KR20220105087A - CRISPR-Cas13 composition and PCR kit for cutting SARS-CoV- 2 RNA - Google Patents
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Abstract
Description
SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA를 절단하기 위한 CRISPR-Cas13 시스템을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트에 관한 것이다. It relates to a composition comprising a CRISPR-Cas13 system for cutting SARS-CoV-2 specific gene RNA and a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 using the same.
코로나 바이러스(Corona Virus)는 RNA 바이러스의 한 종류로서, 유전 정보가 리보핵산(RNA)으로 이루어진 바이러스로, 사람과 동물의 호흡기와 소화기 계통의 감염을 유발한다. 코로나 바이러스는 주로 점막 전염, 비말 전파 등을 통해 쉽게 감염될 수 있으며, 사람에게는 일반적으로 경미한 호흡기 감염을 일으키나, 드물게 치명적 감염을 일으켜 사망에 이르게 하기도 한다.Coronavirus (Corona Virus) is a type of RNA virus, which is a virus with genetic information consisting of ribonucleic acid (RNA), and causes infection of the respiratory and digestive systems of humans and animals. Corona virus can be easily infected mainly through mucosal transmission and droplet transmission, and it usually causes mild respiratory infections in humans, but rarely causes fatal infections that lead to death.
상기 코로나 바이러스의 일종인 중증 급성 호흡기 증후군-코로나 바이러스-2(SARS-CoV-2)는 중국 우한에서 출현하여 전 세계로 빠르게 확산되었으며, 세계보건기구(WHO)는 해당 바이러스에 감염된 질환을 COVID-19로 명명하였다.Severe acute respiratory syndrome-coronavirus-2 (SARS-CoV-2), a kind of the above coronavirus, emerged from Wuhan, China and spread rapidly around the world, and the World Health Organization (WHO) declared a disease infected with the virus as COVID- 19 was named.
중증급성호흡기증후군 코로나바이러스-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)는 약 3만개의 염기쌍으로 이루어진 단일가닥의 양성 RNA 게놈을 가진 바이러스이다. Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is a virus with a single-stranded positive RNA genome consisting of about 30,000 base pairs.
코로나바이러스감염증-19(코로나19) 팬데믹을 발생시킨 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스-2(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)는 숙주세포에 들어와 RNA 유전체를 복제하고 다양한 하위유전체를 발현시킨다. 특히 하위유전체는 RNA-의존 RNA 중합효소(RNA dependent RNA polymerase, RdRp), 외피(E, M, N, S), 비구조 단백질 등을 합성하며 바이러스 입자가 조립되어 세포 밖으로 빠져나간다. 이러한 감염병을 유발하는 병원균의 진단, 치료영역에서 기존의 qPCR 방법보다 개선된 디지털 PCR의 적용과 크리스퍼 유전자 가위와 같은 새로운 기술적 진보가 필요하다. Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), which caused the Coronavirus Infectious Disease-19 (COVID-19) pandemic, enters host cells, replicates RNA genomes, and mutates various subgenomes. make it manifest In particular, the subgenome synthesizes RNA-dependent RNA polymerase (RdRp), envelopes (E, M, N, S), non-structural proteins, etc., and virus particles are assembled and exited the cell. New technological advances such as the application of digital PCR improved over the existing qPCR method and CRISPR gene scissors are needed in the diagnosis and treatment of pathogens that cause these infectious diseases.
본 발명의 목적은 진핵세포에서 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA를 절단하기 위한 CRISPR-Cas13를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다. It is an object of the present invention to provide a composition comprising CRISPR-Cas13 for cleaving SARS-CoV-2 specific gene RNA in eukaryotic cells.
본 발명의 다른 목적은 진핵세포에서 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA를 절단하기 위한 CRISPR-Cas13을 포함하는 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트를 제공하는 것이다. Another object of the present invention is to provide a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 comprising a composition comprising CRISPR-Cas13 for cleaving SARS-CoV-2 specific gene RNA in eukaryotic cells.
본 발명의 다른 목적은 진핵세포에서 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA를 절단하기 위한 CRISPR-Cas13 포함하는 조성물, 상기 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트를 이용한 분석 방법을 이용한 SARS-CoV-2 검출진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다. Another object of the present invention is a composition containing CRISPR-Cas13 for cutting SARS-CoV-2 specific gene RNA in eukaryotic cells, SARS using an analysis method using a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 containing the composition -To provide a method for providing information necessary for CoV-2 detection and diagnosis.
상기 목적을 해결하기 위해서 본 발명은 SARS-CoV-2 특정 유전자의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1벡터; 및In order to solve the above object, the present invention provides a first vector comprising a nucleic acid encoding a guide RNA of a SARS-CoV-2 specific gene; and
Cas13 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2벡터;a second vector comprising a nucleic acid encoding a Cas13 protein;
를 포함하는 진핵세포에서 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단용 CRISPR-Cas13을 포함하는 조성물을 제공한다. It provides a composition comprising CRISPR-Cas13 for SARS-CoV-2 specific gene RNA cleavage in eukaryotic cells comprising a.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 특정 유전자는, SARS-CoV-2의 RdRp, S, E, M 및 N 정상 유전자 및 상기 SARS-CoV-2의 돌연변이 유전자를 포함하는 유전자 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상 일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the SARS-CoV-2 specific gene is a gene sequence including the RdRp, S, E, M and N normal genes of SARS-CoV-2 and the mutant gene of SARS-CoV-2. It may be any one or more selected from the group consisting of.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 가이드 RNA는 단일 사슬 가이드 RNA인 sgRNA 일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the guide RNA may be a single-stranded guide RNA, sgRNA.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 Cas13 단백질은 Cas13a, Cas13b, Cas13c 또는 Cas13d로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the Cas13 protein may be any one selected from the group consisting of Cas13a, Cas13b, Cas13c or Cas13d.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 제1벡터 또는 제2벡터는 서로 동일하지 않으며, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the first vector or the second vector are not identical to each other, and may be a plasmid vector or a viral vector.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트를 제공한다. The present invention provides a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 comprising the composition.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트는 디지털 PCR용 프라이머 세트 및 디지털 PCR용 프로브를 더 포함할 수 있다. In an example of the present invention, the digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 may further include a primer set for digital PCR and a probe for digital PCR.
본 발명은 the present invention
1) SARS-CoV-2의 특정 유전자가 포함된 패키징 재조합 벡터를 제조하는 단계;1) preparing a packaging recombinant vector containing a specific gene of SARS-CoV-2;
2) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질 주입 및 농축하여 SARS-CoV-2 유사체를 제조하는 단계;2) transfecting and concentrating the recombinant vector into a host cell to prepare a SARS-CoV-2 analogue;
3) 상기 SARS-CoV-2 유사체를 진핵세포에 감염시키는 단계3) Infecting eukaryotic cells with the SARS-CoV-2 analogue
4) 상기 진핵세포에서 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단하기 위한 CRISPR-Cas13이 포함된 조성물에 따른 상기 3) 단계의 진핵세포에 형질주입하여 세포내 발현 및 RNA 절단 유도하는 단계; 및4) inducing intracellular expression and RNA cleavage by transfecting the eukaryotic cells of step 3) according to a composition containing CRISPR-Cas13 for cleaving SARS-CoV-2 specific gene RNA in the eukaryotic cell; and
5) 상기 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트를 이용하여 디지털 PCR을 수행하는 단계;5) performing digital PCR using the digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2;
를 포함하는 분석 방법을 이용한 SARS-CoV-2 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. It provides a method of providing information necessary for diagnosing SARS-CoV-2 using an analysis method comprising a.
본 발명에 따른 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단용 CRISPR-Cas13을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트는 RNA 절단 효율에 따라 디지털 PCR을 기반으로 검출함으로써 진단의 정확도와 민감도를 향상시킬 수 있다. The composition containing CRISPR-Cas13 for RNA cleavage of a SARS-CoV-2 specific gene according to the present invention and a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 using the same according to the present invention are digital PCR-based detection according to RNA cleavage efficiency, thereby providing diagnostic accuracy and sensitivity can be improved.
또한 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단용 CRISPR-Cas13을 포함하는 조성물 또는 상기 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트를 이용한 분석 방법은, 정확하고 신뢰성 있으며, 민감도가 개선된 SARS-CoV-2의 분석 정보를 제공할 수 있다. In addition, an analysis method using a composition containing CRISPR-Cas13 for cleaving SARS-CoV-2 specific gene RNA or a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 containing the composition is accurate and reliable, and SARS with improved sensitivity -CoV-2 analysis information can be provided.
