KR102587810B1 - 인터-알파 억제제 단백질을 정량화하는 방법 - Google Patents

인터-알파 억제제 단백질을 정량화하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102587810B1
KR102587810B1 KR1020197034223A KR20197034223A KR102587810B1 KR 102587810 B1 KR102587810 B1 KR 102587810B1 KR 1020197034223 A KR1020197034223 A KR 1020197034223A KR 20197034223 A KR20197034223 A KR 20197034223A KR 102587810 B1 KR102587810 B1 KR 102587810B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
delete delete
iaip
sample
subject
ligand
Prior art date
Application number
KR1020197034223A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20200010262A (ko
Inventor
야우-핀 림
데니스 스페로
Original Assignee
프로테라 바이오로직스, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 프로테라 바이오로직스, 인크. filed Critical 프로테라 바이오로직스, 인크.
Publication of KR20200010262A publication Critical patent/KR20200010262A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102587810B1 publication Critical patent/KR102587810B1/ko

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/55—Protease inhibitors
    • A61K38/57—Protease inhibitors from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/38—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against protease inhibitors of peptide structure
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity
    • G01N2333/4704—Inhibitors; Supressors
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7095—Inflammation

Abstract

IAIP 리간드-기반 검정을 사용하여 (예를 들어, 대상체로부터) 샘플 내 IAIP 수준을 정량화하는 방법이 본 명세서에 기재된다.IAIP-IAIP 리간드 복합체를 측정하는 방법 및 상기 언급된 IAIP 정량화 방법을 사용하여 대상체를 평가하고, 모니터링하고, 그리고 치료하는 방법이 또한 개시된다.

Description

인터-알파 억제제 단백질을 정량화하는 방법
IAIP (인터 알파 억제제 단백질)는 모든 포유동물의 혈액에서 고농도로 순환하는 자연 발생하는 면역조절 혈장 단백질의 계열이다. IAIP는 간에서 주로 생산되어, 혈액으로 방출되고 서브유닛 (비쿠닌)은 소변에서 배출된다. IAIP는 염증을 조절하는데 중요한 역할을 한다. 이들은 감염, 트라우마, 및 손상에 의해 야기된 심각한 염증에 대해 광범위한 보호성 효과를 가지고, 중요하게는, 본 IAIP의 보호성 효과는 원인이 되는 미생물제 또는 촉발제와 독립적이다. 이 계열의 구성원은 글리코사미노글리칸에 의해 공유결합된 무거운 및 가벼운 폴리펩타이드 서브유닛으로 구성된다. IAIP는 2개의 중쇄 (H1 & H2) 및 단일 경쇄 (L)로 구성된 250 kDa 분자인, 인터-알파-억제제 (IαI), 및 프리-알파-억제제 (PαI), 인 하나의 중쇄 (H3) 및 하나의 경쇄 (L)로 구성된 125 kDa 분자로 생체내에서 발견될 수 있다.
신체가 손상 또는 감염 도중에 유발된 것과 같은 염증성 신호를 발생할 때, IAIP는 조직 안으로 이동하고 염증의 부위에 직접적으로 도달한다. IAIP의 중쇄는 염증성 캐스케이드의 일부인 단백질에 결합함에 의해 항-염증 반응을 향상시킨다. 또한, 중쇄가 절단될 때, 그것의 연관된 GAG를 갖는 경쇄 (그것의 2개의 쿠니츠 도메인으로 인해 비쿠닌으로 명명됨)가 방출되고 경쇄의 세린 프로테아제 억제 활성이 활성화된다. 비쿠닌은 세린 프로테아제 예컨대 트립신, 엘라스타제, 플라스민, 카텝신 G, 및 푸린의 활성을 억제한다. IAIP는 다중 기전을 통해 그것의 항-염증성 효과를 발휘한다. 이들은 보체 및 세포외 히스톤 (손상 신호)과 같은 염증을 증폭시키고 따라서 염증 과정을 약화시키는 단백질에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 중쇄를 통해, IAIP는 추가의 세포 매트릭스 (ECM) 단백질에 결합할 수 있고 시험관내 및 생체내 모델 둘 모두에서 손상 후 폐 상피성 회복을 증진하는 것으로 밝혀졌다. IAIP는 또한 다중 생체내 모델에서 염증성 사이토카인, 예컨대 TNF-α 및 IL-6을 하향 조절하는 것으로 나타났다. 비쿠닌-결핍된 (및 따라서 IAIP 결핍된) 마우스는 줄어든 세포 유착의 염증성 마커, VCAM-1 및 ICAM-1을 갖는 것으로 밝혀졌다.
건강한 개체에서, 혈액에 순환하는 IAIP의 양은 상대적으로 높다 (400-800 mg/L). 그러나, IAIP 수준은 신생 및 성인 환자에서 전신 염증/패혈증 동안 빠르게 감소하고 (Baek YW, 등 J Pediatr.2003; 143:11-15; Lim YP, 등 J Infect Dis. 2003; 188:919-926 및 Opal SM, 등 Crit Care Med. 2007; 35:387-392), 그리고 IAIP의 줄어든 수준은 질환 진행과 강하게 상관되는 것으로 밝혀졌다. 질환이 보다 진전되고 생명을 위협하는 단계로 진행함에 따라, IAIP 수준이 급격히 떨어져, IAIP가 임상의가 질환 진행을 모니터링하고 질환 예컨대 중증 염증성 질환 예컨대 중증 폐렴, 패혈증 및 연관된 장기 손상, NEC, 상처 치유, 화상, 암, 뇌졸중, 알츠하이머병, 간질 및 기타에 대해 잘 아는 치료 결정을 내리는데 도움이 되는 예후 및 치료적 지표로서 임상적 유용성을 가짐을 시사한다.
표준화된 경쟁적 IAIP 면역검정은 박테리아 및 바이러스성 감염에 따른 전신 염증이 있는 환자로부터의 과잉 혈액 샘플에서 IAIP를 측정하기 위해 사용되었다. 경쟁적 IAIP 면역검정은 경쇄 만 검출하는 IAIP의 척도를 제공하고, 따라서 온전한 IAIP 및 절단된 비쿠닌이 이 검정에서 검출된다. 경쟁적 검정은 그것의 항-염증성 및 조직 회복 특성에 매우 중요한 IAIP의 다른 결정적인 부분; 즉 중쇄 및 글리코사미노글리칸을 탐지하지 못한다. 따라서, 경쟁적 IAIP 면역검정은 환자 샘플에서 활성 IAIP의 평가에 제한이 있다. 신체의 타고난 보호성 면역 방어의 중요한 성분으로서 IAIP의 중요성과 예후 바이오마커로서의 그것의 잠재적 사용을 고려할 때, IAIP를 정량적으로 측정하기 위한 개선된 방법에 대한 필요성이 존재한다. 이상적인 검정은 완전한 분자를 포착하기 위해 경쇄 및 중쇄 서브유닛 둘 모두를 측정할 것이다.
본 발명은 IAIP에 결합하여 이를 검출하는 제제 (예를 들어, 온전한 IAIP, IAIP의 중쇄, 또는 IAIP의 글리코사미노글리칸 (GAG)에 결합하는 제제)로 직접적인 검출을 통해 대상체로부터의 샘플에서 IAIP를 정량화하는 방법을 제공한다. 정량화의 방법은 대상체를 평가, 진단, 치료 또는 모니터링하거나, 또는 대상체에서의 질환 중증도 또는 치료 효능을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 본 명세서에서 기재된 방법에 따라 IAIP를 정량화하는데 사용될 수 있는 키트를 특징으로 한다.
제1 양태에서, 특징은 하기 단계에 의해 대상체로부터의 샘플에서 인터-알파 억제제 단백질 (IAIP)을 정량화하는 방법이다: a) 샘플을 결합제와 접촉시켜 IAIP-결합제 복합체를 생성하는 단계로, 여기서 상기 결합제는 지지체에 결합되는, 단계; b) 상기 IAIP-결합제 복합체를 검출제와 접촉시키는 단계; 및 c) 다음에 결합된 상기 검출제의 양을 검출하는 단계: IAIP-결합제 복합체로 샘플 내 IAIP를 정량화하는 단계.
일부 구현예에서, IAIP는 온전한 IAIP이다.
일부 구현예에서, 결합제는 IAIP에 결합하는 IAIP 리간드이다. 일부 구현예에서, 결합제는 IAIP에 특이적으로 결합하는 항체이다.
일부 구현예에서, 검출제는 또는 IAIP 리간드를 함유한다. 일부 구현예에서, 검출제는 하기를 추가로 함유한다: 하기에 결합하는 항체: IAIP 리간드 검출제 (예를 들어, IAIP 리간드). 일부 구현예에서, 검출제는 하기에 특이적으로 결합하는 항체이다: IAIP.예를 들어, 특정 구현예에서, 결합제는 IAIP에 특이적으로 결합하는 항체 (예를 들어, MAb 69.26 또는 MAb 69.31)이고 검출제는 IAIP에 결합하는 IAIP 리간드 (예를 들어, 헤파린, 하이알루론산, 내독소 (LPS), 또는 히스톤)이거나 이를 함유한다. 다른 구현예에서, 본 결합제는 IAIP에 결합하는 IAIP 리간드 (예를 들어, 헤파린, 하이알루론산, LPS, 또는 히스톤)이고 본 검출제는 하기에 특이적으로 결합하는 항체이다: IAIP (예를 들어, MAb 69.26 또는 MAb 69.31).
일부 구현예에서, 본 IAIP는 IAIP-IAIP 리간드 복합체 내에 있다.
일부 구현예에서, 본 결합제는 IAIP에 결합하는 IAIP 리간드이다. 일부 구현예에서, IAIP-IAIP 리간드 복합체의 IAIP 리간드는 결합제와 상이하다. 일부 구현예에서, 본 결합제는 하기에 결합하는 항체이다: IAIP-IAIP 리간드 복합체의 IAIP 리간드. 일부 구현예에서, 본 결합제는 하기에 특이적으로 결합하는 항체이다: IAIP-IAIP 리간드 복합체의 IAIP.
일부 구현예에서, 검출제는 IAIP에 결합하는 IAIP 리간드를 함유한다. 일부 구현예에서, 검출제는 IAIP 리간드 검출제에 결합하는 항체를 추가로 함유한다. 일부 구현예에서, IAIP 리간드로 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 것은 하기의 것과 상이하다: IAIP 리간드 검출제. 일부 구현예에서, 본 검출제는 하기에 결합하는 항체이다: IAIP-IAIP 리간드 복합체의 IAIP 리간드. 일부 구현예에서, 본 검출제는 하기에 특이적으로 결합하는 항체이다: IAIP로 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 것.
일부 구현예에서, 항체는 단클론성 항체이다. 일부 구현예에서, 항체는 MAb 69.26 또는 MAb 69.31이다.
일부 구현예에서, IAIP 리간드는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 내독소 (LPS), 헤파린, 히스톤, 하이알루론산, 빈트로넥틴, 파이브로넥틴, 라미닌, 테나스신 C, 아그레칸, 폰빌레브란트 인자, 펜트락신-3 (PTX3), TNF-자극된 유전자-6 (TSG-6), 인자 IX, 보체 성분, 인자 XIIIa, 및 조직 트랜스루타미나제. 일부 구현예에서, 상기 보체 성분은 C1q, C2, C3, C4, C5, C6, C8, 프로페르딘, 또는 인자 D이다.
일부 구현예에서, 검출제는 표지를 함유한다. 일부 구현예에서, 상기 표지는 바이오틴, 효소, 효소 기질, 방사선표지, 발광성 화합물, 콜로이드성 금, 입자, 또는 형광 염료이다.
일부 구현예에서, 상기 지지체는 플레이트, 입자, 나노입자, 수지, 막, 바이오칩, 컨테이너, 테스트 스트립, 또는 비드이다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 추가로 단계 a)와 b) 사이에 세정 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 추가로 단계 b)와 c) 사이에 세정 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 추가로 단계 a) 또는 단계 b) 이전에 차단 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 단계 a) 및/또는 b)에서의 접촉은 약 7.0 내지 약 3.5의 pH에서 수행된다. 일부 구현예에서, pH는 약 5.0 내지 약 3.5이다. 일부 구현예에서, pH는 약 4.0이다.
일부 구현예에서, 샘플은 유체이다. 일부 구현예에서, 유체는 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액, 활막 유체, 양수, 간질액, 여포성 유체, 복막 유체, 기관지폐포 세척 유체, 모유, 가래, 림프, 담즙, 또는 조직 균질물이다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 인간 대상체이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 염증성 질환 또는 병태 또는 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 것으로 확인되었다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 염증성 질환 또는 병태 또는 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 것으로 확인되지 않았다. 일부 구현예에서, 본 방법은 상기 대상체가 염증성 질환 또는 병태 또는 감염이 있거나 또는 그 위험에 있는 것으로 진단 전, 후 또는 그와 동반하여 수행된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 염증성 질환 또는 병태 또는 감염에 대해 상기 대상체의 치료와 실질적으로 동반하여 수행된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 염증성 질환 또는 병태 또는 감염에 대해 상기 대상체의 치료 이전에 수행된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 염증성 질환 또는 병태 또는 감염에 대해 상기 대상체의 치료 이후에 수행된다.
일부 구현예에서, 염증성 질환 또는 병태는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 패혈증, 패혈성 쇼크, 멸균 패혈증, 트라우마, 손상, 뇌졸중, 급성 염증성 질환, SIRS, 급성 폐 손상, ARDS, 폐렴, 괴사성 전장염, 급성 췌장염, 신장 질환, 급성 신장 손상, 간 손상, 급성 순환부전, 자간전증, 암, 암 전이, 종양 침습, 주변 동맥 질환, 1형 또는 2형 당뇨병, 죽상경화성 심혈관 질환, 간헐적 파행, 치명적 사지 허혈성 질환, 심근경색증, 경동맥 폐색, 탯줄 폐색, 저 체중 출산, 미성숙한 출산, 수술-유도된 염증, 농양-유도된 염증, 다발성 경화증, 폐 결핍, 말초 신경병증, 저 산소 허혈, 박테리아 감염, 상처, 화상, 열상, 타박상, 골절, 수술 과정, 조직 허혈, 류마티스성 관절염, 수막염, 염증성 장 질환, 만성적 폐쇄성 폐 질환, 비염, 조기 분만, 또는 감염성 질환.
일부 구현예에서, 본 감염은 하기에 의해 야기된다: 그람 음성 박테리아, 예컨대 나이세리아 종으로 하기를 포함함; 나이세리아 고노르호아에 및 나이세리아 메닌기티디스, 브란하멜라 종으로 하기를 포함함; 브란하멜라 카타르할리스, 에스케리치아 종으로 하기를 포함함; 에스케리치아 콜라이 , 엔테로박터 종, 프로테우스 종으로 하기를 포함함; 프로테우스 미라빌리스, 슈도모나스 종으로 하기를 포함함; 슈도모나스 에어루기노사 , 슈도모나스 말레이, 및 슈도모나스 슈포말레이 , 클렙시엘라 종으로 하기를 포함함; 클렙시엘라 뉴모니아에 , 살모넬라 종, 시겔라 종, 세라티아 종, 아시네토박터 종; 헤모필루스 종으로 하기를 포함함; 헤모필루스 인플루엔자 및 헤모필루스 두크레이, 브루셀라 종, 예르시니아 종으로 종으로 하기를 포함함; 예르시니아 페스티스 및 예르시니아 엔테로콜리티카 , 프란시셀라 종으로 하기를 포함함; 프란시셀라 툴라렌시스 , 파스투렐라 종으로 하기를 포함함; 파스튜렐라 멀토시다 , 비브리오 콜레라에, 플라보박테리움 종, 메닝고셉티쿰 , 캄필로박터 종으로 하기를 포함함; 캄필로박터 제주니, 박테로이데스 종 (경구, 인두)으로 하기를 포함함; 박테로이데스 프라길리스 , 푸소박테리움 종으로 하기를 포함함; 푸소박테리움 뉴클레아툼 , 칼림마토박테리움 그라눌라마티스 , 스트렙토바실러스 종으로 하기를 포함함; 스트렙토바실러스 모닐리포르미스 , 및 레지오넬라 종으로 하기를 포함함; 레지오넬라 뉴모필라.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 신생아, 아동, 청소년, 또는 성인이다.
일부 구현예에서, 본 방법은 년간 1회 이상 수행된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 월간 1회 이상 수행된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 주당 1회 이상 수행된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 일당 1회 이상 수행된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 시간당 1회 이상 수행된다.
일부 구현예에서, 본 방법은 적어도 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 5회, 또는 적어도 10회 수행된다.
일부 구현예에서, 본 방법은 추가로 상기 대상체에게 IAIP 또는 치료제를 포함하는 치료를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 200 μg/mL 이하의 IAIP 농도를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 대상체로부터의 샘플은 참조 샘플에 비하여 상승된 수준의 IAIP-IAIP 리간드 복합체를 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 염증성 질환 또는 병태 또는 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 대상체에게 IAIP 및 치료제를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 치료제는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 항생제, 항바이러스제, 항진균제, 항기생충제, 항-염증제, 항암제, 항-응고제, 면역조절 제제, 기관지확장제 제제, 보체 억제제, 혈관승압제, 진정제, 또는 기계적 환기.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 적어도 1일 동안 앓았다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 적어도 1 주 동안 앓았다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 적어도 1개월 동안 앓았다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 적어도 1년 동안 앓았다.
일부 구현예에서, 본 방법은 하기에 대한 것이다: a) 대상체의 건강 상황을 평가하는 것; b) 대상체의 건강 상황을 모니터링하는 것; c) 상기 대상체가 염증성 질환 또는 병태 또는 감염이 있거나 또는 그 위험에 있는 것으로 진단하는 것; d) 상기 대상체에게 투여된 치료의 효능을 평가하는 것; 또는 e) 상기 대상체에서 질환 중증도를 평가하는 것.
일부 구현예에서, 본 방법은 샘플에서 검출된 IAIP 및/또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 양을 정상 대상체로부터의 샘플에서 발견된 IAIP 및/또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 양 또는 컷오프 값과 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 정상 대상체로부터의 샘플에서 IAIP의 양보다 또는 컷오프 값에 비해 작은 샘플에서 IAIP의 양은 대상체가 염증성 질환 또는 병태 또는 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험에 있는 것을 나타낸다. 일부 구현예에서, 정상 대상체로부터의 샘플에서 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 양보다 또는 컷오프 값에 비해 큰 샘플에서 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 양은 대상체가 염증성 질환 또는 병태 또는 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험에 있는 것을 나타낸다. 일부 구현예에서, 정상 대상체로부터의 샘플에서 IAIP의 양, 또는 컷오프 값은 >250μg/mL이다. 일부 구현예에서, 정상 대상체로부터의 샘플에서 IAIP의 양은 약 260 내지 약 540 μg/mL이다.
일부 구현예에서, 상기 대상체가 250 μg/mL 또는 그 미만의 IAIP 농도를 갖는다는 결정은 하기를 나타낸다: 즉, 상기 대상체는 염증성 질환 또는 병태 또는 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험에 있거나 또는 증가된 위험의 이환율 및/또는 사망률을 갖는 것으로 진단된다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 200 내지 300 μg/mL의 IAIP 농도를 갖는다. 다른 구현예에서 본 방법은 다음 빈도로 수행된다: 적어도 1회/년, 적어도 2회/년, 적어도 1회/개월, 적어도 1회/주, 적어도 1회/일, 또는 적어도 1회/시간.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 이전에 염증성 질환 또는 병태 또는 감염이 있었다.
일부 구현예에서, 본 방법은 치료 전에 및/또는 치료의 과정 동안 1회 이상 수행된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 치료의 개시 후 및/또는 치료의 종결 후에 수행된다. 일부 구현예에서, 본 치료는 대상체에서 IAIP의 이전 측정에 비해 대상체에서 IAIP의 농도가 증가하는 경우 및/또는 대상체에서 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 이전 측정에 비하여 대상체에서 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 농도가 감소하는 경우에 효과적인 것으로 결정된다. 일부 구현예에서, 본 치료는 대상체에서 IAIP의 이전 측정에 비해 대상체에서 IAIP의 농도가 감소하거나 일정하게 유지하는 경우 및/또는 대상체에서 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 이전 측정에 비하여 대상체에서 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 농도가 증가하거나 일정하게 유지하는 경우에 효과가 없는 것으로 결정된다. 일부 구현예에서, 본 방법은 추가로 치료를 변형시키거나 또는 변경하는 단계를 포함한다.
제2 양태에서, 염증성 질환 또는 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 대상체 (예를 들어, 인간, 예컨대 신생아, 아동, 청소년, 또는 성인)를 치료하는 방법이 특징으로 되며, 여기서 상기 대상체는 IAIP 및/또는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 치료제의 치료적 유효량을 상기 대상체에게 투여함에 의해, 제1 양태의 방법에 따라 치료가 필요한 것으로 결정되었다: 항생제, 항바이러스제, 항진균제, 항기생충제, 항-염증제, 항암제, 항-응고제, 면역조절 제제, 기관지확장제 제제, 보체 억제제, 혈관승압제, 진정제, 또는 기계적 환기.
일부 구현예에서, 염증성 질환 또는 병태 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 패혈증, 패혈성 쇼크, 멸균 패혈증, 트라우마, 손상, 뇌졸중, 급성 염증성 질환, SIRS, 급성 폐 손상, ARDS, 폐렴, 괴사성 전장염, 급성 췌장염, 신장 질환, 급성 신장 손상, 간 손상, 급성 순환 부전, 수술-유도된 염증, 농양-유도된 염증, 다발성 경화증, 자간전증, 암, 암 전이, 종양 침습, 주변 동맥 질환, 1형 또는 2형 당뇨병, 죽상경화성 심혈관 질환, 간헐적 파행, 치명적 사지 허혈성 질환, 심근경색증, 경동맥 폐색, 탯줄 폐색, 저 체중 출생, 미성숙한 출생, 폐 결핍, 말초 신경병증, 저산소 허혈, 박테리아 감염, 상처, 화상, 열상, 타박상, 골절, 수술 과정, 조직 허혈, 류마티스성 관절염, 수막염, 염증성 장 질환, 만성적 폐쇄성 폐 질환, 비염, 조기 분만, 또는 감염성 질환.
일부 구현예에서, 감염은 하기에 의해 야기된다: 그람 음성 박테리아, 예컨대 나이세리아 종으로 하기를 포함함; 나이세리아 고노르호아에 및 나이세리아 메닌기티디스 , 브란하멜라 종으로 하기를 포함함; 브란하멜라 카타르할리스, 에스케리치아 종으로 하기를 포함함; 에스케리치아 콜라이 , 엔테로박터 종, 프로테우스 종으로 하기를 포함함; 프로테우스 미라빌리스, 슈도모나스 종으로 하기를 포함함; 슈도모나스 에어루기노사 , 슈도모나스 말레이, 및 슈도모나스 슈포말레이 , 클렙시엘라 종으로 하기를 포함함; 클렙시엘라 뉴모니아에 , 살모넬라 종, 시겔라 종, 세라티아 종, 아시네토박터 종; 헤모필루스 종으로 하기를 포함함; 헤모필루스 인플루엔자 및 헤모필루스 두크레이, 브루셀라 종, 예르시니아 종 으로 하기를 포함함; 예르시니아 페스티스 및 예르시니아 엔테로콜리티카 , 프란시셀라 종으로 하기를 포함함; 프란시셀라 툴라렌시스 , 파스투렐라 종으로 하기를 포함함; 파스튜렐라 멀토시다 , 비브리오 콜레라에, 플라보박테리움 종, 메닝고셉티쿰 , 캄필로박터 종으로 하기를 포함함; 캄필로박터 제주니, 박테로이데스 종 (경구, 인두)으로 하기를 포함함; 박테로이데스 프라길리스 , 푸소박테리움 종으로 하기를 포함함; 푸소박테리움 뉴클레아툼 , 칼림마토박테리움 그라눌라마티스 , 스트렙토바실러스 종으로 하기를 포함함; 스트렙토바실러스 모닐리포르미스 , 및 레지오넬라 종으로 하기를 포함함; 레지오넬라 뉴모필라.
제3 양태에서, 특징으로 되는 것은 샘플 내 IAIP 또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체를 정량화하는 키트이고, 본 키트는 IAIP 결합제 및 IAIP 검출제 그리고, 선택적으로 하기 중 하나 이상을 포함한다: 세정 완충액, 차단제, 표지의 검출을 위한 기질, 및 샘플 내 IAIP 또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 수준을 정량화하기 위한 지침. 본 키트의 성분 중 하나 이상은 용기, 예컨대 튜브 또는 바이알에 제공될 수 있고, 및/또는 즉시 사용가능한 형태 (예를 들어, 키트의 지지체 (예를 들어, 플레이트 또는 테스트 스트립)에 적용일 수 있다.
일부 구현예에서, 결합제는 지지체 상에 고정된다.
일부 구현예에서, 검출제는 라벨링된다.
일부 구현예에서, IAIP 결합제는 IAIP-특이적 항체 또는 IAIP 리간드이다.
일부 구현예에서, 본 키트는 추가로 IAIP 리간드 결합제를 함유한다. 일부 구현예에서, IAIP 리간드 결합제는 IAIP 리간드에 결합하는 항체이다.
일부 구현예에서, IAIP 검출제는 하기이다: IAIP-특이적 항체 또는 IAIP 리간드.
일부 구현예에서, 본 키트는 추가로 IAIP 리간드 검출제를 함유한다. 일부 구현예에서, IAIP 리간드 검출제는 IAIP 리간드에 특이적으로 결합하는 항체이다.
일부 구현예에서, IAIP-특이적 항체는 단클론성 항체이다. 일부 구현예에서, 단클론성 항체는 MAb 69.26 또는 MAb 69.31이다.
일부 구현예에서, 상기 지지체는 플레이트, 수지, 컨테이너, 막, 바이오칩, 입자, 나노입자, 테스트 스트립, 또는 비드이다.
일부 구현예에서, 표지는 효소, 효소 기질, 바이오틴, 입자, 형광 염료, 발광성 화합물, 또는 방사선표지이다.
