 수 있다. In addition, the SARS-CoV-2 detection kit according to the present invention or the method for providing the information necessary for SARS-CoV-2 diagnosis is capable of measuring genetic mutations precisely and can be usefully used in the field of precision molecular diagnosis.
도 1의 본 명의 실시예 2의 모식도를 도시화한 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에 따른 SARS-CoV-2의 특정 유전자가 포함된 SARS-CoV-2 유사체에 CRISPR-Cas13 시스템을 적용한 다음 디지털 PCR(digital PCR)로 수행한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로는 도 2에서 sgCTL은 제1벡터와 제2벡터가 포함되었으나, 세포 성장에 영향을 주지 않는 시퀀스, 염기서열을 사용한 대조군이다. 또한 sgE는 SARS-CoV-2 특정 유전자인 E 유전자의 sgRNA가 포함된 제1벡터와 제2벡터가 포함된 시험군이며, EV는 대조군으로 공벡터를 Empty vector contol을 의미하며, NTC는 HEK293T WT RNA 또는 HEK 293T 세포에 SARS-CoV-2의 특정 유전자가 도입 또는 포함되지 않는 대조군이다.
도 3는 본 발명의 실시예 2에 따른 SARS-CoV-2의 특정 유전자가 포함된 SARS-CoV-2 유사체에 CRISPR-Cas13 시스템을 적용한 다음 디지털 PCR(digital PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로는 도 3에서 sgCTL은 제1벡터와 제2벡터가 포함되었으나, 세포 성장에 영향을 주지 않는 시퀀스, 염기서열을 사용한 대조군이며, sgN 또는 sgE는 SARS-CoV-2 특정 유전자인 N 또는 E 유전자의 sgRNA가 포함된 제1벡터와 제2벡터가 포함된 시험군이다. 또한 NTC는 HEK293T WT RNA 또는 HEK 293T 세포에 SARS-CoV-2의 특정 유전자가 도입 또는 포함되지 않는 대조군이다. 또한 도 3A는 SARS-CoV-2의 특정 유전자인 E 유전자 sgRNA, sgE의 시험군에 대한 결과이고, 도 3B는 SARS-CoV-2의 특정 유전자인 N 유전자 sgRNA, sgN의 시험군에 대한 결과를 나타낸 것이다. Figure 1 is a schematic diagram of Example 2 of the present invention.
Figure 2 shows the results of applying the CRISPR-Cas13 system to a SARS-CoV-2 analogue containing a specific SARS-CoV-2 gene according to Example 2 of the present invention and then performing digital PCR. Specifically, in Figure 2, sgCTL includes a first vector and a second vector, but is a control using sequences and base sequences that do not affect cell growth. In addition, sgE is a test group containing the first and second vectors containing sgRNA of the E gene, a SARS-CoV-2 specific gene, EV means Empty vector control, and NTC is HEK293T WT. This is a control group in which RNA or the specific gene of SARS-CoV-2 is not introduced or included in HEK 293T cells.
Figure 3 shows the results of applying the CRISPR-Cas13 system to a SARS-CoV-2 analogue containing a specific SARS-CoV-2 gene according to Example 2 of the present invention and then performing digital PCR. Specifically, in Figure 3, sgCTL includes the first and second vectors, but is a control using sequences and base sequences that do not affect cell growth, and sgN or sgE is the SARS-CoV-2 specific gene N or E. The test group includes the first and second vectors containing the sgRNA of the gene. Additionally, NTC is a control group in which the specific gene of SARS-CoV-2 is not introduced or included in HEK293T WT RNA or HEK 293T cells. Additionally, Figure 3A shows the results for the test group of the E gene sgRNA and sgE, which are specific genes of SARS-CoV-2, and Figure 3B shows the results of the test group of the N gene sgRNA and sgN, which are specific genes of SARS-CoV-2. It is shown.
이하 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단용 CRISPR-Cas13을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트, 이를 포함하는 분석방법을 이용한 SARS-CoV-2진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 대해 상세히 설명한다. The following provides information necessary for SARS-CoV-2 diagnosis using a composition containing CRISPR-Cas13 for cutting SARS-CoV-2 specific gene RNA, a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 using the same, and an analysis method containing the same. How to do this is explained in detail.
도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.When drawings are described, they are provided as examples so that the idea of the present invention can be sufficiently conveyed to those skilled in the art. Accordingly, the present invention is not limited to the presented drawings and may be embodied in other forms, and the drawings may be exaggerated to clarify the spirit of the present invention.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.At this time, if there is no other definition in the technical and scientific terms used, they have the meaning commonly understood by those skilled in the art to which this invention pertains, and the gist of the present invention is summarized in the following description and accompanying drawings. Descriptions of known functions and configurations that may be unnecessarily obscure are omitted.
또한 본 발명의 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다. Additionally, as used herein, the singular forms “a,” “an,” and “the” are intended to also include the plural forms, unless the context clearly dictates otherwise.
또한 본 발명의 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미한다.In addition, units used without special mention in the specification of the present invention are based on weight, and as an example, units of % or ratio mean weight % or weight ratio.
또한 본 발명의 명세서에서, “포함한다”는 표현은 “구비한다”, “함유한다, “가진다” 또는 “특징으로 한다” 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다.In addition, in the specification of the present invention, the expression “comprises” is an open description that has the same meaning as expressions such as “comprises,” “contains,” “has,” or “features,” and is not additionally listed. does not exclude elements, materials or processes that are not
본 발명은 진핵세포에서 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단용 CRISPR-Cas13을 포함된 조성물로서, SARS-CoV-2 특정 유전자의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1벡터; 및 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2벡터;를 포함하는 진핵세포에서 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단용 CRISPR-Cas13 포함하는 조성물을 제공하는 것이 특징이다. The present invention is a composition containing CRISPR-Cas13 for cutting RNA of a SARS-CoV-2 specific gene in eukaryotic cells, comprising: a first vector containing a nucleic acid encoding the guide RNA of a SARS-CoV-2 specific gene; And a second vector containing a nucleic acid encoding the Cas13 protein; a composition comprising CRISPR-Cas13 for cutting SARS-CoV-2 specific gene RNA in eukaryotic cells.
본 발명에서 암호화하는 핵산과 코딩하는 유전자 또는 유전자 서열은 동일한 의미로 상호 교환하여 사용될 수 있다. In the present invention, the encoding nucleic acid and the encoding gene or gene sequence can be used interchangeably with the same meaning.
상기 제 1벡터는 구체적으로 5'- U6 promoter- SARS-CoV-2 특정 유전자 sgRNA-리포터 유전자-RNAⅡ transcript (complementary strand)-3'로 구성된 벡터일 수 있다. The first vector may specifically be a vector composed of 5'-U6 promoter-SARS-CoV-2 specific gene sgRNA-reporter gene-RNAII transcript (complementary strand)-3'.
상기 리포터 유전자는 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase), 베타-락타마아제(β_lactamase), TEV-프로테아제(TEV-protease), 디히드로엽산환원효소(Dihydrofolate reductase), 루시퍼라제(luciferase), 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase), 가우시아 루시퍼라아제(Gaussia luciferase), 선택 마커(selection marker), 표면 마커 유전자(surface marker gene), 형광단백질 코딩 유전자 또는 항생제 저항성 단백질 코딩 유전자 일 수 있으나, 실시예에서는 베타-락타마아제(beta-lactamase) 유전자를 사용하였다. The reporter gene includes beta-galactosidase, beta-lactamase, TEV-protease, dihydrofolate reductase, luciferase, It may be Renilla luciferase, Gaussia luciferase, selection marker, surface marker gene, fluorescent protein coding gene, or antibiotic resistance protein coding gene. In the examples, the beta-lactamase gene was used.
