KR102594489B1 - Ebv 동정을 포함한 암 면역치료제 효능예측 표적유전체 분석법 - Google Patents

Ebv 동정을 포함한 암 면역치료제 효능예측 표적유전체 분석법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암 면역치료제 효능 예측을 위한 정보 제공방법에 관한 것으로, 종양충실도가 낮은 미만형 위암에서 EBV DNA 존재와 TMB 정도를 정밀하게 동정함으로써, anti-PD-1 또는 PD-L1 단독 또는 병용요법의 면역치료제의 효과 예측에 유용한 정보를 제공할 수 있다.
기존에 별도의 ISH 분석을 고가로 수행하였어야 했던 EBV 진단을 TMB 결정과 한 번에 수행하되, 유전자 증폭 (gene amplification) 및 단일염기변이 (single nucleotide variation)가 동시 동정이 가능하여 비용 효율적이다.

Description

EBV 동정을 포함한 암 면역치료제 효능예측 표적유전체 분석법 {Novel targeted sequencing method to identify EBV and purity/ploidy-corrected tumor mutation burden in cancer}
본 발명은 표적유전체 분석을 통해 엡스타인 바 바이러스 (Epstein-Barr Virus, EBV) 양성 여부를 판단하고, 동시에 암의 종양 변이 부담 (tumor mutation burden, TMB)을 보다 정밀하게 판단함으로써 암 면역치료제 효능을 예측하는 정보 제공방법에 관한 것이다.
국내 전이성 위암의 대부분은 미만형 위암 (diffuse type) 으로, 미만형 위암의 생검 (biopsy) 조직의 경우 종양충실도 (tumor purity)가 전반적으로 낮아 암 유전체 분석에 비뚤림 (artifact)이 심하고 세포충실도 변이 (cellular heterogeneity) 가 심한 문제가 있다. 이를 극복하는 검사법을 개발하는 것이 정밀의료에 있어 매우 시급하다.
엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus, EBV) 감염이 존재하거나 종양 변이 부담 (tumor mutation burden, TMB) 이 높은 위암은 면역치료제의 효능이 높다는 것이 알려져 있지만, 종래의 EBV 진단법은 EBER 유전자에 대한 ISH (in situ hybridization) 이라는 RNA 기반의 분석방법이 가장 흔히 이용되고 있다. 이는 병리조직 절편을 얻어 EBER RNA 에 대한 프로브 (probe)를 형광 반응시켜 병리의가 직접 현미경으로 판독해야 하는 방법이므로, 유전자 증폭 및 변이를 탐색하기 위해 시행하는 NGS 와 완전히 별도의 과정으로 진행해야 하는 고가의 검사라는데 문제가 있었다.
종양세포충실도가 낮은 위암의 표적유전체 분석에서의 문제는, TMB가 실제보다 너무 낮게 나와 high-TMB 종양 (tumor)이 low-TMB 종양 (tumor)으로 잘못 판정되어 면역치료제 투약의 기회를 놓칠 소지가 있다는 점이다. EBV 역시 정상세포가 아닌 종양세포에 존재하므로, 종양세포충실도가 낮은 위암 검체의 표적유전체 분석에서는 위음성의 소지가 있다.
이에 본 발명자는 표적유전체 분석 시, 배수성 (ploidy) 와 종양세포충실도 (tumor purity) 정보를 획득, 배수성/종양세포충실도로 보정하여 TMB 를 판정할 수 있게 함으로써, 종양세포충실도가 낮은 것으로 오판되어 면역치료제 투약의 기회를 놓치는 경우를 최소화하기 위한 것이며, EBV 에도 적용된다.
이와 같이 배수성/종양 세포 충실도를 보정하는 표적유전체분석법 동반진단 개발은 우리나라에서 흔한 위암의 경우에는 임상적 필요가 크다.
대한민국 등록특허 제 10-2112951 호
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 표적유전체 분석으로 암 면역 치료제 효과와 연관된 엡스타인 바 바이러스 (Epstein-Barr Virus, EBV) 양성 여부를 판단하고, 동시에 암의 종양 변이 부담 (tumor mutation burden, TMB)을 정밀하게 판단함으로써 암 면역치료제 효능을 정확하게 예측할 수 있는 정보 제공방법을 제공하는 것이다.