일부 구현예에서, IAIP 리간드는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 내독소 (LPS), 헤파린, 히스톤, 하이알루론산, 라미닌, 테나스신 C, 아그레칸, 빈트로넥틴, 파이브로넥틴, 폰빌레브란트 인자, 펜트락신-3 (PTX3), TNF-자극된 유전자-6 (TSG-6), 인자 IX, 보체 성분, 인자 XIIIa, 및 조직 트랜스루타미나제.
정의
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “약”은 기재된 값보다 10% 이하로 높거나 또는 낮은 값을 지칭한다. 예를 들어, 용어 “약 5 nM”은 4.5 nM 내지 5.5 nM의 범위를 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, “투여”는 임의의 효과적인 경로에 의해 치료제 (예를 들어, IAIP)를 대상체에게 제공 또는 부여하는 것을 지칭한다. 예시적인 투여 경로는 본 명세서에서 하기에 기재되어 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “항체” (Ab)는 특정 항원에 특이적으로 결합하거나 이들과 면역학적으로 반응하는 면역글로불린 분자를 지칭하고, 적어도 중쇄의 가변 도메인을 포함하고, 그리고 정상적으로 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 적어도 가변 도메인을 포함한다. 항체 및 항원-결합 단편, 이의 변이체, 또는 유도체는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: 다클론성, 단클론성, 다중특이적, 인간, 인간화된, 영장류화된, 또는 키메라 항체, 헤테로콘주게이트 항체 (예를 들어, 비- 트리- 및 쿼드-특이적 항체, 디아바디, 트리아바디, 및 테트라바디), 단일-도메인 항체 (sdAb), 에피토프-결합 단편, 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2, Fd, Fvs, 단일-사슬 Fvs (scFv), rlgG, 단일-사슬 항체, 디설파이드-연결된 Fvs (sdFv), VL 또는 VH 도메인 중 어느 하나를 포함하는 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생산된 단편, 및 항-개체특이형 (항-Id) 항체. 본 발명의 항체 분자는 면역글로불린 분자의 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA, 및 IgY), 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스의 것일 수 있다. 나아가, 달리 나타내지 않는 한, 용어 “단클론성 항체” (mAb)는 표적 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 온전한 분자뿐만 아니라 항체 단편 (예컨대, 예를 들어, Fab 및 F(ab')2 단편) 둘 모두를 포함하기 위한 것이다. Fab 및 F(ab')2 단편은 온전한 항체의 Fc 단편을 결하고, 동물의 순환으로부터 보다 빠르게 소거되고, 온전한 항체보다 덜 비-특이적 조직 결합을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 “항원-결합 단편”은 표적 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다. 항체 단편은 Fab, F(ab’)2, scFv, SMIP, 디아바디, 트리아바디, 아피바디, 나노바디, 압타머, 또는 도메인 항체일 수 있다. 용어 항체의 “항원-결합 단편”의 포괄된 결합 단편의 예는, 비제한적으로, 하기를 포함한다: (i) VL, VH, CL, 및 CH1 도메인으로 구성된 Fab 단편인, 1가 단편; (ii) 힌지 영역에서 디설파이드 브릿지에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 F(ab')2 단편인, 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편, (v) VH 및 VL 도메인을 포함한 dAb; (vi) VH 도메인으로 구성되는, dAb 단편 (Ward 등, Nature 341:544-546, 1989); (vii) VH 또는 VL 도메인으로 구성되는 dAb; (viii) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR); 및 (ix) 선택적으로 합성 링커에 의해 연결될 수 있는 2 이상의 단리된 CDR의 조합.게다가, Fv 단편의 2개의 도메인인, VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 이들을 VL 및 VH 영역이 1가 분자를 형성하도록 짝을 이루는 단일 단백질 사슬로 이루어지도록 할 수 있는 링커에 의해 재조합 방법을 사용하여 연결될 수 있다 (단일-사슬 Fv (scFv)로 알려짐; 하기 참고, 예를 들어, Bird 등, Science 242:423-426, 1988, 및 Huston 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883, 1988). 이들 항체 단편은 당해 분야의 숙련가에게 알려진 종래의 기술을 사용하여 수득될 수 있고, 그리고 본 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 선별될 수 있다. 항원-결합 단편은 온전한 면역글로불린의 재조합 DNA 기술, 효소적 또는 화학적 절단에 의해, 또는 일부 구현예에서, 당업계에서 알려진 화학적 펩타이드 합성 절차에 의해 생산될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같은, 용어 “인터-알파 억제제 단백질” 또는 “IAIP”는 구조적으로 관련된 면역조절 단백질의 계열에서 큰, 다중-성분 당단백질을 지칭한다. IAIP는 중성구 엘라스타제, 플라스민, 트립신, 키모트립신, 그란자임 K, 프레단백질 전환효소, 퓨린, 카텝신 G, 및 아크로신을 포함한 다수의 프로테아제의 억제에서 중요한 것으로 밝혀졌다. IAIP는 세린 프로테아제 억제 활성, 예컨대 보체, 세포외 히스톤, 및 응고 인자에 결합하거나 불활성화시키는 것, 전-염증 사이토카인 예컨대 TNF-a 및 IL-6을 하향 조절하는 것, 접착 인자 예컨대 VCAM 및 ICAM을 하향 조절하는 것, 및 NFkB를 하향 조절하는 것에 부가하여 넓은 범위의 항-염증성 기전을 발휘한다. IAIP는 세포 이동 및 증식을 증진하기 위해 중쇄가 기질 단백질로 이전되는 조직의 보호 및 회복을 증진하는데 또한 중요하게는 관여된다. 인간 혈장에서, IAIP는 상대적으로 고농도 (400-800 mg/L)로 발견된다. 다른 억제제 분자와 달리, 이 계열의 억제제는 전형적으로 콘드로이틴 설페이트 사슬에 의해 공유결합된 폴리펩타이드 사슬의 조합 (경쇄 및 중쇄)을 포함한다. IAIP의 중쇄 (H1, H2, 및 H3)는 또한 소위 하이알루론산 (HA) 결합 단백질이다. 인간 혈장에서 발견된 IAIP의 주요 형태는 2개의 중쇄 (H1 및 H2) 및 단일 경쇄 (L)를 함유하는 인터-알파-억제제 (IαI), 및 하나의 중쇄 (H3) 및 하나의 경쇄 (L)를 함유하는 프리-알파-억제제 (PαI)이다. 또 다른 IAIP는 혈장 및 조직 세린 프로테아제를 광범위하게 억제하는 것으로 알려진 글리코사미노글리칸에 결합된 경쇄 (또한 일명 2개의 쿠니츠 도메인을 갖는 비쿠닌 (비-쿠니츠 억제제))이다. 또 다른 IAIP는 비쿠닌에 연결 없이 혈액에서 순환하는 중쇄-관련된 분자 H4이다. 여전히 또 다른 IAIP는 중쇄-관련된 분자 H5이다. 혈장 분획에 존재하는 IαI 및 PαI는 약 60 kDa 내지 약 280 kDa 사이의 겉보기 분자량을 갖는다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “IAIP 리간드”는 생체내 또는 시험관내 IAIP에 결합하는 분자 또는 이의 단편 (예를 들어, 내독소 (LPS), 헤파린, 히스톤, 하이알루론산, 모세포 단백질 (예를 들어, 빈트로넥틴, 파이브로넥틴, 테나스신 C, 라미닌, 아그레칸), 폰빌레브란트 인자, 펜트락신-3 (PTX3), TNF-자극된 유전자-6 (TSG-6), 응고 인자 (예를 들어, 인자 IX 및 인자 XIIIa), 보체 성분, 2가 양이온 예컨대 Ca2 +, 및 조직 트랜스루타미나제)을 지칭한다. IAIP 리간드는 또한 도메인 구조에 기초하여 IAIP에 결합하는 것이 예상되는 분자 (예를 들어, IAIP 중쇄의 폰빌레브란트 인자 A 도메인에 결합하는 RGD 도메인을 갖는 단백질)를 포함한다. 본 명세서에서 기재된 방법에 사용하기 위한 IAIP 리간드는 IAIP의 중쇄, IAIP 복합체, 또는 IAIP의 GAG에 결합하는 리간드 (예를 들어, 비쿠닌에 단독으로 결합하지 않는 리간드)를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “IAIP-특이적 항체” 또는 “IAIP에 특이적으로 결합하는 항체”는 하기 중 적어도 일부분을 포함하는 임의의 단백질 또는 펩타이드-함유 분자를 지칭한다: 면역글로불린 분자, 예컨대 중쇄 또는 경쇄의 적어도 하나의 상보성 결정 영역 (CDR) 또는 이들의 리간드 결합부, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 영역, 또는 이것의 임의의 부분으로, 이들은 IAIP를 결합할 수 있고 임의의 다른 단백질에 특이적으로 결합하지 않는다. 특이적으로 IAIP에 결합하는 항체는 IAIP에 결합하고 적어도 2회 배경 신호 또는 노이즈, 그리고 더욱 전형적으로 10 초과 내지 100회 배경인 신호를 제공할 것이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “단클론성 항체”는 임의의 진핵, 원핵, 또는 파아지 클론을 포함한 단일 클론으로부터 유래되는 항체를 지칭하고 이것이 생산되는 방법은 아니다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, “약제학적 조성물” 또는 “약제학적 제제”는 질환의 완화, 치료, 또는 예방에서 약리적 활성 또는 다른 직접적인 효과를 갖는 조성물 또는 제제, 및/또는 이들의 완성된 투약 형태 또는 제형이다. 본 조성물은, 예를 들어, (예를 들어, 약물 또는 생물학적 조절 지침, 예컨대 F.D.A. 및/또는 E.M.A.에 의해 공포된 것들에 따라) 인간 사용에 대해 지시된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “약제학적으로 허용가능한”은 합리적인 유익/유해 비율에 비례한 과도한 독성, 자극, 알러지성 반응, 및 다른 합병증 문제없이 대상체, 예컨대 포유동물 (예를 들어, 인간)의 조직과 접촉하기에 적합한 화합물들, 물질, 조성물 및/또는 투약 형태를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 어구 “전개할 가능성을 감소시키는 것”은 특정 질환, 증후군, 또는 증상 (예를 들어, 본 명세서에 기재된 증상, 예컨대 염증성 질환 또는 감염))에 민감하거나, 또는 달리 그 위험에 있거나, 또는 현 질환, 증후군, 또는 증상의 정도 또는 중증도에서의 증가의 위험이 있는 환자 (예를 들어, 인간), 예를 들어 중증 지역사회성 폐렴 (sCAP)을 진행할 위험이 있는 지역사회성 폐렴 (CAP)을 갖는 환자의 예방적 치료를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “참조”는 테스트 샘플의 파라미터와 비교 목적으로 사용되는 샘플 또는 표준의 파라미터 (예를 들어, 단백질 수준, 농도, 핵산 발현 수준 및 유전자 복제수)를 지칭한다. 예를 들어, 참조 샘플은 건강한 개체 (예를 들어, 염증성 질환 또는 감염이 없는 개체)로부터 수득될 수 있다. 참조 수준은 하나 이상의 참조 샘플로부터 결정된 피분석물 (예를 들어, 단백질 (예를 들어, IAIP), 핵산, 탄수화물 등)의 발현 또는 농도의 수준 (또는 그의 평균) 일 수 있다. 예를 들어, 참조는 복수의 개체 (예를 들어, 건강한 개체, 또는 염증성 질환 또는 감염이 없는 개체) 중 피분석물 (예를 들어, IAIP)의 평균 수준 (예를 들어, 평균 수준 또는 중앙 수준) 일 수 있다. 다른 사례에서, 참조 수준은, 예를 들어, 경험적 검정에 의해 달리 결정된 바와 같이, 예를 들어, 피분석물의 수준 또는 농도에 기초하여 미리 결정된 역치 수준 일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “샘플”은 대상체 (예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간)로부터 단리된 시료 (예를 들어, 혈액, 혈액 성분 (예를 들어, 혈청 또는 혈장), 소변, 타액, 양수, 폐 세척, 뇌척수액, 조직 (예를 들어, 조직 생검 또는 조직 균질물), 췌장 유체, 활막 유체, 및 세포)를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 어구 “특이적으로 결합한다”는 단백질 및 다른 생물학적 분자의 불균질 모집단에서 피분석물 (예를 들어, 단백질, 예컨대 IAIP)의 존재를 결정하는 결합 반응을 지칭한다. 피분석물은, 예를 들어, 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 의해 인식되는 항원일 수 있다. 측정되는 피분석물과 결합제 (예를 들어, 항체 또는 항원-결합 단편 또는 리간드) 사이의 특이적 결합은 100 nM 미만의 KD를 나타낸다. 예를 들어, 항원 (예를 들어, IAIP)에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 최대 100 nM (예를 들어, 1 pM 내지 100 nM 사이)의 KD로 항원에 결합한다. 특정 항원 또는 이들의 에피토프 (예를 들어, IAIP)에 특이적 결합을 나타내지 않는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 그 특정 항원 또는 이들의 에피토프에 대해 100 nM 초과 (예를 들어, 500 nm, 1 μM, 100 μM, 500 μM, 또는 1 mM 초과)의 KD를 나타낸다. 특정 단백질 또는 탄수화물과 구체적으로 면역반응성인 항체를 선택하기 위해 다양한 면역검정 포맷이 사용될 수 있다. 예를 들어, 고체상 ELISA 면역검정이 단백질 또는 탄수화물과 구체적으로 면역반응성인 항체를 선택하기 위해 일상적으로 사용된다. 특이적 면역반응성을 결정하기 위해 사용될 수 있는 면역검정 포맷 및 조건에 대한 설명에 대해서는, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1988) and Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York (1999)을 참고한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “패혈증”은 조직 손상, 장기 부전, 및 사망으로 이어질 수 있는 급성 조직 손상 및 타고난 면역 활성화와 연관된 감염 (본 명세서에서 일명 “감염성 패혈증”) 또는 비-감염성 과정에 대한 전신 반응을 지칭한다 (본 명세서에서 “멸균 염증” 또는 “멸균 패혈증”으로 교환가능하게 언급됨). 감염성 패혈증은 박테리아, 바이러스, 진균, 또는 다른 미생물 예컨대 기생충 (예를 들어, 원생동물 기생충)에 의해 야기된 감염으로 인해 발생할 수 있다. 멸균 패혈증은 출혈성 쇼크, 다발성외상, 췌장염, 이식 거부, 자가면역 질환, 무기 화합물, 결정, 화학물질 또는 허혈/재관류 후에 발생할 수 있으며 알려진 감염의 존재와 관련이 없다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “대상체”는, 비제한적으로, 인간 또는 비-인간 포유동물, 예컨대 영장류, 소과, 말, 돼지, 양, 고양이, 또는 갯과를 포함한 포유동물을 지칭한다. 상기 대상체는 환자일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 “치료하는”은 장애 및/또는 이와 연관된 증상을 감소시키거나 개선시키는 것을 지칭한다. 배제되지는 않지만, 장애 또는 병태를 치료하는 것은 장애 또는 이와 연관된 증상이 완전히 제거될 필요는 없음이 인정될 것이다.
도 1은 (예를 들어, 혈액에서) 순환하는 IAIP (IaI 및 PaI) 및 유리 경쇄 (LC, 비쿠닌), 예를 들어, 소변에 배출된 것의 구조를 묘사하는 개략도이다. IAIP의 중쇄 및 경쇄는 글리코사미노글리칸 (GAG)에 의해 독특하게 연결된다.
도 2A는 경쟁적 IAIP ELISA 검정을 묘사하는 개략도이다. 이 검정에서, 정제된 IAIP는 지지체, 예컨대 다중-웰 플레이트에 고정되고, 그리고 생물학적 샘플 및 IAIP에 지향된 라벨링된 항체 (예를 들어, MAb 69.26)는 그런 다음 정제된 IAIP에 첨가된다.
도 2B는 경쟁적인 IAIP ELISA 검정에 의해 생성된 데이터의 표준 곡선을 보여주는 그래프이다. 이 검정은 샘플에서 IAIP와 고정된 정제된 IAIP 사이의 경쟁적 항체 결합에 기초하여 IAIP의 간접적인 측정을 제공한다. 보다 낮은 신호는 샘플에서 더 많은 양의 IAIP를 나타낸다.
도 3A는 라벨링된 IAIP 리간드 (예를 들어, 바이오티닐화된 헤파린 또는 LPS)를 사용하는 "샌드위치-유형" ELISA 및 상기 ELISA를 사용하여 생성된 예시적인 표준 곡선을 묘사하는 개략도이다. 이 버전의 검정에서, IAIP에 특이적인 항체 (예를 들어, MAb 69.26)는 지지체, 예컨대 다중-웰 플레이트에 고정되고 그 다음 생물학적 샘플은 고정된 항체를 함유하는 지지체에 첨가된다. IAIP가 샘플에 존재하면, 이것은 항체에 결합하고 그 다음 라벨링된 IAIP 리간드의 첨가에 의해 검출될 것이다.
도 3B 및 3C는 각각 헤파린-IAIP 및 내독소 (LPS)-IAIP 샌드위치-유형 ELISA에 대한 표준 곡선을 나타내는 그래프이다. 이 검정은 IAIP 농도의 직접적인 측정을 제공하며, 증가하는 신호는 샘플에서 더 많은 양의 IAIP를 나타낸다.
도 4는 도 2A에서 묘사된 바와 같이 경쟁적 ELISA를 사용하여 수득된 IAIP 농도의 측정치를 나타내는 그래프이다. IAIP는 입원 기간 동안 연속적인 날에 중증 지역사회성 폐렴 (sCAP)이 있는 환자로부터 혈장 샘플에서 측정되었고, 정상 대조군 대상체의 IAIP 수준과 비교되었다. 경쟁적 ELISA는 sCAP가 있는 환자에서 250 μg/mL 및 건강한 대조군에서 330 μg/mL의 평균 IAIP 농도를 산출했으며, 0, 1, 3일째에 sCAP가 있는 대상체 및 건강한 대조군에서 IAIP 수준간에 유의한 차이를 발견했다.
도 5는 도 3A에서 묘사된 바와 같이 “샌드위치-유형” 리간드-IAIP ELISA를 사용하여 수득된 IAIP 농도의 측정치를 나타내는 그래프이다. 도 5에서 묘사된 결과는 IAIP 리간드로 헤파린을 사용하여 생성되었다. 도 4의 경쟁적 ELISA를 사용하여 평가된 동일한 샘플이 또한 이 검정을 사용하여 측정되었다. 헤파린-IAIP ELISA는 sCAP가 있는 환자에서 125 내지 150 μg/mL 및 건강한 대조군에서 422 μg/mL의 평균 IAIP 농도를 산출했으며, 모든 시점에서 경쟁적 ELISA를 사용하여 관측된 차이보다 더 통계적으로 상당한 sCAP가 있는 대상체 및 건강한 대조군에서 IAIP 수준간에 차이를 발견했다.
도 6은 도 3A에서 묘사된 바와 같이 “샌드위치-유형” 리간드-IAIP ELISA를 사용하여 수득된 IAIP 농도의 측정치를 나타내는 그래프이다. 도 6에서 묘사된 결과는 IAIP 리간드로 LPS를 사용하여 생성되었다. 도 4의 경쟁적 ELISA 및 도 5의 헤파린-IAIP ELISA를 사용하여 평가된 동일한 샘플이 또한 이 검정을 사용하여 측정되었다. LPS-IAIP ELISA는 sCAP가 있는 환자에서 118 내지 145 μg/mL 및 건강한 대조군에서 338 μg/mL의 평균 IAIP 농도를 산출했으며, 모든 시점에서 경쟁적 ELISA를 사용하여 관측된 차이보다 더 통계적으로 상당한 sCAP가 있는 대상체 및 건강한 대조군에서 IAIP 수준간에 차이를 발견했다. LPS-IAIP ELISA는 증가된 민감성 및 sCAP를 갖는 대상체와 건강한 대조군에서 IAIP 수준 사이의 더 측정가능한 차이의 관점에서 헤파린-IAIP ELISA에 비교가능하게 수행하였다.
도 7은 IAIP에 대한 헤파린 및 IAIP-특이적 항체 (MAb 69.26)의 결합을 나타내는 일련의 블랏이다. 중간 블랏에서 나타낸 바와 같이, 바이오티닐화된 헤파린은 정제된 IAIP (250 kDa IαI 및 125 kDa PαI)에 결합하였지만, IAIP 경쇄, 비쿠닌, 또는 음성 대조군 인간 혈청 알부민에는 결합하지 않았다. 그에 반해서, MAb 69.26은 정제된 IAIP 및 비쿠닌 둘 모두에 결합하였다. 이들 데이터는 헤파린이 IAIP의 중쇄에 결합하여, 헤파린-IAIP ELISA에서 순환하는, 온전한 IAIP의 보다 정확한 측정으로 이어질 수 있음을 시사한다.
도 8A-8C는 도 2A에서 묘사된 바와 같은 경쟁적 ELISA 및 도 3A에서 묘사된 바와 같이 “샌드위치-유형” 리간드-IAIP ELISA를 사용하여 수득된 IAIP 농도의 측정치를 나타내는 일련의 그래프이다. IAIP는 중증 폐렴, 중증 패혈증이 있는 환자 및 정상 대조군 대상체에서의 혈장 샘플에서 측정되었다. 각각의 그래프 아래에는 IAIP 농도의 평균 ± 표준오차 및 시험된 환자 샘플의 수 (괄호에 표시)가 나타나 있다. 도 8A에서 나타낸 바와 같이, 경쟁적 ELISA는 중증 폐렴이 있는 환자에서 246 μg/mL, 중증 패혈증이 있는 환자에서 250 μg/mL 및 건강한 대조군에서 330 μg/mL의 평균 IAIP 농도를 산출했으며, 중증 폐렴이 있는 대상체와 건강한 대조군에서 IAIP 수준간에 유의차를 발견지만 중증 패혈증이 있는 대상체와 건강한 대조군 사이에서는 그렇지 않았다. 도 8B에서 나타낸 바와 같이, LPS-IAIP ELISA는 중증 폐렴이 있는 환자에서 141 μg/mL, 중증 패혈증이 있는 환자에서 150 μg/mL 및 건강한 대조군에서 338 μg/mL의 평균 IAIP 농도를 산출했으며, 중증 폐렴 또는 중증 패혈증이 있는 대상체와 건강한 대조군에서 IAIP 수준간에 유의차를 발견하였다. 도 8C에서 나타낸 바와 같이, 헤파린-IAIP ELISA는 중증 폐렴이 있는 환자에서 145 μg/mL, 중증 패혈증이 있는 환자에서 193 μg/mL 및 건강한 대조군에서 422 μg/mL의 평균 IAIP 농도를 산출했으며, 중증 폐렴 또는 중증 패혈증이 있는 대상체와 건강한 대조군에서 IAIP 수준간에 유의차를 발견하였다. LPS-IAIP ELISA는 증가된 민감성을 가지는 것과 경쟁적 ELISA에 비교된 보다 통계적으로 상당한 결과를 제공하는 것의 관점에서 헤파린-IAIP ELISA에 비교가능하게 수행하였다.
도 9는 고정된 혈장-유래된 IAIP, 소과 혈청 알부민 (BSA), 및 IAIP-특이적 항체 MAb 69.26의 IgG에 대한 바이오티닐화된 LPS의 결합을 나타내는 히스토그램이다. LPS는 IAIP에 실질적인 결합과, 음성 대조군으로 작용하는 MAb 69.26에 거의 결합하지 않는다는 것을 실증했다. 현저히, LPS는 IAIP 경쇄, 비쿠닌에 대한 결합을 나타내지 않아, IAIP의 중쇄가 LPS에 대한 결합을 촉진할 수 있음을 나타냈다.
도 10은 LPS, BSA, IAIP-특이적 항체 MAb 69.26의 IgG, 및 비-지방 건조된 밀크에 대한 바이오티닐화된 IAIP의 결합을 나타내는 히스토그램이다. 기대된 대로, IAIP는 MAb 69.26 및 LPS에 결합하였고 BSA 및 비-지방 건조된 밀크에 대한 최소 결합을 나타냈다. 이들 데이터는 도 9의 결과를 확인한다.
도 11은 LPS, BSA 및 IAIP-특이적 항체 MAb 69.26의 IgG에 대한 바이오티닐화된 IAIP의 결합에 대한 pH의 효과를 나타내는 히스토그램이다. 이들 데이터는 IAIP가 pH 6 및 pH 7에서 결합이 감소되고 pH 8 이상 또는 pH 4 이하에서 결합이 거의 또는 전혀 없이, pH 5에서 LPS에 가장 강하게 결합했다는 것을 입증한다. 그에 반해서, IAIP는 pH 5 - pH 9에서 MAb 69.26의 IgG에 결합하였으나 pH 4 이하에서는 결합하지 않았다. 이전의 실험에서와 같이, IAIP는 BSA에 결합하지 않았다.
도 12는 LPS, BSA 및 IAIP-특이적 항체 MAb 69.26의 IgG에 대한 바이오티닐화된 IAIP의 결합에 대한 염 (NaCl) 농도의 효과를 나타내는 히스토그램이다. 이들 데이터는 LPS 및 MAb 69.26 둘 모두에 대한 IAIP의 결합이 염에 의해 영향을 받지 않아, 강하고 특이적인 결합을 나타냈다는 것을 보여준다. 시험된 임의의 염 농도에서 BSA에 대한 결합은 관측되지 않았다.
도 13은 LPS, BSA 및 IAIP-특이적 항체 MAb 69.26의 IgG에 대한 바이오티닐화된 IAIP의 결합에 대한 비-이온성 세제 NP-40의 효과를 나타내는 히스토그램이다. LPS에 대한 IAIP의 결합은 0.05% NP-40의 첨가에 의해 향상되었으며, 1% NP-40의 존재 하에서 여전히 관찰되었으며, 이는 강한 결합 상호작용을 나타낸다. 시험된 임의의 NP-40 농도에서 BSA에 대한 결합은 관찰되지 않았다.
도 14는 LPS, BSA 및 IAIP-특이적 항체 MAb 69.26의 IgG에 대한 바이오티닐화된 IAIP의 결합에 대한 비-이온성 세제 Tween-20의 효과를 나타내는 히스토그램이다. LPS에 대한 IAIP의 결합은 0.05% 트윈-20의 첨가에 의해 향상되었으며, 1% 트윈-20의 존재 하에서 여전히 관찰되었으며, 이는 강한 결합 상호작용을 나타낸다. 시험된 임의의 트윈-20 농도에서 BSA에 대한 결합은 관찰되지 않았다.