또한 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단용 CRISPR-Cas13을 포함하는 조성물 및 이를 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트는 RNA 절단 효율에 따라 디지털 PCR을 기반으로 검출하여 정확하게 SARS-CoV-2 검출이 가능하다. In addition, the composition containing CRISPR-Cas13 for cleaving SARS-CoV-2 specific gene RNA according to the present invention and the digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 containing the same according to the present invention can be accurately detected based on digital PCR according to RNA cleavage efficiency. SARS-CoV-2 detection is possible.
또한 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 키트 또는 상기 SARS-CoV-2 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 의해, 크리스퍼 유전자 교정 분야의 응용이 유용하게 활용될 수 있다. In addition, the kit for detecting SARS-CoV-2 according to the present invention or the method of providing information necessary for diagnosing the SARS-CoV-2 may be usefully applied to the field of CRISPR gene editing.
또한 본 발명에 따른 SARS-CoV-2 검출용 키트 또는 상기 SARS-CoV-2 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은 정밀한 유전자 변이 측정이 가능하여 정밀 분자진단분야에 유용하게 활용될 수 있다. In addition, the kit for detecting SARS-CoV-2 or the method for providing information necessary for diagnosing SARS-CoV-2 according to the present invention can accurately measure genetic mutations and thus can be usefully utilized in the field of precise molecular diagnosis.
도 1의 본 명의 실시예 2의 모식도를 도시화한 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 2에 따른 SARS-CoV-2의 특정 유전자가 포함된 SARS-CoV-2 유사체에 CRISPR-Cas13 시스템을 적용한 다음 디지털 PCR(digital PCR)로 수행한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로는 도 2에서 sgCTL은 제1벡터와 제2벡터가 포함되었으나, 세포 성장에 영향을 주지 않는 시퀀스, 염기서열을 사용한 대조군이다. 또한 sgE는 SARS-CoV-2 특정 유전자인 E 유전자의 sgRNA가 포함된 제1벡터와 제2벡터가 포함된 시험군이며, EV는 대조군으로 공벡터를 Empty vector contol을 의미하며, NTC는 HEK293T WT RNA 또는 HEK 293T 세포에 SARS-CoV-2의 특정 유전자가 도입 또는 포함되지 않는 대조군이다.
도 3는 본 발명의 실시예 2에 따른 SARS-CoV-2의 특정 유전자가 포함된 SARS-CoV-2 유사체에 CRISPR-Cas13 시스템을 적용한 다음 디지털 PCR(digital PCR)을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로는 도 3에서 sgCTL은 제1벡터와 제2벡터가 포함되었으나, 세포 성장에 영향을 주지 않는 시퀀스, 염기서열을 사용한 대조군이며, sgN 또는 sgE는 SARS-CoV-2 특정 유전자인 N 또는 E 유전자의 sgRNA가 포함된 제1벡터와 제2벡터가 포함된 시험군이다. 또한 NTC는 HEK293T WT RNA 또는 HEK 293T 세포에 SARS-CoV-2의 특정 유전자가 도입 또는 포함되지 않는 대조군이다. 또한 도 3A는 SARS-CoV-2의 특정 유전자인 E 유전자 sgRNA, sgE의 시험군에 대한 결과이고, 도 3B는 SARS-CoV-2의 특정 유전자인 N 유전자 sgRNA, sgN의 시험군에 대한 결과를 나타낸 것이다. Fig. 1 shows a schematic diagram of Example 2 of the present invention.
2 shows the results of applying the CRISPR-Cas13 system to a SARS-CoV-2 analog containing a specific gene of SARS-CoV-2 according to Example 2 of the present invention and then performing digital PCR. Specifically, in FIG. 2 , sgCTL includes the first vector and the second vector, but is a control using sequences and base sequences that do not affect cell growth. In addition, sgE is a test group containing the first vector and the second vector containing sgRNA of the E gene, which is a SARS-CoV-2 specific gene, EV is an empty vector as a control, and NTC is HEK293T WT. A control in which a specific gene of SARS-CoV-2 is not introduced or contained in RNA or HEK 293T cells.
3 shows the results of digital PCR (digital PCR) after applying the CRISPR-Cas13 system to the SARS-CoV-2 analog containing a specific gene of SARS-CoV-2 according to Example 2 of the present invention. Specifically, in FIG. 3, sgCTL includes the first vector and the second vector, but is a control using sequences and base sequences that do not affect cell growth, and sgN or sgE is a SARS-CoV-2 specific gene N or E. This is a test group containing the first vector and the second vector containing the sgRNA of the gene. In addition, NTC is a control in which a specific gene of SARS-CoV-2 is not introduced or contained in HEK293T WT RNA or HEK 293T cells. In addition, FIG. 3A shows the results of the test group of E genes sgRNA and sgE, which are specific genes of SARS-CoV-2, and FIG. 3B shows the results of the test group of N genes sgRNA and sgN, which are specific genes of SARS-CoV-2. it has been shown
이하 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단용 CRISPR-Cas13을 포함하는 조성물 및 이를 이용한 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트, 이를 포함하는 분석방법을 이용한 SARS-CoV-2진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 대해 상세히 설명한다. Hereinafter, a composition containing CRISPR-Cas13 for cleaving SARS-CoV-2 specific gene RNA, a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 using the same, and information necessary for diagnosing SARS-CoV-2 using an analysis method including the same are provided. How to do it will be described in detail.
도면이 기재되어 있을 경우, 이는 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 예로서 제공되는 것이다. 따라서 본 발명은 제시되는 도면들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있으며, 상기 도면들은 본 발명의 사상을 명확히 하기 위해 과장되어 도시될 수 있다.When drawings are described, they are provided as examples so that the spirit of the present invention can be sufficiently conveyed to those skilled in the art. Therefore, the present invention is not limited to the drawings presented and may be embodied in other forms, and the drawings may be exaggerated to clarify the spirit of the present invention.
이때, 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명 및 첨부 도면에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.At this time, if there is no other definition in the technical terms and scientific terms used, it has the meaning commonly understood by those of ordinary skill in the art to which this invention belongs, and the gist of the present invention in the following description and accompanying drawings Descriptions of known functions and configurations that may be unnecessarily obscure will be omitted.
또한 본 발명의 명세서에서 사용되는 단수 형태는 문맥에서 특별한 지시가 없는 한 복수 형태도 포함하는 것으로 의도할 수 있다. In addition, the singular form used in the specification of the present invention may also be intended to include the plural form unless the context specifically dictates otherwise.
또한 본 발명의 명세서에서 특별한 언급 없이 사용된 단위는 중량을 기준으로 하며, 일 예로 % 또는 비의 단위는 중량% 또는 중량비를 의미한다.In addition, in the specification of the present invention, the unit used without special mention is based on the weight, for example, the unit of % or ratio means weight % or weight ratio.
또한 본 발명의 명세서에서, “포함한다”는 표현은 “구비한다”, “함유한다, “가진다” 또는 “특징으로 한다” 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다.In addition, in the specification of the present invention, the expression “comprising” is an open-ended description having an equivalent meaning to expressions such as “comprising”, “containing,” “having” or “characterized by”, and is not listed further. It does not exclude elements, materials or processes that are not
본 발명은 진핵세포에서 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단용 CRISPR-Cas13을 포함된 조성물로서, SARS-CoV-2 특정 유전자의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1벡터; 및 Cas13 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2벡터;를 포함하는 진핵세포에서 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단용 CRISPR-Cas13 포함하는 조성물을 제공하는 것이 특징이다. The present invention provides a composition containing CRISPR-Cas13 for cleaving SARS-CoV-2 specific gene RNA in eukaryotic cells, comprising: a first vector comprising a nucleic acid encoding a guide RNA of a SARS-CoV-2 specific gene; It is characterized by providing a composition comprising CRISPR-Cas13 for cleaving SARS-CoV-2 specific gene RNA in eukaryotic cells, including; and a second vector comprising a nucleic acid encoding a Cas13 protein.
본 발명에서 암호화하는 핵산과 코딩하는 유전자 또는 유전자 서열은 동일한 의미로 상호 교환하여 사용될 수 있다. In the present invention, the encoding nucleic acid and the encoding gene or gene sequence may be used interchangeably with the same meaning.
상기 제 1벡터는 구체적으로 5'- U6 promoter- SARS-CoV-2 특정 유전자 sgRNA-리포터 유전자-RNAⅡ transcript (complementary strand)-3'로 구성된 벡터일 수 있다. Specifically, the first vector may be a vector composed of 5'-U6 promoter-SARS-CoV-2 specific gene sgRNA-reporter gene-RNAII transcript (complementary strand)-3'.