상기 2벡터는 구체적으로 양 LTR에 EF-1a 프로모터- PspCas13b 단백질을 코딩하는 유전자-HIV-NES- WRRE-를 포함하는 제 2 벡터일 수 있다. Specifically, the second vector may be a second vector containing the EF-1a promoter - the gene encoding the PspCas13b protein - HIV-NES - WRRE - in both LTRs.
상기 SARS-CoV-2 특정 유전자는 RNA 유전자인, SARS-CoV-2의 RdRp, S, E, M 및 N 정상 유전자 및 상기 SARS-CoV-2의 돌연변이 유전자를 포함하는 유전자 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상 일 수 있다. The SARS-CoV-2 specific gene is selected from the group consisting of RNA genes, RdRp, S, E, M and N normal genes of SARS-CoV-2, and gene sequences including mutant genes of SARS-CoV-2. It can be any one or more.
상기 SARS-CoV-2 특정 유전자인, 상기 SARS-CoV-2의 RdRp, S, E, M 및 N 정상 유전자는 Wuhan-Hu-1 바이러스주의 공개된 염기서열(Genbank: MN908947)을 참조서열을 하여, 상기 참조서열에서 RdRp 유전자 전체 (13025번부터 16405번 서열) 서열, E 유전자 시작부터, M 유전자를 포함하며, N 유전자 끝을 포함하는 염기서열(26245번부터 29530번 서열)을 포함하나, 참조서열과 28144번 서열이 T가 C인 점에서 차이점이 있다. 또한 상기 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질은 S 유전자 일부(21563번부터 23473번 서열)를 포함한다. The SARS-CoV-2 specific gene, the RdRp, S, E, M and N normal genes of SARS-CoV-2, was referenced by using the published base sequence of the Wuhan-Hu-1 virus strain (Genbank: MN908947). , In the reference sequence, it includes the entire RdRp gene sequence (sequence 13025 to 16405), the base sequence from the start of the E gene, including the M gene, and the nucleotide sequence including the end of the N gene (sequence 26245 to 29530). The difference between the sequence and sequence number 28144 is that T is C. Additionally, the SARS-CoV-2 packaging RNA standard includes part of the S gene (sequence numbers 21563 to 23473).
상기 SARS-CoV-2 특정 유전자인, 상기 SARS-CoV-2의 돌연변이 유전자는 참조 SARS-CoV-2 게놈 서열(Reference SARS-CoV-2 genome sequence)을 기준으로 하여 SARS-CoV-2의 유전자 염기서열이 치환 결실 또는 삽입된 유전자를 의미한다. 상기 참조 SARS-CoV-2 게놈 서열은 2019년 초기에 확인된 SARS-CoV-2 유전체 서열 또는 Wuhan-Hu-1 바이러스주의 서열일 수 있으며, 일 예로, MN908947 일 수 있다. The SARS-CoV-2 specific gene, the mutant gene of SARS-CoV-2, is the genetic base of SARS-CoV-2 based on the reference SARS-CoV-2 genome sequence. The sequence refers to a gene with a substitution, deletion, or insertion. The reference SARS-CoV-2 genome sequence may be the SARS-CoV-2 genome sequence identified in early 2019 or the sequence of the Wuhan-Hu-1 virus strain, for example, MN908947.
상기 SARS-CoV-2의 돌연변이 유전자는 일 예로, 상기 S(spike) 유전자의 S1의 수용체 결합 부분(319~541 aa)에서, 돌연변이 부분 유전자, N74K, G75V, I197V, S256F, T299I, E309Q, T345I, N437S, I468T, D614G, S721V, M731I, E780D, A903S, H1058Q, L1063F, A1078S, H1083R, A1174V, V1176F, K1191N, M1229I, S1252F, V3F, L5F, S12F, C15F, R21T, T22I, T29I, G35V, T30I, S50L, H49Y, S71F, S71P, T76I, V83F, S98F, S112L, T124I, I128F, D138H, H146Q, M153I, N165H, L176F, D178N, E180K, G181V, S221L, H245Y, S247R, D253G, S254F, S255F, S256P, W258L, A262T, F275L, G283V, T284I, E298K, T307I, V308L, E309Q, P330A, K444N, G446V, L455F, I469T, A475V, S477N, V483F, G485R, S494L, T500I, N501Y, H519Q, P521S, A522V, P621S, T632N, G639V, S698L, T778I, S704L, T716I, P812S, D839N, K1073N, V1122L, V1122M, G1124V, D1163G 또는 D1163G 일 수 있다. The mutant gene of the SARS-CoV-2 is, for example, in the receptor binding portion (319-541 aa) of S1 of the S (spike) gene, the mutant partial gene, N74K, G75V, I197V, S256F, T299I, E309Q, T345I , N437S, I468T, D614G, S721V, M731I, E780D, A903S, H1058Q, L1063F, A1078S, H1083R, A1174V, V1176F, K1191N, M1229I, S1252F, V3F, L5F, S12F, C1 5F, R21T, T22I, T29I, G35V, T30I , S50L, H49Y, S71F, S71P, T76I, V83F, S98F, S112L, T124I, I128F, D138H, H146Q, M153I, N165H, L176F, D178N, E180K, G181V, S221L, H245Y, S247R, D 253G, S254F, S255F, S256P , W258L, A262T, F275L, G283V, T284I, E298K, T307I, V308L, E309Q, P330A, K444N, G446V, L455F, I469T, A475V, S477N, V483F, G485R, S494L, T500I, N501Y, H519Q, P521S, A522V, P621S , T632N, G639V, S698L, T778I, S704L, T716I, P812S, D839N, K1073N, V1122L, V1122M, G1124V, D1163G or D1163G.
또한 상기 SARS-CoV-2의 돌연변이 유전자는 상기 SARS-CoV-2의 NSP12(RdRp) 유전자의 14408번 염기서열이 C에서 T로 치환된, P323L, 상기 SARS-CoV-2의 ORF3a 유전자의 25563번 염기서열이 G에서 T로 치환된 Q57H, 상기 SARS-CoV-2의 NSP2 유전자의 1059번 염기서열이 C에서 T로 치환된 T85I, 상기 SARS-CoV-2의 ORF8 유전자의 28144번 염기서열이 T에서 C로 치환된 L84S, 상기 SARS-CoV-2의 NSP13(Helicase) 유전자의 17858번 염기서열이 A에서 G치환된 Y541C, 상기 SARS-CoV-2의 NSP13(Helicase) 유전자 17747번 염기서열이 C에서 T로 치환된 P504L 또는 상기 SARS-CoV-2의 ORF8 유전자 27964번 염기서열이 C에서 T로 치환된 S24L 일 수 있으나, SARS-CoV-2의 돌연변이 유전자이면, 이에 제한되지 않는다. In addition, the mutant gene of the SARS-CoV-2 is P323L, where base sequence 14408 of the NSP12 (RdRp) gene of the SARS-CoV-2 is substituted from C to T, and 25563 of the ORF3a gene of the SARS-CoV-2. Q57H in which the nucleotide sequence is substituted from G to T, T85I in which nucleotide sequence 1059 of the NSP2 gene of the SARS-CoV-2 is substituted from C to T, and nucleotide sequence 28144 of the ORF8 gene of the SARS-CoV-2 is T L84S substituted with C, base sequence 17858 of the NSP13 (Helicase) gene of the SARS-CoV-2 is substituted from A to G, Y541C, base sequence 17747 of the NSP13 (Helicase) gene of the SARS-CoV-2 is C It may be P504L, where the base sequence 27964 of the ORF8 gene of SARS-CoV-2 is substituted for T, or S24L, where C is substituted for T. However, if it is a mutant gene of SARS-CoV-2, it is not limited thereto.