도 15A-15B는 초기 제시에서 성별, 중량 및 재태 연령-매칭된 건강한 대조군(n=26)에서뿐만 아니라 NEC (n=14) 및 SIP (n=13)를 갖는 영아에서 혈액 IAIP 수준 (도 15 A) 및 CRP (도 15 B)를 묘사하는 히스토그램이다. 줄어든 IAIP 수준이 입증된 NEC가 있는 영아에서 발견되었고 (평균 ± SD:139 ± 21ug/mL) 반면에 건강한 대조군 (276 ± 110ug/mL) 또는 SIP가 있는 영아 (319 ± 72ug/mL)에서의 수준은 상당히 더 높았다 (p<0.05 및 p<0.005). 그에 반해서, SIP가 있는 영아와 대조군에서 IAIP 수준 사이에 통계적으로 유의차가 없었다 (p>0.4). CRP 수준이 시험될 때, SIP, NEC 및 대조군 그룹 사이에 유의차는 발견되지 않았다 (p>0.05).
도 16A-16B는 NEC 영아에서 IAIP 및 CRP의 ROC 곡선을 묘사하는 그래프이다. IAIP 수준의 예측 값은 100%의 감수성, 64.7%의 특이성, PPV 18% 및 NPV 98%를 갖는 CRP (도 16B)에 비교하여 100%의 감수성, 88.2%의 특이성, PPV 41% 및 NPV 100%, (도 16A)으로 우월하다.
도 17은 하기와 같은 영아에서 혈장 IAIP 수준의 종방향 연구의 결과를 묘사하는 그래프이다:
NEC (n=8) 및 SIP (n=9). 질환 제시의 개시 전후 시점에서 혈액을 연속적으로 수집하였다. 질환 개시 전에 SIP와 NEC를 가진 영아 그룹 둘 모두에서 IAIP 수준의 유의차가 발견되지 않았지만 (p 값 > 0.6), 개시 후 최대 10일에서 NEC를 가진 영아의 IAIP 수준은 SIP를 가진 영아의 수준에 비해 상당히 낮았다 (p < 0.04).
도 18은 측면 유동 면역검정-기반 IAIP 신속한 테스트의 개략도이다.
도 19는 ESEQuant 판독기를 사용한 신속한 IAIP 테스트의 표준 곡선을 묘사하는 그래프이다. 각각의 점의 값을 총 13개의 독립적인 분석의 평균 + SD로 플롯팅하였다. 신속한 테스트 표준 곡선은 17.5 내지 1100 μg/mL 범위인 IAIP 수준을 갖는 혈장 샘플에 적합하다.
도 20A-20C는 ESEQuant 판독기, Detekt 판독기, iCalQ 판독기를 사용한 IAIP 신속한 테스트에 의해 수득된 결과와 확립된 경쟁적 ELISA 형식에 의해 수득된 결과 사이의 상관관계를 묘사하는 일련의 그래프이다.
도 21A-21B는 하이알루론산이 96-웰 플레이트 상에 고정되어 IAIP를 포착하고, IAIP가 바이오틴-접합된 MAb 69.26 (인간 IAIP에 대한 단클론성 항체)을 사용하여 검출되는 "샌드위치-유형" ELISA를 이용한 IAIP의 정량화를 묘사하는 일련의 그래프이다. 검정은 웰당 50 ng, 100 ng 또는 200 ng 하이알루론산을 사용하여 인간 혈장 (도 21A) 및 정제된 IAIP (도 21B) 둘 모두의 연속 희석에서 IAIP를 정량화하는데 사용될 수 있다.
샘플에서 IAIP의 양을 측정하는데 사용될 수 있는 시약 (예를 들어, IAIP 리간드 같은, 샘플에서 IAIP에 직접적으로 결합하는 시약, 또는 IAIP에 결합된 IAIP 리간드에 결합하는 시약)을 사용하여 샘플 (예를 들어, 대상체로부터의 샘플, 예컨대 혈액 샘플)에서 IAIP 농도를 측정하는 방법이 특징이다. 시약은 검출가능한 표지를 사용함에 의해 측정될 수 있다. 본 방법은 염증성 질환 또는 병태 또는 감염이 있거나 또는 전개할 위험이 있는 대상체를 확인하고, 대상체의 건강 상황 또는 그 질환 중증도를 결정하고, 그리고 치료제 (예를 들어, IAIP 또는 염증성 질환 또는 병태 또는 감염을 치료하기 위한 제제)가 투여된 대상체에서 병태 (예를 들어, 염증성 질환 또는 병태 또는 감염)의 치료를 모니터링하기 위해 사용될 수 있다.
IAIP의 정량화를 위한 검정
대상체로부터 수집된 샘플(들) 내 IAIP를 정량화하는 방법이 제공된다. IAIP를 검출하는 이전의 방법은 샘플 내 IAIP 농도의 간접적인 측정을 제공하는 항체-기반 경쟁적 ELISA에 의존하였다. 이 방법은 온전한 IAIP 복합체 (예를 들어, 하나 이상의 중쇄 (H1-H5) 및 경쇄, 비쿠닌을 함유하는 IAIP) 및 비쿠닌 단독 둘 모두를 검출한다. 그에 반해서, 본 명세서에서 기재된 방법은, 비쿠닌 단독에는 결합하지 않지만, IAIP 중쇄, 온전한 IAIP 복합체의 중쇄 및 경쇄, 또는 IAIP 복합체의 GAG에 결합함에 의해 직접적으로 샘플에서 IAIP를 검출하는 시약 (예를 들어, IAIP 리간드)을 사용한다.
이론에 의해 구속되기를 바라지 않으면서, 본 명세서에 기재된 IAIP 리간드-기반 검정은 IAIP 중쇄 또는 온전한 IAIP 복합체의 검출에 기인하여 경쟁적 ELISA보다 더 큰 민감성 및 강건성을 나타낸다. 본 방법은 절단된 또는 분해된 IAIP 경쇄를 검출하는 항체-기반 검정에 비해 샘플에서 기능적 IAIP의 양의 개선된 판독을 제공한다.
본 명세서에서 기재된 방법은, 예를 들어, IAIP-특이한 제제, 예컨대 항체를 사용하여 IAIP, 예를 들어, 기판 (예를 들어, 고형 지지체, 예를 들어, 플레이트, 수지, 입자, 컨테이너, 막, 또는 비드) 상에 포착된 IAIP를 검출하기 위해 IAIP 리간드의 사용, IAIP-특이적 항체로 후속적인 검출을 위한 IAIP를 포착하기 위해 IAIP 리간드의 사용, 및 제2의 상이한 IAIP 리간드로 후속적인 검출을 위한 IAIP를 포착하기 위해 IAIP 리간드의 사용을 포함한다.
샘플에서 온전한 IAIP를 검출하기 위해 사용될 수 있는 제1 방법은 지지체에 부착되고 샘플에서 IAIP를 포착하는데 사용되는 IAIP 결합제 (예를 들어, IAIP-특이적 항체 또는 IAIP 리간드)를 포함한다. IAIP 결합제와 복합체를 형성한 IAIP에 결합하는 IAIP 검출제 (예를 들어, IAIP 리간드 또는 IAIP-특이적 항체)가 그런 다음 첨가된다. IAIP 농도는 그럼 다음, 예를 들어, IAIP 검출제에 직접적으로 부착되거나 IAIP 검출제에 결합하는 시약에 부착된 표지의 존재를 검출함에 의해 정량화될 수 있다.
샘플에서 IAIP의 양을 검출하기 위해 사용될 수 있는 제2 방법은 생체내 형성되고 샘플에 존재하는 IAIP-IAIP 리간드 복합체를 검출하는 것을 포함한다. 이 방법은 또한 지지체에 부착된 결합제의 사용으로 시작한다. 본 결합제는 IAIP 또는 IAIP 리간드 중 어느 하나에 결합할 수 있다. 검출제가 그런 다음 첨가되어, IAIP-IAIP 리간드 복합체의 다른 성분에 결합한다 (예를 들어, 결합제가 IAIP로 지향하는 경우, 검출제는 IAIP 리간드로 지향하고, 그리고, 반대로, 결합제가 IAIP 리간드로 지향하는 경우, 검출제는 IAIP로 지향한다). IAIP의 농도는, 예를 들어, 검출제에 직접적으로 또는 간접적으로 부착된 표지의 존재를 검출함에 의해 측정될 수 있다.
본 방법 및 방법 단계에서 사용된 시약은 아래에서 상세히 논의된다.
IAIP 리간드
본 명세서에서 기재된 방법에서 사용하기 위한 IAIP 리간드는 하나 이상의 IAIP 중쇄, IAIP 중쇄(들) 및 경쇄, 비쿠닌 (예를 들어, 온전한 IAIP), 또는 IAIP의 GAG (예를 들어, 온전한 IAIP에서의 GAG)에 결합하는 리간드를 포함한다. 온전한 IAIP는 적어도 하나의 IAIP 중쇄 (H1, H2, H3, H4, 및/또는 H5) 및 IAIP 경쇄 (비쿠닌)를 함유하는 복합체이다. 예를 들어, 내독소 (리포폴리사카라이드, LPS), 헤파린, 히스톤, 하이알루론산, 빈트로넥틴, 파이브로넥틴, 테나스신 C, 라미닌, 아그레칸, 폰빌레브란트 인자, 펜트락신-3 (PTX3), TNF-자극된 유전자-6 (TSG-6), 응고 단백질 (예를 들어, 인자 IX 및 인자 XIIIa), 보체 단백질 (예를 들어, C1q, C2, C3, C4, C5, C6, C8, 프로페르딘, 및 인자 D), 2가 양이온 (예를 들어, Ca2 +), 및 조직 트랜스루타미나제를 포함하는, IAIP의 중쇄 또는 온전한 IAIP에 결합하는 임의의 리간드가 본 명세서에서 기재된 방법에서 사용될 수 있다. IAIP 리간드는 당업계에서 알려진 표준 기술 (예를 들어, 아래에 기재된 검출가능한 표지 중 하나 이상을 사용함)에 따라 라벨링될 수 있다.
IAIP 항체
IAIP에 특이적으로 결합하는 항체가 본 명세서에서 기재된 방법에서 결합제 또는 검출제로서 사용될 수 있다. IAIP에 특이적으로 결합하는 항체는 IAIP 이외의 임의의 단백질에 특이적으로 결합하지 않는 항체 또는 이들의 항원 결합 단편이다 (예를 들어, 비-IAIP 단백질과 IAIP-특이적 항체의 상호작용은 배경에 유사한 신호를 생성한다). IAIP에 특이적으로 결합하는 항체는 IAIP의 중쇄, IAIP의 경쇄, 또는 둘 모두, 또는 IAIP의 GAG에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 본 항체는 IAIP의 중쇄 또는 중쇄 및 경쇄를 함유하는 온전한 IAIP에 결합한다. 본 항체는 인간 IAIP에 대해, 또는 또 다른 포유동물 (예를 들어, IAIP를 발현하는 비-인간 영장류, 소, 돼지, 양, 염소, 고양이, 개, 랫트, 마우스, 토끼, 기니아 피그, 또는 임의의 다른 비-인간 포유동물)로부터 IAIP에 대해 상승될 수 있다. IAIP에 특이적으로 결합하는 항체는 단지 인간 IAIP에만 결합할 수 있거나, 또는 인간 및 다른 포유동물로부터의 결합가능한 IAIP일 수 있다. 본 항체는 IAIP로 항체를 생성하기 위해 전형적으로 사용된 동물 (예를 들어, 토끼, 기니아 피그, 랫트, 마우스, 양, 당나귀, 염소, 햄스터, 및 닭)의 면역화에 의해 생산될 수 있다. IAIP-특이적 항체는 다클론성 (예를 들어, PAb R16, PAb R20, PAb R21), 단클론성 (예를 들어, MAb 69.26 또는 MAb 69.31), 키메라, 또는 재조합일 수 있다.
라벨
본 명세서에서 기재된 방법에서 IAIP의 농도를 검출하기 위한 라벨은 IAIP 리간드, IAIP-특이적 항체, 또는 본 명세서에 기재된 다른 시약에 부착 또는 접합될 수 있다. IAIP 리간드, IAIP 리간드-특이적 항체, 및/또는 IAIP-특이적 항체의 검출에 적합한 라벨은 바이오틴, 효소 (예를 들어, 홀스래디쉬 페록시다아제 (HRP), 알칼리성 포스파타제 (AP), β-갈락토시다아제, 아세틸콜린에스테라제, 및 카탈라제), 효소 기질, 방사선표지 (예를 들어, 방사성 동위원소), 발광성 화합물, 입자 (예를 들어, 콜로이드성 금 (예를 들어, 금 나노입자), 자기 입자, 또는 라텍스 입자) 및 형광 염료를 포함한다. 본 표지는 그런 다음 효소-접합된 아비딘 또는 스트렙타비딘 (예를 들어, 바이오틴의 검출을 위해 AP 또는 HRP에 접합된 아비딘 또는 스트렙타비딘)의 사용을 통해, 및/또는 기질의 사용을 통해 직접적으로 (예를 들어, 형광 염료의 이미지형성, 방사능의 검출, 또는 입자의 검출을 통해) 평가될 수 있고, 예를 들어, 분광측정기, 형광측정기, 발광분석기, 또는 액체 섬광 계수기를 포함한 알려진 방법 및 장치에 의해 시각화될 수 있다. 기질은 비색계 (예를 들어, AP를 검출하기 위한 PNPP; 또는 HRP를 검출하기 위한 ABTS, OPD, 또는 TMB), 화학발광, 또는 형광일 수 있다. 기질은 또한 방사능의 검출을 위한 액체 섬광기를 포함한다. 당해 분야에서 알려진 표준 검출 방법이 본 명세서에 기재된 라벨을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
샘플
본 명세서에서 기재된 방법은 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)로부터의 샘플을 사용하여 수행될 수 있다. 적합한 샘플은 유체 샘플을 포함한다. 예를 들어, IAIP는 대상체 (예를 들어, 염증성 질환 또는 병태, 예컨대 패혈증이 있는 대상체, 또는 염증성 질환 또는 병태, 예컨대 패혈증을 전개할 위험이 있는 대상체)로부터의 혈액 또는 혈장의 샘플에서 측정될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 방법은 또한 다른 체액, 예컨대 소변, 뇌척수액, 활막 유체, 양수, 간질액, 여포성 유체, 복막 유체, 기관지폐포 세척 유체, 모유, 가래, 림프, 및 담즙의 샘플을 사용하여 수행될 수 있다. 대상체로부터 조직 샘플 (예를 들어, 생검)은 이들 방법을 사용하여 IAIP의 정량화를 위한 "유체"를 생성하기 위해 적절한 완충액에서 균질화될 수 있다.
검정에서 사용된 샘플의 용적은 수행되는 검정의 유형 (예를 들어, ELISA, 측면 흐름 면역검정, 또는 또 다른 검정) 및 지지체 (예를 들어, 플레이트, 막, 테스트 스트립, 또는 또 다른 지지체)에 의존하여 다양할 것이다. 사용된 샘플의 용적은 약 1 μL 내지 약 500 μL (예를 들어, 약 1μL 내지 약 150 μL, 예를 들어, 검정 예컨대 측면 흐름 면역검정에 대해 1μL 내지 약 30 μL, 또는 검정 예컨대 ELISA에 대해 약 50 μL to 약 200 μL)일 수 있다. 샘플은 결합 또는 검출제에 대한 결합을 방해하지 않을 완충액 (예를 들어, 물, PBS, 또는 본 검정의 방법에서 사용된 완충액)으로 검정에서 사용 전에 희석될 수 있거나 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:100 또는 그 초과로 희석될 수 있다.
온전한 IAIP를 검출하기 위한 방법
제1 IAIP 정량화 검정은 IAIP를 함유하는 샘플을 IAIP 결합제 (예를 들어, IAIP 또는 IAIP 리간드에 특이적으로 결합하는 항체)에 접촉시켜 IAIP-결합제 복합체를 형성하는 것을 포함한다. IAIP 결합제는 지지체 (예를 들어, 고형 지지체)에 부착될 수 있다. 적합한 지지체는 플레이트 (예를 들어, 다중-웰 플레이트), 입자 (예를 들어, 자기 입자, 나노입자, 자기 나노입자), 바이오칩, 수지, 막 (예를 들어, 니트로셀룰로스 막, PVDF 막), 용기 (예를 들어, 튜브), 시험 스트립 (예를 들어, 셀룰로스, 유리 섬유, 니트로셀룰로스), 및 비드 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 비드, 자기 비드, 유리 구슬, 플라스틱 비드)를 포함한다. 지지체는 바람직하게는 1회 이상 (예를 들어, 완충액, 예컨대 TBS, TBS-T, PBS, 또는 PBS-T를 사용하여) 세정되어 IAIP 결합제에 결합하지 않는 물질을 제거할 수 있다.
IAIP-결합제 복합체는 그런 다음 IAIP 검출제 (예를 들어, IAIP 리간드 또는 IAIP에 특이적으로 결합하는 항체)와 접촉된다. IAIP 검출제는 라벨 (예를 들어, 상기에 기재된 라벨 중 하나 이상)에 접합될 수 있고, 그런 다음 알려진 검출 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 대안적으로, IAIP 검출제는 표지의 사용 없이 직접적으로 검출될 수 있다. IAIP 검출제의 첨가 후, 미결합된 검출제를 제거하기 위해 추가의 세정 단계 (예를 들어, 하나 이상)가 수행될 수 있다.
IAIP는 그런 다음 당업계에서 알려진 표준 기술을 사용하여 접합된 표지 또는 부착된 검출제로부터의 신호 (예를 들어, 효소 활성 또는 형광)에 기초하여 측정될 수 있다. 효소가 표지로서 사용되는 경우, 기질은 신호 (예를 들어, 색상 변화)를 생성하도록 첨가될 수 있고, 분광측정기와 같은 신호를 검출하기에 적합한 장치에 의해 판독될 수 있다. 신호 (예를 들어, 흡광도 또는 형광)는 표준 곡선을 확립하기 위해 IAIP의 알려진 농도로 표준에 대해 플롯팅될 수 있거나 또는 알려진 기준 농도에 대해 비교될 수 있다. 샘플에서 알려지지 않은 농도는 확립된 표준 곡선 또는 기준 농도 값에 기초하여 계산 및 결정될 수 있다.
IAIP 결합제에 샘플을 첨가하기 전에, 비-특이적 결합을 방지하거나 감소시키기 위해 차단 단계가 수행될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 방법에서 사용하기 위한 차단제는, 예를 들어, 그 중에서도 밀크, BSA, 카세인, 젤라틴 (예를 들어, 어류 젤라틴), 및 혈청 (예를 들어, 염소 혈청, 당나귀 혈청, 말 혈청, 우태 혈청)을 포함한다.
본 방법 단계는 7.0 내지 3.5의 pH (예를 들어, pH 5.0 내지 pH 3.5, 예를 들어, pH 4.0)에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 결합 단계 및 검출 단계 둘 중 하나 또는 모두는 7.0 내지 3.5의 pH (예를 들어, pH 5.0 내지 pH 3.5, 예를 들어, pH 4.0)에서 수행될 수 있다. IAIP 결합제는 7.0 내지 3.5의 pH (예를 들어, pH 5.0 내지 pH 3.5, 예를 들어, pH 4.0)를 갖는 완충액에서 제조될 수 있고 및/또는 IAIP 검출제 (예를 들어, IAIP 리간드)는 7.0 내지 3.5의 pH (예를 들어, pH 5.0 내지 pH 3.5, 예를 들어, pH 4.0)를 갖는 완충액에서 제조될 수 있다. IAIP의 검출을 개선하기 위해 낮은 pH 완충액 (예를 들어, 5.0 이하의 pH, 예를 들어, pH 4.0)이 사용될 수 있다.
또한, 검정 동안 IAIP를 안정화시키기 위해, 2가 양이온 (예를 들어, Ca2+, Mg2+, Mn2+, Fe2+, 등)이 IAIP 결합제와 접촉 전 또는 접촉 동안 샘플에 첨가될 수 있고, 및/또는 결합제-IAIP 복합체와 접촉 전 또는 접촉 동안 검출제를 함유하는 완충액에 첨가될 수 있다. 2가 양이온은 1 μM 내지 1 M (예를 들어, 100 μM 내지 100 mM, 1 mM 내지 10 mM)의 농도로 제공될 수 있다.
a) IAIP-특이적 항체 결합제 및 IAIP 리간드 검출제
본 명세서에 기재된 방법의 일 예에서, IAIP 결합제는 IAIP에 특이적으로 결합하는 항체 (예를 들어, MAb 69.26 또는 MAb 69.31)이고 검출제는 라벨링된 IAIP 리간드 (예를 들어, 헤파린, 하이알루론산, 또는 LPS)이다. 대안적으로, 리간드는 IAIP 리간드에 대해 특이적인 라벨링된 항체를 사용하여 비표지되고 검출될 수 있거나, 또는 비표지된 리간드는 IAIP 리간드에 대해 특이적인 비표지된 항체를 사용하여 검출될 수 있고, 그런 다음 라벨링된 이차 항체 (예를 들어, IAIP 항체에 결합하지 않지만 IAIP 리간드에 대해 특이적인 항체에 결합하는 라벨링된 이차 항체, 예를 들어, IAIP 항체 및 IAIP 리간드 항체는 상이한 숙주 종에서 생성됨)를 사용하여 검출된다. 리간드가 라벨링된 리간드-특이적 항체, 또는 리간드-특이적 항체 및 라벨링된 이차 항체의 사용을 통해 비표지되고 검출되는 경우, 추가의 세정 단계가 각각의 항체로 인큐베이션 전 및/또는 후에 수행될 수 있다.
b) IAIP 리간드 결합제 및 IAIP-특이적 항체 검출제
본 명세서에 기재된 방법의 또 다른 예에서, IAIP 결합제는 IAIP 리간드 (예를 들어, 헤파린, 하이알루론산, 또는 LPS)이고, 검출제는 IAIP에 대해 특이적인 항체 (예를 들어, MAb 69.26 또는 MAb 69.31)이다. 이 실시예에서, IAIP에 대해 특이적인 항체는 표지에 직접적으로 접합될 수 있거나, 또는 항체는 IAIP-특이적 항체에 결합하는 라벨링된 이차 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 라벨링된 이차 항체가 사용된 경우, 세정 단계는 IAIP 측정 이전에 비-특이적 신호를 최소화하기 위해 이차 항체로 인큐베이션 후에 수행될 수 있다.
c) IAIP 리간드 결합제 및 IAIP 리간드 검출제
본 명세서에 기재된 방법의 제3 예에서, 결합제는 IAIP 리간드 (예를 들어, 하이알루론산)이고, 검출제는 IAIP의 상이한 영역에 결합하는 라벨링된 IAIP 리간드 (예를 들어, 헤파린, 하이알루론산, 또는 LPS)이다. 이 방법은 IAIP의 동일한 영역에 결합하지 않는 임의의 2개의 IAIP 리간드 (예를 들어, IAIP에 대한 결합에 대해 경쟁하지 않거나 또는 IAIP 리간드 중 하나의 결합이 IAIP에 대한 제2 IAIP 리간드의 결합을 입체적으로 방해하지 않는 2개의 IAIP 리간드)로 수행될 수 있다. IAIP 검출제로서 작용하는 리간드는 검출제로 작용하는 IAIP 리간드에 특이적인 라벨링된 항체를 사용하여 비표지되고 검출될 수 있거나, 또는 이것은 검출제로 작용하는 IAIP 리간드에 특이적인 비표지된 항체에 결합하는 라벨링된 이차 항체에 의해 검출될 수 있다. 만일 라벨링된 항체가 검출제로 작용하는 IAIP 리간드의 검출을 위해 사용되는 경우, 추가의 세정 단계가 각각의 항체로 인큐베이션 전 및/또는 후에 수행될 수 있다.
d) IAIP -특이적 항체 결합제 및 IAIP -특이적 항체 검출제
본 명세서에 기재된 방법의 제4 예에서, 결합제는 IAIP-특이적 항체이고 검출제는 라벨링된 IAIP-특이적 항체이다. 　 이 실시예에서, IAIP-특이적 항체 중 적어도 하나는 온전한 IAIP 또는 적어도 하나의 중쇄를 포함하는 IAIP 중 어느 하나에 결합할 수 있다 (예를 들어, 항체는 적어도 하나의 IAIP 중쇄가 존재하지 않는 한 비쿠닌에 결합하지 않고, 예를 들어, 항체는 절단되거나 또는 분해된 IAIP 결여 비쿠닌에 결합하지 않는다). 　 또한, 검정에 사용된 2개의 IAIP-특이적 항체는 IAIP의 상이한 에피토프에 결합한다 (예를 들어, 항체는 IAIP에 대한 결합에 대해 경쟁하지 않는다). 　 2개의 IAIP-특이적 항체가 상이한 숙주 종을 사용하여 생성되는 경우, 검출제로서 사용된 IAIP-특이적 항체는 라벨링된 2차 항체를 사용하여 비표지되고 및 검출될 수 있다. 　 라벨링된 이차 항체가 사용되는 경우, 추가의 세정 단계는 라벨링된 이차 항체로 인큐베이션 전 및/또는 후에 수행될 수 있다.
e) 신속한 측면-흐름 면역검정 ( LFIA )을 사용한 IAIP의 정량화
제5 예에서, 본 명세서에 기재된 방법은 측면-흐름 면역검정-기반 테스트를 사용하여 수행될 수 있다. 이 실시예에서, 샘플의 작은 용적 (예를 들어, 1-30 μL, 예를 들어, 15 μL)이 희석되지 않은 형태 또는 희석된 형태 (예를 들어, 완충액 (예를 들어, PBS) 또는 물로, 예를 들어, 1:2, 1:5, 1:10, 1:20, 1:100 이상 희석됨)로 테스트 스트립 (예를 들어, 셀룰로스, 유리 섬유, 또는 니트로셀룰로스)에 적용될 수 있고 완충액이 그런 다음 첨가되어 스트립을 통해 샘플을 밀어낸다. 스트립은 샘플 내 IAIP에 결합하기 위한 IAIP 결합제 (예를 들어, IAIP-특이적 항체 또는 IAIP 리간드)를 함유한다. IAIP는 샘플의 첨가 전, 후 또는 첨가와 동반하여 스트립에 첨가될 수 있는 IAIP 검출제 (예를 들어, 라벨링된 IAIP-특이적 항체 또는 라벨링된 IAIP 리간드)를 사용하여 검출될 수 있다. 테스트 스트립은 IAIP 검출제에 부착된 표지의 정량화에 적절한 판독기 (예를 들어, 그 중에서도 휴대용 테이블탑 측면 흐름 판독기, 수동 PDA-기반 판독기, 또는 스마트폰/정제 기초 판독기)를 사용하여 판독될 수 있다. 결합제 및 검출제 조합의 선택은 본 명세서에서 설명된 파라미터에 기초하여 이루어질 수 있다. 이 검정은 신속하게 수행될 수 있고 (예를 들어, 15 분 이하, 예컨대 15분, 10분 또는 7분 이하), 작은 샘플 용적에서 IAIP의 정량적이고 신속한 측정을 제공한다.