상기 리포터 유전자는 베타-갈락토시다제(beta-galactosidase), 베타-락타마아제(β_lactamase), TEV-프로테아제(TEV-protease), 디히드로엽산환원효소(Dihydrofolate reductase), 루시퍼라제(luciferase), 레닐라 루시퍼라아제(Renilla luciferase), 가우시아 루시퍼라아제(Gaussia luciferase), 선택 마커(selection marker), 표면 마커 유전자(surface marker gene), 형광단백질 코딩 유전자 또는 항생제 저항성 단백질 코딩 유전자 일 수 있으나, 실시예에서는 베타-락타마아제(beta-lactamase) 유전자를 사용하였다. The reporter gene is beta-galactosidase (beta-galactosidase), beta-lactamase (β_lactamase), TEV- protease (TEV-protease), dihydrofolate reductase (Dihydrofolate reductase), luciferase (luciferase), Renilla luciferase (Renilla luciferase), Gaussia luciferase (Gaussia luciferase), selection marker (selection marker), surface marker gene (surface marker gene), fluorescent protein coding gene or antibiotic resistance protein coding gene, but may be, In the examples, beta-lactamase (beta-lactamase) gene was used.
상기 2벡터는 구체적으로 양 LTR에 EF-1a 프로모터- PspCas13b 단백질을 코딩하는 유전자-HIV-NES- WRRE-를 포함하는 제 2 벡터일 수 있다. The second vector may be a second vector including, specifically, the EF-1a promoter-PspCas13b protein-coding gene-HIV-NES-WRRE- in both LTRs.
상기 SARS-CoV-2 특정 유전자는 RNA 유전자인, SARS-CoV-2의 RdRp, S, E, M 및 N 정상 유전자 및 상기 SARS-CoV-2의 돌연변이 유전자를 포함하는 유전자 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상 일 수 있다. The SARS-CoV-2 specific gene is an RNA gene, selected from the group consisting of RdRp, S, E, M and N normal genes of SARS-CoV-2 and a gene sequence comprising a mutant gene of SARS-CoV-2 It may be any one or more.
상기 SARS-CoV-2 특정 유전자인, 상기 SARS-CoV-2의 RdRp, S, E, M 및 N 정상 유전자는 Wuhan-Hu-1 바이러스주의 공개된 염기서열(Genbank: MN908947)을 참조서열을 하여, 상기 참조서열에서 RdRp 유전자 전체 (13025번부터 16405번 서열) 서열, E 유전자 시작부터, M 유전자를 포함하며, N 유전자 끝을 포함하는 염기서열(26245번부터 29530번 서열)을 포함하나, 참조서열과 28144번 서열이 T가 C인 점에서 차이점이 있다. 또한 상기 SARS-CoV-2 포장 RNA 표준물질은 S 유전자 일부(21563번부터 23473번 서열)를 포함한다. The SARS-CoV-2 specific gene, RdRp, S, E, M and N normal genes of SARS-CoV-2 were referenced to the published nucleotide sequence (Genbank: MN908947) of the Wuhan-Hu-1 virus strain. , In the reference sequence, the entire RdRp gene (sequences from 13025 to 16405) sequence, from the beginning of the E gene, including the M gene, and the nucleotide sequence including the end of the N gene (sequences from 26245 to 29530). There is a difference between the sequence and the sequence 28144 in that T is C. In addition, the SARS-CoV-2 packaging RNA standard includes a portion of the S gene (sequences 21563 to 23473).
상기 SARS-CoV-2 특정 유전자인, 상기 SARS-CoV-2의 돌연변이 유전자는 참조 SARS-CoV-2 게놈 서열(Reference SARS-CoV-2 genome sequence)을 기준으로 하여 SARS-CoV-2의 유전자 염기서열이 치환 결실 또는 삽입된 유전자를 의미한다. 상기 참조 SARS-CoV-2 게놈 서열은 2019년 초기에 확인된 SARS-CoV-2 유전체 서열 또는 Wuhan-Hu-1 바이러스주의 서열일 수 있으며, 일 예로, MN908947 일 수 있다. The SARS-CoV-2 specific gene, the SARS-CoV-2 mutant gene, is the SARS-CoV-2 gene base based on the reference SARS-CoV-2 genome sequence. It refers to a gene in which the sequence has been substituted, deleted or inserted. The reference SARS-CoV-2 genome sequence may be a SARS-CoV-2 genome sequence identified in early 2019 or a sequence of the Wuhan-Hu-1 strain, for example, MN908947.
상기 SARS-CoV-2의 돌연변이 유전자는 일 예로, 상기 S(spike) 유전자의 S1의 수용체 결합 부분(319~541 aa)에서, 돌연변이 부분 유전자, N74K, G75V, I197V, S256F, T299I, E309Q, T345I, N437S, I468T, D614G, S721V, M731I, E780D, A903S, H1058Q, L1063F, A1078S, H1083R, A1174V, V1176F, K1191N, M1229I, S1252F, V3F, L5F, S12F, C15F, R21T, T22I, T29I, G35V, T30I, S50L, H49Y, S71F, S71P, T76I, V83F, S98F, S112L, T124I, I128F, D138H, H146Q, M153I, N165H, L176F, D178N, E180K, G181V, S221L, H245Y, S247R, D253G, S254F, S255F, S256P, W258L, A262T, F275L, G283V, T284I, E298K, T307I, V308L, E309Q, P330A, K444N, G446V, L455F, I469T, A475V, S477N, V483F, G485R, S494L, T500I, N501Y, H519Q, P521S, A522V, P621S, T632N, G639V, S698L, T778I, S704L, T716I, P812S, D839N, K1073N, V1122L, V1122M, G1124V, D1163G 또는 D1163G 일 수 있다. The SARS-CoV-2 mutant gene is, for example, in the receptor binding portion (319-541 aa) of S1 of the S (spike) gene, the mutant portion gene, N74K, G75V, I197V, S256F, T299I, E309Q, T345I , N437S, I468T, D614G, S721V, M731I, E780D, A903S, H1058Q, L1063F, A1078S, H1083R, A1174V, V1176F, K1191N, M1229I, S1252F, V3F, L5F, T29I, G12F, C15F, R21F, C15F , S50L, H49Y, S71F, S71P, T76I, V83F, S98F, S112L, T124I, I128F, D138H, H146Q, M153I, N165H, L176F, D178N, E180K, G181V, S221L, H245Y, S247R, D253G, S254F, S , W258L, A262T, F275L, G283V, T284I, E298K, T307I, V308L, E309Q, P330A, K444N, G446V, L455F, I469T, A475V, S477N, V483F, G485R, S494L, T500I, P521S, H519Q, P521S, H519Q , T632N, G639V, S698L, T778I, S704L, T716I, P812S, D839N, K1073N, V1122L, V1122M, G1124V, D1163G or D1163G.
또한 상기 SARS-CoV-2의 돌연변이 유전자는 상기 SARS-CoV-2의 NSP12(RdRp) 유전자의 14408번 염기서열이 C에서 T로 치환된, P323L, 상기 SARS-CoV-2의 ORF3a 유전자의 25563번 염기서열이 G에서 T로 치환된 Q57H, 상기 SARS-CoV-2의 NSP2 유전자의 1059번 염기서열이 C에서 T로 치환된 T85I, 상기 SARS-CoV-2의 ORF8 유전자의 28144번 염기서열이 T에서 C로 치환된 L84S, 상기 SARS-CoV-2의 NSP13(Helicase) 유전자의 17858번 염기서열이 A에서 G치환된 Y541C, 상기 SARS-CoV-2의 NSP13(Helicase) 유전자 17747번 염기서열이 C에서 T로 치환된 P504L 또는 상기 SARS-CoV-2의 ORF8 유전자 27964번 염기서열이 C에서 T로 치환된 S24L 일 수 있으나, SARS-CoV-2의 돌연변이 유전자이면, 이에 제한되지 않는다. In addition, the mutant gene of SARS-CoV-2 is P323L, in which nucleotide sequence 14408 of the NSP12 (RdRp) gene of SARS-CoV-2 is substituted from C to T, and number 25563 of the ORF3a gene of SARS-CoV-2 Q57H in which the nucleotide sequence is substituted from G to T, T85I in which nucleotide sequence 1059 of the NSP2 gene of SARS-CoV-2 is substituted from C to T, and nucleotide sequence 28144 of the ORF8 gene of SARS-CoV-2 is T In L84S substituted with C, Y541C in which nucleotide sequence 17858 of the NSP13 (Helicase) gene of SARS-CoV-2 is substituted from A to G, NSP13 (Helicase) gene sequence 17747 of the SARS-CoV-2 is C In P504L substituted with T, or S24L in which the nucleotide sequence 27964 of the ORF8 gene of SARS-CoV-2 is substituted from C to T, it is not limited thereto.