상기 가이드 RNA(guide RNA)'는 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA) 를 포함하는 이중 RNA(dual RNA) 있으나, 구체적으로는 단일 사슬 가이드 RNA인 sgRNA 일 수 있다. The 'guide RNA' may be a dual RNA including crRNA (CRISPR RNA) and tracrRNA (trans-activating crRNA), but may specifically be a single-chain guide RNA, sgRNA.
또한 상기 가이드 RNA(guide RNA)는 SARS-CoV-2 특정 유전자 DNA 의 특이적인 RNA를 의미하며, Cas 단백질과 결합하여 Cas 단백질을 표적 DNA 또는 RNA로 인도할 수 있다. 또한. 본 발명에서, 가이드 RNA는 절단하고자 하는 SARS-CoV-2 특정 유전자에 특이적으로 되도록 제조될 수 있다.In addition, the guide RNA refers to the specific RNA of the SARS-CoV-2 specific gene DNA, and can bind to the Cas protein and guide the Cas protein to the target DNA or RNA. also. In the present invention, the guide RNA can be prepared to be specific to the specific SARS-CoV-2 gene to be cut.
또한 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 구성요소로 포함하는 이중 RNA (dual RNA); 또는 표적 DNA의 상보적 사슬(complementary strand)과 염기 쌍을 형성할 수 있는 서열을 포함하는 제1 부위 및 Cas 단백질과 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 형태, 보다 구체적으로 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부분이 융합된 형태인 sgRNA (single-chain guide RNA)일 수 있다.In addition, the guide RNA is a dual RNA containing two RNAs, namely, crRNA (CRISPR RNA) and tracrRNA (trans-activating crRNA) as components; or a form comprising a first site comprising a sequence capable of forming base pairs with the complementary strand of the target DNA and a second site comprising a sequence that interacts with the Cas protein, more specifically crRNA and It may be sgRNA (single-chain guide RNA), which is a fusion form of the main part of tracrRNA.
상기 가이드 RNA의 표적 DNA 서열의 상보적 사슬과 염기 쌍을 형성할 수 있는 서열의 길이는 18 내지 24bp, 19내지 23bp, 이에 제한되지 않는다. 또한 sgRNA에 적용될 수 있다.The length of the sequence that can form base pairs with the complementary chain of the target DNA sequence of the guide RNA is 18 to 24 bp, 19 to 23 bp, but is not limited thereto. It can also be applied to sgRNA.
상기 SARS-CoV-2 특정 유전자의 가이드 RNA는 상기 SARS-CoV-2 특정 유전자의 SNP를 찾거나 확인하여, 이를 이용해서 crRNA 또는 SgRNA를 디자인 할 수 있다. The guide RNA of the SARS-CoV-2 specific gene can find or confirm the SNP of the SARS-CoV-2 specific gene, and use this to design crRNA or SgRNA.
상기 Cas 단백질은 CRISPR-Cas 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)와 복합체를 형성하여 이의 활성을 나타낼 수 있다. 상기 Cas 단백질은 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제 (nickase) 활성을 나타낼 수 있다.The Cas protein refers to an essential protein element in the CRISPR-Cas system, and can exhibit its activity by forming a complex with crRNA (CRISPR RNA) and tracrRNA (trans-activating crRNA). The Cas protein may exhibit active endonuclease or nickase activity.
Cas 단백질은 가이드 RNA와 복합체를 형성할 때 엔도뉴클레아제 또는 니카아제 활성을 갖는다면 모두 해당되나, 바람직하게는 Cas13 단백질이다. Any Cas protein can be used as long as it has endonuclease or nickase activity when forming a complex with guide RNA, but Cas13 protein is preferable.
또한 본 발명에서 CRISPR-Cas13 또는 CRISPR-Cas13 시스템은 동일한 의미로 상호 교환적으로 사용할 수 있다. 또한 유전자 가위의 의미도 포함된다. Additionally, in the present invention, CRISPR-Cas13 or CRISPR-Cas13 system can be used interchangeably with the same meaning. It also includes the meaning of genetic scissors.
상기 Cas13 단백질(C2c2 단백질)은 Cas13a, Cas13b, Cas13c 또는 Cas13d로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있으나, 이에 제한되지 않으나, 실시예에서 cas13b를 사용하였다. The Cas13 protein (C2c2 protein) may be any one selected from the group consisting of Cas13a, Cas13b, Cas13c, or Cas13d, but is not limited thereto, and cas13b was used in the examples.
상기 Cas13a은 렙토트리키아(Leptotrichia), 리스테리아(Listeria), 코리네박터(Corynebacter), 수테렐라(Sutterella), 레지오넬라(Legionella), 트레포네마 (Treponema), 필리팍토르(Filifactor), 유박테리움(Eubacterium), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 마이코플라스마(Mycoplasma), 박테로이데스(Bacteroides), 플라비이볼라(Flaviivola), 플라보박테리움(Flavobacterium), 스파에로카에타(Sphaerochaeta), 아조스피릴룸(Azospirillum), 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter), 네이세리아(Neisseria), 로세부리아 (Roseburia), 파르비바큘럼(Parvibaculum), 스타필로코커스(Staphylococcus), 니트라티프락토르(Nitratifractor), 마이코플라스마(Mycoplasma), 캄필로박터(Campylobacter), 및 라크노스피라(Lachnospira)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 유기체로부터 유래될 수 있다. The Cas13a is Leptotrichia , Listeria , Corynebacter , Sutterella , Legionella , Treponema , Filifactor , Eubacterium ( Eubacterium ), Streptococcus , Lactobacillus , Mycoplasma , Bacteroides , Flaviivola , Flavobacterium, Spaerocaeta ( Sphaerochaeta ), Azospirillum , Gluconacetobacter , Neisseria, Roseburia , Parvibaculum , Staphylococcus, Nitratiproctor ( Nitratifractor ), Mycoplasma ( Mycoplasma ), Campylobacter ( Campylobacter ), and Lachnospira ( Lachnospira ).
상기 Cas13b는 베르게이엘라 (Bergeyella), 프레보텔라 (Prevotella, PsP), 포르피로모나스(Porphyromonas), 박테리오이데스 (Bacterioides), 알리스티페스 (Alistipes), 리에메렐라(Riemerella), 미로이데스(Myroides), 카프노사이토파가(Capnocytophaga), 포르피로모나스(Porphyromonas), 플라보박테리움(Flavobacterium), 포르피로모나스(Porphyromonas), 크리세오박테리움(Chryseobacterium), 팔루디박터(Paludibacter), 사이크로플렉서스(Psychroflexus), 리에메렐라(Riemerella), 파에오닥틸리박터(Phaeodactylibacter), 시노미크로비움(Sinomicrobium), 레이켄바키엘라 (Reichenbachiella)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 유기체로부터 유래될 수 있다. The Cas13b is Bergeyella , Prevotella (PsP), Porphyromonas , Bacterioides , Alistipes , Riemerella , Myroides , Capnocytophaga , Porphyromonas , Flavobacterium , Porphyromonas , Chryseobacterium , Paludibacter , Cycloplexus ( Psychroflexus ), Riemerella ( Riemerella ), Phaeodactylibacter ( Phaeodactylibacter ), Sinomicrobium ( Sinomicrobium ), Reichenbachiella ( Reichenbachiella ).
상기 Cas13c는 푸소박테리움(Fusobacterium) 및 아나에로살리박터 (Anaerosalibacter)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 유기체로부터 유래될 수 있다. The Cas13c may be derived from an organism of the genus selected from the group consisting of Fusobacterium and Anaerosalibacter .