자연 발생 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 검출
자연 발생 IAIP-IAIP 리간드 복합체 (예를 들어, 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)에서 생체내 형성되고 대상체로부터의 샘플에 존재하는 IAIP-IAIP 리간드 복합체)를 검출하는 방법이 또한 제공된다. 이 방법은 샘플 (예를 들어, 유체 샘플, 예컨대 혈장, 혈청, 혈액, 기관지폐포 유체, 뇌척수액, 가래, 소변 또는 다른 체액)을 결합제, 예를 들어, 지지체 (예를 들어, 고형 지지체)에 부착된 결합제에 접촉시키는 단계를 포함한다. 결합제는 IAIP 결합제 (예를 들어, IAIP에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어, MAb 69.26 또는 MAb 69.31, 또는 IAIP 리간드)일 수 있거나, 또는 결합제는 관심 있는 IAIP 리간드에 특이적으로 결합하는 항체 (예를 들어, 생체내 IAIP-IAIP 리간드 복합체를 형성하는 것으로 의심되는 IAIP 리간드)일 수 있다. 적합한 지지체는 플레이트 (예를 들어, 다중-웰 플레이트), 입자 (예를 들어, 자기 입자, 나노입자, 자기 나노입자), 바이오칩, 수지, 컨테이너 (예를 들어, 튜브), 막 (예를 들어, 니트로셀룰로스 막, PVDF 막), 시험 스트립 (예를 들어, 셀룰로스, 유리 섬유, 또는 니트로셀룰로스) 및 비드 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 비드, 자기 비드, 유리 구슬, 플라스틱 비드)를 포함한다. 지지체는 바람직하게는 결합제에 결합하지 않는 물질을 제거하기 위해 (예를 들어, 완충액, 예컨대 TBS, TBS-T, PBS, 또는 PBS-T를 사용하여) 1회 이상 세정될 수 있다.
검정에서 사용된 결합제가 IAIP 결합제 (예를 들어, IAIP에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어, MAb 69.26 또는 MAb 69.31, 또는 IAIP 리간드)인 경우, IAIP-IAIP 리간드 복합체는 항체를 IAIP 복합체-결합제 복합체에 접촉시킴에 의해 관심 있는 IAIP 리간드에 대해 지향된 항체인 검출제를 사용하여 검출될 수 있다. 검정에서 사용된 결합제가 관심 있는 IAIP 리간드에 특이적으로 결합하는 항체인 경우, IAIP-IAIP 리간드 복합체는 검출제를 IAIP 복합체-결합제 복합체에 접촉시킴에 의해 IAIP (예를 들어, IAIP에 특이적으로 결합하는 항체, 예를 들어, MAb 69.26 또는 MAb 69.31, 또는 상이한 IAIP 리간드)에 특이적으로 결합하는 검출제를 사용하여 검출될 수 있다.
세정 단계 (예를 들어, 하나 이상)는 검출제로 인큐베이션 후 수행될 수 있다. 또한, IAIP 또는 IAIP 리간드 결합제에 샘플의 첨가 전에, 비-특이적 결합을 방지하거나 줄이기 위해 차단 단계가 수행될 수 있다. 본 명세서에서 기재된 방법에서 사용하기 위한 차단제는, 예를 들어, 그 중에서도 밀크, BSA, 카세인, 젤라틴 (예를 들어, 어류 젤라틴), 및 혈청 (예를 들어, 염소 혈청, 당나귀 혈청, 말 혈청, 우태 혈청)을 포함한다.
검출제가 항체 (예를 들어, IAIP-특이적 항체 또는 IAIP 리간드-특이적 항체)인 경우, 검출제는 표지 (예를 들어, 상기에 기재된 표지)에 직접적으로 접합될 수 있거나, 또는 검출제는 검정에 사용된 임의의 다른 항체 (예를 들어, 항체인 경우, 결합제)에 결합하지 않는 라벨링된 이차 항체를 첨가함에 의해 시각화될 수 있다.
검출제가 리간드 (예를 들어, IAIP 리간드, 예컨대 검정에서 검출되는 것과 상이한 IAIP 리간드)인 경우, 검출제는 표지 (예를 들어, 상기에 기재된 표지)에 직접적으로 접합될 수 있거나, 또는 그 다음 검출되어 지는 라벨링된 리간드-특이적 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 대안적으로, 검출제는 비표지된 리간드-특이적 항체 및 검정에서 사용된 임의의 다른 항체에 결합하지 않는 라벨링된 이차 항체 (예를 들어, 항체인 경우, 결합제)를 사용하여 검출될 수 있다. 검출제가 비표지되고 추가의 시약 (예를 들어, 라벨링된 일차 또는 이차 항체)가 사용된 경우, 비-특이적 신호를 최소화하기 위해 하나 이상의 세정 단계가 추가의 시약으로 인큐베이션 후 수행될 수 있다. 표지는 동일한 기질 및 상기에 언급된 이미지형성 방법을 사용하여 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 농도를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 샘플로부터의 신호는 (예를 들어, 표준 곡선을 확립하기 위해) IAIP-IAIP 리간드 복합체의 알려진 농도를 갖는 샘플(들)에서 측정된 신호에 비교될 수 있다. 샘플에서 알려지지 않은 농도는 확립된 표준 곡선에 기초하거나 또는 알려진 기준 농도 값에 기초하여 계산될 수 있다.
IAIP-IAIP 리간드 복합체에서 IAIP 리간드의 동일성이 알려지지 않은 경우, 상기 방법은 결합제로서 IAIP에 특이적으로 결합하는 항체 (예를 들어, 온전한 IAIP 및/또는 IAIP 중쇄에 결합하는 항체)를 사용하여 수행될 수 있다. 　 검출 단계는 그런 다음 상이한 IAIP 리간드에 특이적인 라벨링된 이차 항체를 부가하고, 라벨링된 이차 항체로 인큐베이션 후 세정하고, 그리고 표지로부터 신호를 검출하여 IAIP-IAIP 리간드 복합체에서 IAIP 리간드의 동일성을 결정함에 의해 수행될 수 있다. 　 라벨링된 항체는 IAIP 리간드 확인을 위해 개별적으로 첨가되어 평가될 수 있거나, 또는 이들은 상이한 라벨이 각각의 항체 (예를 들어, 상이한 형광 염료)에 부착 또는 접합되는 경우 동시에 첨가될 수 있다. 　 일단 IAIP 리간드가 확인되면, 샘플 내 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 양은 본 명세서에서 기재된 바와 같이 정량화될 수 있다.
검정에서 포착된 IAIP의 정량화
IAIP 또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체는 표준 곡선을 작성하기 위해 사용된 알려진 양의 IAIP 또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체를 함유하는 샘플과 나란히 관심 있는 샘플을 사용하여 본 명세서에서 기재된 검출 방법을 수행함에 의해 정량화될 수 있다. 대상체로부터의 샘플은 알려진 양의 IAIP 또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체와 동시에 측정될 수 있어 샘플 내 IAIP 또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 농도가 결정될 수 있다. 대상체로부터의 샘플 내 농도는 대조군 모집단, 예컨대 건강한 대조군에서의 동일한 검정을 사용하여 측정된 IAIP 또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 평균 농도에 비교되어, 샘플에서의 IAIP의 농도가 정상 범위내로 되는지, 또는 이환 대조군으로 되는지, 샘플에서의 IAIP의 농도가 질환 상태에 대한 범위내로 되는지 여부가 결정될 수 있다.
대상체로부터의 샘플 내 IAIP 또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체 농도는 본 명세서에서 기재된 방법을 사용하여 테스트 샘플 및 대조군 샘플 둘 모두에서 동시에 IAIP 또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체를 측정함에 의해 건강한 대조군에서의 IAIP 또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체 농도에 또한 비교될 수 있다. 대조군 샘플은 동일한 원료 물질로부터 유래된 것들을 포함한다 (예를 들어, 테스트 샘플 및 대조군 샘플 둘 모두는 동일한 체액 또는 동일한 조직 유형으로부터 유래된다). 동일한 원료 물질로부터 유래된 것 외에도, 테스트 샘플 및 대조군 샘플은 또한 대상체 간의 가능한 변동을 최소화하기 위해 동일한 연령 및/또는 동일한 성별의 대상체로부터 수집될 수 있다. IAIP 농도가 대상체와 건강한 대조군 사이에 직접적으로 비교되는 경우, 건강한 대조군과 비교하여 25% 또는 그 초과의 대상체에서 IAIP 농도의 감소는 상기 대상체가 염증성 질환 또는 병태 또는 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험에 있는 것을 나타낸다.
대안적으로, 대상체로부터의 샘플에서 IAIP 또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체 농도는 알려진 상태 (예를 들어, 건강한 상태 또는 질환 상태) 하에서 IAIP 또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 농도에 대한 사전결정된 컷오프 값과 비교될 수 있다. 컷오프 값은 정상 대상체 또는 질환 대상체의 모집단으로부터 결정된 IAIP 또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 평균 농도일 수 있다.
본 명세서에서 기재된 방법을 사용하여, 건강한 대조군 대상체는 혈장 내에 400 ±140 μg/mL IAIP를 갖는 것으로 밝혀졌지만, 건강한 대상체에서도 또한 더 높은 농도가 관찰되었다. 중증 염증성 질환을 갖는 대상체는 약 200 μg/mL 미만의 IAIP의 평균 농도를 갖는 것으로 밝혀졌다. 약 250 μg/mL의 IAIP 농도는 대상체를 질환 또는 병태 (예를 들어, 염증성 질환 또는 병태 또는 감염)를 갖거나 전개할 위험이 있는 것으로 분류하기 위해 컷오프로서 사용될 수 있다. 이 분류는 치료 또는 추가 진단 시험을 위해 추천된 대상체에 대해 사용될 수 있다. 중간 정도-내지-저수준의 IAIP (예를 들어, 300 내지 200 μg/mL)를 갖는 대상체는, 이들 수준이 염증성 질환 또는 병태 또는 감염을 전개할 위험, 염증성 질환 또는 병태 또는 감염의 존재를 나타낼 수 있거나, 또는 이들이 대상체에 대한 정상의 기준선 수준을 제시할 수 있기 때문에, IAIP 수준이 일정한지 또는 변하는지 (예를 들어, 증가 또는 감소하는지) 여부를 결정하기 위해 경시적으로 (예를 들어, 매주 1회, 매달 2회, 매월 1회, 2개월마다 1회, 연간 3회, 또는 연간 2회) 반복된 시험으로부터의 이점이 있을 수 있다.
검출 검정으로 IAIP 및 IAIP - IAIP 리간드 복합체를 사용하여 질환 상태 또는 질환 위험을 결정하는 방법
본 명세서에서 기재된 IAIP 및 IAIP-IAIP 리간드 복합체 검출 방법은 다양한 대상체, 예컨대 질환 또는 병태 (예를 들어, 염증성 질환 또는 병태 또는 감염 (예를 들어, 박테리아 감염))를 갖거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 IAIP 및/또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체를 측정하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 대상체에서 IAIP 및 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 수준은, 예를 들어, 상기 대상체에서 질환 또는 병태의 존재 또는 상기 대상체가 질환 또는 병태를 전개하는지 또는 전개할 것인지 위험을 진단하거나 또는 질환 또는 병태를 발전 또는 해소하는지에 대해 대상체를 모니터링할 목적을 위해 임의의 상기 검정을 사용하여 평가될 수 있다.
본 검정 방법을 사용하여, 예를 들어, 진단 또는 모니터링될 수 있는 염증성 질환 또는 병태는, 예를 들어, 하기를 포함한다: 급성 염증성 질환, 패혈증, 패혈성 쇼크, 전신 염증 반응 증후군 (SIRS), 트라우마 및/또는 손상 (예를 들어, 상처, 화상, 열상, 타박상, 골절, 수술 과정), 뇌졸중 (예를 들어, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중), 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 폐렴 (예를 들어, 중증 폐렴, 중증 또는 비-중증: 지역사회성 폐렴, 병원 획득된 폐렴, 요양원 획득된 폐렴), 괴사성 전장염, 급성 췌장염, 신장 질환 (예를 들어, 급성 신장 손상, 간 손상, 급성 순환 부전), 자간전증, 암, 암 전이, 종양 침습, 주변 동맥 질환, 1형 또는 2형 당뇨병, 죽상경화성 심혈관 질환, 간헐적 파행, 치명적 사지 허혈성 질환, 심근경색증, 경동맥 폐색, 탯줄 폐색, 저 체중 출생, 미성숙한 출생, 수술-유도된 염증, 농양-연관된 염증, 폐 결핍, 말초 신경병증, 저산소 허혈 (예를 들어, 신생아 저산소 허혈성 뇌 손상 또는 저산소 허혈성 뇌병증), 조직 허혈 (예를 들어, 골격 근육, 평활근, 심장 근육, 뇌, 피부 간엽 조직, 결합 조직, 위장 조직, 또는 뼈의 허혈), 류마티스성 관절염, 수막염, 다발성 경화증, 염증성 장 질환 (예를 들어, 크론병), 만성적 폐쇄성 폐 질환, 비염, 조기 분만, 또는 감염성 질환 (예를 들어, 인플루엔자 또는 바이러스성 감염, 예를 들어, 뎅기열 또는 웨스트 나일 열).
본 검정 방법을 사용하여, 예를 들어, 진단 또는 모니터링될 수 있는 감염은, 예를 들어, 하기로의 감염을 포함한다: 그람 음성 박테리아, 예컨대 나이세리아 종으로 하기를 포함함; 나이세리아 고노르호아에 및 나이세리아 메닌기티디스 , 브란하멜라 종으로 하기를 포함함; 브란하멜라 카타르할리스, 에스케리치아 종으로 하기를 포함함; 에스케리치아 콜라이 , 엔테로박터 종, 프로테우스 종으로 하기를 포함함; 프로테우스 미라빌리스, 슈도모나스 종으로 하기를 포함함; 슈도모나스 에어루기노사 , 슈도모나스 말레이, 및 슈도모나스 슈포말레이 , 클렙시엘라 종으로 하기를 포함함; 클렙시엘라 뉴모니아에 , 살모넬라 종, 시겔라 종, 세라티아 종, 아시네토박터 종; 헤모필루스 종으로 하기를 포함함; 헤모필루스 인플루엔자 및 헤모필루스 두크레이, 브루셀라 종, 예르시니아 종 으로 하기를 포함함; 예르시니아 페스티스 및 예르시니아 엔테로콜리티카 , 프란시셀라 종으로 하기를 포함함; 프란시셀라 툴라렌시스 , 파스투렐라 종으로 하기를 포함함; 파스튜렐라 멀토시다 , 비브리오 콜레라에, 플라보박테리움 종, 메닝고셉티쿰 , 캄필로박터 종으로 하기를 포함함; 캄필로박터 제주니, 박테로이데스 종 (경구, 인두)으로 하기를 포함함; 박테로이데스 프라길리스 , 푸소박테리움 종으로 하기를 포함함; 푸소박테리움 뉴클레아툼 , 칼림마토박테리움 그라눌라마티스 , 스트렙토바실러스 종으로 하기를 포함함; 스트렙토바실러스 모닐리포르미 , 및 레지오넬라 종으로 하기를 포함함; 레지오넬라 뉴모필라.
본 명세서에 기재된 검정은 염증성 질환 또는 병태 또는 감염을 전개할 위험이 있는 대상체에서 IAIP 수준을 측정하기 위해 사용될 수 있다. 위험 인자는 면역억제, 면역결핍 (예를 들어, 면역저하된 대상체), 고령, 화상 (예를 들어, 열 화상), 트라우마, 수술, 이물질, 암, 미성숙한 출생 (예를 들어, 조기에 태어난 신생아), 비만, 및 대사 증후군을 포함한다.
본 명세서에서 기재된 방법은 일상적인 물리적 시험의 일부로 또는 건강의 일반적인 평가로 수행될 수 있다.
질환 상태 또는 질환의 위험의 진단
본 명세서에 기재된 검정은 대상체가 염증성 질환 또는 병태 또는 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험에 있는지 여부를 결정하기 위해 전통적인 진단 방법과 함께 사용될 수 있다. 본 검정을 사용하여 수득된 IAIP 측정은 또한 환자가 IAIP 치료 또는 항-염증성 또는 항-감염성 요법에 대한 후보인지 또는 IAIP의 투여에 대한 반응을 예측하는지 (예를 들어, 낮은 수준의 IAIP를 갖는 환자가 IAIP로 치료될 수 있는지 및/또는 IAIP로 치료에 유리하게 반응할 수 있는지) 여부를 결정하는데 사용될 수 있다. IAIP의 측정은 적절한 것으로 간주된 경우 (예를 들어, IAIP 수준이, 예를 들어, 건강한 대상체에서의 정상 IAIP 수준인 것으로 간주된 것보다 적어도 25% 낮은 것으로 결정된 경우, 또는 IAIP 수준이 200 μg/mL 미만인 경우)에 이어서 IAIP의 투여가 대상체에 대한 항-염증성 또는 항-감염성 요법일 수 있다.
대상체로부터 샘플 내 IAIP 및/또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 측정은 상기 대상체가 염증성 질환 또는 병태 또는 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험에 있는지 여부를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 상기 방법은 상기 기재된 방법 중 하나를 사용하여 IAIP 및/또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 수준을 측정하는 단계, 및 본 수준을 대조군 값 (예를 들어, 건강한 환자로부터의 기준 샘플 또는 명백하게 건강한 환자의 모집단의 측정으로부터 얻은 평균값)과 비교하는 단계를 포함한다. 건강한 대조군에 비교하여 대상체에서 감소된 수준의 IAIP (예를 들어, 대조군에 비교하여 대상체에서 25%, 30%, 40%, 50% 또는 그 초과로 낮은 수준) 또는 약 250 μg/mL 이하의 IAIP 농도는 상기 대상체가 염증성 질환 또는 병태 또는 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험에 있다는 것을 나타낸다. 건강한 대조군에 비교하여 대상체에서 상승된 수준의 IAIP-IAIP 리간드 복합체 (예를 들어, 대조군에 비교하여 대상체에서 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% 또는 그 초과로 더 높은 수준)는 상기 대상체가 염증성 질환 또는 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험에 있다는 것을 나타낸다.
자연 발생 IAIP-IAIP 리간드 복합체에서 IAIP에 결합된 리간드의 동일성은 또한 대상체가 발병하거나 발병할 위험이 있는 염증성 질환 또는 감염의 유형에 대한 통찰력을 제공할 수 있다. 예를 들어, 대상체로부터의 샘플에서 IAIP-LPS 복합체의 상승된 수준을 검출하는 것은 상기 대상체가 감염 (예를 들어, 박테리아 감염)을 갖거나 전개할 위험이 있음을 나타낼 수 있고, 대상체로부터의 샘플에서 IAIP-히스톤 복합체의 상승된 수준을 검출하는 것은 대상체가 급성 전신 염증성 질환 (예를 들어, 패혈증 또는 뇌졸중)을 갖거나 전개할 위험이 있음을 나타낼 수 있다. 이러한 측정은 특정 염증성 질환 또는 감염이 있는 대상체를 진단하거나 치료의 요법 또는 치료 과정을 추천하는데 사용될 수 있다.
질환 중증도
본 명세서에서 기재된 방법 또한 질환 중증도를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 검정을 사용하여 측정될 때, 약 200 μg/mL 미만의 IAIP 농도를 갖는 대상체는 중증의 염증 또는 감염을 갖거나 또는 전개할 고위험이 있거나 또는 이환율 및/또는 사망률 위험이 더 큰 것으로 분류될 수 있다. 대안적으로, 본 명세서에 기재된 검정을 사용하여 측정될 때, 상승된 수준의 IAIP-IAIP 리간드 복합체를 갖는 대상체 (예를 들어, 건강한 대조군 또는 알려진 기준 농도 값에 비교하여 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 초과로 더 높은 IAIP-IAIP 리간드 복합체, 예컨대 IAIP-LPS 복합체의 수준을 갖는 대상체)는 중증의 염증 또는 감염을 갖거나 또는 전개할 고위험이 있거나 또는 이환율 및/또는 사망률 위험이 더 큰 것으로 분류될 수 있다. 일단 중증도가 평가되면, 상응하는 치료 과정이 권고될 수 있다. 중증의 염증을 나타내는 IAIP 농도를 갖는 대상체는 IAIP 농도가 염증성 질환 또는 병태를 갖거나 전개할 위험이 중간 정도 또는 낮은 위험을 나타내는 대상체보다 더 빈번하거나 더 공격적인 치료를 위해 선택될 수 있다. 본 명세서에 기재된 검정은 온전한 IAIP를 측정하는데 사용될 수 있고, 따라서 생명을 위협하는 병태를 검출하고 적절한 치료적 반응에 대한 필요성을 평가하는데 사용될 수 있다.
모니터링
염증성 질환 또는 병태 또는 감염이 이전에 있었거나 전개할 위험이 있는 대상체 (예를 들어, 유전적 소인이 있는 대상체, 질환 또는 감염이 있는 타인에게 노출된 대상체, 또는 상기 기재된 임의의 위험 인자를 갖는 대상체)는 본 명세서에서 기재된 방법을 사용하여 모니터링될 수 있다. 모니터링은 또한, 특히 대상체가 명확한 염증 또는 감염의 증상을 나타내지 않는 경우, 중간 정도-내지-낮은 IAIP 수준 (예를 들어, 300 내지 200 μg/mL)을 가진 대상체 및/또는 약간 상승된 수준의 IAIP-IAIP 리간드 복합체 (예를 들어, 건강한 대조군 또는 알려진 기준 농도 값에 비교하여 1%, 5%, 또는 10% 더 높은 IAIP-IAIP 리간드 복합체, 예컨대 IAIP-LPS 복합체의 수준을 갖는 대상체)를 갖는 대상체에 대한 적합한 접근법일 수 있다. IAIP 및/또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체 측정은 IAIP 및/또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체 수준이 일정한지 또는 변하는지 여부를 결정하기 위해 규칙적 간격 (예를 들어, 1년에 1회, 1년에 2회, 3개월에 1회, 매월 1회, 매월 2회, 또는 매주 1회)으로 수행될 수 있다. IAIP의 수준이 증가하는 것 및/또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 수준이 감소하는 것은 개선을 나타내고 모니터링 및/또는 치료의 중단으로 이어질 수 있다. IAIP의 수준이 감소하는 것 및/또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 수준이 증가하는 것은 회복하는 대상체에서 재발 또는 염증성 질환 또는 감염의 전개 또는 악화되는 것을 나타낼 수 있고, 진단 시험 (예를 들어, 더 큰 빈도) 및 치료의 개시, 또는 증가 또는 변화로 이어질 수 있다.
치료 효능
본 명세서에서 기재된 방법은 염증성 질환 또는 병태 또는 감염에 대해 (예를 들어, 항생제, 항-염증제, 항-감염제, 또는 IAIP로) 치료되고 있는 대상체에서 치료 효능을 평가하기 위해 또한 사용될 수 있다. IAIP 수준은 치료의 개시 전후에 측정될 수 있고 그리고 그 다음 치료 동안 (예를 들어, 1일 1회, 주 1회, 격주, 1개월 1회, 2개월마다, 3개월에 1회, 또는 1년에 2회) 지속적으로 측정될 수 있다. 치료 과정 동안 IAIP 수준에서의 증가 (예를 들어, 이전 측정에 비하여 1%, 5%, 10%, 20%, 30% 또는 그 초과의 증가)는 개선을 나타낼 수 있고 치료의 유효성을 입증하는 반면, 일정한 또는 감소하는 IAIP 수준 (예를 들어, 이전 측정에 비하여 변화는 나타내지 않거나 또는 1%, 5%, 10%, 20%, 30% 또는 그 초과의 감소를 나타내는 하나 이상의 측정)은 개선이 없는 것을 나타낼 수 있고 치료의 과정이 변형 또는 변화되어야 한다 (예를 들어, 용량 또는 빈도 또는 둘 모두가 증가되거나, 상이한 치료제로 변화되거나, 또는 추가의 치료제를 포함하도록 변형되어야 한다)는 것을 시사한다.
대안적으로, 또는 IAIP 측정에 부가하여, IAIP-IAIP 리간드 복합체 (예를 들어, IAIP-LPS)의 검출은 염증성 질환 또는 감염의 위험을 치료 또는 감소시키기 위한 요법으로 치료의 효능을 평가하는데 사용될 수 있다. 상기 방법은 치료 개시 전후에 치료를 받는 대상체에서 바이오마커로서 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 수준을 측정하고 그 다음 치료 동안 (예를 들어, 1일 1회, 주 1회, 격주, 1개월 1회, 2개월마다, 3개월에 1회, 또는 1년에 2회) 지속적으로 측정하는 단계를 포함한다. IAIP-IAIP 리간드 복합체의 수준은 대조군 값 (예를 들어, 건강한 환자로부터의 기준 샘플 또는 대조군 대상체의 모집단 (예를 들어, 건강한 환자)의 측정으로부터 얻은 평균 값)에 대한 수준 또는 대상체로부터 얻어진 이전의 측정치에 비교될 수 있다. “정상 수준”을 향한 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 수준에서의 감소 또는 치료 도중 후기 시점에서의 감소 (예를 들어, 이전 측정에 비교하여 1%, 5%, 10%, 20%, 30% 또는 그 초과의 감소)는 요법이 효과적임을 나타낼 것이다. IAIP-IAIP 리간드 복합체의 수준에서의 증가 (예를 들어, 이전 측정 또는 “정상 수준”에 비하여 1%, 5%, 10%, 20%, 30% 또는 그 초과의 증가)는 치료가 효과 없고 변형 (예를 들어, 더 높은 용량, 더 빈번한 투여, 또는 둘 모두, 또는 상이한 치료적 또는 병용 요법)을 요한다는 것을 나타낼 것이다.