상기의 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (a) 환자에서 분리된 암 시료에 대해 표적유전체 분석을 수행하는 단계; 및 (b) 분석 결과에서 측정된 엡스타인 바 바이러스 (Epstein-Barr Virus, EBV) 리드 수를 수학식 1 내지 3을 이용하여 보정하는 단계를 포함하는, 암 면역치료제 효능 예측을 위한 정보 제공방법을 제공한다.
[수학식 1]
[수학식 2]
이 때, a는 배수성(ploidy)이고, D는 종양세포충실도(tumor purity)이다.
[수학식 3]
상기 암은 위암 (gastric cancer) 또는 비인두암 (nasopharyngeal cancer) 일 수 있다.
상기 표적유전체 분석은 EBV 특이적인 유전자를 검출하는 프로브를 이용하는 것일 수 있다.
상기 프로브는 서열번호1 내지 3 중 선택되는 어느 하나의 유전자를 검출하는 것 일수 있다.
상기 표적유전체 분석은 동일한 환자에서 분리된 암 시료 및 정상 시료를 동시에 분석하는 것 일수 있다.
상기 암 시료는 암 조직 시료 또는 세포진 (cytology) 시료이고, 상기 정상 시료는 정상 혈액 시료 또는 정상 조직 시료일 수 있다.
상기 (b) 단계에서 보정된 EBV 리드 수가 10,000 이상인 경우 EBV 양성 암으로 판정하는 것일 수 있다.
상기 암 면역치료제 효능 예측은, EBV 양성 암 환자는 EBV 음성 암 환자와 비교하여 anti-PD-1 또는 anti-PD-L1 의 단독 또는 병용요법의 면역치료제의 효과가 우수할 것으로 예측하는 것 일수 있다.
상기 (a) 단계의 표적유전체 분석은 동일한 환자에서 분리된 암 시료 및 정상 시료를 대상으로 수행되며, 상기 표적유전체 분석 결과에서 측정된 종양 변이 부담 (observed tumor mutation burden, observed TMB)을 하기 수학식 2, 4 및 5를 이용하여 보정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
[수학식 2]
(이 때, a는 배수성(ploidy)이고, D는 종양세포충실도(tumor purity)임)
[수학식 4]
(상기 Ft 는 상기 수학식 2에 의해 계산됨)
[수학식 5]
상기 보정된 TMB (corrected TMB)가 설정값(기준값) 이하인 경우, low-TMB 암으로 판단하며, 설정값(기준값) 초과인 경우 high-TMB 암으로 판단하며, 상기 high-TMB 암인 경우, anti-PD-1 또는 anti-PD-L1 의 단독 또는 병용요법의 면역치료제의 효과가 우수할 것으로 예측하는 것일 수 있다.
상기 암은 위암이며, 상기 설정값(기준값)은 10/Mb일 수 있다.
본 발명은 암 면역치료제 효능 예측을 위한 정보 제공방법에 관한 것으로, 종양충실도가 낮은 미만형 위암에서 발명자는 위암 조직의 시료의 엡스타인 바 바이러스 (Epstein-Barr Virus, EBV)의 DNA 존재 여부를 알 수 있는 표적유전체 분석방법을 제공하며, 동시에 종양 변이 부담 (tumor mutation burden, TMB)을 정밀하게 결정할 수 있다.
따라서 암 환자에서 TMB 및 EBV와 연관된 anti-PD-1 또는 PD-L1 단독 또는 병용요법의 면역치료제의 효과를 예측하여 유용한 정보를 제공할 수 있다.
특히 EBV DNA가 주변정상세포 보다는 주로 종양세포에 존재하고, 따라서 종양세포충실도 (tumor purity) 에 따라 결과값이 달라질 수 있으므로, 이를 보정하기 위해 배수성과 종양세포 충실도를 검체마다 구하여 EBV DNA 검출시 보정할 수 있게 함으로써 정밀성을 향상시켰다.
본 발명에서는 암의 표적치료제 선택을 위해 별도의 ISH 분석을 고가로 수행하였어야 했던 EBV 진단을 TMB 결정과 한 번에 수행하여 유전자 증폭 (gene amplification) 및 단일염기변이 (single nucleotide variation)가 동시 동정이 가능하여 비용 효율적이다.
도 1은 본 발명을 요약한 것 이다.
본 발명자는 암 시료의 엡스타인 바 바이러스 (Epstein-Barr Virus, EBV) DNA 존재를 보정하여 엡스타인 바 바이러스 양성 여부를 판단하는 표적유전체 분석 알고리즘을 개발하고, 임상에서 본 발명의 알고리즘의 결과와 일치함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
또한, 본 발명은 세포충실도가 낮은 암 생검 시료로부터도 종양 변이 부담 (tumor mutation burden, TMB)을 정밀하게 결정하는 방법을 제공한다.