상기 Cas13d 루미노코쿠스 플레이브족(Ruminococcus flavefaciens) 속의 유기체로부터 유래될 수 있다. The Cas13d may be derived from an organism of the Ruminococcus flavefaciens genus.
또한 상기 Cas13 단백질은 Cas9와 다르게 DNA 대신에 RNA를 절단하고, 또한 목적 RNA를 절단한 후에 비특이적으로 주변의 RNA를 절단하는 특성(collateral cleavage activity)이 존재하여, SARS-CoV-2의 특정 유전자를 절단 할 수 있다. In addition, unlike Cas9, the Cas13 protein cleaves RNA instead of DNA, and also has the characteristic of cleaving surrounding RNA non-specifically after cleaving the target RNA (collateral cleavage activity), thereby cleaving a specific gene of SARS-CoV-2. Can be cut.
또한 CRISPR-Cas13 또는 CRISPR-Cas13 시스템은 아토몰(10-18M) 수준의 극미량으로 존재하는 바이러스를 검출할 수 있으며, 단일 핵산 염기 다형현상(SNP, single nucleotide polymorphism)을 구분할 수 있기 때문에 돌연변이 유무도 확인이 가능하다. In addition, the CRISPR-Cas13 or CRISPR-Cas13 system can detect viruses that exist in trace amounts at the attomolar level (10-18M) and can distinguish single nucleotide polymorphisms (SNPs), so the presence or absence of mutations can be determined. It is possible to check.
본 명세서에서 사용된 용어, '벡터'는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으나, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터 일 수 있다. As used herein, the term 'vector' refers to a genetic construct containing the nucleotide sequence of a gene operably linked to a suitable regulatory sequence to enable expression of a gene of interest in a suitable host, wherein the control sequence is transcribed. It may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence for regulating such transcription, and sequences regulating termination of transcription and translation. The vector of the present invention is not particularly limited as long as it can replicate within cells, and any vector known in the art can be used, but it may be a plasmid vector or a viral vector.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 제1벡터 또는 제2벡터는 서로 동일하지 않으며, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터인 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일예로 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스(Lentivirus) 벡터 레트로바이러스(retrovirus)벡터, 아데노바이러스(adenovirus)벡터, 아데노부속바이러스 (adeno-associated virus)벡터, 및 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus)벡터 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. In one example of the present invention, the first vector or the second vector are not identical to each other and may be a plasmid vector or a viral vector, but are not limited thereto. For example, the viral vector may be a lentivirus vector, a retrovirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, and a herpes simplex virus vector. However, it is not limited to this.
상기 제1벡터 또는 제2벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 퓨로마이신, 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.The first vector or the second vector may contain an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, puromycin, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, and kanamycin. , there are resistance genes for geneticin, neomycin, and tetracycline.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2검출용 디지털 PCR 키트를 제공하는 것이 특징이다. The present invention is characterized by providing a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 containing the above composition.
상기 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR)은 정량적 PCR(quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR) 기법의 상대정량의 한계를 극복하고, 소량의 변이도 찾아내기 위해 민감도(sensitivity), 특이도(specificity)를 높이면서 절대 정량이 가능한 가능하다. 특히 Droplet Digital PCR(ddPCR)은 타겟 유전자를 수십 만개의 미세방울로 이루어진 구획으로 나누어 각각의 독립된 공간에 들어있는 유전자의 증폭여부에 따른 형광 신호를 검출함으로써 copy 복제 개수를 측정할 수 있다. 기술한 바와 같이 PCR mixture를 상기 미세방울(droplet)이나 미소유체(microfluidic) chip을 이용하여 구획을 아주 작은 단위로 분리시켜 PCR을 진행하여, 한 구획 안에 미세량((0 - 2) copies)의 DNA가 들어가 증폭하게 되면 기준곡선 없이 세밀한 정량이 가능하여, 소량의 바이러스도 정확하게 검출이 가능하다. The digital PCR (Digital PCR, dPCR) overcomes the limitations of relative quantification of the quantitative PCR (quantitative polymerase chain reaction, qPCR) technique and increases sensitivity and specificity to detect even small amounts of mutations, while maintaining absolute quantitation. Quantification is possible. In particular, Droplet Digital PCR (ddPCR) can measure the number of copies by dividing the target gene into compartments made up of hundreds of thousands of microdroplets and detecting the fluorescent signal according to the amplification of the gene in each independent space. As described, PCR was performed by separating the PCR mixture into very small compartments using the droplet or microfluidic chip, and a small amount ((0 - 2) copies) was obtained in one compartment. When DNA is entered and amplified, detailed quantification is possible without a reference curve, making it possible to accurately detect even a small amount of virus.
상기 SARS-CoV-2검출용 디지털 PCR 키트는 디지털 PCR용 프라이머 세트 및 디지털 PCR용 프로브를 더 포함할 수 있다. The digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 may further include a primer set for digital PCR and a probe for digital PCR.
상기 디지털 PCR용 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 형광물질로 태그될 수 있다. The probe for digital PCR may be tagged with a fluorescent substance at the 5' and 3' ends.
상기 디지털 PCR 키트는 RNA에서 Reverse transcription 과정을 거쳐 DNA가 만들어지고, droplet 안에서 단일 분자 DNA가 증폭되면서 FAM, HEX 형광신호로 증폭된 분자들에 포함되어 신호 강도가 강해지면서 디지털 PCR의 프아송 분포에 의해 복제(copy)수를 정량하는 방법으로, CRISPR-Cas13에 의해 RNA가 절단되면 상기 디지털 PCR용 형광 프로브가 결합하지 못해 형광신호가 나타나지 않아, 복제수 정량 및 RNA 전달 효율에 의해 정확하면서도 민감하게 바이러스 검출 진단이 가능하다. The digital PCR kit produces DNA from RNA through a reverse transcription process, and as the single molecule DNA is amplified within the droplet, it is included in the amplified molecules as FAM and HEX fluorescent signals, increasing the signal intensity and conforming to the Poisson distribution of digital PCR. This is a method of quantifying the number of copies. When RNA is cut by CRISPR-Cas13, the fluorescent probe for digital PCR does not bind and no fluorescent signal appears, so it is accurate and sensitive by copy number quantification and RNA delivery efficiency. Virus detection and diagnosis is possible.
또한 상기 조성물 또는 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트를 사용할 경우, SARS-CoV-2 관련 시료에서, 디지털 PCR(digital PCR)에 사용한 디지털 PCR용 프라이머 세트 및 디지털 PCR용 프로브는 WT(wild type) binding 하며, CRISPR-Cas13에 의해 절단되며, SARS-CoV-2 시료가 돌연변이가 일어난 시료일 경우, 상기 디지털 PCR용 프로브가 결합하지 못하여, 복제(copy)수 또한 감소하게 되어 RNA 절단 효율 또는 돌연변이 유무를 검출 진단이 가능하다. In addition, when using the composition or a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 containing the composition, the primer set for digital PCR and the probe for digital PCR used in digital PCR (digital PCR) in SARS-CoV-2 related samples WT (wild type) binds and is cleaved by CRISPR-Cas13. If the SARS-CoV-2 sample is a mutated sample, the digital PCR probe cannot bind, and the number of copies is also reduced, resulting in RNA Diagnosis is possible by detecting cleavage efficiency or the presence or absence of mutations.