상기 가이드 RNA(guide RNA)'는 crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA) 를 포함하는 이중 RNA(dual RNA) 있으나, 구체적으로는 단일 사슬 가이드 RNA인 sgRNA 일 수 있다. The 'guide RNA' is a dual RNA including crRNA (CRISPR RNA) and tracrRNA (trans-activating crRNA), but specifically, sgRNA, which is a single-stranded guide RNA, may be used.
또한 상기 가이드 RNA(guide RNA)는 SARS-CoV-2 특정 유전자 DNA 의 특이적인 RNA를 의미하며, Cas 단백질과 결합하여 Cas 단백질을 표적 DNA 또는 RNA로 인도할 수 있다. 또한. 본 발명에서, 가이드 RNA는 절단하고자 하는 SARS-CoV-2 특정 유전자에 특이적으로 되도록 제조될 수 있다.In addition, the guide RNA (guide RNA) refers to a specific RNA of the SARS-CoV-2 specific gene DNA, and can guide the Cas protein to the target DNA or RNA by binding to the Cas protein. In addition. In the present invention, the guide RNA may be prepared to be specific for the SARS-CoV-2 specific gene to be cleaved.
또한 상기 가이드 RNA는 두 개의 RNA, 즉, crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)를 구성요소로 포함하는 이중 RNA (dual RNA); 또는 표적 DNA의 상보적 사슬(complementary strand)과 염기 쌍을 형성할 수 있는 서열을 포함하는 제1 부위 및 Cas 단백질과 상호작용하는 서열을 포함하는 제2 부위를 포함하는 형태, 보다 구체적으로 crRNA 및 tracrRNA의 주요 부분이 융합된 형태인 sgRNA (single-chain guide RNA)일 수 있다.In addition, the guide RNA includes two RNAs, that is, a dual RNA (dual RNA) including crRNA (CRISPR RNA) and tracrRNA (trans-activating crRNA) as components; or a form comprising a first site comprising a sequence capable of base pairing with a complementary strand of the target DNA and a second site comprising a sequence that interacts with a Cas protein, more specifically crRNA and It may be a single-chain guide RNA (sgRNA) in which a major part of tracrRNA is fused.
상기 가이드 RNA의 표적 DNA 서열의 상보적 사슬과 염기 쌍을 형성할 수 있는 서열의 길이는 18 내지 24bp, 19내지 23bp, 이에 제한되지 않는다. 또한 sgRNA에 적용될 수 있다.The length of the sequence capable of forming a base pair with the complementary strand of the target DNA sequence of the guide RNA is 18 to 24 bp, 19 to 23 bp, but is not limited thereto. It can also be applied to sgRNA.
상기 SARS-CoV-2 특정 유전자의 가이드 RNA는 상기 SARS-CoV-2 특정 유전자의 SNP를 찾거나 확인하여, 이를 이용해서 crRNA 또는 SgRNA를 디자인 할 수 있다. The guide RNA of the SARS-CoV-2 specific gene may be used to design crRNA or SgRNA by finding or confirming the SNP of the SARS-CoV-2 specific gene.
상기 Cas 단백질은 CRISPR-Cas 시스템에서 필수적인 단백질 요소를 의미하고, crRNA(CRISPR RNA) 및 tracrRNA(trans-activating crRNA)와 복합체를 형성하여 이의 활성을 나타낼 수 있다. 상기 Cas 단백질은 활성 엔도뉴클레아제 또는 니카아제 (nickase) 활성을 나타낼 수 있다.The Cas protein refers to an essential protein element in the CRISPR-Cas system, and may form a complex with crRNA (CRISPR RNA) and tracrRNA (trans-activating crRNA) to exhibit its activity. The Cas protein may exhibit active endonuclease or nickase activity.
Cas 단백질은 가이드 RNA와 복합체를 형성할 때 엔도뉴클레아제 또는 니카아제 활성을 갖는다면 모두 해당되나, 바람직하게는 Cas13 단백질이다. The Cas protein is a Cas13 protein if it has an endonuclease or nickase activity when forming a complex with the guide RNA, but is preferably a Cas13 protein.
또한 본 발명에서 CRISPR-Cas13 또는 CRISPR-Cas13 시스템은 동일한 의미로 상호 교환적으로 사용할 수 있다. 또한 유전자 가위의 의미도 포함된다. Also, in the present invention, CRISPR-Cas13 or CRISPR-Cas13 system may be used interchangeably with the same meaning. Also includes the meaning of gene scissors.
상기 Cas13 단백질(C2c2 단백질)은 Cas13a, Cas13b, Cas13c 또는 Cas13d로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 일 수 있으나, 이에 제한되지 않으나, 실시예에서 cas13b를 사용하였다. The Cas13 protein (C2c2 protein) may be any one selected from the group consisting of Cas13a, Cas13b, Cas13c or Cas13d, but is not limited thereto, but cas13b was used in the Examples.
상기 Cas13a은 렙토트리키아(Leptotrichia), 리스테리아(Listeria), 코리네박터(Corynebacter), 수테렐라(Sutterella), 레지오넬라(Legionella), 트레포네마 (Treponema), 필리팍토르(Filifactor), 유박테리움(Eubacterium), 스트렙토코커스 (Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 마이코플라스마(Mycoplasma), 박테로이데스(Bacteroides), 플라비이볼라(Flaviivola), 플라보박테리움(Flavobacterium), 스파에로카에타(Sphaerochaeta), 아조스피릴룸(Azospirillum), 글루콘아세토박터(Gluconacetobacter), 네이세리아(Neisseria), 로세부리아 (Roseburia), 파르비바큘럼(Parvibaculum), 스타필로코커스(Staphylococcus), 니트라티프락토르(Nitratifractor), 마이코플라스마(Mycoplasma), 캄필로박터(Campylobacter), 및 라크노스피라(Lachnospira)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 유기체로부터 유래될 수 있다. The Cas13a is Leptotrichia , Listeria , Corynebacter , Sutterella , Legionella , Treponema , Filifactor , Eubacterium. ( Eubacterium ), Streptococcus ( Streptococcus ), Lactobacillus , Mycoplasma , Bacteroides , Flaviivola ), Flavobacterium ( Flavobacterium ) Sphaerochaeta ), Azospirillum ( Azospirillum ), Gluconacetobacter , Neisseria , Roseburia , Parvivaculum ), Staphylococcus , Nitra Nitratifractor ), Mycoplasma , Campylobacter , and Lachnospira ).
상기 Cas13b는 베르게이엘라 (Bergeyella), 프레보텔라 (Prevotella, PsP), 포르피로모나스(Porphyromonas), 박테리오이데스 (Bacterioides), 알리스티페스 (Alistipes), 리에메렐라(Riemerella), 미로이데스(Myroides), 카프노사이토파가(Capnocytophaga), 포르피로모나스(Porphyromonas), 플라보박테리움(Flavobacterium), 포르피로모나스(Porphyromonas), 크리세오박테리움(Chryseobacterium), 팔루디박터(Paludibacter), 사이크로플렉서스(Psychroflexus), 리에메렐라(Riemerella), 파에오닥틸리박터(Phaeodactylibacter), 시노미크로비움(Sinomicrobium), 레이켄바키엘라 (Reichenbachiella)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 유기체로부터 유래될 수 있다. The Cas13b is Bergeyella ( Bergeyella ), Prevotella ( Prevotella, PsP), Porphyromonas ( Porphyromonas ), Bacterioides , Alistipes ( Alistipes ), Riemerella ( Riemerella ), Myroides ( Myroides ) , Capnocytophaga ( Capnocytophaga ), Porphyromonas ( Porphyromonas ), Flavobacterium ( Flavobacterium ), Porphyromonas ( Porphyromonas ), Chryseobacterium ( Chryseobacterium ), Paludibacter ( Paludibacter ), Cycloplexus Psychroflexus ), Riemerella , Phaeodactylibacter , Sinomicrobium , Reichenbachiella ) .
상기 Cas13c는 푸소박테리움(Fusobacterium) 및 아나에로살리박터 (Anaerosalibacter)로 이루어진 군으로부터 선택되는 속의 유기체로부터 유래될 수 있다. The Cas13c may be derived from an organism of a genus selected from the group consisting of Fusobacterium and Anaerosalibacter .
상기 Cas13d 루미노코쿠스 플레이브족(Ruminococcus flavefaciens) 속의 유기체로부터 유래될 수 있다. The Cas13d may be derived from an organism of the genus Ruminococcus flavefaciens .