치료 방법
본 발명은 또한 본 명세서에서 기재된 진단 방법에 따라 필요한 것으로 결정된 대상체 (예를 들어, 인간) (예를 들어, 기준에 비교하거나 또는 이전 측정에 비교하여 낮은 IAIP 수준 및/또는 상승된 수준의 IAIP-IAIP 리간드 복합체를 갖는 대상체)에서 염증성 질환 또는 병태 또는 감염 (예를 들어, 중증 감염)을 치료, 예방 또는 그것을 전개할 위험을 감소시키는 방법을 특징으로 한다. 상기 대상체는 질환 또는 병태에 대해 적절한 관리 기준 치료제 및/또는 IAIP로 치료될 수 있다. 상기 대상체는 신생아, 아동, 청소년, 또는 성인일 수 있다.
IAIP 또는 다른 치료제를 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하기 전에, IAIP 농도가 본 명세서에서 기재된 방법에 따라 대상체로부터의 샘플에서 측정될 수 있다. 대안적으로 또는 IAIP 수준의 측정에 부가하여, 상기 방법은 IAIP의 투여 전에 IAIP-IAIP 리간드 복합체를 검출하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 방법은 박테리아 감염 (예를 들어, 그람 음성 박테리아 감염)이 있거나 있는 것으로 의심되는 대상체에서 IAIP-LPS 복합체를 검출하는 단계, 및/또는 대상체로부터의 샘플에서 IAIP 농도를 측정하는 단계, 및 IAIP를 상기 대상체에게 투여하는 단계 (예를 들어, IAIP를 건강한 대조군 또는 기준 값에 비교하여 증가된 수준의 IAIP-LPS 복합체 (예를 들어, 건강한 대조군에서의 수준보다 1%, 5%, 10%, 20%, 30% 또는 그 초과로 더 높은 IAIP-LPS 복합체의 수준)를 갖는 대상체에게 투여하는 단계, 또는 IAIP를 전신 염증 또는 쇼크 증후군의 위험이 있는 대상체 (예를 들어, 건강한 대조군의 것보다 적어도 25% 미만의 IAIP 수준을 갖는 대상체)에게 투여하는 단계)를 포함할 수 있다.
IAIP 또는 IAIP를 함유하는 조성물은 (예를 들어, 본 명세서에서 기재된 방법 중 하나 이상을 사용하여 결정된 바와 같이) 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. IAIP로 치료될 수 있는 대상체는 감염 (예를 들어, 그람 음성 박테리아 감염)이 있는 대상체 또는 감염을 전개할 상승된 위험이 있는 대상체 (예를 들어, 면역억제, 면역결핍 (예를 들어, 면역저하된 대상체), 고령, 화상 (예를 들어, 열 화상), 트라우마, 수술, 이물질, 암, 최근 출생 (예를 들어, 신생아), 미성숙한 출생 (예를 들어, 조기에 태어난 신생아), 비만, 및 대사 증후군을 포함한 하나 이상의 위험 인자가 있는 대상체)를 포함한다. 감염은 그람 음성 박테리아 감염으로부터 리포폴리사카라이드 (LPS) 분자의 방출에 의해 유발된 내독소로부터 유래할 수 있다. 그람 음성 박테리아에 의한 중증 감염은 중증 전신 염증, 패혈증, 쇼크 증후군, 및 사망으로 이어질 수 있다. 본 명세서에서 나타낸 바와 같이, IAIP는 LPS에 결합하고, 따라서, IAIP의 투여는 그람 음성 박테리아에 감염된 대상체를 치료하기 위해 사용되어 LPS-유도된 세포독성을 감소시키거나 예방할 수 있다.
IAIP로 치료에 대해 적합한 감염은 하기로의 감염을 포함한다: 그람 음성 박테리아, 예컨대 나이세리아 종으로 하기를 포함함; 나이세리아 고노르호아에 및 나이세리아 메닌기티디스 , 브란하멜라 종으로 하기를 포함함; 브란하멜라 카타르할리스, 에스케리치아 종으로 하기를 포함함; 에스케리치아 콜라이 , 엔테로박터 종, 프로테우스 종으로 하기를 포함함; 프로테우스 미라빌리스, 슈도모나스 종으로 하기를 포함함; 슈도모나스 에어루기노사 , 슈도모나스 말레이, 및 슈도모나스 슈포말레이 , 클렙시엘라 종으로 하기를 포함함; 클렙시엘라 뉴모니아에 , 살모넬라 종, 시겔라 종, 세라티아 종, 아시네토박터 종; 헤모필루스 종으로 하기를 포함함; 헤모필루스 인플루엔자 및 헤모필루스 두크레이, 브루셀라 종, 예르시니아 종 으로 하기를 포함함; 예르시니아 페스티스 및 예르시니아 엔테로콜리티카 , 프란시셀라 종으로 하기를 포함함; 프란시셀라 툴라렌시스 , 파스투렐라 종으로 하기를 포함함; 파스튜렐라 멀토시다 , 비브리오 콜레라에, 플라보박테리움 종, 메닝고셉티쿰 , 캄필로박터 종으로 하기를 포함함; 캄필로박터 제주니, 박테로이데스 종 (경구, 인두)으로 하기를 포함함; 박테로이데스 프라길리스 , 푸소박테리움 종으로 하기를 포함함; 푸소박테리움 뉴클레아툼 , 칼림마토박테리움 그라눌라마티스 , 스트렙토바실러스 종으로 하기를 포함함; 스트렙토바실러스 모닐리포르미 , 및 레지오넬라 종으로 하기를 포함함; 레지오넬라 뉴모필라.
(예를 들어, 본 명세서에서 기재된 방법 중 하나 이상을 사용하여) 치료가 필요한 것으로 결정되거나 또는 이러한 필요성이 결정된 후 IAIP로 치료될 수 있는 대상체는 또한 하기를 갖거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 대상체를 포함한다: 염증성 질환 또는 병태 예컨대 급성 염증성 질환, 패혈증, 패혈성 쇼크, 멸균 패혈증, 전신 염증 반응 증후군 (SIRS), 트라우마/손상 (예를 들어, 상처, 화상, 열상, 타박상, 골절, 수술 과정), 뇌졸중 (예를 들어, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중), 급성 폐 손상, 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 폐렴 (예를 들어, 중증 폐렴, 중증 또는 비-중증: 지역사회성 폐렴, 병원 획득된 폐렴, 요양원 획득된 폐렴), 괴사성 전장염, 급성 췌장염, 급성 신장 손상을 포함한 신장 질환, 간 손상, 급성 순환 부전, 자간전증, 암, 암 전이, 종양 침습, 주변 동맥 질환, 1형 또는 2형 당뇨병, 죽상경화성 심혈관 질환, 간헐적 파행, 치명적 사지 허혈성 질환, 심근경색증, 경동맥 폐색, 탯줄 폐색, 저 체중 출생, 미성숙한 출생, 수술-유도된 염증, 농양-연관된 염증, 폐 결핍, 말초 신경병증, 저산소 허혈 (예를 들어, 신생아 저산소 허혈성 뇌 손상 또는 저산소 허혈성 뇌병증), 조직 허혈 (예를 들어, 골격 근육, 평활근, 심장 근육, 뇌, 피부 간엽 조직, 결합 조직, 위장 조직, 또는 뼈의 허혈), 류마티스성 관절염, 수막염, 다발성 경화증, 염증성 장 질환 (예를 들어, 크론병), 만성적 폐쇄성 폐 질환, 비염, 조기 분만, 또는 감염성 질환 (예를 들어, 인플루엔자 또는 바이러스성 감염, 예를 들어, 뎅기열 또는 웨스트 나일 열); 낮은 IAIP 수준 (예를 들어, 250, 225, 200, 175, 150 μg/mL 이하의 IAIP 수준)을 갖는 대상체, 및 증가된 수준의 질환-연관된 IAIP-IAIP 리간드 복합체 (예를 들어, IAIP-LPS 또는 IAIP-히스톤)를 갖는 대상체.
투여
IAIP (예를 들어, IαI 및/또는 PαI), 또는 이러한 단백질 및 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제, 또는 담체를 함유하는 조성물은 하기 방법에 따라 필요한 것으로 결정된 염증성 질환 또는 병태 또는 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 대상체 (예를 들어, 인간)에게 하기에 의해 투여될 수 있다: 본 명세서에서 기재된 진단 방법에 따라 (예를 들어, 기준에 비교하거나 또는 사전 측정에 비교하여 낮은 IAIP 수준 및/또는 상승된 수준의 IAIP-IAIP 리간드 복합체를 갖는 대상체) , 예를 들어, 비경구로, 흡입에 의해 스프레이, 국소적으로, 비강으로, 협측으로, 설하로, 비강내로, 경구 투여에 의해, 흡입, 좌약, 직장으로, 질로, 또는 주사에 의한 것을 포함한 임의의 적합한 경로에 의함.주사에 의한 투여는, 예를 들어, 정맥내, 복강내, 피하, 진피내, 피부내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내, 흉골내, 척추강내, 병소내, 유리체내, 및 두개내 주사를 포함한다. 환자가 입원한 경우, 바람직한 투여 방법은 정맥내 주사에 의한 것이다.
본 IAIP (예를 들어, IαI 및/또는 PαI) 또는 이러한 단백질을 함유하는 조성물은 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 또는 24 시간마다 1회 이상; 매 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 일마다 1회 이상; 또는 매 1, 2, 3, 또는 4 주마다 1회 이상 대상체에게 투여될 수 있다. 다른 사례에서, 본 IAIP (예를 들어, IαI 및/또는 PαI) 또는 이러한 단백질을 함유하는 조성물은 연속적 주입으로 투여된다.
본 발명의 조성물에서 사용하기 위한 IAIP (예를 들어, IαI 및/또는 PαI)은 당해 분야에서 알려진 방법에 의해, 예를 들어, 인간 혈장 및 혈액으로부터 수득될 수 있다 (하기 참고, 예를 들어, 미국특허 번호 9,139,641, 이것은 전체적으로 참고로 본 명세서에 편입된다).
특히, IAIP는 천연 공급원 (예를 들어, 혈액)으로부터 80% 내지 100% (예를 들어, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 100%)의 순도로 수득될 수 있고 본 발명의 조성물을 제조하기 위해 사용될 수 있다 (하기 참고, 예를 들어, 미국특허 번호 7,932,365, 이것은 전체적으로 참고로 본 명세서에 편입된다). 본 발명의 조성물에서 사용하기 위한 IAIP는 또한 정제 동안 낮은 pH 조건 (예를 들어, 약 4.0 이하의 pH, 예를 들어, 약 pH 3.6 이하를 갖는 세정 완충액)에 노출될 수 있다 (다음에 기재된 바와 같음: 미국특허 번호 9,139,641).
본 조성물은 임의의 적합한 IAIP, 예를 들어, IαI, PαI, 중쇄, 경쇄, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 조성물은 IαI, PαI, 및/또는 비쿠닌을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본 조성물은 IαI 및 PαI을 포함할 수 있다. 중쇄는 H1, H2, H3, H4, 또는 H5일 수 있다. 경쇄는 비쿠닌일 수 있다.
조성물에서 IAIP (예를 들어, IαI 및/또는 PαI)의 비율 및 농도는 투약량, 화학적 특성 (예를 들어, 소수성), 및 투여 경로를 포함한 수많은 인자에 의존하여 다양할 수 있다. IAIP (예를 들어, IαI 및/또는 PαI)는 생리적 비율로 조성물에 존재할 수 있다. 생리적 비율은, 예를 들어, 건강한 사람 또는 동물에서 발견된 비율 및/또는 인간 혈장에서 자연적으로 나타나는 IαI 및 PαI의 비율일 수 있다. 생리적 비율은 전형적으로 약 60% 내지 약 80% IαI 및 약 20% 내지 약 40% PαI이다.
IAIP (예를 들어, Iαl 및/또는 PαI) 또는 이들의 조성물은, 예를 들어, 약 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 7.5, 또는 10 시간 초과의 반감기를 가질 수 있다. IAIP (예를 들어, Iαl 및/또는 PαI) 또는 이들의 조성물은 약 5 시간 초과 또는, 바람직하게는, 약 10 시간 초과의 반감기를 가질 수 있다. 예를 들어, 경시적으로 대상체에게 더 적은 용량이 투여될 필요가 있기 때문에 더 긴 반감기가 바람직하다.
투약량
본 명세서에서 기재된 진단 방법에 따라 필요한 것으로 결정된 염증성 질환 또는 병태 또는 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험 대상체 (예를 들어, 기준에 비교하거나 또는 사전 측정에 비교하여 낮은 IAIP 수준 및/또는 상승된 수준의 IAIP-IAIP 리간드 복합체를 갖는 대상체)에게 투여를 위한 본 발명의 약제학적으로 허용가능한 조성물은 당업계에서 알려진 투약량으로 IAIP (예를 들어, IαI 및/또는 PαI)를 포함한다 (하기 참고, 예를 들어, 미국특허 번호 7,932,365, 국제 특허 출원 공개 번호 WO2009154695, 및 미국특허 출원 공개 번호 2009/0190194, 이들 각각은 본 명세서에 전체적으로 참고로 편입된다). 예를 들어, 본 발명의 조성물은 약 1 mg/kg 내지 50 mg/kg 범위인 투약량, 바람직하게는 10 mg/kg과 30 mg/kg 사이의 투약량으로 투여될 수 있다. 용량은 매 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 또는 24 시간, 매 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6, 일, 또는 매 1, 2, 3, 또는 4 주 마다 1회 이상, 또는 필요에 따라 투여될 수 있다. 상기 언급된 것보다 더 낮거나 더 높은 용량이 유리할 수 있다. 임의의 특정 대상체에 대한 특이적 투약량 및 치료 레지멘은 이용된 특이적 조성물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강 상황, 성별, 다이어트, 투여 시간, 배출 속도, 약물 조합체, 질환의 중증도 및 경과 (예를 들어, 환자의 상태 및/또는 증상), 질환에 대한 대상체의 성향, 및 치료하는 의료 전문가 (예를 들어, 의사)의 판단을 포함한 다양한 인자에 의존할 것이다. IAIP는 단일 투약 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있다.
본 명세서에서 기재된 바와 같이 IAIP 및/또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체의 측정에 의해 또는 증상의 개선에 기초하여 평가된 바와 같이, 환자의 상태의 개선에 의해, 유지 용량의 IAIP 조성물 또는 병용 요법이 필요하면 투여될 수 있다. 결과적으로, 투약량 또는 투여 빈도, 또는 둘 모두는 증상에서의 감소의 기능에 따라 개선된 상태가 유지되는 수준으로 감소될 수 있다. 증상이 원하는 수준으로 경감되거나 IAIP가 증가하거나 및/또는 IAIP-IAIP 리간드 복합체가 원하는 수준으로 감소한 경우, 치료는 중단될 수 있다. 그러나, 대상체는 질환 증상의 임의의 재발 또는 IAIP 수준의 감소에 따라 장기간에 걸쳐 간헐적인 치료를 요구할 수 있다. 상태의 개선은 또한 환자로부터 유래된 생물학적 샘플 (예를 들어, 혈액 (예를 들어, 전혈, 혈장, 또는 혈청), 기관지의 세척 유체 (BALF), 가래, 소변, 뇌척수액 (CSF), 또는 조직 균질물 (예를 들어, 간 생검의 균질물)에서 lαIp의 수준에 기초하여 판단될 수 있다. 생물학적 샘플에서 lαIp 및/또는 IAIP-IAIP 복합체의 수준은 본 명세서에 기재된 검정 중 하나 이상을 사용하여 결정될 수 있다.
제형
본 발명은 하기 방법에 따라 필요한 것으로 결정된 염증성 질환 또는 병태 또는 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 대상체에게 IAIP를 투여하는 방법을 제공한다: 본 명세서에서 기재된 진단 방법에 따른 방법(예를 들어, 본 명세서에서 기재된 방법에 따라 측정될 때 저수준의 IAIP 및/또는 상승된 수준의 IAIP-IAIP 리간드 복합체, 예를 들어, IAIP-LPS 복합체를 갖는 것으로 밝혀진 대상체). 본 방법은 하기의 투여를 포함한다: IAIP (예를 들어, IαI 및/또는 PαI), 하기를 포함하는 조성물: IAIP (예를 들어, IαI 및/또는 PαI) 및 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 또는 희석제, 또는 본 명세서에 기재된 바와 같은 2차 치료와 조합된 이와 같은 조성물. 본 조성물은 고체 또는 액체로 제형화될 수 있다. 본 조성물은 본 명세서에서 기재된 것을 포함한 임의의 적당한 수단에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다.
주입가능 형태의 IAIP가 투여에 특히 바람직하다. IAIP 및 이를 함유하는 조성물은 정맥내, 복강내, 피하, 피부내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내, 흉골내, 척추강내, 진피내, 유리체내, 병소내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 위해 제형화될 수 있다. 약제학적 조성물은 멸균 주사가능 제제의 형태, 예를 들어, 멸균 주입가능 수성 또는 지질생산성 현탁액으로 될 수 있다. 이 현탁액은 적합한 분산제 또는 습윤제 (예컨대, 예를 들어, TWEEN® 80) 및 현탁화제를 사용하여 당업계에서 알려진 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사가능 제제는 또한 무독성 비경구로 허용가능한 희석제 또는 용매 중의 멸균 주입가능 용액 또는 현탁액일 수 있다.
조성물은 또한 비제한적으로, 캡슐, 정제, 알약, 에멀션 및 수성 현탁액, 분산물 및 용액을 포함한, 임의의 경구로 허용가능한 투약 형태로 경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 고체 조성물, 예컨대 정제를 제조하기 위해, IAIP는 약제학적 부형제와 혼합되어 균질한 혼합물을 함유하는 고체 사전-제형 조성물을 형성할 수 있다. 이 고체 사전-제형은 그런 다음, 예를 들어, 1 mg/kg 내지 약 50 mg/kg의 IAIP (예를 들어, IαI 및/또는 PαI)를 함유하는 상기 기재된 유형의 단위 투약 형태로 세분될 수 있다. 고체 사전-제형은 약 10 mg/kg 내지 30 mg/kg의 IAIP (예를 들어, IαI 및/또는 PαI)를 함유할 수 있다. 본 발명의 정제 또는 알약은 코팅되거나 달리 배합되어 지속 작용의 이점을 제공하는 투약 형태를 제공할 수 있다.
조성물을 경구로 또는 주사로 투여하기 위해 편입될 수 있는 액체 형태는 수용액, 적합하게 풍미 시럽, 수성 또는 오일 서스펜션, 및 식용 오일 예컨대 목화씨 오일, 참께 오일, 코코넛 오일, 또는 땅콩 오일을 갖는 풍미 에멀션, 뿐만 아니라 엘릭시르 및 유사한 약제학적 비히클을 포함한다.
흡입 또는 취입용 조성물은 약제학적으로 허용가능한 수성 또는 유기 용매, 또는 이들의 혼합물에서의 용액 및 현탁액, 및 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 본 명세서에서 기재된 바와 같은 및/또는 당업계에서 알려진 적합한 약제학적으로 허용가능한 부형제를 함유할 수 있다. 본 조성물은 국소 또는 전신 효과를 위해 경구 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여될 수 있다. 조성물은 불활성 가스의 사용에 의해 분무될 수 있다.
원하는 치료가 국소 적용에 의해 용이하게 접근가능한 영역 또는 기관을 포함할 때 조성물의 국소 투여 유용하다. 피부에 국소적으로 적용하기 위해, 조성물은 담체에 현탁되거나 용해된 활성 성분을 함유하는 적합한 연고로 제형화 되어야 한다. 대안적으로, 약제학적 조성물은 적합한 유화제와 함께 담체에 현탁되거나 용해된 활성 조성물을 함유하는 적합한 로션 또는 크림으로 제형화될 수 있다.
약제학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌약의 형태로 투여될 수 있다. 이들 조성물은 본 발명의 조성물을 실온에서 고체이지만 직장 온도에서 액체인 적합한 무-자극성 부형제와 혼합함으로써 제조될 수 있으며, 따라서 직장에서 녹아 활성 성분을 방출할 것이다. 국소적-경피 패치가 또한 본 발명에 포함된다.
대상체에게 투여되는 조성물은 상기 기재된 하나 이상의 약제학적 조성물의 형태일 수 있다. 이들 조성물은 통상적인 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나 또는 멸균 여과될 수 있다. 수용액은 있는 그대로 사용하기 위해 포장되거나, 또는 동결건조될 수 있으며, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수성 담체와 조합된다.
다른 전달 시스템은 적기 방출, 지연 방출 또는 지속 방출 전달 시스템을 포함할 수 있다. 이러한 시스템은 본 발명의 조성물의 반복된 투여를 피할 수 있어, 대상체 및 의사의 편의성을 증가시킨다. 많은 유형의 방출 전달 시스템이 이용가능하고 당해 분야의 숙련가에게 알려져 있다. 이들은 다음에 기재된 것들과 같은 폴리머 기반 시스템을 포함한다 (미국특허 번호 3,773,919; 유럽 특허 번호 58,481, 유럽 특허 번호 133, 988, Sidman, K.R. 등, Biopolymers 22:547-556, 및 Langer, R. 등, J. Biomed.Mater.Res.15:267-277; Langer, R.Chem.Tech.12:98-105). 다른 지속-방출 조성물의 예는 형상화된 물품, 예를 들어, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태인 반-침투성 폴리머 매트릭스를 포함한다. 전달 시스템은 또한: 지질; 하이드로겔 방출 시스템; 음절 시스템; 펩타이드 기초 시스템; 왁스 코팅물; 통상적인 결합제 및 부형제를 사용한 압축 정제; 부분적으로 융합된 이식물; 등인 비-폴리머 시스템을 포함한다. 이러한 제형의 제조 방법은 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다 (하기 참고, 예를 들어, 미국특허 번호 4,452,775, 4,667,014, 4,748,034 및 5,239,660, 3,832,253, 및 3,854,480).
약제학적 제제를 제형화하는 방법은 당해 기술에 공지되어 있는데, 예를 들어, Niazi, Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations (Second Edition), CRC Press 2009, 는 액체, 멸균, 압축된, 세미-압축된 및 OTC 형태의 제형 발달을 기술한다. 경피 및 점막 전달, 림프계 전달, 나노입자, 조절된 의약품 방출 시스템, 치료진단제, 단백질 및 펩타이드 약물, 및 생물제제 전달이 하기에 기재되어 있다: Wang 등, Drug Delivery:Principles and Applications (Second Edition), Wiley 2016; 펩타이드 및 단백질 제제의 제형 및 전달은, 예를 들어, 하기에 기재되어 있다: Banga, Therapeutic Peptides and Proteins: Formulation, Processing, and Delivery Systems (Third Edition), CRC Press 2015.
병용 요법
본 발명의 방법은 또한 하기를 위해 제2 치료를 투여하거나 또는 함께 투여하는 것을 포함한다: (예를 들어, 독립형 요법으로 또는 다음의 것에 부가하여: IAIP (예를 들어, Iαl 및/또는 PαI) 또는 이들의 조성물) 하기의 치료: 염증성 질환 또는 병태 (예를 들어, 패혈증, 패혈성 쇼크, 멸균 패혈증, SIRS, 트라우마/손상 (예를 들어, 상처, 화상, 열상, 타박상, 골절, 수술 과정), 뇌졸중 (예를 들어, 허혈성 뇌졸중, 출혈성 뇌졸중), 급성 폐 손상, ARDS, 폐렴 (예를 들어, 중증 폐렴, 중증 또는 비-중증: 지역사회성 폐렴, 병원 획득된 폐렴, 요양원 획득된 폐렴), 괴사성 전장염, 급성 췌장염, 급성 신장 손상을 포함한 신장 질환, 간 손상, 급성 순환 부전, 자간전증, 암, 암 전이, 종양 침습, 주변 동맥 질환, 1형 또는 2형 당뇨병, 죽상경화성 심혈관 질환, 간헐적 파행, 치명적 사지 허혈성 질환, 심근경색증, 경동맥 폐색, 탯줄 폐색, 저 체중 출생, 미성숙한 출생, 수술-유도된 염증, 농양-연관된 염증, 폐 결핍, 말초 신경병증, 저산소 허혈, 조직 허혈, 류마티스성 관절염, 수막염, 다발성 경화증, 염증성 장 질환 (예를 들어, 크론병), 만성적 폐쇄성 폐 질환, 비염, 조기 분만, 또는 감염성 질환) 또는 감염 (예를 들어, 박테리아 감염). 예를 들어, 제2 치료는 하기를 투여하는 것을 포함할 수 있다: 대상체가 박테리아 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 경우 항생제, 대상체가 바이러스성 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 경우 항바이러스제 (예를 들어, 뎅기열 또는 웨스트 나일 열), 대상체가 진균 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 경우 항진균제, 대상체가 기생충 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 경우 항기생충제, 대상체가 본 명세서에 기재된 염증성 질환 또는 병태가 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 경우 항-염증제, 대상체가 암 또는 암 전이가 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 경우 항암제, 대상체가 뇌졸중 또는 심근경색증이 있거나 또는 그 위험이 있는 경우 항-응고제, 대상체가 암 또는 자가면역 질환 또는 병태 (예를 들어, 염증성 장 질환 또는 류마티스성 관절염)가 있는 경우 면역조절 제제, 및 대상체가 하기가 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 경우 기관지확장제 제제, 보체 억제제, 혈관승압제, 진정제, 또는 기계적 환기: 급성 폐 손상, ARDS, 또는 폐렴.