또한 상기 조성물 또는 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트에 SARS-CoV-2의 spike(S) 유전자에 돌연변이가 일어난 바이러스 시료를 적용할 경우, 해당 돌연변이가 상기 디지털 PCR용 프로브에 의해 인지가 가능하며, 상기 돌연변이가 일어난 부분을 상기 조성물의 CRISPR-Cas13에 의해 절단하게 되면 증폭신호를 잃어버리게 되어, 복제(copy)수가 감소하게 되어, SARS-CoV-2의 돌연변이의 유무의 검출 및 정량이 가능하다. In addition, when applying a virus sample in which a mutation in the spike (S) gene of SARS-CoV-2 is applied to the composition or a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 containing the composition, the mutation is included in the probe for digital PCR. It can be recognized by, and when the mutated part is cut by CRISPR-Cas13 of the composition, the amplification signal is lost, the number of copies is reduced, and the presence or absence of the mutation of SARS-CoV-2 is detected. and quantification are possible.
본 발명은 This invention
1) SARS-CoV-2의 특정 유전자가 포함된 패키징 재조합 벡터를 제조하는 단계;1) Preparing a packaging recombinant vector containing a specific gene of SARS-CoV-2;
2) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질 주입 및 농축하여 SARS-CoV-2 유사체를 제조하는 단계;2) preparing SARS-CoV-2 analogs by transfecting and concentrating the recombinant vector into host cells;
3) 상기 SARS-CoV-2 유사체를 진핵세포에 감염시키는 단계3) Infecting eukaryotic cells with the SARS-CoV-2 analogue
4) 상기 진핵세포에서 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단하기 위한 CRISPR-Cas13 시스템이 포함된 조성물을 상기 3) 단계의 진핵세포에 형질주입시켜 세포 내 발현 및 RNA 절단 유도하는 단계; 및4) transfecting a composition containing the CRISPR-Cas13 system for cutting RNA of the SARS-CoV-2 specific gene in the eukaryotic cell into the eukaryotic cell of step 3) to induce intracellular expression and RNA cutting; and
5) 상기 디지털 PCR 키트를 이용하여 디지털 PCR을 수행하는 단계;5) performing digital PCR using the digital PCR kit;
를 포함하는 분석 방법을 이용한 SARS-CoV-2 검출에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. Provides a method of providing the information necessary for detecting SARS-CoV-2 using an analysis method including.
도 1의 모식도와 같이 SARS-CoV-2 유사체를 제조 및 농축한 다음, 세포에 감염시키고 그 다음 CRISPR-Cas13이 포함된 조성물을 세포에 형질주입한 다음, 세포내 발현 및 RNA 절단을 유도하여 RNA 추출 및 복제 개수를 확인하여 디지털 PCR을 수행하여 복제개수를 통한 RNA 절단 효율을 확인하여 정확하게 바이러스 검출 유무를 아토몰(10-18M) 수준 또는 1 내지 2 복제수로 정확하게 확인하여 SARS-CoV-2 유무를 확인하여 정보를 제공할 수 있다. 또한 본 발명에서 코로나19 포장 RNA 표준물질, 코로나19 유사체또는 SARS-CoV-2 바이러스 유사체는 상기 SARS-CoV-2 유사체와 동일한 의미로 상호 교환적으로 사용될 수 있다. As shown in the schematic diagram of Figure 1, SARS-CoV-2 analogues are prepared and concentrated, cells are infected, and a composition containing CRISPR-Cas13 is transfected into the cells, and intracellular expression and RNA cleavage are induced to produce RNA. Extraction and copy number are checked, digital PCR is performed, RNA cutting efficiency is checked through copy number, and the presence or absence of virus detection is accurately confirmed at the attomole (10-18M) level or 1 to 2 copy number to identify SARS-CoV-2. You can provide information by checking the presence or absence. Additionally, in the present invention, COVID-19 packaging RNA standard material, COVID-19 analogue, or SARS-CoV-2 virus analogue may be used interchangeably with the SARS-CoV-2 analogue in the same sense.
상기 형질 주입을 하기 위한 방법으로는 종래 알려진 다양한 방법, 예를 들면, 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), 입자 분사법(particle bombardment), 정자를 이용하는 방법(sperm-mediated gene transfer), 바이러스 감염법(viral infection), 직접근육주입법(direct muscle injection), 인슐레이터(insulator), G-fectin, Mirus TrasIT-TKO 지질친화성 시약, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴(cellfectin), 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 양이온성 미셀, 양이온성 에멀젼 또는 리포좀을 포함하는 전달시약과 함께 세포 내로 도입되거나, 폴리에틸렌글리콜과 같은 생체적합성 고분자를 접합하여 숙주 세포 내 흡수를 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 당 분야에 인식된 다양한 기법 중에서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다. Methods for the above transfection include various conventionally known methods, such as microinjection, electroporation, particle bombardment, and sperm-mediated gene transfer. , viral infection, direct muscle injection, insulator, G-fectin, Mirus TrasIT-TKO lipophilic reagent, lipofectin, lipofectamine, cellfectin, cation Uptake into host cells can be increased by being introduced into cells together with delivery reagents including phospholipid nanoparticles, cationic polymers, cationic micelles, cationic emulsions or liposomes, or by conjugating biocompatible polymers such as polyethylene glycol. It is not limited to this. Additionally, it can be appropriately selected and applied from among various techniques recognized in the art.
상기 진핵세포는 동물세포 또는 사람유래 세포 모두 가능하며, 일 예로, 베로세포, Per.C6 세포, BHK 세포, Cf2Th 세포, HeLa 세포, D17세포, PCK 세포, MDCK 세포, MDBK 세포, 293 세포(예, HEK 293T 세포, HEK 293R 세포), 및 COS 세포 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 실험예에서는 HEK 293T 세포 또는 HEK 293R 세포를 사용하였다. The eukaryotic cells can be either animal cells or human-derived cells, for example, Vero cells, Per.C6 cells, BHK cells, Cf2Th cells, HeLa cells, D17 cells, PCK cells, MDCK cells, MDBK cells, 293 cells (e.g. , HEK 293T cells, HEK 293R cells), and COS cells. In the experimental example, HEK 293T cells or HEK 293R cells were used.
또한 상기 정보를 제공하는 방법은 sgRNA에 의한 SARS-CoV-2의 비돌연변이 유전자인 정상 유전자와 SARS-CoV-2의 돌연변이의 복제 개수 농도 검출 차이 또는 RNA 절단(CRISPR cutting) 효율을 비교함으로써, SARS-CoV-2의 돌연변이 검출진단에 대한 정보를 제공할 수 있다. In addition, the method of providing the above information is by comparing the detection difference in copy number concentration or RNA cutting (CRISPR cutting) efficiency of the normal gene, which is a non-mutant gene of SARS-CoV-2, and the mutant SARS-CoV-2 by sgRNA, -Can provide information on detection and diagnosis of mutations in CoV-2.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are presented to aid understanding of the present invention. However, the following examples are merely illustrative of the present invention and the scope of the present invention is not limited to the following examples.
제조예 1. SARS-CoV-2의 특정 유전자가 삽입된 렌티바이러스 재조합 벡터 제조 Preparation Example 1. Preparation of lentiviral recombinant vector inserting a specific gene of SARS-CoV-2
제조예 1-1. SARS-CoV-2의 E, M, N 유전자가 삽입된 렌티바이러스 재조합 벡터 제조 Production Example 1-1. Manufacturing of a lentiviral recombinant vector inserting the E, M, and N genes of SARS-CoV-2
HIV 기반 렌티바이러스 벡터이며, 좌측 5’ LTR -패키징 시그날-Rev-응답요소-CPP/CTS 서열- EF1-lα 프로모터-다중클로닝 부위(MCS, Multiple cloning site)-WRRE-3’ LTR으로 구성된 벡터의 다중클로닝 부위 MCS에 ACC65I 제한효소(restriction enzyme)과 BamHI 제한효소(restriction enzyme)를 이용하여 SARS-CoV-2 바이러스의 E, M, N 유전자를 클로닝(cloning) 하여 제작하였다. It is an HIV-based lentiviral vector, and the vector consists of left 5' LTR - packaging signal - Rev - response element - CPP/CTS sequence - EF1-lα promoter - multiple cloning site (MCS) - WRRE-3' LTR. The E, M, and N genes of the SARS-CoV-2 virus were cloned into the multiple cloning site MCS using ACC65I restriction enzyme and BamHI restriction enzyme.