또한 상기 Cas13 단백질은 Cas9와 다르게 DNA 대신에 RNA를 절단하고, 또한 목적 RNA를 절단한 후에 비특이적으로 주변의 RNA를 절단하는 특성(collateral cleavage activity)이 존재하여, SARS-CoV-2의 특정 유전자를 절단 할 수 있다. In addition, unlike Cas9, the Cas13 protein cuts RNA instead of DNA, and also has a characteristic (collateral cleavage activity) of non-specifically cleaving surrounding RNA after cleaving the target RNA. can be cut
또한 CRISPR-Cas13 또는 CRISPR-Cas13 시스템은 아토몰(10-18M) 수준의 극미량으로 존재하는 바이러스를 검출할 수 있으며, 단일 핵산 염기 다형현상(SNP, single nucleotide polymorphism)을 구분할 수 있기 때문에 돌연변이 유무도 확인이 가능하다. In addition, the CRISPR-Cas13 or CRISPR-Cas13 system can detect viruses present in very trace amounts at the level of atomol (10-18M), and can distinguish single nucleotide polymorphisms (SNPs), so the presence or absence of mutations is also determined. It is possible to check
본 명세서에서 사용된 용어, '벡터'는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 포함하는 유전자 작제물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 본 발명의 벡터는 세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않고 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있으나, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터 일 수 있다. As used herein, the term 'vector' refers to a genetic construct comprising the nucleotide sequence of a gene operably linked to a suitable regulatory sequence so as to express a target gene in a suitable host, wherein the regulatory sequence is transcribed promoters capable of initiating such transcription, optional operator sequences for regulating such transcription, and sequences regulating the termination of transcription and translation, and the like. The vector of the present invention is not particularly limited as long as it can replicate in cells, and any vector known in the art may be used, but may be a plasmid vector or a viral vector.
본 발명의 일 예에 있어서, 상기 제1벡터 또는 제2벡터는 서로 동일하지 않으며, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터인 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 일예로 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스(Lentivirus) 벡터 레트로바이러스(retrovirus)벡터, 아데노바이러스(adenovirus)벡터, 아데노부속바이러스 (adeno-associated virus)벡터, 및 헤르페스 심플렉스 바이러스(herpes simplex virus)벡터 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. In one embodiment of the present invention, the first vector or the second vector are not identical to each other, and may be a plasmid vector or a viral vector, but is not limited thereto. For example, the viral vector may be a lentivirus vector retrovirus vector, an adenovirus vector, an adeno-associated virus vector, and a herpes simplex virus vector. However, the present invention is not limited thereto.
상기 제1벡터 또는 제2벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 퓨로마이신, 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.The first vector or the second vector may include an antibiotic resistance gene commonly used in the art as a selection marker, for example, puromycin, ampicillin, gentamicin, carbenicillin, chloramphenicol, streptomycin, kanamycin. , geneticin, neomycin and tetracycline resistance genes.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2검출용 디지털 PCR 키트를 제공하는 것이 특징이다. The present invention is characterized by providing a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 comprising the composition.
상기 디지털 PCR(Digital PCR, dPCR)은 정량적 PCR(quantitative Polymerase Chain Reaction, qPCR) 기법의 상대정량의 한계를 극복하고, 소량의 변이도 찾아내기 위해 민감도(sensitivity), 특이도(specificity)를 높이면서 절대 정량이 가능한 가능하다. 특히 Droplet Digital PCR(ddPCR)은 타겟 유전자를 수십 만개의 미세방울로 이루어진 구획으로 나누어 각각의 독립된 공간에 들어있는 유전자의 증폭여부에 따른 형광 신호를 검출함으로써 copy 복제 개수를 측정할 수 있다. 기술한 바와 같이 PCR mixture를 상기 미세방울(droplet)이나 미소유체(microfluidic) chip을 이용하여 구획을 아주 작은 단위로 분리시켜 PCR을 진행하여, 한 구획 안에 미세량((0 - 2) copies)의 DNA가 들어가 증폭하게 되면 기준곡선 없이 세밀한 정량이 가능하여, 소량의 바이러스도 정확하게 검출이 가능하다. The digital PCR (dPCR) overcomes the limitations of relative quantitation of quantitative PCR (quantitative polymerase chain reaction, qPCR) techniques, and increases sensitivity and specificity to detect even a small amount of mutation. quantification is possible. In particular, Droplet Digital PCR (ddPCR) divides the target gene into compartments made up of hundreds of thousands of microdroplets and detects the fluorescence signal depending on whether the gene contained in each independent space is amplified, thereby measuring the number of copy copies. As described, the PCR mixture was separated into very small units using the microdroplets or microfluidic chip and PCR was performed, and a micro amount ((0 - 2) copies) in one compartment When DNA enters and amplifies, precise quantification is possible without a reference curve, and even a small amount of virus can be accurately detected.
상기 SARS-CoV-2검출용 디지털 PCR 키트는 디지털 PCR용 프라이머 세트 및 디지털 PCR용 프로브를 더 포함할 수 있다. The digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 may further include a primer set for digital PCR and a probe for digital PCR.
상기 디지털 PCR용 프로브는 5' 말단 및 3' 말단에 형광물질로 태그될 수 있다. The digital PCR probe may be tagged with a fluorescent material at the 5' end and the 3' end.
상기 디지털 PCR 키트는 RNA에서 Reverse transcription 과정을 거쳐 DNA가 만들어지고, droplet 안에서 단일 분자 DNA가 증폭되면서 FAM, HEX 형광신호로 증폭된 분자들에 포함되어 신호 강도가 강해지면서 디지털 PCR의 프아송 분포에 의해 복제(copy)수를 정량하는 방법으로, CRISPR-Cas13에 의해 RNA가 절단되면 상기 디지털 PCR용 형광 프로브가 결합하지 못해 형광신호가 나타나지 않아, 복제수 정량 및 RNA 전달 효율에 의해 정확하면서도 민감하게 바이러스 검출 진단이 가능하다. In the digital PCR kit, DNA is made from RNA through a reverse transcription process, and single-molecule DNA is amplified in the droplet, and the signal strength is strengthened by being included in the molecules amplified by FAM and HEX fluorescence signals, thereby contributing to the Poisson distribution of digital PCR. As a method of quantifying the number of copies by CRISPR-Cas13, when RNA is cleaved by CRISPR-Cas13, the fluorescent probe for digital PCR fails to bind and no fluorescence signal appears. Virus detection and diagnosis are possible.
또한 상기 조성물 또는 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트를 사용할 경우, SARS-CoV-2 관련 시료에서, 디지털 PCR(digital PCR)에 사용한 디지털 PCR용 프라이머 세트 및 디지털 PCR용 프로브는 WT(wild type) binding 하며, CRISPR-Cas13에 의해 절단되며, SARS-CoV-2 시료가 돌연변이가 일어난 시료일 경우, 상기 디지털 PCR용 프로브가 결합하지 못하여, 복제(copy)수 또한 감소하게 되어 RNA 절단 효율 또는 돌연변이 유무를 검출 진단이 가능하다. In addition, when using the composition or a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 containing the composition, in the SARS-CoV-2 related sample, the digital PCR primer set and digital PCR probe used for digital PCR are WT (wild type) binding, cleaved by CRISPR-Cas13, and when the SARS-CoV-2 sample is a mutated sample, the digital PCR probe fails to bind, and the number of copies is also reduced, so RNA It is possible to detect and diagnose the cleavage efficiency or the presence or absence of mutations.
또한 상기 조성물 또는 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트에 SARS-CoV-2의 spike(S) 유전자에 돌연변이가 일어난 바이러스 시료를 적용할 경우, 해당 돌연변이가 상기 디지털 PCR용 프로브에 의해 인지가 가능하며, 상기 돌연변이가 일어난 부분을 상기 조성물의 CRISPR-Cas13에 의해 절단하게 되면 증폭신호를 잃어버리게 되어, 복제(copy)수가 감소하게 되어, SARS-CoV-2의 돌연변이의 유무의 검출 및 정량이 가능하다. In addition, when a virus sample with a mutation in the spike (S) gene of SARS-CoV-2 is applied to a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 containing the composition or composition, the mutation is applied to the digital PCR probe. When the mutated portion is cut by CRISPR-Cas13 of the composition, the amplification signal is lost, the number of copies is reduced, and detection of the presence or absence of mutation in SARS-CoV-2 and quantification.