TMB는 면역치료제 효능과의 관련성이 보고 되고 있는데, 우리나라에 흔한 위암 같은 경우에 있어서는 위암 특유의 세포이질성 (cellular heterogeneity) 의 문제로 TMB 값이 위음성으로 낮게 나올 소지가 있다.
이는 위암 생검 조직의 특성상 종양세포 충실도 (tumor purity) 가 낮은 검체들이 TMB 분석에 있어서 비뚤림 (bias) 을 흔히 초래하는데 연유한다. 이에 한국인 위암 환자들의 실제 조직 검체에서 유래된 표적유전체 데이터를 근거로, 낮은 종양세포충실도로 인한 비뚤림을 보정하여 정밀한 TMB 를 계산하는 알고리즘을 개발하고, 본 발명의 알고리즘으로 보정된 TBM가 기존의 임상과 일치하는 결과를 나타냄을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 암 면역치료제 효능 예측을 위한 정보 제공방법의 알고리즘을 도식화 한 것이다.
도 1을 참조하면 암 시료에서 표적유전체 분석을 수행하고 tumor DNA fraction을 이용하여 EBV 유전자 검출결과(리드 수)를 보정하여 EBV 양성 또는 음성 암을 판단하여 면역치료제를 효과를 예측하며, 동시에 비뚤림 (artifact) 을 보정하여 정밀한 TMB 를 계산하여 high TMB 암 환자에서 면역치료제를 효과가 우수할 것으로 예측하는 알고리즘을 나타내고 있다.
본 발명은 (a) 환자에서 분리된 암 시료에 대해 표적유전체 분석을 수행하는 단계; 및 (b) 분석 결과에서 측정된 엡스타인 바 바이러스 (Epstein-Barr Virus, EBV) 리드 수를 수학식 1 내지 3을 이용하여 보정하는 단계를 포함하는, 암 면역치료제 효능 예측을 위한 정보 제공방법에 관한 것이다.
[수학식 1]
[수학식 2]
이 때, a는 배수성(ploidy)이고, D는 종양세포충실도(tumor purity)이다.
[수학식 3]
본 발명의 실시예에서 종양 세포 위주 (enrich) 로 절제 (macrodissect) 해낸 종양 DNA 200ng 과 혈액 또는 정상조직에서 분리한 정상(normal) DNA 200ng 을 input genomic DNA 로 유전체 분석을 수행하였다.
따라서 본 발명에서 표적유전체 분석은 동일한 환자에서 분리된 암 시료 및 정상 시료를 동시에 분석하는 것일 수 있다.
또한 본 발명에서 암 시료는 암 조직 시료 또는 세포진 (cytology) 시료이고, 정상 시료는 정상 혈액 시료 또는 정상 조직 시료일 수 있다.
상기 시료는 포르말린 (formalin-fixed paraffin-embedded) 시료, 동결 시료 또는 RNA 레이터 (RNA later) 시료가 될 수 있으며, 시료 보존방법에 제한 받지 않는다.
본 발명의 실시예에서, 인체에 존재하지 않으며 EBV 에만 특이적인 DNA 염기서열의 대표적인 MK973062.1 의 (13,501 내지 13,860, 서열번호1) 서열 360bp 을 커버하는 프로브를 이용하여 EBV 유전자를 검출하였다.
따라서, 상기 표적유전체 분석은 EBV 특이적인 유전자를 검출하는 프로브를 이용하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에서 EBV 특이적인 유전자는 서열번호1 내지 3의 유전자에서 선택되는 하나 일 수 있다.
따라서 본 발명의 프로브는 서열번호1 내지 3 중 선택되는 어느 하나의 유전자를 검출하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 위암 환자에서 분리한 시료를 표적유전체 분석하여 EBV 리드 (read) 수를 검출하고, 수학식 1 내지 3으로 보정된 EBV 리드 수가 10,000 이상이 환자가 전통적인 EBV 진단법 (in situ hybridization)과 일치함을 확인하였다.
따라서 상기 (b) 단계에서 보정된 EBV 리드 수가 10,000 이상인 경우 EBV 양성 암으로 판정하는 것일 수 있다.
엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus, EBV) 양성 위암 (gastric cancer) 또는 비인두암 (nasopharyngeal cancer) 환자는 면역 치료제인 anti-PD-1 또는 anti-PD-L1 의 단독 또는 병용요법 효과가 우수한 것으로 알려져 있다 (Kim ST et al. Nat Med. 2018;24(9);1449. Park JC et al. J Clin Oncol 2020;38;15S).
따라서, 상기 면역치료제 효능 예측은, EBV 양성 암 환자는 EBV 음성 암 환자와 비교하여 면역치료제의 효과가 우수할 것으로 예측하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명에서 암은 위암 (gastric cancer) 또는 비인두암 (nasopharyngeal cancer)일수 있다.
또한 본 발명은 상기 (a) 단계의 표적유전체 분석은 동일한 환자에서 분리된 암 시료 및 정상 시료를 대상으로 수행되며, 상기 표적유전체 분석 결과에서 측정된 종양 변이 부담(observed tumor mutation burden, observed TMB)을 하기 수학식 2, 4 및 5를 이용하여 보정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
[수학식 2]
(이때, a는 배수성(ploidy)이고, D는 종양세포충실도(tumor purity)임)
[수학식 4]
(상기 Ft 는 상기 수학식 2에 의해 계산됨)
[수학식 5]
본 발명의 일 실시예에서 현미부수체 (microsatellite, MSI) 불안정 (MSI-High, MSI-H)) 위암 환자 3명과 현미부수체 안정 (MSI 음성) 위암 환자 2명을 대상으로 표적유전체분석 (custom targeted DNA sequencing)을 수행하여, 수학식2, 4 및 5에 따라서 TMB 보정하여 계산하고, high-TMB 또는 low-TMB 여부를 판단하였으며, 분석결과, 이에 capillary PCR 을 이용한 Bethesda panel의 MSI testing 결과와 비교하여 보정된 TMB 판정 결과가 일치함을 확인하였다.
폐암이나 악성 흑색종 등에서는 high-TMB tumor 의 기준은 20/Mb 이상, low-TMB tumor 의 기준은 8/Mb 이하로 하는 경우가 많으며, 위암 TCGA 연구상으로는 whole exome sequencing 상, 과돌연변이 위암 (hypermutated gastric cancer)의 기준이 TMB > 11.6/Mb 으로 되어 있다. 따라서 보정된 TMB (corrected TMB) 값이 10/Mb 이하인 경우, low-TMB tumor로 진단하였으며, 10/Mb 초과인 경우, high-TMB tumor 으로 진단하였다.
따라서 본 발명의 제공방법은 상기 보정된 TMB (corrected TMB)가 설정값(기준값) 이하인 경우, low-TMB 암으로 판단하며, 설정값(기준값) 초과인 경우 high-TMB 암으로 판단하며, 상기 high-TMB 암인 경우, anti-PD-1 또는 anti-PD-L1 의 단독 또는 병용요법의 면역치료제의 효과가 우수할 것으로 예측하는 것 것 일수 있다.
상기 암은 위암이며, 상기 설정값(기준값)은 10/Mb인 것을 특징할 수 있다.
그러나 본 발명에서 상기 설정값(기준값)은 위암에서 10/Mb 기준으로 low-TMB 암 또는 high-TMB 암를 구분하는 방법에만 국한되지는 않으며, 임상의 판단에 따라 다양한 기준이 적용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[실시예1] 표적유전체분석법 및 배수성/종양세포충실도 보정을 이용한 EBV 진단
혼성화 프로브(Hybridization probe)는 120-bp SureSelect hybridization probe (Agilent) 로 human probe와 EBV probe 를 혼합하였다.
이 중에서 human probe 는 4.208 Mb 의 커버리지를 가지도록 되어 있다. 이는 286 개 유전자에 대한 1.377Mb coding sequence 와, 1Mb-copy number resolution OneSeq backbone (2.7Mb, Agilent) 을 위주로 하는 noncoding sequence 로 구성되어 있다.
EBV 프로브 (probe)는 인체에 존재하지 않으며 EBV 에만 특이적인 DNA 염기서열(서열번호1 내지 3)을 검출하는 프로브를 사용할 수 있다(표 1).
본 실시예에서는 서열번호1의 서열 360bp 를 cover 하는 EBV 프로브를 이용하여 분석을 수행하였다.