제조예 1-2. SARS-CoV-2의 RdRp 유전자가 삽입된 렌티바이러스 재조합 벡터 제조 Production Example 1-2. Manufacturing of a lentiviral recombinant vector with the RdRp gene of SARS-CoV-2 inserted
HIV 기반 렌티바이러스 벡터이며, 좌측 5’ LTR - 패키징 시그날-Rev-응답요소-CPP/CTS 서열- EF1-lα 프로모터-다중클로닝 부위 MCS(Multiple cloning site)-WRRE-3’ LTR으로 구성된 벡터의 다중클로닝 부위인 MCS에 ACC65I 제한효소(restriction enzyme)과 BamHI 제한효소(restriction enzyme)를 이용하여 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp 유전자를 클로닝(cloning) 하여 제작하였다. It is an HIV-based lentiviral vector, and the vector consists of the left 5' LTR - packaging signal-Rev-responsive element-CPP/CTS sequence- EF1-lα promoter-multiple cloning site MCS (multiple cloning site)-WRRE-3' LTR. The RdRp gene of the SARS-CoV-2 virus was cloned into the cloning site MCS using ACC65I restriction enzyme and BamHI restriction enzyme.
제조예 1-3. SARS-CoV-2의 S 유전자가 삽입된 렌티바이러스 재조합 벡터 제조 Production Example 1-3. Manufacturing of a lentiviral recombinant vector with the S gene of SARS-CoV-2 inserted
HIV 기반 렌티바이러스 벡터이며, 좌측 5’ LTR -패키징 시그날-Rev-응답요소-CPP/CTS 서열- EF1-lα 프로모터-다중클로닝 부위 MCS(Multiple cloning site)-WRRE-3’ LTR으로 구성된 벡터의 다중클로닝 부위 MCS에 ACC65I 제한효소(restriction enzyme)과 BamHI 제한효소(restriction enzyme)를 이용하여 SARS-CoV-2 바이러스의 S 유전자를 클로닝(cloning) 하여 제작하였다. It is an HIV-based lentiviral vector, and the vector consists of left 5' LTR - packaging signal - Rev - response element - CPP/CTS sequence - EF1-lα promoter - multiple cloning site MCS (multiple cloning site) - WRRE-3' LTR. The S gene of the SARS-CoV-2 virus was cloned into the MCS cloning site using ACC65I restriction enzyme and BamHI restriction enzyme.
제조예 2. SARS-CoV-2의 특정 유전자가 삽입된 렌티바이러스 재조합 벡터 형질 주입 및 농축, SARS-CoV-2 유사체 제조 Preparation Example 2. Injection and enrichment of lentiviral recombinant vector into which the specific gene of SARS-CoV-2 is inserted, manufacturing of SARS-CoV-2 analogue
HEK 293T 세포주를 100 mm dish(배양접시), 10 mL 세포배양액을 이용하여 1 × 106 세포수로 배양하였다. 그 다음 Eppendorf tube에 각각의 상기 제조예 1에서 제조한 SARS-CoV-2 유전자가 삽입된 렌티바이러스 벡터, VSV-G 또는 Gag-Pol 유전자가 포함된 포장 벡터 그리고 500 μL의 Opti-MEM (Gibco)를 혼합하였다. 형질주입 시약(transfection Reagent, TransIT-293, Mirus)를 DNA 양의 3배가 되게 넣은 후 피펫을 이용하여 균일하게 혼합하였다. 실온에서 20분 반응시키고, HEK293T 세포주에 형질주입 하였다. 형질주입 후 48시간 동안 방치한 배양액을 모아 0.45μm 주사기 필터(syringe filter)를 이용하여 부유 HEK 293T 세포를 제거하였다. 여과한 배양액을 50mL conical tube에 모은 후 농축 과정을 진행하였다. 그 다음 상기 농축액을 상기 HEK 293T 세포 배양액의 3분의 1 부피만큼 첨가하여(예, 9 mL 배양액일 경우 3 mL 농축액 첨가) 교반기(vortex)를 사용하여 잘 혼합한 후 4 ℃에 30 분에서 8 시간 동안 반응시켜주었다. 이후 4 ℃, 1,500 x g 조건에서 45분 동안 원심분리를 진행하고, 가라앉은 하얀색 펠렛(pellet)을 제외한 상층액을 완벽히 제거하였다. 렌티바이러스 파티클을 안전하게 보관하기 위해 초기 바이러스 배양액 부피의 10분의 1만큼 검체 수송배지를 첨가한 후 펠렛(pellet)을 피펫을 이용하여 풀어주었다. 농축 포장 RNA 중 일부는 분주에 필요한 양을 측정하기 위하여 사용하고 나머지는 -70 ℃ 냉장고에 소분하여 보관하였다. 이와 같이 제조예 1과 제조예 2를 단계로 SARS-CoV-2 유사체를 제조하였다. HEK 293T cell line was cultured at 1 × 10 6 cells using a 100 mm dish (culture dish) and 10 mL cell culture medium. Then, in an Eppendorf tube, each of the lentiviral vectors inserted with the SARS-CoV-2 gene prepared in Preparation Example 1 above, the packaging vector containing the VSV-G or Gag-Pol genes, and 500 μL of Opti-MEM (Gibco) was mixed. Transfection Reagent (TransIT-293, Mirus) was added in three times the amount of DNA and mixed evenly using a pipette. The reaction was conducted at room temperature for 20 minutes and transfected into HEK293T cell line. The culture medium left for 48 hours after transfection was collected, and floating HEK 293T cells were removed using a 0.45 μm syringe filter. The filtered culture medium was collected in a 50mL conical tube and the concentration process was performed. Next, add the concentrate as much as one-third of the volume of the HEK 293T cell culture medium (e.g., add 3 mL concentrate for 9 mL culture medium), mix well using a vortex, and incubate at 4°C for 30 minutes for 8 minutes. It was allowed to react for some time. Afterwards, centrifugation was performed at 4°C and 1,500 xg for 45 minutes, and the supernatant was completely removed except for the settled white pellet. To safely store the lentivirus particles, sample transport medium was added in an amount equal to one-tenth of the initial virus culture volume, and the pellet was released using a pipette. Some of the concentrated packaged RNA was used to measure the amount required for dispensing, and the rest was divided into portions and stored in a -70°C refrigerator. In this way, SARS-CoV-2 analogues were prepared through Preparation Example 1 and Preparation Example 2.
실시예 1. SARS-CoV-2 특정 유전자의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1벡터 및 Cas 13단백질을 코딩하는 유전자 포함하는 제2벡터 제조 Example 1. Preparation of a first vector containing a nucleic acid encoding the guide RNA of a SARS-CoV-2 specific gene and a second vector containing a gene encoding the Cas 13 protein
SARS-CoV-2 특정 유전자의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1벡터를 제조하였으며, 상기 SARS-CoV-2 특정 유전자의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산은 하기 표 1의 sgRNA 서열 핵산을 디자인하여, 양 BbsI 제한 효소를 사용하여 5'- U6 promoter- SARS-CoV-2 특정 유전자 sgRNA-리포터 유전자(beta-lactamase) -RNAⅡ transcript (complementary strand)-3'구성의 플라스미드 벡터를 클로닝하여 제조하였다. A first vector containing a nucleic acid encoding the guide RNA of the SARS-CoV-2 specific gene was prepared, and the nucleic acid encoding the guide RNA of the SARS-CoV-2 specific gene was designed by designing the sgRNA sequence nucleic acid in Table 1 below. , a plasmid vector consisting of 5'-U6 promoter-SARS-CoV-2 specific gene sgRNA-reporter gene (beta-lactamase)-RNAII transcript (complementary strand)-3' was prepared by cloning using sheep BbsI restriction enzyme.