본 발명은 the present invention
1) SARS-CoV-2의 특정 유전자가 포함된 패키징 재조합 벡터를 제조하는 단계;1) preparing a packaging recombinant vector containing a specific gene of SARS-CoV-2;
2) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질 주입 및 농축하여 SARS-CoV-2 유사체를 제조하는 단계;2) transfecting and concentrating the recombinant vector into a host cell to prepare a SARS-CoV-2 analogue;
3) 상기 SARS-CoV-2 유사체를 진핵세포에 감염시키는 단계3) Infecting eukaryotic cells with the SARS-CoV-2 analogue
4) 상기 진핵세포에서 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단하기 위한 CRISPR-Cas13 시스템이 포함된 조성물을 상기 3) 단계의 진핵세포에 형질주입시켜 세포 내 발현 및 RNA 절단 유도하는 단계; 및4) inducing intracellular expression and RNA cleavage by transfecting the eukaryotic cell of step 3) with a composition containing the CRISPR-Cas13 system for cleaving SARS-CoV-2 specific gene RNA in the eukaryotic cell; and
5) 상기 디지털 PCR 키트를 이용하여 디지털 PCR을 수행하는 단계;5) performing digital PCR using the digital PCR kit;
를 포함하는 분석 방법을 이용한 SARS-CoV-2 검출에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. It provides a method of providing information necessary for SARS-CoV-2 detection using an analysis method comprising a.
도 1의 모식도와 같이 SARS-CoV-2 유사체를 제조 및 농축한 다음, 세포에 감염시키고 그 다음 CRISPR-Cas13이 포함된 조성물을 세포에 형질주입한 다음, 세포내 발현 및 RNA 절단을 유도하여 RNA 추출 및 복제 개수를 확인하여 디지털 PCR을 수행하여 복제개수를 통한 RNA 절단 효율을 확인하여 정확하게 바이러스 검출 유무를 아토몰(10-18M) 수준 또는 1 내지 2 복제수로 정확하게 확인하여 SARS-CoV-2 유무를 확인하여 정보를 제공할 수 있다. 또한 본 발명에서 코로나19 포장 RNA 표준물질, 코로나19 유사체또는 SARS-CoV-2 바이러스 유사체는 상기 SARS-CoV-2 유사체와 동일한 의미로 상호 교환적으로 사용될 수 있다. As shown in the schematic diagram of FIG. 1, SARS-CoV-2 analogs were prepared and concentrated, then infected with cells and then transfected with a composition containing CRISPR-Cas13 into cells, and then intracellular expression and RNA cleavage was induced to induce RNA SARS-CoV-2 SARS-CoV-2 by checking the extraction and copy count and performing digital PCR to check the RNA cleavage efficiency through the copy number to accurately check the presence or absence of virus detection at the atomol (10-18M) level or 1 to 2 copy number Information can be provided by checking the presence or absence. Also, in the present invention, the Corona 19 packaging RNA standard material, the Corona 19 analog, or the SARS-CoV-2 virus analog may be used interchangeably with the same meaning as the SARS-CoV-2 analog.
상기 형질 주입을 하기 위한 방법으로는 종래 알려진 다양한 방법, 예를 들면, 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), 입자 분사법(particle bombardment), 정자를 이용하는 방법(sperm-mediated gene transfer), 바이러스 감염법(viral infection), 직접근육주입법(direct muscle injection), 인슐레이터(insulator), G-fectin, Mirus TrasIT-TKO 지질친화성 시약, 리포펙틴, 리포펙타민, 셀펙틴(cellfectin), 양이온성 인지질 나노입자, 양이온성 고분자, 양이온성 미셀, 양이온성 에멀젼 또는 리포좀을 포함하는 전달시약과 함께 세포 내로 도입되거나, 폴리에틸렌글리콜과 같은 생체적합성 고분자를 접합하여 숙주 세포 내 흡수를 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 당 분야에 인식된 다양한 기법 중에서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다. As a method for performing the transfection, various methods known in the art, for example, microinjection, electroporation, particle bombardment, and sperm-mediated gene transfer. , viral infection, direct muscle injection, insulator, G-fectin, Mirus TrasIT-TKO lipophilic reagent, lipofectin, lipofectamine, cellfectin, cationic Introduced into cells together with a delivery reagent including sex phospholipid nanoparticles, cationic polymers, cationic micelles, cationic emulsions or liposomes, or by conjugating biocompatible polymers such as polyethylene glycol to increase uptake in host cells, However, the present invention is not limited thereto. In addition, it can be appropriately selected and applied from various techniques recognized in the art.
상기 진핵세포는 동물세포 또는 사람유래 세포 모두 가능하며, 일 예로, 베로세포, Per.C6 세포, BHK 세포, Cf2Th 세포, HeLa 세포, D17세포, PCK 세포, MDCK 세포, MDBK 세포, 293 세포(예, HEK 293T 세포, HEK 293R 세포), 및 COS 세포 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 실험예에서는 HEK 293T 세포 또는 HEK 293R 세포를 사용하였다. The eukaryotic cells may be either animal cells or human-derived cells, for example, Vero cells, Per.C6 cells, BHK cells, Cf2Th cells, HeLa cells, D17 cells, PCK cells, MDCK cells, MDBK cells, 293 cells (eg , HEK 293T cells, HEK 293R cells), and COS cells. In the experimental example, HEK 293T cells or HEK 293R cells were used.
또한 상기 정보를 제공하는 방법은 sgRNA에 의한 SARS-CoV-2의 비돌연변이 유전자인 정상 유전자와 SARS-CoV-2의 돌연변이의 복제 개수 농도 검출 차이 또는 RNA 절단(CRISPR cutting) 효율을 비교함으로써, SARS-CoV-2의 돌연변이 검출진단에 대한 정보를 제공할 수 있다. In addition, the method of providing the information is by comparing the detection difference or RNA cutting (CRISPR cutting) efficiency of the normal gene, which is a non-mutant gene of SARS-CoV-2, and the copy number concentration of a mutant of SARS-CoV-2 by sgRNA. -CoV-2 mutation detection and diagnosis can provide information.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are presented to help the understanding of the present invention, but the following examples are only illustrative of the present invention and the scope of the present invention is not limited to the following examples.
제조예 1. SARS-CoV-2의 특정 유전자가 삽입된 렌티바이러스 재조합 벡터 제조 Preparation Example 1. Preparation of a recombinant lentiviral vector into which a specific gene of SARS-CoV-2 is inserted
제조예 1-1. SARS-CoV-2의 E, M, N 유전자가 삽입된 렌티바이러스 재조합 벡터 제조 Preparation Example 1-1. Preparation of lentiviral recombinant vector in which SARS-CoV-2 E, M, N genes are inserted
HIV 기반 렌티바이러스 벡터이며, 좌측 5’ LTR -패키징 시그날-Rev-응답요소-CPP/CTS 서열- EF1-lα 프로모터-다중클로닝 부위(MCS, Multiple cloning site)-WRRE-3’ LTR으로 구성된 벡터의 다중클로닝 부위 MCS에 ACC65I 제한효소(restriction enzyme)과 BamHI 제한효소(restriction enzyme)를 이용하여 SARS-CoV-2 바이러스의 E, M, N 유전자를 클로닝(cloning) 하여 제작하였다. HIV-based lentiviral vector, left 5' LTR -packaging signal-Rev-response element-CPP/CTS sequence-EF1-la promoter-Multiple cloning site (MCS)-WRRE-3' LTR of the vector consisting of It was prepared by cloning the E, M, N genes of SARS-CoV-2 virus using ACC65I restriction enzyme and BamHI restriction enzyme in the multi-cloning site MCS.
제조예 1-2. SARS-CoV-2의 RdRp 유전자가 삽입된 렌티바이러스 재조합 벡터 제조 Preparation 1-2. Preparation of lentiviral recombinant vector into which RdRp gene of SARS-CoV-2 is inserted
HIV 기반 렌티바이러스 벡터이며, 좌측 5’ LTR - 패키징 시그날-Rev-응답요소-CPP/CTS 서열- EF1-lα 프로모터-다중클로닝 부위 MCS(Multiple cloning site)-WRRE-3’ LTR으로 구성된 벡터의 다중클로닝 부위인 MCS에 ACC65I 제한효소(restriction enzyme)과 BamHI 제한효소(restriction enzyme)를 이용하여 SARS-CoV-2 바이러스의 RdRp 유전자를 클로닝(cloning) 하여 제작하였다. HIV-based lentiviral vector, left 5' LTR - packaging signal-Rev-response element - CPP/CTS sequence - EF1-la promoter - Multiple cloning site MCS (Multiple cloning site) - WRRE-3' LTR It was prepared by cloning the RdRp gene of SARS-CoV-2 virus using ACC65I restriction enzyme and BamHI restriction enzyme in MCS, which is a cloning site.