유전자명 염기서열
MK973062.113,501 내지 13,860
(서열번호1) 		TCCCATGTAAGCCTGCCTCGAGTAGGTGCCTCCAGAGCCCCTTTTGCCCCCCTGGCGGCCCAGCCCGACCCCCGGGCGCCCCCAAACGTTGTCCAGATGTCCAGGGGTCCCCGAGGGCGAGGCCCAGCCCCCTCCCTCCCCTGTCCACTGCCCCGGTCCCCCCAGAAGCCCCCAAAAGTAGAGGCTCAGGCCATGCGCGCCCTGTCACCAGGCCTGCCAAAGAGCCAGATCTAAGGCCAGGAGAGGCAGCCCCAAAGCGGGTGCAGTAACAGGTAATCTCTGGTAGTGATTTGGACCCGAAATCTGACACTTTAGAGCTCTGGAGGACTTTAAAACTCTAAAAATCAAAACTTTAGAGGC
AY961628.313,753 내지 14,112
(서열번호2) 		TCCCATGTAAGCCTGCCTCGAGTAGGTGCCTCCAGAGCCCCTTTTGCCCCCCTGGCGGCCCAGCCCGACCCCCGGGCGCCCCCAAACTTTGTCCAGATGTCCAGGGGTCCCCGAGGGCGAGGCCCAGCCCCCTCCCACCCCTGTCCACTGCCCCGGTCCCCCCAGAAGCCCCCAAAAGTAGAGGCTCAGGCCATGCGCGCCCTGTCACCAGGCCTGCCAAAGAGCCAGATCTAAGGCCAGGAGAGGCAGCCCCAAAGCGGGTGCAGTAACAGGTAATCTCTGGTAGTGATTTGGACCCGAAATCTGACACTTTAGAGCTCTGGAGGACTTTAAAACTCTAAAAATCAAAACTTTAGAGGC
NC_007605.1/AJ507799.213,718 내지14,077
(서열번호3) 		TCCCATGTAAGCCTGCCTCGAGTAGGTGCCTCCAGAGCCCCTTTTGCCCCCCTGGCGGCCCAGCCCGACCCCCGGGCGCCCCCAAACTTTGTCCAGATGTCCAGGGGTCCCCGAGGGTGAGGCCCAGCCCCCTCCCGCCCCTGTCCACTGCCCCGGTCCCCCCAGAAGCCCCCAAAAGTAGAGGCTCAGGCCATGCGCGCCCTGTCACCAGGCCTGCCAAAGAGCCAGATCTAAGGCCGGGAGAGGCAGCCCCAAAGCGGGTGCAGTAACAGGTAATCTCTGGTAGTGATTTGGACCCGAAATCTGACACTTTAGAGCTCTGGAGGACTTTAAAACTCTAAAAATCAAAACTTTAGAGGC
종양 세포 위주 (enrich) 로 절제 (macrodissect) 해낸 종양 DNA 200ng 과 혈액 또는 정상조직에서 분리한 정상(normal) DNA 200ng 을 input genomic DNA 로 사용하였다.
Agilent 프로토콜에 따라 DNA 시료를 초음파분쇄기 (ultrasonicator)로 랜덤 절편화(random fragmentation)한 후 barcode and adaptor ligation, library amplification 과정을 진행하였다. Illumina NovaSeq platform 으로 수행하여 150-bp paired-end reads 로 raw data 를 생산하였다. Raw fastq 는 hg19 fasta file 에 EBV 게놈 (genome, MK973062.1) fasta 를 결합한 custom fasta file 에 fastqc, cutadapt, BWA, picard, GATK 등으로 맵핑 (mapping) 한다.
이와 같이 MK973062.1 (13,501 -13,860) 서열 360bp 을 targeted DNA sequencing 의 probe 로 이용하여 표적유전체 분석을 수행하면 아래 5 loci (1.8kb) 의 EBV 게놈서열 리드 (read) 를 읽을 수 있다
MK973062.1: 13,501 -13,860
MK973062.1: 16,574 -16,933
MK973062.1: 19,647 - 20,006
MK973062.1: 22,720 -23,079
MK973062.1: 25,793 - 26,152
이 때 mapping 하는 reference fasta file 은 UCSC genomic browser 에서 다운로드된 hg19 fasta file 에 EBV genome (MK973062.1) fasta 를 결합한 custom fasta file 을 이용한다. Raw NGS data 를 fastqc, cutadapt, BWA, picard, GATK 등으로 mapping 하여 recalibrated BAM file 을 만든다. 여러 방법이 가능하나, 대표적으로 해당 BAM file 을 samtools view filename.bam | awk ' $3=="MK973062.1" ' | wc - l 명령어로 EBV read 를 구한다. 정규화 (normalization) 를 위해 total read count 를 구한다 (여러 방법이 가능하나 대표적으로 samtools view filename.bam | wc - l 명령어 사용). 배수성(ploidy)과 종양세포충실도(tumor purity) 계산은, 여러 방법이 가능하나 대표적으로 pureCN 등의 알고리즘을 사용한다.