또한 양 LTR에 EF-1a 프로모터- PspCas13b 단백질을 암호화하는 핵산-HIV-NES- WRRE-를 포함하는 제 2 벡터를 클로닝(Cloning) 작업을 통해 바이러스 벡터를 제조하였다. In addition, a viral vector was prepared by cloning a second vector containing the EF-1a promoter-HIV-NES-WRRE-nucleic acid encoding the PspCas13b protein in both LTRs.
실시예 2. SARS-CoV-2 유사체 RNA 감염 및 디지털 PCR 수행 Example 2. SARS-CoV-2 analogue RNA infection and digital PCR performance
상기 제조예 2의 SARS-CoV-2 유사체 RNA 감염. HEK293T 세포주를 100 mm 배양접시, 10 mL 세포배양액을 이용하여 1 × 106 세포수로 배양하였다. 상기 제조예 2의 농축된 SARS-CoV-2 유사체(100 X)를 24 ~ 48 hr 감염시킨 후 2~5일 배양하였다.SARS-CoV-2 analogue RNA infection of Preparation Example 2. HEK293T cell line was cultured at 1 × 10 6 cells using a 100 mm culture dish and 10 mL cell culture medium. The concentrated SARS-CoV-2 analogue (100
상기 실시예 1의 SARS-CoV-2 특정 유전자의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1벡터 및 Cas 13단백질을 포함하는 제2벡터를 형질주입 시약을 이용하여 HEK293T 세포주에 도입한 후, 48시간 반응하여 세포 내 발현 및 RNA 절단을 유도하였다. 그 다음 RNA 추출 및 복제 개수 농도 확인 한 후. SARS-CoV-2의 특정 유전자의 복제 개수 농도 및 Cas13 단백질의 특정 유전자 RNA 전달 효율인, CRISPR cutting 효율을 확인하기 위하여 먼저, HEK 293T 세포에서 Rneasy Mini Kit로 RNA를 추출하였다. SARS-CoV-2의 E 유전자와 N 유전자의 RNA와 상보적으로 결합할 수 있도록 하기 표 2의 디지털 PCR용 프라이머 세트 및 디지털 PCR용 프로브, Supermix, Reverse transcriptase, DTT, DW를 추가하여 단단계 역전사 디지털 중합효소연쇄반응(one-step reverse transcription digital PCR, one-step RT dPCR)을 수행하였다. 상기 one-step RT dPCR의 실험 조건은 하기 표 3 및 표 4와 같다. After introducing the first vector containing the nucleic acid encoding the guide RNA of the SARS-CoV-2 specific gene of Example 1 and the second vector containing the Cas 13 protein into the HEK293T cell line using a transfection reagent, 48 Intracellular expression and RNA cleavage were induced in response to time. Then after RNA extraction and copy number concentration confirmation. To confirm the copy number concentration of the specific gene of SARS-CoV-2 and the CRISPR cutting efficiency, which is the RNA transfer efficiency of the Cas13 protein for the specific gene, RNA was first extracted from HEK 293T cells using the Rneasy Mini Kit. Single-step reverse transcription was performed by adding the digital PCR primer set and digital PCR probes, Supermix, Reverse transcriptase, DTT, and DW in Table 2 below to enable complementary binding to the RNA of the E and N genes of SARS-CoV-2. Digital polymerase chain reaction (one-step reverse transcription digital PCR, one-step RT dPCR) was performed. The experimental conditions for the one-step RT dPCR are shown in Tables 3 and 4 below.
(Cycling step)step
(Cycling step)
(Temperature, ℃)temperature
(Temperature, ℃)
(Time)hour
(Time)
(Ramp Rate)ramp rate
(Ramp Rate)
(Number of cycles)cycle
(Number of cycles)
상기와 같이 단단계 역전사 디지털 중합효소연쇄반응(one-step reverse transcription digital PCR, one-step RT dPCR)을 수행을 통한, 복제개수 농도 정량 확인을 통하여 RNA 절단(CRISPR cutting) 효율을 확인하였다. As described above, RNA cutting (CRISPR cutting) efficiency was confirmed by quantitative confirmation of copy number concentration through one-step reverse transcription digital polymerase chain reaction (one-step reverse transcription digital PCR, one-step RT dPCR).
결과는 도 2 및 도 3과 같고, 상기 도 2 및 도 3에서, sgCTL은 제1벡터와 제2벡터가 포함되며, 세포 성장에 영향을 주지 않는 시퀀스, 염기서열을 사용한 대조군이다. 또한 EV는 대조군으로 공벡터를 Empty vector contol을 의미하며, NTC는 HEK293T WT RNA, HEK 293T 세포에 SARS-CoV-2의 유전자가 도입 또는 포함되지 않는 대조군이다. The results are the same as Figures 2 and 3, and in Figures 2 and 3, sgCTL includes a first vector and a second vector, and is a control using sequences and base sequences that do not affect cell growth. In addition, EV refers to empty vector control as a control, and NTC is a control in which the SARS-CoV-2 gene is not introduced or included in HEK293T WT RNA or HEK 293T cells.
상기 도 2의 결과에서 Cas13과 sgE, 작용에 의해 RNA가 절단되어 sgCTL에 비해 복제 개수가 감소되는 것을 확인하였다. 특히 대조군인 EV negative control에서 복제(copy)수가 검출 되지 않음을 확인하여, EV 대조군과 비교하여 시험군인 sgE에서 RNA 절단 및 복제 개수가 정량적으로 검출되는 것을 확인되었다. From the results shown in FIG. 2, it was confirmed that RNA was cleaved by the action of Cas13 and sgE, thereby reducing the number of copies compared to sgCTL. In particular, it was confirmed that the number of copies was not detected in the EV negative control, which was the control group, and it was confirmed that RNA cleavage and copy number were quantitatively detected in the sgE test group compared to the EV control group.
또한 도 3A와 도 3B의 결과에서도 Cas13과 sgE, sgN 작용에 의해 RNA가 절단되어 sgCTL에 비해 감소한 복제 개수 농도가 검출되고, RNA 절단(CRISPR cutting)이 효율적으로 이루어지는 것을 확인하였다.In addition, the results in Figures 3A and 3B show that RNA is cleaved by the action of Cas13, sgE, and sgN, and a reduced copy number concentration compared to sgCTL is detected, confirming that RNA cutting (CRISPR cutting) is performed efficiently.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As above, specific parts of the content of the present invention have been described in detail, and those skilled in the art will understand that these specific techniques are merely preferred embodiments and do not limit the scope of the present invention. It will be obvious. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.