제조예 1-3. SARS-CoV-2의 S 유전자가 삽입된 렌티바이러스 재조합 벡터 제조 Preparation Example 1-3. Preparation of lentiviral recombinant vector into which S gene of SARS-CoV-2 is inserted
HIV 기반 렌티바이러스 벡터이며, 좌측 5’ LTR -패키징 시그날-Rev-응답요소-CPP/CTS 서열- EF1-lα 프로모터-다중클로닝 부위 MCS(Multiple cloning site)-WRRE-3’ LTR으로 구성된 벡터의 다중클로닝 부위 MCS에 ACC65I 제한효소(restriction enzyme)과 BamHI 제한효소(restriction enzyme)를 이용하여 SARS-CoV-2 바이러스의 S 유전자를 클로닝(cloning) 하여 제작하였다. It is an HIV-based lentiviral vector and consists of a left 5' LTR-packaging signal-Rev-response element-CPP/CTS sequence-EF1-la promoter-multiple cloning site MCS (Multiple cloning site)-WRRE-3' LTR. Cloning site MCS was prepared by cloning the S gene of SARS-CoV-2 virus using ACC65I restriction enzyme and BamHI restriction enzyme.
제조예 2. SARS-CoV-2의 특정 유전자가 삽입된 렌티바이러스 재조합 벡터 형질 주입 및 농축, SARS-CoV-2 유사체 제조 Preparation Example 2. Transfection and concentration of a lentiviral recombinant vector into which a specific gene of SARS-CoV-2 is inserted, SARS-CoV-2 analog preparation
HEK 293T 세포주를 100 mm dish(배양접시), 10 mL 세포배양액을 이용하여 1 × 106 세포수로 배양하였다. 그 다음 Eppendorf tube에 각각의 상기 제조예 1에서 제조한 SARS-CoV-2 유전자가 삽입된 렌티바이러스 벡터, VSV-G 또는 Gag-Pol 유전자가 포함된 포장 벡터 그리고 500 μL의 Opti-MEM (Gibco)를 혼합하였다. 형질주입 시약(transfection Reagent, TransIT-293, Mirus)를 DNA 양의 3배가 되게 넣은 후 피펫을 이용하여 균일하게 혼합하였다. 실온에서 20분 반응시키고, HEK293T 세포주에 형질주입 하였다. 형질주입 후 48시간 동안 방치한 배양액을 모아 0.45μm 주사기 필터(syringe filter)를 이용하여 부유 HEK 293T 세포를 제거하였다. 여과한 배양액을 50mL conical tube에 모은 후 농축 과정을 진행하였다. 그 다음 상기 농축액을 상기 HEK 293T 세포 배양액의 3분의 1 부피만큼 첨가하여(예, 9 mL 배양액일 경우 3 mL 농축액 첨가) 교반기(vortex)를 사용하여 잘 혼합한 후 4 ℃에 30 분에서 8 시간 동안 반응시켜주었다. 이후 4 ℃, 1,500 x g 조건에서 45분 동안 원심분리를 진행하고, 가라앉은 하얀색 펠렛(pellet)을 제외한 상층액을 완벽히 제거하였다. 렌티바이러스 파티클을 안전하게 보관하기 위해 초기 바이러스 배양액 부피의 10분의 1만큼 검체 수송배지를 첨가한 후 펠렛(pellet)을 피펫을 이용하여 풀어주었다. 농축 포장 RNA 중 일부는 분주에 필요한 양을 측정하기 위하여 사용하고 나머지는 -70 ℃ 냉장고에 소분하여 보관하였다. 이와 같이 제조예 1과 제조예 2를 단계로 SARS-CoV-2 유사체를 제조하였다. The HEK 293T cell line was cultured in a 100 mm dish (culture dish) and 1 × 10 6 cells using 10 mL cell culture solution. Then, each of the SARS-CoV-2 gene prepared in Preparation Example 1 is inserted into the Eppendorf tube, the packaging vector containing the VSV-G or Gag-Pol gene, and 500 μL of Opti-MEM (Gibco) was mixed. The transfection reagent (transfection reagent, TransIT-293, Mirus) was added so that 3 times the amount of DNA was added and then mixed uniformly using a pipette. After reacting at room temperature for 20 minutes, the cells were transfected into HEK293T cell line. After transfection, the culture medium left for 48 hours was collected and suspended HEK 293T cells were removed using a 0.45 μm syringe filter. After collecting the filtered culture solution in a 50mL conical tube, the concentration process was performed. Then, add the concentrate by one-third volume of the HEK 293T cell culture medium (eg, add 3 mL concentrate in the case of 9 mL culture solution), mix well using a vortex, and then at 4°C for 30 minutes to 8 reacted for an hour. Thereafter, centrifugation was performed at 4 °C and 1,500 x g for 45 minutes, and the supernatant was completely removed except for the submerged white pellets. In order to safely store the lentivirus particles, a sample transport medium was added to one-tenth the volume of the initial virus culture medium, and then the pellet was released using a pipette. Some of the concentrated packaged RNA was used to measure the amount required for dispensing, and the rest were stored in subdivisions at -70 ° C. In this way, a SARS-CoV-2 analogue was prepared in the steps of Preparation Example 1 and Preparation Example 2.
실시예 1. SARS-CoV-2 특정 유전자의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1벡터 및 Cas 13단백질을 코딩하는 유전자 포함하는 제2벡터 제조 Example 1. Preparation of a first vector containing a nucleic acid encoding a guide RNA of a specific gene for SARS-CoV-2 and a second vector containing a gene encoding a Cas 13 protein
SARS-CoV-2 특정 유전자의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1벡터를 제조하였으며, 상기 SARS-CoV-2 특정 유전자의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산은 하기 표 1의 sgRNA 서열 핵산을 디자인하여, 양 BbsI 제한 효소를 사용하여 5'- U6 promoter- SARS-CoV-2 특정 유전자 sgRNA-리포터 유전자(beta-lactamase) -RNAⅡ transcript (complementary strand)-3'구성의 플라스미드 벡터를 클로닝하여 제조하였다. A first vector containing a nucleic acid encoding the guide RNA of the SARS-CoV-2 specific gene was prepared, and the nucleic acid encoding the guide RNA of the SARS-CoV-2 specific gene was designed by designing the sgRNA sequence nucleic acid of Table 1 below. , It was prepared by cloning a plasmid vector of 5'-U6 promoter-SARS-CoV-2 specific gene, sgRNA-reporter gene (beta-lactamase)-RNAII transcript (complementary strand)-3' configuration using BbsI restriction enzyme.
또한 양 LTR에 EF-1a 프로모터- PspCas13b 단백질을 암호화하는 핵산-HIV-NES- WRRE-를 포함하는 제 2 벡터를 클로닝(Cloning) 작업을 통해 바이러스 벡터를 제조하였다. In addition, a viral vector was prepared by cloning a second vector including an EF-1a promoter- a nucleic acid encoding a PspCas13b protein-HIV-NES-WRRE- in both LTRs.
실시예 2. SARS-CoV-2 유사체 RNA 감염 및 디지털 PCR 수행 Example 2. SARS-CoV-2 analogue RNA infection and digital PCR performed
상기 제조예 2의 SARS-CoV-2 유사체 RNA 감염. HEK293T 세포주를 100 mm 배양접시, 10 mL 세포배양액을 이용하여 1 × 106 세포수로 배양하였다. 상기 제조예 2의 농축된 SARS-CoV-2 유사체(100 X)를 24 ~ 48 hr 감염시킨 후 2~5일 배양하였다.SARS-CoV-2 analog RNA infection of Preparation Example 2. The HEK293T cell line was cultured at 1 × 10 6 cells in a 100 mm culture dish and 10 mL cell culture medium. The concentrated SARS-CoV-2 analogue (100 X) of Preparation Example 2 was infected for 24 to 48 hr and then cultured for 2 to 5 days.