상기 방법이 하기의 조합을 투여하는 것을 포함할 때, 즉 IAIP (예를 들어, Iαl 및/또는 PαI), 또는 하기를 포함하는 조성물: IAIP (예를 들어, Iαl 및/또는 PαI) 및 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제, 또는 담체, 및 하나 이상의 제2 치료 제제, 각각의 제제는 단일 치료 레지멘으로 정상적으로 투여된 투약량의 약 1 내지 100%, 그리고 더 바람직하게는 약 5 내지 95%의 투약량 수준으로 존재한다. 제2 치료의 제제(들)는 IAIP (예를 들어, Iαl 및/또는 PαI) 또는 이들의 조성물과 별도로, 다중 용량 레지멘의 일부로 투여될 수 있다. IAIP와 제2 치료의 제제(들)는 동시에 또는 임의의 순서로 순차적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 제2 치료의 제제(들)는, 예를 들어, 다음과 함께 혼합된 단일 투약 형태의 일부일 수 있다: IAIP (예를 들어, IαI 및/또는 PαI)와 단일 조성물.
하기와 조합 투여될 수 있는 제제: IAIP (예를 들어, Iαl 및/또는 PαI)는 다음을 포함한다; 디데옥시뉴클레오사이드, 예를 들어 지도부딘 (AZT), 2′,3′-디데옥시이노신 (ddI) 및 2′,3′-디데옥시시티딘 (ddC), 라미부딘 (3TC), 스타부딘 (d4T), 및 트리지비르 (아바카비르+지도부딘+라미부딘); 비-뉴클레오사이드, 예를 들어, 에파비렌즈 (DMP-266, DuPont Pharmaceuticals/Bristol Myers Squibb), 네비라핀 (Boehringer Ingleheim), 및 델라비리딘 (Pharmacia-Upjohn); TAT 길항제 예컨대 Ro 3-3335 및 Ro 24-7429; 프로테아제 억제제, 예를 들어, 퓨린 억제제, 인디나비르 (Merck), 리토나비르 (Abbott), 사퀴나비르 (Hoffmann LaRoche), 넬피나비르 (Agouron Pharmaceuticals), 141 W94 (Glaxo-Wellcome), 아타자나비르 (Bristol Myers Squibb), 암프레나비르 (GlaxoSmithKline), 포삼프레나비르 (GlaxoSmithKline), 티프라나비르 (Boehringer Ingleheim), KALETRA (로피나비르+리토나비르, Abbott), 및 다른 제제 예컨대 9-(2-하이드록시에톡시메틸)구아닌 (아사이클로비르); 인터페론, 예를 들어, 알파-인터페론, 인터류킨 II, 및 포스포노포르메이트 (포스카르네트); 또는 유입 억제제, 예를 들어, T20 (엔푸비르타이드, Roche/Trimeris) 또는 UK-427,857 (Pfizer), 레바미솔 또는 티모신, 시스플라틴, 카보플라틴, 도세탁셀, 파클리탁셀, 플루오로우라실, 카페시타빈, 젬시타빈, 이리노테칸, 토포테칸, 에토포시드, 미토마이신, 게피티닙, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 독소루비신, 사이클로포스파마이드, 셀레콕십, 로페콕십, 발데콕십, 이부프로펜, 나프록센, 케토프로펜, 덱사메타손, 프레드니손, 프레드니솔론, 하이드로코르티손, 아세트아미노펜, 미소니다졸, 아미포스틴, 탐설로신, 페나조피리딘, 온단세트론, 그라니세트론, 알로세트론, 팔로노세트론, 프로메타진, 프로클로르퍼라진, 트리메토벤즈아미드, 아프레피탄트, 아트로핀을 갖는 디페녹실레이트, 및/또는 로페르아미드; 및 항-응고제, 예를 들어, 항-트롬빈 III 및 활성화된 단백질 C.
하기에 논의된 것은 다음과 조합하여 투여될 수 있는 추가의 예시적인 제제이다: IAIP (예를 들어, Iαl 및/또는 PαI) 또는 이들의 조성물.
항생제
대상체가 박테리아 감염 (예를 들어, 괴사성 전장염 또는 그람 음성 박테리아 감염)이 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 경우 제2 치료는 박테리아 감염을 치료하기 위해 사용되는 항생제를 포함할 수 있다. 항생제의 비-제한적인 예는 하기를 포함한다: 아목시실린, 페니실린, 독시사이클린, 클라리트로마이신, 벤질페니실린, 아지트로마이신, 다프토마이신, 리네졸라이드, 레보플록사신, 목시플록사신, 갈티플로신, 겐타마이신, 매크롤라이드, 세팔로스포린, 아지트로마이신, 시프로플록사신, 세푸록심, 아목실린-칼륨 클라불라네이트, 에리트로마이신, 설파메톡사졸-트리메토프림, 독시사이클린 일수화물, 세페핌, 암피실린, 세프포독심, 세프트리악손, 세파졸린, 에리트로마이신 에틸석시네이트, 메로페넴, 피페라실린-타조박탐, 아미카신, 에리트로마이신 스테아레이트, 덱스트로스 내 세페핌, 독시사이클린 하이클레이트, 암피실린-설박탐, 세프타지딤, 제미플록사신, 겐타마이신 설페이트, 에리트로마이신 락토바이오네이트, 이미페넴-실라스타틴, 세폭시틴, 세프디토렌 피복실, 에르타페넴, 독시사이클린-벤조일 과산화물, 암피실린-설박탐, 메로페넴, 세푸록심, 세포테탄, 피페라실린-타조박탐, 광범위 플루오로퀴놀론 (예를 들어, 비정형 병원체 예컨대 마이코플라스마 뉴모니아에 또는 클라마이도필라 뉴모니아에에 의해 야기된 폐렴을 치료하기 위해 사용될 수 있음), 및 당업계에서 알려진 기타의 것들.
항바이러스제
대상체가 바이러스성 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 경우 (예를 들어, 뎅기열 또는 웨스트 나일 열), 제2 치료는 바이러스성 감염을 치료하기 위해 사용되는 항바이러스제를 포함할 수 있다. 비-제한적인 예의 항바이러스제는 자나미비르, 오셀타미비르, 페르미비르, 리바비린, 아사이클로비르, 강시클로비르, 포스카르네트, 사이도포비르, 및 당업계에서 알려진 기타의 것들을 포함한다.
항진균제
대상체가 진균 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 경우, 제2 치료는 진균 감염을 치료하기 위해 사용되는 항진균제를 포함할 수 있다. 비-제한적인 예의 항진균제는 암포테리신, 카스포펀진, 보리코나졸, 이트라코나졸, 포사코나졸, 플루코나졸, 플루시토신, 및 당업계에서 알려진 기타의 것들을 포함한다.
항기생충제
대상체가 기생충 감염이 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 경우, 제2 치료는 기생충 감염 (예를 들어, 기생충 원생동물 감염을 치료하기 위해 사용되는 항기생충제를 포함할 수 있다. 비-제한적인 예의 항기생충제는 니타족사나이드, 멜라르소프롤, 에플로니틴, 메트로니다졸, 티니다졸, 밀테포신, 메벤다졸, 피란텔 파모에이트, 티아벤다졸, 디에틸카바마진, 이베르멕틴, 알벤다졸, 프라지콴텔, 리팜핀, 및 당업계에서 알려진 기타의 것들을 포함한다.
항-염증제
대상체가 본 명세서에 기재된 염증성 질환 또는 병태가 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 경우, 제2 치료는 염증을 치료하거나 또는 감소시키기 위해 사용되는 항-염증제를 포함할 수 있다. 비-제한적인 예의 항-염증제는 코르티코스테로이드, 스타틴, 스테로이드, 비스테로이드 항-염증성 약물, 글루코코르티코이드, 및 당업계에서 알려진 기타의 것들을 포함한다.
기관지확장제
대상체가 하기 질환이 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 경우: 급성 폐 손상, ARDS, 또는 폐렴, 제2 치료는 기도가 더 크게 되도록 하여 기관지 근육을 이완하고 공기가 폐를 통과하도록 하기 위해 사용되는 기관지확장제를 포함할 수 있다. 비-제한적인 예의 기관지확장제는 베타 2 효능제, 잔틴, 이프라트로피움, 옥시트로피움, 무스카린성 수용체 길항제, 이프라트로피움, 옥시트로피움, 테오필린, 테오브롬, 카페인, 살부타몰, 이소프로테레놀, 알부테롤, 레발뷰레롤, 피르부테롤, 메타프로테레놀, 테르부탈린, 살메테롤, 포르모테롤, 및 당업계에서 알려진 기타의 것들을 포함한다.
혈관승압제
대상체가 하기 질환이 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 경우: 급성 폐 손상, ARDS, 폐렴, 또는 트라우마/손상 (예를 들어, 상처, 화상, 또는 수술 과정), 제2 치료는 혈관수축 및/또는 혈압에서의 증가를 야기하는 혈관승압제를 포함할 수 있다. 비-제한적인 예의 혈관승압제는 에피네프린, 이소프로테레놀, 페닐에프린, 노르에피네프린, 도부타민, 에페드린, 드록시도파, 및 당업계에서 알려진 기타의 것들을 포함한다.
진정제
제2 치료는 진정제를 포함할 수 있다. 비-제한적인 예의 진정제는 프로포폴, 디프리반, 모르핀, 펜타닐, 미다졸람, 로라제팜, 프레세드, 인퓨모르프, 덱스메데토미딘, 알펜타닐, 및 당업계에서 알려진 기타의 것들을 포함한다.
보체 억제제
대상체가 하기 질환이 있거나 또는 이를 전개할 위험이 있는 경우: 급성 폐 손상, ARDS, 또는 폐렴, 제2 치료는 보체 활성화의 억제제를 포함할 수 있다. 본 조성물은 하나 이상의 보체 성분 예컨대 C1, C2, C3 (예를 들어, C3a 및 C3b), C4 (예를 들어, C4b), C5 (예를 들어, C5a 및 C5b), C6, C7, C8, C9, 막 공격 복합체, 인자 B, 인자 D, MASP-1, 및 MASP-2, 또는 이의 단편의 활성화를 억제할 수 있다. 보체 억제제는 프로테아제 억제제 예컨대 C1-INH 및 Rhucin/rhC11NH, 가용성 보체 조절인자 예컨대 sCR1/TP10, CAB-2/MLN-2222, 치료적 항체 예컨대 에쿨리주맙/SOLIRIS®, 펙셀리줌나, 오파투무맙, 보체 성분 억제제 예컨대 콤프스타틴, 수용체 길항제 예컨대 PMX-53 및 rhMBL을 포함할 수 있다.
키트
본 발명은 또한 환자 (예를 들어, 인간 환자, 예컨대 신생아, 아동, 청소년, 또는 성인)로부터 샘플 (예를 들어, 유체 샘플) 내 IAIP를 측정하는데 사용하기 위한 키트를 특징으로 한다. 본 키트는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 지지체 (예를 들어, 플레이트 (예를 들어, 다중-웰 플레이트)), 입자 (예를 들어, 자기 입자, 예를 들어, 나노입자, 자기 나노입자), 바이오칩, 수지, 용기 (예를 들어, 튜브), 막 (예를 들어, 니트로셀룰로스 막, PVDF 막), 시험 스트립 (예를 들어, 셀룰로스, 유리 섬유, 또는 니트로셀룰로스) 또는 비드 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 비드, 자기 비드, 유리 구슬, 플라스틱 비드))로 고정된 IAIP 결합제 (예를 들어, IAIP-특이적 항체 또는 IAIP 리간드)를 함유, 라벨링된 IAIP 검출제 (예를 들어, IAIP 리간드 또는 IAIP-특이적 항체), 세정 완충액, 차단제, 표지의 검출을 위한 기질, 희석 제제, 및 검출 검정을 수행하는 지침.결합제 및 검출제는 용기에 제공될 수 있거나, 또는 결합제는 지지체에 사전-부착되어 제공될 수 있다 (예를 들어, 결합제는 플레이트 또는 테스트 스트립에 이미 부착되어 있다).
본 발명은 또한 환자로부터의 샘플 (예를 들어, 유체 샘플)에서 IAIP-IAIP 리간드 복합체를 측정하는데 사용하기 위한 키트를 특징으로 한다. 본 키트는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 지지체 (예를 들어, 플레이트 (예를 들어, 다중-웰 플레이트)), 입자 (예를 들어, 자기 입자, 예를 들어, 나노입자, 자기 나노입자), 바이오칩, 수지, 컨테이너 (예를 들어, 튜브), 막 (예를 들어, 니트로셀룰로스 막, PVDF 막), 시험 스트립 (예를 들어, 셀룰로스, 유리 섬유, 또는 니트로셀룰로스) 또는 비드 (예를 들어, 단백질 A 또는 단백질 G 비드, 자기 비드, 유리 구슬, 플라스틱 비드))로 고정된 결합제 (예를 들어, IAIP-특이적 항체, 상이한 IAIP 리간드, 또는 IAIP 리간드에 특이적으로 결합하는 항체)를 함유, 라벨링된 검출제 (예를 들어, 상이한 IAIP 리간드, IAIP-특이적 항체, 또는 IAIP 리간드에 특이적으로 결합하는 항체), 세정 완충액, 차단제, 표지의 검출을 위한 기질, 팽창 제제, 및 검출 검정을 수행하는 지침.결합제 및 검출제는 용기에 제공될 수 있거나, 또는 결합제는 지지체에 사전-부착되어 제공될 수 있다 (예를 들어, 결합제는 플레이트 또는 테스트 스트립에 이미 부착될 수 있다).
실시예
하기 실시예는 본 발명의 일부 구현예를 추가로 설명하기 위해 제공되지만, 본 발명의 범위를 한정하려는 것은 아니다; 당해 분야의 숙련가에게 알려진 다른 절차, 방법론 또는 기술이 대안적으로 사용될 수 있다는 것이 그것의 예시적인 특성에 의해 이해될 것이다.
실시예 1: 헤파린-IAIP 검정
바이오티닐화된 헤파린의 제조
헤파린 (헤파린 나트륨 주사 USP, Sagent Pharmaceuticals, Cat#NDC 25021-400-30)을 제조자의 지침에 따라 바이오틴 하이드라자이드 시약 (ApExBIO, Cat#A87007)을 사용하여 바이오틴과 접합하였다. 간단히, 1000 IU 헤파린 용액을 실온에서 3시간 동안 온화한 혼합을 하면서 0.1 M MES 완충액 pH 4.7 내에 DMSO에 미리 용해되어 진 0.25 mg 가교결합제 시약 EDC (1-(3-디메틸아미노프로필)-3-3에틸카보디이미드 하이드로클로라이드, Alfa Aesar Cat#A10807) 및 0.5 mM 바이오틴 하이드라자이드와 혼합하였다. 비접합된 바이오틴 및 완충액 교환은 5 kDa 컷오프 필터 막 (Millipore)을 갖는 Amicon Ultra 원심 필터 디바이스 상에서 한외여과에 의해 수행되었다. d-H2O에서 희석에 이어, 바이오티닐화된 헤파린을 검정에서 즉시 사용가능하게 하였다.
“샌드위치 유형” 헤파린-IAIP ELISA
인간 IAIP의 경쇄 (MAb 69.26)에 대한 정제된 마우스 단클론성 항체를 32 ℃에서 2시간 동안 200 ng/웰로 96-웰 마이크로플레이트 (Immulon 600, Greiner BioOne) 상에 고정시켰다. 5% 비-지방 건조된 밀크로 1시간 동안 차단 및 TBS-T (TBS + 0.05% Tween 20)로 세정한 후, 알려지지 않은 샘플 및 알려진 IAIP 표준을 TBS + 0.1% Tween 20에서 희석하고 마이크로플레이트에 첨가하였다 (최종 용적 50 uL/웰). 샘플 및 연속으로 희석된 IAIP 표준 용액을 32 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. TBS-T로 마이크로플레이트의 수회 세정 후, 바이오티닐화된 헤파린을 20 mM 아세트산 + 25 mM NaCl, pH 4.0 (1:2500)을 함유한 완충액에서 희석하고 웰당 50 μL를 첨가하였다. 바이오티닐화된 헤파린은 32 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하고 마이크로플레이트는 그런 다음 TBS-T를 사용하여 적어도 3회 세정하였다. 마지막으로, 1:5000 (50 uL/웰)으로 희석된 HRP-접합된 스트렙타비딘 (Pierce)을 마이크로플레이트에 첨가하였다. 세정에 이어서, 50 μL의 기질 TMB를 첨가하고 (Neogen Enhanced K-Blue TMB 기질) 50 μL 1 M HCl을 첨가하여 반응을 중단시키고 450 nm 파장에서 분광측정기 (Molecular Devices) 상에서 색상 변화를 판독하였다. 표준 곡선은 4-점 로지스틱 회귀분석 (SoftMax Pro 소프트웨어, Molecular Devices)을 사용하여 생성되었으며, 7-점 곡선은 도 3B에서 나타낸 바와 같이 연속 2-배 희석으로 2.0 μg/mL의 최대 IAIP 농도에서 0.03125 μg/mL로 플롯팅되었다. 알려지지 않은 샘플의 IAIP 농도는 생성된 표준 곡선에 기초하여 계산되었다.
실시예 2: LPS-IAIP 검정
바이오티닐화된 내독소/LPS (리포폴리사카라이드)의 제조:
에스케리치아 콜라이 055:B5 (Sigma 카탈로그 # L2280)로부터의 리포폴리사카라이드 (LPS/내독소)를 제조자의 지침에 따라 그리고 헤파린에 대해 사용된 프로토콜에 유사하게 바이오틴 하이드라자이드 시약 (ApExBIO, Cat#A87007)을 사용하여 바이오틴으로 라벨링하였다. 10 mg LPS는 0.1 M MES 완충액 및 2.5 mM 바이오틴-하이드라자이드에서 재구성하고 그리고 2.5 mg EDC (1-(3-디메틸아미노프로필)-3-3에틸카보디이미드 하이드로클로라이드, Alfa Aesar Cat#A10807)를 3시간 동안 실온에서 부드럽게 혼합하였다. 비접합된 LPS의 제거 및 완충액 교환은 5 kDa 컷오프 필터 막 (Millipore)을 갖는 Amicon Ultra 원심 필터 디바이스 상에서 한외여과에 의해 수행되었다. d-H2O에서 희석에 이어, 바이오티닐화된 LPS를 검정에서 즉시 사용가능하게 하였다.
“샌드위치 유형” LPS-IAIP ELISA
상기 기재된 헤파린-IAIP 프로토콜에 유사하게, 인간 IAIP의 경쇄 (MAb 69.26)에 대한 정제된 마우스 단클론성 항체를 32 ℃에서 2시간 동안 50 ng/웰로 96-웰 마이크로플레이트 (Immulon 600, Greiner BioOne) 상에 고정시켰다. 5% 비-지방 건조된 밀크로 1시간 동안 차단 및 TBS-T (TBS + 0.05% Tween 20)로 세정한 후, 알려지지 않은 샘플 및 알려진 IAIP 표준을 TBS + 0.1% Tween 20에서 희석하고 마이크로플레이트에 첨가하였다 (최종 용적 50 uL/웰). 샘플 및 연속으로 희석된 IAIP 표준 용액을 32 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. TBS-T로 마이크로플레이트의 수회 세정 후, 바이오티닐화된 LPS를 20 mM 아세트산 + 25 mM NaCl, pH 4.0 (1:32,000)을 함유한 완충액에서 희석하고 웰당 50 μL를 첨가하였다. 바이오티닐화된 LPS는 32 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하고 마이크로플레이트는 그런 다음 TBS-T를 사용하여 적어도 3회 세정하였다. 마지막으로, 1:10,000 (50 uL/웰)으로 희석된 HRP-접합된 스트렙타비딘 (Pierce)을 마이크로플레이트에 첨가하였다. 세정에 이어서, 50 μL의 기질 TMB를 첨가하고 (Neogen Enhanced K-Blue TMB 기질) 50 μL 1 M HCl을 첨가하여 반응을 중단시키고 450 nm 파장에서 분광측정기 (Molecular Devices) 상에서 색상 변화를 판독하였다. 표준 곡선은 4-점 로지스틱 회귀분석 (SoftMax Pro 소프트웨어, Molecular Devices)을 사용하여 생성되었으며, 7-점 곡선은 도 3C에서 나타낸 바와 같이 연속 2-배 희석으로 2.0 μg/mL의 최대 IAIP 농도에서 0.03125 μg/mL로 플롯팅되었다.
실시예 3: 중증 지역사회성 폐렴 ( sCAP )이 진단된 환자로부터 혈액 샘플의 분석
연속 혈액 샘플을 로드 아일랜드 병원의 중환자실에 입원한 sCAP의 확인된 진단을 받은 환자로부터 수집하였다. 16명의 환자가 연구에 등록되었고 혈장은 0일 (ICU에 대한 인정의 시점), 1, 3 및 7일째에 수집하였다. IAIP의 수준은 확립된 경쟁적 ELISA (도 2A) 및 분자를 검출하는 것으로서 바이오티닐화된 헤파린 또는 바이오티닐화된 LPS를 사용하는 두 샌드위치-유형 ELISA (도 3A)를 사용하여 결정되었다. 17세에서 71세 사이의 건강한 대조군 95명으로부터의 혈액 샘플 (건강한 혈액 공여체에게서 수득하고 로드 아일랜드 혈액 센터에서 구입됨)은 건강한 대조군의 IAIP 수준을 sCAP 환자에서 측정된 수준과 비교하기 위해 이 연구에 포함하였다. 결과는 도 4, 5, 및 6에 도시되어 있다.
결과는 IAIP 수준이 입원 시점 및 질병 진행 동안 (최대 7일) 건강한 대조군과 비교하여 sCAP 환자에서 상당히 더 낮았음을 나타낸다. 따라서, IAIP 수준은 의사가 예후를 평가하고 치료적 결정을 내릴 수 있도록 안내하는 데 사용될 수 있다. 경쟁적 ELISA가 sCAP 환자에서 감소된 IAIP 수준을 나타냈으나, 특이적 결합 리간드로서 바이오틴-접합된 헤파린 및/또는 LPS를 사용하는 "샌드위치-유형" ELISA 검정은 보다 통계적으로 유의한 결과를 산출하였다 (건강한 대조군에 비교하여 0,1,3 및 7일째에 IAIP 수준 간에 p 값= 0.0001). 바이오틴-접합된 헤파린 및/또는 LPS를 사용한 “샌드위치-유형” ELISA 검정은 또한 sCAP 환자에서 더 낮은 농도의 IAIP를 산출하여, sCAP가 있는 환자와 건강한 대조군에서 측정된 IAIP 수준 간에 더 큰 차이를 일으켰다. 이들 데이터는 라벨링된 IAIP 리간드를 사용한 “샌드위치-유형” ELISA 검정이 경쟁적 ELISA 검정보다 증가된 민감성 및 잠재적으로 더 높은 정확도를 가진다는 것을 나타낸다.
동일한 검정이 또한 로드 아일랜드 병원의 중환자실에 입원한 패혈증이 있는 대상체로부터의 샘플을 평가하기 위해 사용되었다. 이들 검정은 유사한 결과를 산출하였다. 정상 건강한 대조군의 IAIP 값은 경쟁적 ELISA (평균 ± 표준오차=328.9+6.34 μg/mL) 및 양 LPS 또는 헤파린-IAIP 검정 (337.7 ± 9.05 및 421.8 ± 14.47 μg/mL)에서 유사한 반면, 폐렴 및 패혈성 그룹에서 IAIP의 수준은 경쟁적 ELISA에서 상당히 더 높아, 이환 그룹과 건강한 대조군 사이에 통계적으로 낮은 유의미한 차를 초래하거나 차이가 없었다 (도 8A-8C).
실시예 4: IAIP에 대한 헤파린의 결합의 분석
IAIP에 대한 헤파린의 특이적 결합의 평가는 웨스턴 블랏 검정을 사용하여 수행되었다. 음성 대조군으로서 고순도 IAIP (1 μg), 정상 인간 혈장 (1 μL), 정제된 비쿠닌 (주사용 울리나스타틴, Techpool, 2μg) 및 인간 혈청 알부민 (HSA, 2 μg)을 7.5% SDS-PAGE 겔에서 분리하고 니트로셀룰로스 막 상으로 이전하였다. 5% 비-지방 건조된 밀크로 차단 후, 니트로셀룰로스 막은 바이오틴-접합된 헤파린 (TBS 내 1:500)으로 밤새 실온에서 인큐베이션하였다. TBS+0.05% Tween으로 수회 세정 후, HRP-접합된 스트렙타비딘 (1:15,000)을 첨가하고 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 세정 후, 기판 금속-향상된 DAB (Pierce)을 첨가하여 반응 밴드를 시각화하였다.
바이오틴-접합된 헤파린은 MAb 69.26 (인간 IAIP에 대한 단클론성 항체)에 유사하게, 레인 2 (도 7)에서 나타낸 바와 같이 정제된 IAIP에 구체적으로 결합했다 (250 kDa IαI 및 125 kDa PαI). 경쇄 (비쿠닌)에 결합된 MAb 69.26 (레인 3)에 대조적으로, 바이오틴-접합된 헤파린은 IAIP의 경쇄에 결합하지 않아, 헤파린이 중쇄를 통해 IAIP에 결합함을 시사한다. IAIP의 중쇄는 헤파린에 구체적으로 결합되는 것으로 보인다.
다중 반응 단백질 밴드는 인간 혈장에서 바이오틴-접합된 헤파린에 의해 검출되었고 (도 7, 레인 1) HAS에 대한 결합은 검출 불가능하였다.
나아가, 유리 비쿠닌은 헤파린-IAIP 또는 LPS-IAIP ELISA에서 검출되지 않았는데, 이는 온전한 중쇄를 갖는 IAIP 복합체 만이 헤파린 또는 LPS-IAIP ELISA를 사용하여 측정된다는 것을 시사한다. 이들 데이터는 헤파린 및/또는 LPS (또는 다른 IAIP 리간드)를 사용한 샌드위치-유형 ELISA가 다른 알려진 IAIP 검정, 예컨대 경쟁적 IAIP 검정에 비하여 증가된 정확도 및 강건성을 갖는 대상체 (예를 들어, 병리 상태를 갖는 대상체)에서 순환 IAIP 복합체의 평가를 제공한다는 것을 나타낸다 (도 2A).