이후 하기 수학식 1 내지 3을 이용하여 EBV 리드 수 (read count)를 보정하였다.
[수학식 1]
[수학식 2]
(이때, a는 배수성(ploidy)이고, D는 종양세포충실도(tumor purity)임)
[수학식 3]
최종적으로 보정된 EBV 리드 수(corrected EBV read count) 10,000 이상(≥ 10,000) 인 검체에 대해 EBV 양성으로 진단하였다.
EBV 양성 위암 환자 3명과 음성 위암 환자 2명을 대상으로 표적유전체 분석 (custom targeted DNA sequencing)을 수행하여, 수학식 1 내지 3에 따라서 EBV 리드 수를 보정하여 계산하고, EBV 양성 여부를 진단하였다. 또한 동일한 환자에서 전통적인 EBV 진단방법을 이용한 결과와 비교검증 하였다.
본 발명의 Targeted DNA sequencing 및 수학식 1 내지 3을 이용하여 보정한 EBV 진단 결과가 전통적인 EBV 진단법 (in situ hybridization)과 일치하는 것을 확인하였는바, 본 발명의 방법을 이용하여 위암 환자에서 EBV 진단에 활용 가능하다(표 2).
환자1 환자2 환자3 환자4 환자5
전체 read 개수 31,117,800 35,645,238 35,160,087 32,833,315 17,044,679
EBV read 개수 924,996 171,574 212,555 204 159
Purity (a) 0.47 0.22 0.26 0.32 0.85
ploidy (D) 2.06316 2.067 3.0437 2.087529809 2.344309351
Tumor DNA fraction 0.47775 0.22 0.3484 0.33 0.87
Corrected EBV read count 1,866,600 656,369 520,552 564 322
전통적인 EBV 진단 양성 양성 양성 음성 음성
알고리즘이용한
EBV 진단 		양성 양성 양성 음성 음성
[실시예2] 표적유전체분석법 및 배수성/종양세포충실도 보정을 이용한 종양 변이 부담 (tumor mutation burden, TMB) 계산
한국인 위암 동결조직 및 동일한 환자의 주변 정상 (adjacent normal) 위조직에 대해 표적유전체분석 (custom targeted DNA sequencing) 을 120-bp SureSelect hybridization probe (Agilent) 로 아래와 같이 수행하였다. 프로브는 총 4.208Mb 의 human probe 커버리지를 가지도록 되어 있다. 코딩 시퀸스 프로브 (coding sequence probe)는 286 개 유전자에 대해 1.377Mb 로서, 10 개 유전자 (EGFR, ERBB2, FGFR2, CCND1, MET 등)의 코딩 영역 (coding region)에 대한 타일링 프로브 (tiling probe) 402 개 (39,332 bp) 를 포함한다. 논코딩 시퀸스 프로브 (noncoding sequence) 는 1Mb-copy number resolution OneSeq backbone (2.7Mb, Agilent) 를 포함한다.
종양 세포 위주 (enrich) 로 절제 (macrodissect) 해낸 종양 DNA 200ng 과 혈액 또는 정상조직에서 분리한 정상 (normal) DNA 200ng 을 input genomic DNA 로 사용하였다.
Agilent 프로토콜에 따라 DNA 시료를 초음파분쇄기 (ultrasonicator)로 랜덤 절편화 (random fragmentation)한 후 barcode 및 adaptor ligation, library amplification 진행하였다. Illumina NovaSeq platform 으로 150-bp paired-end reads 로 raw data 를 생산하였다. Raw NGS data 는 BWA 로 맵핑(mapping) 하였으며, GATK 로 process 하되, MuTect v1.4 의 default setting 을 사용하여 somatic calling 하였고, 이를 Snpeff 로 vcf file 을 annotate 하여 단백질 코딩 영역(protein-coding region)의 nonsynonymous missense/nonsense mutation 과 splice site mutation 을 call 하여 전체 코딩 영역 변이(coding region mutation) 개수를 구하였다. 이를 coding sequence coverage (1.377Mb) 로 나누어 측정된 TMB (observed TMB)를 계산하였다. 이 때 UTR, intergenic region, 인트론의 somatic variation 은 제외하였다.