상기 실시예 1의 SARS-CoV-2 특정 유전자의 가이드 RNA를 암호화하는 핵산을 포함하는 제1벡터 및 Cas 13단백질을 포함하는 제2벡터를 형질주입 시약을 이용하여 HEK293T 세포주에 도입한 후, 48시간 반응하여 세포 내 발현 및 RNA 절단을 유도하였다. 그 다음 RNA 추출 및 복제 개수 농도 확인 한 후. SARS-CoV-2의 특정 유전자의 복제 개수 농도 및 Cas13 단백질의 특정 유전자 RNA 전달 효율인, CRISPR cutting 효율을 확인하기 위하여 먼저, HEK 293T 세포에서 Rneasy Mini Kit로 RNA를 추출하였다. SARS-CoV-2의 E 유전자와 N 유전자의 RNA와 상보적으로 결합할 수 있도록 하기 표 2의 디지털 PCR용 프라이머 세트 및 디지털 PCR용 프로브, Supermix, Reverse transcriptase, DTT, DW를 추가하여 단단계 역전사 디지털 중합효소연쇄반응(one-step reverse transcription digital PCR, one-step RT dPCR)을 수행하였다. 상기 one-step RT dPCR의 실험 조건은 하기 표 3 및 표 4와 같다. After introducing the first vector containing the nucleic acid encoding the guide RNA of the SARS-CoV-2 specific gene of Example 1 and the second vector containing the Cas 13 protein into the HEK293T cell line using a transfection reagent, 48 Time response induced intracellular expression and RNA cleavage. Then after RNA extraction and copy count concentration check. First, RNA was extracted from HEK 293T cells with Rneasy Mini Kit in order to check the CRISPR cutting efficiency, which is the copy number concentration of a specific gene of SARS-CoV-2 and RNA delivery efficiency of a specific gene of Cas13 protein. Single-step reverse transcription by adding the primer sets for digital PCR and digital PCR probes, Supermix, Reverse transcriptase, DTT, and DW in Table 2 below so that they can be complementary to the RNA of the E gene and N gene of SARS-CoV-2 A digital polymerase chain reaction (one-step reverse transcription digital PCR, one-step RT dPCR) was performed. The experimental conditions of the one-step RT dPCR are shown in Tables 3 and 4 below.
(Cycling step)step
(Cycling step)
(Temperature, ℃)temperature
(Temperature, ℃)
(Time)hour
(Time)
(Ramp Rate)ramp rate
(Ramp Rate)
(Number of cycles)cycle
(Number of cycles)
상기와 같이 단단계 역전사 디지털 중합효소연쇄반응(one-step reverse transcription digital PCR, one-step RT dPCR)을 수행을 통한, 복제개수 농도 정량 확인을 통하여 RNA 절단(CRISPR cutting) 효율을 확인하였다. CRISPR cutting efficiency was confirmed through quantitative confirmation of the copy number concentration by performing one-step reverse transcription digital PCR, one-step RT dPCR, as described above.
결과는 도 2 및 도 3과 같고, 상기 도 2 및 도 3에서, sgCTL은 제1벡터와 제2벡터가 포함되며, 세포 성장에 영향을 주지 않는 시퀀스, 염기서열을 사용한 대조군이다. 또한 EV는 대조군으로 공벡터를 Empty vector contol을 의미하며, NTC는 HEK293T WT RNA, HEK 293T 세포에 SARS-CoV-2의 유전자가 도입 또는 포함되지 않는 대조군이다. The results are the same as in FIGS. 2 and 3 , and in FIGS. 2 and 3 , the sgCTL includes the first vector and the second vector, and is a control using a sequence and a nucleotide sequence that do not affect cell growth. In addition, EV means an empty vector control as a control, and NTC is a control in which the SARS-CoV-2 gene is not introduced or contained in HEK293T WT RNA and HEK 293T cells.
상기 도 2의 결과에서 Cas13과 sgE, 작용에 의해 RNA가 절단되어 sgCTL에 비해 복제 개수가 감소되는 것을 확인하였다. 특히 대조군인 EV negative control에서 복제(copy)수가 검출 되지 않음을 확인하여, EV 대조군과 비교하여 시험군인 sgE에서 RNA 절단 및 복제 개수가 정량적으로 검출되는 것을 확인되었다. From the results of FIG. 2, it was confirmed that RNA was cleaved by the action of Cas13 and sgE, thereby reducing the number of copies compared to sgCTL. In particular, it was confirmed that the number of copies was not detected in the EV negative control, which is a control, and it was confirmed that RNA cleavage and the number of copies were quantitatively detected in the test group, sgE, compared to the EV control.
또한 도 3A와 도 3B의 결과에서도 Cas13과 sgE, sgN 작용에 의해 RNA가 절단되어 sgCTL에 비해 감소한 복제 개수 농도가 검출되고, RNA 절단(CRISPR cutting)이 효율적으로 이루어지는 것을 확인하였다.In addition, in the results of FIGS. 3A and 3B, RNA was cleaved by the action of Cas13, sgE, and sgN, and a decreased copy number concentration compared to sgCTL was detected, and it was confirmed that CRISPR cutting was performed efficiently.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As described above in detail a specific part of the content of the present invention, for those of ordinary skill in the art, this specific description is only a preferred embodiment, and the scope of the present invention is not limited thereby It will be obvious. Accordingly, it is intended that the substantial scope of the present invention be defined by the appended claims and their equivalents.
<110> KRISS
<120> CRISPR-Cas13 composition and PCR kit for cutting SARS-CoV-2 RNA
<130> P20120671575
<160> 4
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SARS-CoV-2 E gene sgRNA Sense strand
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<110> KRISS
<120> CRISPR-Cas13 composition and PCR kit for cutting SARS-CoV-2 RNA
<130> P20120671575
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<170> KoPatentIn 3.0
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Claims (8)
Cas13 단백질을 암호화하는 핵산을 포함하는 제2벡터;
를 포함하는 진핵세포에서 SARS-CoV-2 특정 유전자 RNA 절단용 CRISPR-Cas13 을 포함하는 조성물.a first vector comprising a nucleic acid encoding a guide RNA of a SARS-CoV-2 specific gene; and
a second vector comprising a nucleic acid encoding a Cas13 protein;
A composition comprising CRISPR-Cas13 for SARS-CoV-2 specific gene RNA cleavage in eukaryotic cells comprising a.
상기 SARS-CoV-2 특정 유전자는, SARS-CoV-2의 RdRp, S, E, M 및 N 정상 유전자 및 상기 SARS-CoV-2의 돌연변이 유전자를 포함하는 유전자 서열로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인, 조성물.The method of claim 1
The SARS-CoV-2 specific gene is at least one selected from the group consisting of a gene sequence comprising RdRp, S, E, M and N normal genes of SARS-CoV-2 and a mutant gene of SARS-CoV-2. , composition.
상기 가이드 RNA는 단일 사슬 가이드 RNA인 sgRNA인 조성물. According to claim 1,
The guide RNA is a single-stranded guide RNA sgRNA composition.
상기 Cas13 단백질은 Cas13a, Cas13b, Cas13c 또는 Cas13d 단백질인 조성물. The method of claim 1
The Cas13 protein is a Cas13a, Cas13b, Cas13c or Cas13d protein composition.
상기 제1벡터 또는 제2벡터는 서로 동일하지 않으며, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터인 것인, 조성물.According to claim 1,
The first vector or the second vector are not identical to each other, and the composition is a plasmid vector or a viral vector.
상기 SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트는 디지털 PCR용 프라이머 세트 및 디지털 PCR용 프로브를 더 포함하는 것인, SARS-CoV-2 검출용 디지털 PCR 키트.7. The method of claim 6,
The digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2 further comprises a primer set for digital PCR and a probe for digital PCR, a digital PCR kit for detecting SARS-CoV-2.
2) 상기 재조합 벡터를 숙주세포에 형질 주입 및 농축하여 SARS-CoV-2 유사체를 제조하는 단계;
3) 상기 SARS-CoV-2 유사체를 진핵세포에 감염시키는 단계
4) 제1항 내지 제5항의 조성물을 상기 3) 단계의 진핵세포에 형질주입하여 세포내 발현 및 RNA 절단 유도하는 단계; 및
5) 제6항의 키트를 이용하여 디지털 PCR을 수행하는 단계;
를 포함하는 분석 방법을 이용한 SARS-CoV-2 검출에 필요한 정보를 제공하는 방법.
1) preparing a packaging recombinant vector containing a specific gene of SARS-CoV-2;
2) transfecting and concentrating the recombinant vector into a host cell to prepare a SARS-CoV-2 analogue;
3) Infecting eukaryotic cells with the SARS-CoV-2 analogue
4) inducing intracellular expression and RNA cleavage by transfecting the eukaryotic cell of step 3) with the composition of claims 1 to 5; and
5) performing digital PCR using the kit of claim 6;
A method of providing information necessary for SARS-CoV-2 detection using an analysis method comprising a.
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| WO2024029898A1 (en) * | 2022-08-04 | 2024-02-08 | 한국생명공학연구원 | Naked eye detection method for sars-cov-2 rdrp mutations |
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- 2021-01-19 KR KR1020210007715A patent/KR102597362B1/en active IP Right Grant
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Also Published As
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|---|---|
| KR102597362B1 (en) | 2023-11-06 |
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