실시예 5: 고정된 혈장-유래된 IAIP에 바이오티닐화된 LPS의 결합
시험관내 IAIP에 LPS의 직접적인 결합을 조사하기 위해, IAIP 및 다른 대조군 단백질 (BSA = 소과 혈청 알부민; 비쿠닌 (IAIP의 경쇄); 및 단클론성 항체 MAb 69.26의 정제된 IgG)을 1000 μg/웰로 96-웰 마이크로플레이트 (Greiner Microlon 600) 상에 고정시키고 비-지방 건조된 밀크 (TBS+0.1%Tween 20 내 5%)로 차단하였다. 세정한 후, 100 μg 바이오티닐화된 LPS (에스케리치아 콜라이 O55:B5로부터의 리포폴리사카라이드, Sigma, Cat# L2880로부터 구매됨)를 각 웰에 첨가하고 TBS + 150 mM CaCl2 완충액에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. TBS + 0.1%Tween으로 수회 세정한 후, HRP-접합된 스트렙타비딘을 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하였다. 마지막으로, TMB 기질을 첨가하고 1 M HCl 용액을 부가함에 의해 반응을 중단시켰다. 색상 변화 및 흡광도는 450 nm에서 분광적으로 측정하였다. IAIP에 대한 바이오티닐화된 LPS 분자의 상당한 결합이 LPS에 결합하는 것으로 기술된 바와 같이 양성 대조군 (David SA, 등, Innate Immunity 1995; 2(2):99-106)으로서 작용하는 BSA 또는 MAb 69.26의 IgG (음성 대조군)와 비교하여 발견되었다 (도 9). LPS는 IAIP의 경쇄 (비쿠닌)에 유의하게 결합하지 않았으며, 이는 IAIP의 중쇄가 LPS에 대한 결합을 촉진한다는 것을 시사한다. 결합은 또한 글리코사미노글리칸 사슬에 의해 매개될 수 있다.
실시예 6: 고정된 LPS에 바이오티닐화된 IAIP의 결합
이전의 실험의 역전에서, 바이오티닐화된 IAIP (4 μg/웰)을 첨가하고 1시간 동안 인큐베이션하여 양성 대조군으로 LPS (100 μg/웰), BSA (2 μg/웰), MAb 69.26의 IgG (2 μg/웰), 및 음성 대조군 (블랭크)으로 비-지방 건조된 밀크 (2 μg/웰)를 고정화시켰다. 수회 세정 후, HRP-접합된 스트렙타비딘을 첨가하고 후속으로 TMB 기질을 마이크로플레이트 웰들에 첨가하였다. 고정된 LPS에 바이오티닐화된 IAIP의 상당한 결합이 검출되었고, 반면에 고정된 BSA 또는 비-지방 건조된 밀크에 대한 IAIP의 상당히 낮은 결합이 관측되었다 도 10). 이 실험에서 양성 대조군으로 작용하는 MAb 69.26의 IgG (인간 IAIP에 특이적인 단클론성 항체)는 바이오티닐화된 IAIP에 강하게 결합하였다.
실시예 7: IAIP-LPS 결합에 대한 pH 영향의 분석
IAIP 및 LPS의 결합을 추가로 특성화하기 위해, 유사한 고상 결합 실험을 수행하였다. 바이오티닐화된 IAIP를 다양한 pH 조건 하에서 고정된 LPS, MAb 69.26의 IgG (양성 대조군), 또는 BSA (음성 대조군)로 인큐베이션하였다. 아세테이트 완충액 (50 mM)을 낮은 pH 용액 (pH 3-6)에 대해 사용하였고 트리스-HCl 완충액 (50 mM)을 사용하여 중성 또는 더 높은 pH 용액 (pH 7-9)을 얻었다. 바이오티닐화된 IAIP는 pH 5에서 강하게 결합된 반면, pH 3 또는 4에서 결합은 관측되지 않았다 (도 11). pH가 pH 5 이상으로 증가한 경우 IAIP의 줄어든 결합이 관측되었다. 그것의 특이적 단클론성 항체 MAb 69.26에 대한 IAIP의 결합은 pH 7에서 피크였지만, 흥미롭게도 pH가 pH 9까지 증가할 때 유의미하게 변화하지 않았다. 유사하게, pH 3 및 4에서, 단클론성 항체에 대한 IAIP 결합은 무시할만하였다. 바이오티닐화된 IAIP와 BSA 사이에는 결합이 관측되지 않았다. 결과는 IAIP와 LPS 사이의 최적의 결합이 pH 4-7의 범위에서, 특히 약 pH 5에서 발생함을 분명히 시사한다.
실시예 8: IAIP-LPS 결합에 대한 염 농도의 영향의 분석
염 농도의 영향을 증가하는 양의 염 (NaCl)을 마이크로플레이트 상에 고정화된 LPS로 바이오티닐화된 IAIP의 인큐베이션 동안 완충액에 부가함에 의해 조사했다. LPS에 대한 IAIP의 결합은 염 농도가 증가함에 따라 감소하였으나, 1200 mM의 염 농도에서도 감소는 상당하지 않았으며, 이는 LPS에 대한 IAIP의 결합이 이 실험에서 양성 대조군으로 사용된 인간 IAIP에 대한 단클론성 항체 (MAb 69.26)에 IAIP의 특이적 결합에 유사하게, 상대적으로 강하고 특이적이었다는 것을 시사한다(도 12).
실시예 9: IAIP - LPS 결합에 대한 비-이온성 세제 (NP-40 및 Tween- 20)의 영향의 분석
고정된 LPS에 바이오티닐화된 IAIP의 결합에 대한 증가하는 농도의 비-이온성 세제 노닐 페녹시폴리에톡실에탄올 (NP-40) (도 13) 및 Tween 20 (도 14)의 영향을 연구하기 위해 추가의 조사를 수행하였다. 세제의 첨가 없는 TBS 완충제 단독과 비교하여, 0.05% (w/w) NP-40 또는 Tween-20이 IAIP의 LPS에 대한 결합 반응에 첨가될 때 증가된 결합이 관찰되었다. 소량의 세제는 LPS와의 결합을 촉진할 수 있으며, 이는 LPS 분자의 지질 결합 도메인이 이 상호작용에 관여할 수 있음을 시사한다. 세제의 양이 1%까지 증가된 경우에도, IAIP의 결합은 여전히 상대적으로 강했는데, 이는 대부분의 IAIP는 여전히 LPS에 결합되어 있어 시험관내에서 IAIP와 LPS 사이의 강한 상호작용을 나타냈기 때문이다. 유사하게, 바이오티닐화된 IAIP는 고특이성 및 친화도로 MAb 69.26에 강하게 결합하였고 최대 1%까지 세제의 첨가도 결합을 상당히 변화시키지 않았다. 그에 반해서, 음성 대조군 (BSA)은 IAIP에 대한 어떤 결합도 나타내지 않았다.
실시예 10: 신속한 측면-흐름 면역검정 (LFIA)을 사용한 IAIP의 정량화
본 명세서에서 기재된 방법은 측면-흐름 면역검정 (LFIA)을 사용하여 IAIP의 신속한 정량화를 위해 사용될 수 있다. 실시예 1-3에서 기재되고 사용된 “샌드위치 유형” IAIP ELISA는 생명 위협, 중증 염증성 병태 (예를 들어, 신생아 패혈증 (NS) 및 괴사성 전장염 (NEC))가 있는 고위험 대상체 (예를 들어, 영아, 청소년, 또는 성인)를 확인하기 위해 사용될 수 있는, 현장 진단 (POC), 신속한, 신뢰할 수 있는, 정량적 및 사용자-친화적인 테스트인 LFIA에 적응될 수 있다. LFIA는 a) 하기를 측정할 수 있고: 선형 범위의 20 내지 700 μg/ml IAIP; b) 150 μg/ml 근처 (예를 들어, 약 100 내지 약 200 μg/mL)의 IAIP 수준에 대한 높은 정확성 (예를 들어, <5%의 가변성 또는 에러)를 나타낼 수 있고; c) 1시간 또는 그 미만 내에 결과를 얻을 수 있고 (예를 들어, 15 분 또는 그 미만, 예컨대 10 미만, 7, 또는 5분 또는 그 미만); 및 d) 혈장 또는 전혈 샘플의 작은 샘플 용적 <150 μL (예를 들어, 150, 100, 75, 50, 25, 15, μL 또는 그 미만)을 요할 수 있다.
본 테스트는 대상체 (예를 들어, 조산 신생아, 영아, 청소년 또는 성인)에서 이상조절된 염증 반응을 빠르게 식별하기 위해 사용될 수 있다. 염증성 질환 또는 병태 또는 감염을 겪는 환자의 생존을 개선하기 위해 조기 개입이 중요하다는 것이 공지되어 있다.
신생아에서, 예를 들어, 조기 개입 프로토콜을 적용하는 능력은 종종 덜 심각한 다른 질환으로부터 그러한 병태 (예를 들어, NS 및 NEC)를 식별하는데 있어서의 어려움에 의해 제한된다. IAIP의 탁월한 음성 예측의 값은, 예를 들어, 임상의가 현재 시험이 정보 제공하지 않는 대상체 (예를 들어, 영아, 청소년 또는 성인)에서 항생제 치료의 조기 종결과 같은 어려운 결정을 내리도록 안내할 수 있다. 게다가, 치료적 단백질로서, IAIP는 중환자 대상체 (예를 들어, 영아, 청소년 또는 성인)에게 유익할 수 있고, 혈중 농도는 의사가 IAIP 또는 다른 부속 치료제로의 대체 요법에 대한 정보에 근거한 결정을 내리는 데 도움이 되고 질환 진행을 모니터링하는데 유용한 치료진단적 마커로서 작용할 수 있다.
단시간 기간 (예를 들어, 15분 또는 그 미만) 내에 판독가능한 정확한 정량적 결과를 갖는 간단한 사용자-친화적인 및 휴대용 디바이스를 사용하여, 치료 (예를 들어, 항생제 치료)의 개시 및 기간과 같은 치료적 결정에 영향을 미치는 데 사용될 수 있는 IAIP를 기반으로 한 신속한 치료 시점 테스트는 획기적일 뿐만 아니라 이환율 및 사망률을 감소시키는 데 임상적으로 유용하다.
LFIA는 대상체로부터의 샘플을 테스트 스트립 (예를 들어, 셀룰로스, 유리 섬유 또는 니트로셀룰로스)에 첨가하는 것을 포함하고, 그 다음 완충액을 사용하여 스트립 안으로 밀어 넣는다. 스트립은 IAIP 결합제 (예를 들어, IAIP-특이적 항체 또는 IAIP 리간드)를 함유한다. 라벨링된 검출제 (예를 들어, IAIP-특이적 항체 또는 IAIP 리간드)는 샘플 전, 후 또는 이와 동반하여 스트립에 첨가될 수 있고, IAIP의 신속한 정량화를 위해 표준 방법을 사용하여 시각화될 수 있다.
a) 금- 접합된 시약: 금 나노입자는 그것의 우월한 콜로이드성 안정성으로 인해 시약을 (LFIA) 형식으로 표지하는데 사용될 수 있다. 하이드라자이드로 작용화된 금 나노 입자의 안정한 제형은 상업적으로 입수가능하다 (Innova Bioscience). 일반적으로 항체는 검출 시약으로서 콜로이드성 금에 공유결합되지만, 헤파린 또는 LPS는 InnovaCoat Gold 나노 입자를 사용하여 그것의 당 사슬을 통해 유사하게 접합될 수 있다. LPS 및 헤파린의 금 콘주게이션은 소규모로 수행될 수 있고 LFIA에서의 그것의 안정성 및 성능에 대해 시험될 수 있다.
b) LFIA의 포착, 검출, 샘플 시약 및 조건의 최적화: 아래에 기재된 경쟁적 LFIA 개발 경험을 바탕으로, 포착 라인 상에서의 MAb 69.26의 제형 및 코팅 조건 및 다른 인자, 예컨대 차단제, 계면활성제, 및 탄수화물이 비-특이적 결합을 감소시키고 유동 특성을 개선하기 위해 선택될 수 있다. 간섭 및 비-특이적 결합을 감소시키는 최적의 희석 인자 및 적합한 희석제가 또한 결정될 수 있다. 다중-계승의 실험 디자인 (DoE)이 사용되어 하기 파라미터의 상호작용을 결정할 수 있다: 1) 결합제 농도, 2) 코팅 pH 및 완충액 유형 (범위 = 4-10), 3) 코팅 기간 및 4) 차단제의 유형 (예를 들어, 소과 혈청 알부민, 어류 젤라틴, 등).
c) 테스트 스트립 성분, 하우징 및 판독기: 테스트 스트립은 샘플 웰이 있는 플라스틱 카셋트에 하우징될 수 있으며 테스트 판독 창이 스트립의 적절한 영역 위에 배치된다. 다양한 표준화된 스트립 치수 배치형태가 사용될 수 있다. Detekt 또는 ESEQuant 판독기에 적응할 수 있는 것과 같은 적합한 하우징이 선택될 수 있다. 샘플의 조성물 및 콘주게이트 패드, 뿐만 아니라 니트로셀룰로스 막의 기공 크기는 원하는 모세관 작용 속도, 및 그러므로, 검출기 시약과 샘플의 반응 시간을 달성하도록 선택될 수 있다.
LFIA 성능 목표는, 예를 들어, 하기를 변화함에 의해 최적화될 수 있다: 테스트 라인의 스트립핑 조건에 대한 제형 및 공정 시약, 검출 분자 (예를 들어, LPS 또는 헤파린)의 콘주게이션 방법, 및 검출의 적정 제제, 뿐만 아니라 패드 및 심지의 최적의 물질 및 치수로, 아래에 기재된 바와 같음:
a. 테스트 및 대조 라인의 최적화. 막 스트립핑 조건은 테스트 스트립의 테스트 라인 (MAb 69.26) 및 대조 라인 (LPS-결합 단백질 또는 헤파린-결합 단백질 (예를 들어, 응고 인자 IX) 둘 모두에 대해 최적화될 수 있다. LFIA 막의 강력한 제조 절차로 37 ℃에서 30분 건조 기간을 사용하여 테스트 및 대조 라인을 고정시킬 수 있다. 다중-계승의 DoE가 사용되어 하기 막 스트립핑 파라미터의 상호작용을 결정할 수 있다: 1) 결합제 농도, 2) pH 및 완충액 유형 (범위=pH 4-10), 3) 염 농도 및 4) 스트립핑 용적 (1-3 μL/스트립) 및 잉크젯 속도. 초기 최적화 연구로부터 막 스트립핑 개선 통합.다중-계승의 DoE가 또한 사용되어 다양한 농도 (0-1 μg/스트립)의 단백질 차단제, 계면활성제, 탄수화물 및 금 입자 비-특이적 결합을 감소시키거나 막의 유동 특성을 개선시킬 수 있는 기타 제제와의 막 공동-코팅의 효능을 결정할 수 있다. 본 발명자들의 고상 결합 연구에 기초하여, LPS 및 헤파린은 5보다 낮은 pH에서 IAIP에 상당히 강하게 결합한다. 유사한 조건이 LFIA에서 사용될 수 있다.
b. 테스트 스트립 파라미터의 최적화. 샘플 패드 및 콘주게이트 패드의 조성, 뿐만 아니라 니트로셀룰로스 막의 기공 크기는 모세관 작용의 속도에 영향을 줄 수 있고, 그러므로 샘플과 금 검출기 시약의 반응 시간에 영향을 미치고, 따라서 원하는 결과를 달성하기 위해 선택될 수 있다. 본 발명자들은 빠른 흐름 NC (HF090, Millipore)가 민감도 및 결과에 대한 시간에 대한 디자인 사양을 충족시키는 것으로 확인했다. DoE를 사용하여 검정을 위한 필터의 유형, 패드 및 심지 재료를 평가할 수 있다. 유사하게, 샘플 패드 및 콘주게이트 패드의 크기 및 기하학이 조정되어 원하는 결과를 달성할 수 있다.
샘플 패드는 다음으로 최적화될 수 있다: 1) 희석되지 않은 샘플을 받아들이고, 2) 비-특이적 결합을 최소화하도록 필요한 제형을 제공하고 그리고 3) 전혈 샘플을 받아들인다. 아래에 논의된 경쟁적 IAIP 원형 신속한 테스트는 희석된 샘플 (1:5)을 이용하였으며, 이것은 테스트 스트립을 입력 원 샘플 용적에 대한 필요성을 완화하였고 비-특이적 결합 문제를 완화시키는 차단 단백질 및 계면활성제를 포함했다. 제형-기반 샘플 패드 (예를 들어, 건조된 제형)은 성분 (예를 들어, 단백질 차단제, 계면활성제, 등) 및 그것의 농도에 대해 발전될 수 있다. 간섭 및 비-특이적 결합을 효과적이고 확실하게 감소시키기 위해 사용될 수 있는 이용가능한 면역검정 첨가제가 있다. 후보 제제의 스크리닝 연구가, 예를 들어, 차단제의 최적의 농도를 결정하기 위한 다중-계승의 DoE에 이어질 수 있다.
LPS 및 헤파린에 대한 콘주게이션 기술은 금 콜로이드 (나노입자) 및 염색된 라텍스 입자-기반 콘주게이션 기술과 함께 사용하기 위해 평가될 수 있다.
c. 혈액 분리 여과 막 및 플라스틱 하우징 카셋트. 건조된 샘플 패드 제형에 부가하여, 전혈 샘플에 대해 적혈구를 배제하기에 적합한 인-라인 혈액 분리 필터 막이 채택될 수 있다. 본 목표는 과정을 간소화하고, 손가락 찌르기로부터 또는 수집관을 통해 수집된 직접적으로 적용되는 전혈을 사용하는 경우와 같이, 특히 현장 진단에서 실험실을 벗어난 적용에 대해 신속한 테스트 형식의 시험을 사용자 친화적으로 만드는 것이다. VividTM 또는 CytosepTM 막 (Pall) 또는 다른 제조자 (GE Lifesciences)와 같은 다중 유형의 이들 혈액 필터가 상업적으로 입수가능하고 LFIA에 사용될 수 있다. 테스트 스트립용 플라스틱 하우징 치수는 판독기 (예를 들어, Detekt 판독기)와 함께 사용하도록 선택될 수 있다.
본 발명자들은 소형 DetektTM 판독기 모델 RDS-150 PRO (Detekt Biomedical, Austin, TX)가 LFIA에 사용될 수 있음을 결정했다. 신속한 테스트 판독기에 대한 Detekt의 광학 측면 흐름 판독기 기술은 현재 음식 및 음료 안전성 시험, 생물-위협 검출, 환경 모니터링 및 동물 건강에서 상업적 진단 디바이스에 사용되고 있다. 판독기는 테스트 스트립을 광학적으로 스캔하고 시험과 대조 라인 신호 강도를 프로그래밍된 보정 알고리즘과 비교하는 소형 디바이스이다. 신호 통합 소프트웨어는 IAIP 용량- 반응 곡선을 해석하도록 맞춤형일 수 있고, 이 알고리즘은 DetektTM 장치에 상주할 수 있다. Vision Suite Pro 현상액의 키트 소프트웨어 프로그램은 텍사스주 오스틴 소재 제조업체인 Detekt Biomedical LLC와 공동으로 사용하여 IAIP 테스트 스트립의 해석을 Detekt 판독기와 통합할 수 있다. IAIP 결합 곡선 형상 및 내부 대조에 기초한 소프트웨어 알고리즘은 하기 기능을 수행하도록 개발될 수 있다: a) 테스트 라인 신호 강도에 대한 IAIP 결합 곡선의 형상을 확립하는 것; b) 가능하게는, 대조 라인 신호를 기반으로 내부 대조를 확립하여 테스트 스트립 러닝의 일상적인 가변성을 수정하는 것; c) 키트 로트-특이적 정보가 (예를 들어 바코드 스캐닝을 통해) 판독기 안으로 편입되도록 소프트웨어를 확립하는 것.
개발되고 최적화된 샌드위치-유형 IAIP 신속한 테스트의 성능 (상기와 본 명세서에서 논의된 파라미터에 따름)은 전-임상 설정에서 평가될 수 있다. LFIA 카셋트는 아래와 같이 시험될 수 있다:
a) 분석적 민감성, 보고가능한 범위 및 정확성 - 정황적 범위의 IAIP 농도 (25-800 μg/mL)에 걸치는 알려진 IAIP 농도의 샘플/대조군은 다중 오퍼레이터 (최소 N=3)에 의해 며칠 (N=10)에 걸친 다중 반복으로 시험될 수 있다. 데이터는 분석되어 IAIP 결합 곡선의 모든 점에서 정확성을 확립할 수 있어, 검정 컷-오프 포인트의 정확성을 포함한다 (150 μg/mL로 설정).
b) 간섭하는 서브스턴스 - 알려진 IAIP 농도의 샘플 풀은 잠재적으로 간섭하는 서브스턴스로 스파이킹되어 용량 회복에 미치는 영향을 결정할 수 있다. 임상시험표준협회 (CLSI) EP-07A 프로토콜이 참조로 사용될 수 있다. 환자 샘플에서 고농도로 발견될 수 있는 서브스턴스 (예를 들어 헤모글로빈, 빌리루빈, 인간 IgG, 등)의 모액은 IAIP 샘플 안으로 스파이킹되고 시험될 수 있다.
c) 사용자 강건성 평가 - 알려진 IAIP 농도의 샘플 풀이 사용되어 최종 사용자에 의해 생성된 다양한 시나리오/오류에 대한 테스트 스트립의 강견성을 검증할 수 있다. 시험된 파라미터는 하기를 포함한다: 1) 첨가된 부정확한 샘플 용적 (+ 25%), 2) 실험실 환경 조건 (온도 65-85 °F; 습도 10-70% RH) 및 3) 부정확한 테스트 스트립 판독 시간 (+ 50-100% 권고됨).
d) 제품 저장수명 안정성 - IAIP 테스트 키트는 상이한 온도 레지멘 (예를 들어, 대기 및 37 °C) 하에서 저장될 수 있고 제품의 안정성을 결정하기 위해 제조 후 다양한 간격 (>1 년)으로 알려진 IAIP 농도의 IAIP 대조군의 세트를 사용하여 시험될 수 있다.
e) 예비 임상 샘플에서 민감성 및 특이성 - 제품은 대상체 (예를 들어, NS 및 NEC의 의심되고 확인된 진단이 있는 영아)로부터의 임상 샘플을 사용하여 시험될 수 있다.
관찰 임상 연구에서 IAIP 신속한 테스트를 평가하기 위해, 일상적인 임상 평가 및 관리를 받는 대상체 (예를 들어, 염증성 질환 또는 병태 또는 감염이 있거나 또는 그 위험에 있는 대상체)로부터 샘플이 수집될 수 있다. 동일한 염증성 질환 또는 병태 또는 감염을 갖는 대상체의 광범위한 불균질 모집단을 돌보는 여러 센터에서 데이터의 취득은 적절한 수의 연구 대상체를 제공하고 IAIP와 질환 또는 감염 사이의 연관성을 강화하기 위해 사용될 수 있다. IAIP 수준을 실시간으로 제공할 수 있는 디바이스 외에 신속한 현장 진단은 불필요한 개입의 사용 또는 불필요한 치료 (예를 들어, 항생제 요법)의 연장을 방지하고 입원의 기간/비용을 줄일 수 있다.
IAIP LFIA는 아래와 같이 대상체의 임상 평가를 위해 사용될 수 있다:
1) 혈액 샘플의 수집: 다양한 의료 센터에서 염증성 질환 또는 병태가 있거나 전개할 위험이 있는 대상체로부터 샘플을 수집할 수 있다. 연령, 체중, 성별, 및 실험실 결과를 포함한 임상 및 인구통계적 데이터가 모든 대상체에 대해 기록될 수 있다. 다양한 시점 (예를 들어, 0, 24, 48, 72시간 및 7일)에서 수집된 동일한 대상체로부터의 연속 샘플이 또한 LFIA에 사용될 수 있다. LFIA는 IAIP 수준이 질병의 중증도 및 진행과 관련이 있는지 여부, IAIP 수준이 위험 또는 후속적인 질환을 예측하는지 여부, 및 대상체가 치료법 후 더 심각한 질환으로 발생하는지 개선되는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다.
2) 파워 분석 : 염증성 질환 또는 병태 또는 감염이 있는 대상체의 예비 데이터 및 공개된 연구는 샘플 크기 추정에 사용될 수 있다.
3) 혈액 분석: 수집된 임상 혈장 샘플을 연구 바이알로 옮기고, 라벨링하고 (식별), 테스트 할 때까지 냉동된 상태로 저장할 수 있다. IAIP 수준은 실온에서 24시간 동안, 일반적인 냉장된 임상 저장 하에서 최대 14일 동안 그리고 20ºC에서 무제한 시간 동안 안정적이다. IAIP 수준은 LFIA 신속한 IAIP 테스트 및 비교 연구를 위한 샌드위치-유형 IAIP ELISA를 사용하여 분석될 수 있다.
IAIP 신속한 테스트 LFIA에 대한 개념 증명을 평가하기 위해, 본 발명자들은 도 2A에 도시된 것과 유사한 경쟁적 LFIA를 사용하여 IAIP를 측정하도록 설계된 테스트 스트립 카셋트를 생산하였다. 아래에 기재된 이 면역검정 형식을 사용하여 생산된 데이터는 샌드위치-유형 형식 (도 3A에 도시된 것에 유사한 것)에 기초한 LFIA가 또한 사용될 수 있음을 확인한다. 경쟁적 LFIA는 아래에 기재되어 있다.
신생아에서 패혈증 및 전신 염증 반응 증후군
집중 치료의 발전으로 대상체 (예를 들어, 영아, 특히 조기, 초저 체중 출생 (VLBW) (<1,500 g) 영아)의 생존에서의 실질적인 개선으로 이어졌다. 그러나 조기 영아는 기회 감염 및 급성 생명을 위협하는 병태인 신생아 패혈증 (NS) 및 괴사성 전장염 (NEC)에 걸리기 쉽다. 최근 여러 센터 조사는 최대 21%의 VLBW 영아가 후발성 (출생 > 72시간) 혈액 배양으로 입증된 패혈증과 최대 7%의 VLBW 발생 NEC 중 적어도 하나의 에피소드에 직면한다는 것을 시사한다. NS 및 NEC는 부정적인 신경-발달 결과를 포함한 심각한 이환율과 연관이 있으며, NS (10-30%) 및 NEC (16-42%)에서 상대적으로 높은 사망률을 갖는다. 이들 신생아 질환의 조기 경고 징후 및 증상은 비-특이적이며, 빈번하게 눈에 띄지 않으며, 비-감염성 원인론, 예컨대 기관지폐 이형성증의 악화, 미성숙 무호흡, 위식도 역류, 또는 기능적 장내 운동성장애에 기인하는 것으로 쉽게 착각할 수 있다. 더욱 두려운 점은 두 질환의 임상 악화가 쇼크, 파종성 혈관내 응고, 및 임상 제시의 수 시간 내 사망을 초래하는 전격성 방식으로 진행할 수 있다는 것이다. 현재 중증 질환과 사망으로의 환자 진행의 위험에 대해 의사를 광범위하게 안내하는 신속한 검사는 없다.