그러나 본 발명에서의 observed TMB 계산법이 상기 방법에만 국한되는 것은 아니다.
종양 충실도와 배수성 (purity/ploidy)을 이용하여 하기 수학식 4에 따라 교정지수 c (correction coefficient)를 계산하였다. 종양 충실도와 배수성 계산은, 여러 방법이 가능하나 대표적으로 pureCN 등의 알고리즘을 사용하였다.
하기 수학식 5와 같이 관찰된 TMB (observed TMB)에 교정지수 c 에 곱하여 보정된 TMB (corrected TMB) 를 계산하였다.
[수학식 4]
상기 Ft 는 수학식 2에 의해 계산된 tumor DNA fraction이다.
[수학식 5]
폐암이나 악성 흑색종 등에서는 high-TMB tumor 의 기준은 20/Mb 이상, low-TMB tumor 의 기준은 8/Mb 이하로 하는 것이 일반적이며, 위암 TCGA 연구상으로는 whole exome sequencing 상, 과돌연변이 위암 (hypermutated gastric cancer)는 TMB > 11.6/Mb 으로 정의되어 있다.
따라서 본 발명에서는, 보정된 TMB (corrected TMB) 값이 10/Mb 이하인 경우를 low-TMB 암(tumor)으로 진단하였으며, 10/Mb 초과인 경우를 high-TMB로 진단하였다.
MSI-H 위암 환자 3명과 MSI 없음 위암 환자 2명을 대상으로 표적유전체분석 (custom targeted DNA sequencing)을 수행하여, 수학식 2, 4 및 5에 따라서 TMB 보정하여 계산하고, high-TMB 또는 low-TMB 여부를 진단하였다.
capillary PCR 을 이용한 Bethesda panel 의 MSI 검사 결과상 MSI-H (현미부수체 불안정)으로 나오는 위암이, 대표적인 high-TMB 위암이라는 것이, TCGA 데이터를 비롯한 모든 문헌에 보고되어있다 (Nature 2014,513;202). 따라서 현미부수체 불안정 (MSI 양성, MSI-H) 을 전통적인 양성 표준 (gold standard positive control) 로 하여 본 발명의 예측력을 검토하였다.
분석결과, high-TMB 진단 결과가 MSI 테스트 결과와 일치하는 것을 확인하였는바, 본 발명의 방법을 이용하여 위암 환자에서 high-TMB 또는 low-TMB 진단에 활용 가능하다(표 3).
환자6 환자7 환자8 환자9 환자10
purity (a) 0.21 0.34 0.77 0.41 0.5
ploidy (D) 2.13 2.036 1.98 2.13 1.93
교정지수 c 1.6768 1.399 1.0758 1.296 1.2346
observed TMB 52.39/Mb 32.42/Mb 17.77/Mb 7.26/Mb 2.9/Mb
corrected TMB 87.85/Mb 45.35/Mb 19.11/Mb 9.41/Mb 3.59/Mb
알고리즘이용한
TMB 진단 		high-TMB tumor high-TMB tumor high-TMB tumor low-TMB tumor low-TMB tumor
현미부수체(MSI) 검사 MSI-H (불안정) MSI-H
(불안정)		 MSI-H
(불안정)		 MSI 없음
(안정)		 MSI 없음
(안정)
<110> NATIONAL CANCER CENTER <120> Novel targeted sequencing method to identify EBV and purity/ploidy-corrected tumor mutation burden in cancer <130> DP20200285 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 360 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epstein Barr Virus <400> 1 tcccatgtaa gcctgcctcg agtaggtgcc tccagagccc cttttgcccc cctggcggcc 60 cagcccgacc cccgggcgcc cccaaacgtt gtccagatgt ccaggggtcc ccgagggcga 120 ggcccagccc cctccctccc ctgtccactg ccccggtccc cccagaagcc cccaaaagta 180 gaggctcagg ccatgcgcgc cctgtcacca ggcctgccaa agagccagat ctaaggccag 240 gagaggcagc cccaaagcgg gtgcagtaac aggtaatctc tggtagtgat ttggacccga 300 aatctgacac tttagagctc tggaggactt taaaactcta aaaatcaaaa ctttagaggc 360 360 <210> 2 <211> 360 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epstein Barr Virus <400> 2 tcccatgtaa gcctgcctcg agtaggtgcc tccagagccc cttttgcccc cctggcggcc 60 cagcccgacc cccgggcgcc cccaaacttt gtccagatgt ccaggggtcc ccgagggcga 120 ggcccagccc cctcccaccc ctgtccactg ccccggtccc cccagaagcc cccaaaagta 180 gaggctcagg ccatgcgcgc cctgtcacca ggcctgccaa agagccagat ctaaggccag 