<110> KRISS <120> CRISPR-Cas13 composition and PCR kit for cutting SARS-CoV-2 RNA <130> P20120671575 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 E gene sgRNA Sense strand <400> 1 cccgcattac gtttggtgga 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 E gene sgRNA Antisense strand <400> 2 tccaccaaac gtaatgcggg 20 <210> 3 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 N gene sgRNA sense strand <400> 3 cccgcattac gtttggtgga 20 <210> 4 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 N gene sgRNA Antisense strand <400> 4 tccaccaaac gtaatgcggg 20 <110> KRISS <120> CRISPR-Cas13 composition and PCR kit for cutting SARS-CoV-2 RNA <130> P20120671575 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 E gene sgRNA Sense strand <400> 1 cccgcattac gtttggtgga 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 E gene sgRNA Antisense strand <400> 2 tccaccaaac gtaatgcggg 20 <210> 3 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 N gene sgRNA sense strand <400> 3 cccgcattac gtttggtgga 20 <210> 4 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV-2 N gene sgRNA Antisense strand <400> 4 tccaccaaac gtaatgcggg 20
Claims (8)
Cas13b 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2벡터;
를 포함하는 진핵세포에서 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단용 CRISPR-Cas13b를 포함하는 조성물.As a SARS-CoV-2 specific gene, a first vector containing both nucleic acids encoding the E and N guide RNAs of SARS-CoV-2; and
A second vector containing nucleic acid encoding Cas13b protein;
A composition comprising CRISPR-Cas13b for cutting SARS-CoV-2 specific gene RNA in eukaryotic cells.
상기 가이드 RNA는 단일 사슬 가이드 RNA인 sgRNA인 조성물. According to paragraph 1,
A composition wherein the guide RNA is sgRNA, a single-chain guide RNA.
상기 제1벡터 또는 제2벡터는 서로 동일하지 않으며, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터인 것인, 조성물.According to paragraph 1,
The composition wherein the first vector or the second vector are not identical to each other and are plasmid vectors or viral vectors.
상기 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트는 디지털 PCR용 프라이머 세트 및 디지털 PCR용 프로브를 더 포함하는 것인, SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트.According to clause 6,
The digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 further includes a primer set for digital PCR and a probe for digital PCR.
2) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질 주입 및 농축하여 SARS-CoV-2 유사체를 제조하는 단계;
3) 상기 SARS-CoV-2 유사체를 진핵세포에 감염시키는 단계;
4) 제1항 및 제3항 및 제5항 중 어느 한 항의 조성물을 상기 3) 단계의 진핵세포에 형질주입하여 세포내 발현 및 RNA 절단 유도하는 단계; 및
5) 제6항의 키트를 이용하여 디지털 PCR을 수행하는 단계;
를 포함하는 분석 방법을 이용한 SARS-CoV-2 검출에 필요한 정보를 제공하는 방법.1) Preparing a packaging recombinant vector containing the guide RNA of the E and N genes of SARS-CoV-2;
2) preparing SARS-CoV-2 analogs by transfecting and concentrating the recombinant vector into host cells;
3) infecting eukaryotic cells with the SARS-CoV-2 analogue;
4) transfecting the composition of any one of claims 1, 3, and 5 into the eukaryotic cell of step 3) to induce intracellular expression and RNA cleavage; and
5) performing digital PCR using the kit of clause 6;
A method of providing information necessary for detecting SARS-CoV-2 using an analysis method including.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210007715A KR102597362B1 (en) | 2021-01-19 | 2021-01-19 | CRISPR-Cas13 composition and PCR kit for cutting SARS-CoV- 2 RNA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020210007715A KR102597362B1 (en) | 2021-01-19 | 2021-01-19 | CRISPR-Cas13 composition and PCR kit for cutting SARS-CoV- 2 RNA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220105087A KR20220105087A (en) | 2022-07-26 |
| KR102597362B1 true KR102597362B1 (en) | 2023-11-06 |
Family
ID=82609731
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020210007715A KR102597362B1 (en) | 2021-01-19 | 2021-01-19 | CRISPR-Cas13 composition and PCR kit for cutting SARS-CoV- 2 RNA |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR102597362B1 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20240020320A (en) * | 2022-08-04 | 2024-02-15 | 한국생명공학연구원 | Naked eye detection method for RdRp variation of SARS-CoV-2 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111363860A (en) | 2020-05-27 | 2020-07-03 | 吴江近岸蛋白质科技有限公司 | Nucleic acid composition for detecting novel coronavirus COVID-19 and application |
| CN112143731A (en) | 2020-09-14 | 2020-12-29 | 广州瑞风生物科技有限公司 | gRNA for targeted destruction of SARS-CoV-2 virus genome and its application |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3679130A4 (en) * | 2017-09-09 | 2021-06-30 | The Broad Institute, Inc. | Multi-effector crispr based diagnostic systems |
-
2021
- 2021-01-19 KR KR1020210007715A patent/KR102597362B1/en active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111363860A (en) | 2020-05-27 | 2020-07-03 | 吴江近岸蛋白质科技有限公司 | Nucleic acid composition for detecting novel coronavirus COVID-19 and application |
| CN112143731A (en) | 2020-09-14 | 2020-12-29 | 广州瑞风生物科技有限公司 | gRNA for targeted destruction of SARS-CoV-2 virus genome and its application |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| BIORXIV PREPRINT (2020.11.19.) [HTTPS://WWW.BIORXIV.ORG/CONTENT/10.1101/2020.11.18.389312V1.FULL.PDF] 1부.* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20220105087A (en) | 2022-07-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Russell et al. | Single-cell virus sequencing of influenza infections that trigger innate immunity | |
| US20220334126A1 (en) | Aav vector and assay for anti-aav (adeno-associated virus) neutralizing antibodies | |
| Shabman et al. | An upstream open reading frame modulates ebola virus polymerase translation and virus replication | |
| Sack et al. | Sources of error in mammalian genetic screens | |
| Bock et al. | Use of a transient assay for studying the genetic determinants of Fv1 restriction | |
| Marsh et al. | Highly conserved regions of influenza a virus polymerase gene segments are critical for efficient viral RNA packaging | |
| Wertz et al. | Adding genes to the RNA genome of vesicular stomatitis virus: positional effects on stability of expression | |
| CN108103245B (en) | Method for detecting lentivirus quality index combination and application thereof | |
| Gammage et al. | Engineered mtZFNs for manipulation of human mitochondrial DNA heteroplasmy | |
| Dinh et al. | Antagonistic effects of cellular poly (C) binding proteins on vesicular stomatitis virus gene expression | |
| US20200208114A1 (en) | Taxonomy and use of bone marrow stromal cell | |
| CN111133100A (en) | Multiplexed receptor-ligand interaction screening | |
| KR102597362B1 (en) | CRISPR-Cas13 composition and PCR kit for cutting SARS-CoV- 2 RNA | |
| Oskarsson et al. | Duplicated sequence motif in the long terminal repeat of maedi-visna virus extends cell tropism and is associated with neurovirulence | |
| McNally et al. | U1 small nuclear ribonucleoprotein and splicing inhibition by the Rous sarcoma virus negative regulator of splicing element | |
| Ziegler et al. | NEDD4 family ubiquitin ligases associate with LCMV Z’s PPXY domain and are required for virus budding, but not via direct ubiquitination of Z | |
| Nikolaitchik et al. | Deciphering the role of the Gag-Pol ribosomal frameshift signal in HIV-1 RNA genome packaging | |
| KR102283733B1 (en) | SARS-CoV-2 packaged RNA reference material for COVID-19 virus diagnosis, preparation method and use thereof | |
| AU2017225350B2 (en) | Promoter | |
| WO2018111735A1 (en) | A cell-based reporter assay for live virus vaccines | |
| US20230374500A1 (en) | Engineered guide rna comprising u-rich tail for optimized crispr/cas12f1 system and use thereof | |
| Nakamura et al. | A cell-based method for screening RNA-protein interactions: identification of constitutive transport element-interacting proteins | |
| Wu et al. | Shen et al. | |
| WO2021231305A2 (en) | Viral delivery vehicle selection | |
| Ke et al. | Establishment of a novel minigenome system for the identification of drugs targeting Nipah virus replication |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
| GRNT | Written decision to grant |