240 gagaggcagc cccaaagcgg gtgcagtaac aggtaatctc tggtagtgat ttggacccga 300 aatctgacac tttagagctc tggaggactt taaaactcta aaaatcaaaa ctttagaggc 360 360 <210> 3 <211> 360 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Epstein Barr Virus <400> 3 tcccatgtaa gcctgcctcg agtaggtgcc tccagagccc cttttgcccc cctggcggcc 60 cagcccgacc cccgggcgcc cccaaacttt gtccagatgt ccaggggtcc ccgagggtga 120 ggcccagccc cctcccgccc ctgtccactg ccccggtccc cccagaagcc cccaaaagta 180 gaggctcagg ccatgcgcgc cctgtcacca ggcctgccaa agagccagat ctaaggccgg 240 gagaggcagc cccaaagcgg gtgcagtaac aggtaatctc tggtagtgat ttggacccga 300 aatctgacac tttagagctc tggaggactt taaaactcta aaaatcaaaa ctttagaggc 360 360

Claims (11)

  1. (a) 환자에서 분리된 위암 시료에 대해 표적유전체 분석을 수행하는 단계; 및
    (b) 분석 결과에서 측정된 엡스타인 바 바이러스 (Epstein-Barr Virus, EBV) 리드 수를 수학식 1 내지 3을 이용하여 보정하는 단계; 및
    (c) 보정된 리드 수에 따라 위암 면역치료제 효능을 예측하는 단계;를 포함하는,
    위암 면역치료제 효능 예측을 위한 정보 제공방법.
    [수학식 1]

    [수학식 2]

    (이 때, a는 배수성 (ploidy)이고, D는 종양세포충실도 (tumor purity)임)
    [수학식 3]
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 표적유전체 분석은 EBV 특이적인 유전자를 검출하는 프로브를 이용하는 것을 특징으로 하는, 정보 제공방법.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 프로브는 서열번호1 내지 3 중 선택되는 어느 하나의 유전자를 검출하는 것을 특징으로 하는, 정보 제공방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 표적유전체 분석은 동일한 환자에서 분리된 위암 시료 및 정상 시료를 동시에 분석하는 것을 특징으로 하는, 정보 제공방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 위암 시료는 위암 조직 시료 또는 세포진 (cytology) 시료이고, 상기 정상 시료는 정상 혈액 시료 또는 정상 조직 시료인 것을 특징으로 하는, 정보 제공방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 보정된 EBV 리드 수가 10,000 이상인 경우 EBV 양성 위암으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 정보 제공방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 면역치료제 효능 예측은, EBV 양성 위암 환자는 EBV 음성 위암 환자와 비교하여 anti-PD-1 또는 anti-PD-L1의 단독 또는 병용요법의 면역치료제의 효과가 우수할 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 정보 제공방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 (a) 단계의 표적유전체 분석은 동일한 환자에서 분리된 위암 시료 및 정상 시료를 대상으로 수행되며,
    상기 표적유전체 분석 결과에서 측정된 종양 변이 부담 (observed tumor mutation burden, observed TMB)을 하기 수학식 2, 4 및 5를 이용하여 보정하는 단계를 더 포함하고, 보정된 TMB (corrected TMB)에 따라 위암 면역치료제 효능을 예측하는 단계를 포함하는, 정보 제공방법.
    [수학식 2]

    (이 때, a는 배수성 (ploidy)이고, D는 종양세포충실도 (tumor purity)임)
    [수학식 4]

    (상기 Ft 는 상기 수학식 2에 의해 계산됨)
    [수학식 5]
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 보정된 TMB (corrected TMB)가 설정값(기준값) 이하인 경우, low-TMB 위암으로 판단하며, 설정값(기준값) 초과인 경우 high-TMB 위암으로 판단하며, 상기 high-TMB 위암인 경우, anti-PD-1 또는 anti-PD-L1 의 단독 또는 병용요법의 면역치료제의 효과가 우수할 것으로 예측하는 것을 특징으로 하는, 정보 제공방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 설정값(기준값)은 10/Mb인 것을 특징으로 하는, 정보 제공방법.
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