NEC의 정확한 원인은 여전히 불분명하지만, 감염원이 장내 상피성 층을 가로 질러 이동하고 선천성 면역 방어를 회피하고 후속적인 염증 및 조직 괴사를 유발할 때 NEC 발병이 발생한다고 널리 여겨지고 있다. NS 및 NEC 둘 모두는 전신 염증 반응 연관된다. 초기 단계에서 비-특이적이고 미묘한 그것의 임상 제시는 매우 유사하다. 게다가, NS 및 NEC는 종종 동일한 질환 에피소드에 공존한다 (예를 들어, 패혈증이 있는 NEC는 사례-관리 연구에서 NEC의 사례 중 3분의 1에서 발생했다). 즉각적인 항미생물 치료 및 지지적 치료로의 즉각적인 의료 관리가 두 병태에 대한 치료 기준이다. 따라서, 가능한 한 이른 기회에서 이들 잠재적으로 치명적인 병태의 위험을 식별하는 것이 실제적이고 임상적으로 중요하다.
염증성 질환 또는 감염 (예를 들어, NS 및/또는 NEC)의 조기에 그리고 정확한 확인을 위한 바이오마커는 종래의 테스트가 정보 제공을 하지 않는 대상체 (예를 들어, 영아)에서 의사가 항생제 치료의 초기 사용 및 지속 또는 조기 종료에 대해 어려운 결정을 내릴 수 있도록 하는데 매우 유용할 것이다. 불행하게도, 현재 이들 도전적 질환의 관리에 임상적으로 유용하고 효과적인 널리-이용가능한 바이오마커는 없다. 최근에 프로칼시토닌 (PCT)이 하부 기도 감염 및 패혈증이 있는 환자에서 항생제 치료를 관리하는 데 도움이 되는 바이오마커로 승인되었지만 이 마커는 박테리아 감염에 대해서만 특이적이고 바이러스 또는 다른 비-박테리아 감염에 의해 야기된 전신 염증성 병태를 검출하는 데는 민감하지 않다. 게다가, PCT 테스트의 사용은 소아 환자, 특히 생후 첫 며칠 동안 조기 영아의 소아 환자에서 여전히 논란의 여지가 있다. 따라서, 염증성 질환 과정의 중증도에 대한 정보를 제공하는 민감성 바이오마커는 염증성 질환 또는 감염 (예를 들어, 조기 영아에서 NS 및 NEC)의 관리에 임상적으로 유용할 것이다. 이것은 큰 도전으로 남아 있다.
전신 염증 및 보다 ‘ 국소화된 ’ 질환 (자발적인 장내 천공)가 있는 영아를 검출하는데 있어 다른 마커와 IAIP의 예측 값의 비교 연구
본 발명자들은 IAIP가 탁월한 중증도 바이오마커이다는 것과 이것은 NEC를 보다 초점 염증성 질환, 자발적인 장내 천공 (SIP)과 구분할 수 있다는 것을 확인한다. IAIP 테스트는 SIP로부터 NEC의 진단에서 CRP보다 성능이 우수하다.
IAIP는 질환 중증도, 예를 들어, 국소 염증 반응 (SIP) 대 전신 및 잠재적으로 생명 위협 염증 반응 (NEC 및 NS)을 식별할 수 있다. 본 발명자들은 로드아일랜드 프로비던스 소재의 여성 & 영아 병원에서 신생아 패혈증 (NS), 괴사성 전장염 (NEC) 및 자발적인 장내 천공 (SIP)이 의심되는 95명의 영아 (64 여성 및 31 남성)로부터 혈액 샘플을 수집했다. 일련의 샘플은 각각의 개별 환자로부터 이용가능할 때 또한 수집했다. 대부분의 영아는 1235 그램의 평균 출생 체중을 갖는 <30 주 임신 연령 (23-31 wks. 범위임)이였다. 이들 수집된 샘플로부터, 본 발명자들은 입증된 NEC를 가진 8명의 영아, SIP를 가진 9명의 영아 및 NS를 가진 20명의 영아를 수득했다. 본 발명자들은 NS에 대한 양성 및 음성 예측 값을 결정하기 위해 IAIP 검정을 이전에 사용했으므로, 본 발명자들은 NEC와 같은 전신 염증 질환 병태 및 SIP와 같은 보다 ‘국소화된’ 및 초점 괴저성 질환 병태에서 IAIP 수준의 예측 값을 평가했다. 본 발명자들은 또한 성별, 체중 및 재태 연령 매칭된 대조군에 대한 이들 영아에서 IAIP의 수준과 또 다른 염증성 바이오마커 C-반응 단백질 (CRP)을 비교했다. 인간 IAIP (MAb 69.26)에 대해 특이적인 단일 단클론성 항체를 사용한 경쟁적 ELISA를 사용하여 혈액 IAIP의 수준을 측정하고 CRP ELISA 키트를 사용하여 맹검 방식으로 CRP 수준을 분석했다. 건강한 영아 (p<0.05) 및 SIP가 있는 영아 (방사선사진 NEC가 없음, p<0.005)와 비교하여 NEC로 진단된 영아 (변형된 벨의 단계 II 이상)에서 IAIP 수준에서의 상당한 감소가 발견되었다. 그러나, SIP를 가진 영아와 건강한 대조군 사이에 유의차는 발견되지 않았다. 그에 반해서, CRP의 증가된 수준은 NEC 및 SIP가 있는 영아 둘 모두에서 발견되었지만, 증가가 통계적으로 유의미한 것은 아니었다 (p>0.05) (도 15A-15B 참고). 게다가, <4의 컷오프 값에서 CRP의 리시버 작동 특성 (ROC)은 100%의 감수성, 64.7%의 특이성, 18.7의 양성 예측의 값 (PPV) 및 100의 음성 예측의 값 (NPV)으로 0.65 (p=0.01, 95%CI; 0.54-0.90)의 곡선하 면적 (AUC)을 생성하였고; 반면에 <207 mg/L의 컷오프 값에서 IAIP의 ROC은 0.98 (p<0.0001, 95% CI; 0.84-0.99)의 강력한 AUC를 산출하였다. IAIP의 예측의 값은 100%의 감수성, 88.2%의 특이성, 41의 PPV, 및 100의 NPV를 갖는 CRP의 것에 비교하여 우월하였다 (도 16A-16B).
영아로부터의 다중 연속 샘플은 NEC 및 SIP의 개시 전후에 전부는 아니지만 일부 영아로부터 이용가능하였다. 본 발명자들은 확립된 IAIP 경쟁적 ELISA를 사용하여 IAIP 수준을 더 분석했다. NEC를 가진 영아의 IAIP 수준은 진단 시 및 치료의 개시 후 SIP 환자 (도 17)에서 발견된 수준에 비해 상당히 낮았다. 이들은 편리 샘플이었다.
그것을 단지 잔존 채혈로부터 이용가능하였다. 이들 결과는 IAIP 수준이 높은 민감성 및 특이성을 갖는 (NS에 부가하여) NEC와 같은 생명을 위협하는 전신 염증성 병태를 식별하는 유용한 바이오마커이다는 것을 입증하고, IAIP 수준은 SIP 환자에서 생명을 덜 위협하는 병태와 NEC를 또한 구별하는 것으로 보인다. IAIP 테스트는 NEC (100%) 및 NS (98%) 둘 모두에서 탁월한 NPV를 실증했다. IAIP 테스트는 종래의 검사가 정보 제공을 하지 않는 영아에서의 조기 종결과 같은 치료 (예를 들어, 항생제 치료) 결정을 안내하는 데 사용될 수 있다.
혈액 IAIP 수준을 측정하고 NS 및 NEC를 검출하는 IAIP에 대한 정량적 경쟁적 측면 흐름 면역검정 (LFIA)의 원형 개발
a) 테스트 형식 및 검정 구조의 선택: 측면 흐름 면역검정-기반 테스트는 IAIP 신속한 테스트의 형식을 위해 선택되었다 (도 18 참고). LFIA는 이들이 다음과 같이 설계되기 때문에 신속한 현장 진단 검정을 전개할 때 많은 이점을 제공한다: 1) 작은 샘플 용적 사용; 2) 잘 특성규명된 동력학을 따르고 결과를 테스트하기 위한 신속한 간격을 제공; 3) 분석적으로 민감하고 정확함; 4) 디바이스의 적절한 성능을 확인하기 위해 내부 대조를 통상적으로 함유함; 5) 잘 특성규명되고 널리 이용가능한 원료로 제조됨; 및 6) 스트립 판독기를 사용하여 정량적으로 분석될 수 있는 신호 생성. 따라서, IAIP 신속한 테스트로서 LFIA는 예를 들어 현장 진단 환경에서 사용될 수 있다.
b) LFIA의 포착, 검출 및 샘플 시약과 조건의 최적화:
측면 흐름 면역검정의 포착, 검출, 샘플 시약과 조건을 최적화함으로써 확립된 경쟁적 IAIP ELISA를 경쟁적 LFIA 형식에 채택하는데 초기 노력이 성공하였다. 본 발명자들은 신속한 IAIP 검정 형식의 용량-반응 곡선 뿐만 아니라 평가된 신호 타이밍, 정확성, 및 반복성을 추가로 확립하였다. 테스트 결과의 판독기-기반 데이터 분석은 초기에 Qiagen 테스트 스트립 판독기를 사용하여 채택되었다. 이들 초기 테스트에 이어, 본 발명자들은 시험 스트립 및 검정 조건을 최적화하고 본 발명자들의 시험 스트립에 이용가능하고 적합한 몇 개의 휴대용 판독기를 테스트했다.
c) IAIP ( MAb 69. 26)에 대한 정제된 IAIP 및 단클론성 항체: 두 시약 모두는 경쟁적 검정 형식에서 사용된 주요 성분이다. 본 발명자들은 고수율과 고순도를 제공하는 인간 혈장으로부터 IAIP의 단리를 위한 확장가능한 바이오프로세스 방법을 개발하고 최적화하였다. 하이브리도마 세포는 항체의 시험관내 대규모 생산을 위해 확장가능한 CELLine 배양 플라스크 (Integra Bioscience)에서 성장되었다. IgG는 친화도 단백질 A 크로마토그래피에 의해 하이브리도마 상청액으로부터 단리되었다.
d) 테스트 스트립: 스트립의 다중 파일롯 로트가 준비되었고 선택된 제형은 인간 혈장에서 IAIP의 정량적 측정을 위한 안정한 플랫폼이다: 1) 샘플 패드: 완충액 및 계면활성제를 갖는 셀룰로스 패드; 2) 콘주게이트 패드: 항-IAIP (MAb 69.26) 금 콘주게이트 및 토끼 IgG 금 콘주게이트 (대조 라인)를 갖는 유리 섬유 패드; 3) 니트로셀룰로스:IAIP 줄무늬 (테스트 라인) 및 염소-항-토끼 IgG 줄무늬 (대조 라인 말단 심지: 셀룰로스 패드 (제형 없음))를 갖는 빠른 흐름 (Millipore HF090) 니트로셀룰로스.
e) 샘플: 작은 용적의 혈장 (1:5 희석된 샘플의 15 μl)을 스트립에 첨가하고 그런 다음 115 μl 체이스 완충액이 스트립을 통해 샘플을 밀어냈다. 체이스 완충액은 다음으로 최적화되었다: 2mM Tris pH 8.0 + 100mM NaCl + 0.5% Brij + 0.05% Tween 20 + 1.0% 소태아 혈청. Brij 계면활성제는 완충액에 첨가되어 스트립의 상류 부분으로부터 콘주게이트의 신속한 클리어링을 촉진했다
f) 실행 시간: 스트립은 혈장 샘플 또는 IAIP 캘리브레이터로 실행되었고 (3개의 상이한 농도에서) 그 다음 샘플 첨가 10, 15, 20, 25, 30, 45 및 60분 후에 Qiagen 판독기에 의해 정량화되었다. 스트립은 약 7분 수행되었고 (즉, 니트로셀룰로스가 이질적인 금을 제거했고) 그 후 임의의 시간에 판독될 수 있었다. 본 발명자들은 15분 후에도 신호가 극적으로 변하지 않았다는 것을 알아냈다. 따라서, 본 발명자들은 샘플을 추가한 후 15분에 스트립을 균일하게 판독하였다.
g) 캘리브레이터 및 대조: ELISA 결과에 기초하여 알려진 IAIP 값을 갖는 인간 혈장 (로드 아일랜드 혈액 센터)을 캘리브레이터 및 내부 표준 대조로서 사용하였다. 1% FCS-함유 완충액으로 혈장을 희석하여 상이한 용량이 생성되었다. 휴대용 Qiagen 테스트 판독기 (ESEQuant LFR)를 사용하여 본 발명자들은 17.5에서 1100 μg/mL (1:5 샘플 희석 사용) 범위인 표준 곡선을 확립했다. 5일 동안 하루 중 서로 다른 시간에 최대 13회 일련의 캘리브레이터를 반복하고 실행함에 의해 1일에 걸쳐 보정 곡선의 재현성을 시험했다. 결과는 도 19에 도시되어 있다. 각각의 값의 평균 및 SD가 플롯팅되었다. 결과는 본 테스트가 5일에 걸쳐 탁월한 분산 계수 (CV 15% 미만)로 긴밀한 확산을 실증하였다는 것을 보여주었다.
h) 테스트 스트립 판독기 및 소프트웨어: 본 발명자들의 IAIP 신속한 테스트는 정량적인 것으로 의도되기 때문에, 본 발명자들은 시험 스트립에 의해 생성된 신호를 포착하는 판독기를 주의하여 선택했다. 다양한 유형의 테스트 스트립 판독기가 상업적으로 입수가능하다. 판독기의 선택은 특징 및 사양 예컨대 엔지니어링, 인체공학, 및 소프트웨어 강건성에 기초했다. 이것은 신속한 테스트의 중요한 부분이므로, 본 발명자들은 IAIP 신속한 시험 스트립에 대해 서로 다른 기술과 특징을 가진 3개의 상이한 판독기를 시험했다: 1) 휴대용 테이블탑 측면 흐름 판독기 (Qiagen 사의 ESEQuant LFR); 2) 소형 PDA 기반 판독기 Detekt RDS 1500 Pro (Detekt Biomedical, Austin, TX) 및 3) 스마트폰/태블릿 기반 판독기 시스템 (iCalq 판독기 - iCalq, Salt Lake City, UT). 본 발명자들은 Detekt 판독기가 시험된 다른 판독기보다 5 내지 700 μg/mL 범위로 되는 더 나은 선형 곡선을 생성했다는 것을 알았다.
최적화된 검정의 검정-간 및 검정-내 정확성의 결정
수집된 혈액를 사용하여 신속한 테스트의 검정-간 정확성 특성을 결정하였다.
샘플 (n=6)로 6 연속 일 동안 반복적으로 수행. 결과는 3개의 상이한 휴대용 및 소형 판독기를 사용하여 후속적으로 판독되었고, 분산 계수 (CV)는 각각의 개별 샘플로부터 얻은 결과로부터 계산되었다. ESEQuant 판독기를 사용한 IAIP 신속한 테스트의 CV는 평균 13%로 4 내지 16%의 범위인 반면, Detekt 판독기는 10%의 평균 CV (5-16%의 범위임)를 실증했고 iCalQ 스마트폰 기반 판독기는 16%의 평균 CV (10-23%의 범위임)를 수득했다. Detekt 판독기는 본 발명자들이 시험한 다른 두 판독기보다 상대적으로 더 낮은 CV로 더 잘 수행되었다. 테스트의 검정-내 정확성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 8개의 혈장 샘플을 실행하고 최적화된 프로토콜을 기반으로 IAIP 수준을 분석했다. 각각의 샘플로부터 수득된 신호를 다양한 판독기에서 3회 판독하고 IAIP 값을 확립된 표준 곡선에 기초하여 개별적으로 계산하였다. 후속으로, CV는 3회 판독 치로부터 결정되었고, 시험된 모든 3개 판독기에 대해 평균 CV가 5%로 2 내지 8%의 범위인 것으로 밝혀졌다.
영아 혈장에서 신속한 검정의 성능 평가
여성 & 영아 병원에서의 영아로부터 수집된 샘플을 사용하여, 본 발명자들은 상기에 기재된 IAIP 시험 스트립에 대한 최적화된 조건을 기반으로 IAIP 분석을 수행했다. 수득한 신호는 3개의 독립적인 판독기를 사용하여 순차적으로 판독되고, 결과는 판독기의 각각의 표준 곡선에 기초하여 계산되었다. 신속한 테스트의 결과를 확립된 경쟁적 ELISA 검정에 의해 수득된 결과와 비교하고, 각각의 개별 샘플의 값을 신속한 테스트의 결과에 대해 플롯팅하였다 (도 20A-20C). 결과는 6시간 경쟁적 ELISA와 15분 이내에 하기를 사용하여 생성된 신속한 경쟁적 LFIA 테스트 결과 사이에 탁월한 상관관계를 실증했다: ESEQuant 판독기 (상관 계수R2; 0.832, n=311) 및 Detekt 판독기 (R2=0.84, n=339). 그러나, iCalQ 스마트폰 기반 판독기는, 특히 높은 수준 IAIP (> 600 μg/ml)를 함유하는 샘플에서 ELISA 결과와 비교할 수 없는 테스트 결과를 생성했다.
요약하면, 본 발명자들은 6시간의 실험실-기반 경쟁적 ELISA를 혈액 내 순환 IAIP (10 - 800 μg/mL 범위)를 허용가능한 검정-간 및 검정-내 정확성 (20% CV 미만)으로 15분 이내에 정확하게 (ELISA 결과에 비교하여 상관 계수 R2>0.8) 측정할 수 있는 현장 진단 IAIP 신속한 테스트로 성공적으로 전환했다. 본 발명자들은 혈액 IAIP 수준은 NS뿐만 아니라 고감수성 (100%) 및 고특이성 (88%)을 가진 NEC에 유용한 예측 마커임을 확인했다. IAIP 테스트는 CRP 테스트보다 NEC 탐지에 더 특이적이고 IAIP 수준은 NEC를 SIP 환자와 구별하는 데에 또한 유용하다.
경쟁적 검정을 LFIA 형식에 성공적으로 적용하면, 본 발명자들은 (예를 들어, 도 3A에서 나타낸 바와 같이) 본 명세서에 기재된 “샌드위치-유형” IAIP ELISA가 또한 LFIA 형식에 적응될 수 있다고 기대한다. IAIP의 신속한 정량화는 염증성 질환 또는 병태 또는 감염 (예를 들어, 패혈증, NEC, 박테리아 감염, 또는 또 다른 질환 또는 병태)이 있거나 전개할 위험이 있는 대상체 (예를 들어, 인간 대상체, 예컨대 영아, 소아, 청소년, 또는 성인)의 조기 확인 및 최적의 요법의 시기적절한 개시로 이어질 수 있다.
실시예 11: 하이알루론산-IAIP 고체 결합 검정
하이알루론산, 나트륨 염 (Sigma-Aldrich)을 dH2O (모액 농도 1 mg/mL)에 용해시키고 추가로 pH 9.0에서 20 mM NaHCO3/Na2CO3 완충액으로 희석하였다. 웰당 50, 100 및 200 ng 하이알루론산을 37 ℃에서 120분 동안 96-웰 마이크로플레이트 (Greiner BioOne, Microlon 600) 상에 고정시켰다. 37 ℃에서 60분 동안 TBS-T (pH 7.3에서 20 mM 트리스-완충 식염수 용액 + 0.05% Tween-20 (v/v)) 내 5% 비-지방 밀크 분말로 차단하고 3회 TBS-T로 세정한 후, IAIP를 함유하는 연속으로 희석된 용액 (TBS 내 인간 혈장 및 고순도 IAIP)을 마이크로플레이트에 첨가하고 37 ℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 인간 혈장은 국소 혈액 은행으로부터 수득된 신선한 냉동 혈장의 동결-침전에 의해 제조되었다. 동결-상청액이 이 실험에서 사용되었고 IAIP 농도는 250 μg/mL였다. 정제된 IAIP는 개시시에 1 mg/mL의 농도였다. 마이크로플레이트는 그런 다음 TBS-T로 3회 세정되었고 TBS 내 1:1000 희석에서의 바이오틴-접합된 MAb 69.26 (인간 IAIP에 대한 단클론성 항체)이 첨가되고 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션되었다.
TBS-T로 3회 추가의 세정을 한 후, TBS에서 1:5000으로 희석된 홀스래디쉬 페록시다아제 (HRP)-접합된 스트렙타비딘 (Inova Bioscience)이 첨가되고 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션되었다. TBS-T로 3회 세정 후, 50 μL Enhanced K-Blue TMB 기질 (Neogen)이 각 웰에 첨가되고 반응은 50 μL 1M 염산 (HCl)을 부가함에 의해 중단되었다. 색상 변화는 650nm 파장에서 분광측정기 (Molecular Devices SpectraMax Plus 마이크로플레이트 판독기)를 사용하여 판독하였고, 인간 혈장 또는 정제된 IAIP에 대한 표준 곡선을 50, 100 및 200 ng/웰 고정된 하이알루론산으로 플롯팅하였다 (도 21A-21B). 이들 데이터는 하이알루론산을 사용하여 IAIP 복합체 분자를 포착하고 IAIP의 경쇄에 특이적인 단클론성 항체 (예를 들어, MAb 69.26)를 사용하여 포착된 IAIP를 검출함으로써 생물학적 혼합물에서 IAIP가 정량적으로 측정될 수 있음을 보여준다. 도 21A-21B에서 나타낸 바와 같이, 표준 곡선은 정제된 IAIP 또는 알려진 양의 IAIP를 갖는 인간 혈장을 사용하여 최적화되고 확립될 수 있다. 　결과적으로, 이 검정은 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 알려지지 않은 양의 IAIP를 정량화하는데 사용될 수 있다. IAIP-특이적 단클론성 항체가 IAIP를 포착하는데 사용되고 바이오틴-라벨링된 하이알루론산이 리간드로 사용되어, 실시예 1 및 2에서 사용된 접근법에 유사하게 결합된 IAIP를 검출하는, 이 방법에 대한 대안적인 접근법이 이용될 수 있다.
다른 구현예
상기 명세서에서 언급된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 공보, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 전체적으로 참고로 편입되는 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 참조로 편입된다. 미국가출원 번호 62/490,003 및 62/614,333은 본 명세서에 구체적으로 전체적으로 편입된다. 본 발명의 기재된 방법, 약제학적 조성물, 및 키트의 다양한 변형 및 변동은 청구된 발명의 범위 및 사상을 벗어나지 않으면서 당해 분야의 숙련가에게 명백할 것이다. 본 개시내용은 특정 구현예와 관련하여 기재되었지만, 추가의 변형이 가능하고 청구된 바와 같은 본 발명은 이러한 특정 구현예에 지나치게 제한되어서는 안된다는 것을 이해할 것이다.

Claims (189)

  1. a) 2가 양이온을 샘플에 첨가하고, 여기서 상기 2가 양이온은 Ca2+, Mg2+, Mn2+ 또는 Fe2+인 단계;
    b) 샘플을 결합제와 접촉시켜 인터-알파-억제제 (IαI) 또는 프리-알파-억제제 (PαI) 결합제 복합체를 생성하고, 여기서 상기 결합제는 지지체에 결합되고 비쿠닌에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것인 단계;
    c) 상기 IαI 또는 PαI 결합제 복합체를 검출제와 접촉시키고, 여기서 상기 검출제는 하나 이상의 IAIP 중쇄에 결합하는 IAIP 리간드를 포함하는 것인 단계; 및
    d) 상기 IαI 또는 PαI 결합제 복합체에 결합된 검출제의 양을 검출하는 단계
    를 포함하고,
    IαI 또는 PαI는 비쿠닌, 및 H1, H2 및 H3 쇄로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 인터-알파 억제제 단백질 (IAIP) 중쇄를 포함함으로써, 샘플에서 IαI 및 PαI를 정량화하는 것인,
    대상체로부터의 샘플에서 IαI 및 PαI를 정량화하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 b), c) 또는 d) 중 하나 이상이 7.0 내지 3.5의 pH에서 수행되는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, pH가 5.0 내지 3.5인 방법.
  4. 제3항에 있어서, pH가 4.0인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 대상체가 인간 대상체인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, IAIP 리간드가 내독소 (LPS), 헤파린, 히스톤, 하이알루론산, 빈트로넥틴, 파이브로넥틴, 라미닌, 테나스신 C, 아그레칸, 폰빌레브란트 인자, 펜트락신-3 (PTX3), TNF-자극된 유전자-6 (TSG-6), 인자 IX, 보체 성분, 인자 XIIIa 및 조직 트랜스루타미나제로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, IAIP 리간드가 헤파린, 하이알루론산 또는 히스톤인 방법.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, IAIP 리간드가 헤파린인 방법.
  9. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 검출제가 표지를 추가로 포함하고, 여기서 상기 표지는 바이오틴, 금 나노입자, 자기 입자, 라텍스 입자, 효소, 효소 기질, 형광 염료, 발광성 화합물 또는 방사선표지인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 표지가 효소이고, 여기서 상기 효소는 홀스래디쉬 페록시다아제인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 표지가 금 나노입자를 포함하는 것인 방법.
  12. 제9항에 있어서, 검출제가 바이오틴 및 스트렙타비딘 또는 아비딘 중 하나를 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액, 활막 유체, 양수, 간질액, 여포성 유체, 복막 유체, 기관지폐포 세척 유체, 모유, 가래, 림프, 담즙 또는 조직 균질물인 방법.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 혈액, 뇌척수액, 기관지폐포 세척 유체, 활막 유체 또는 가래인 방법.
  15. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 혈액인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 샘플이 혈장 또는 혈청인 방법.
  17. 제9항에 있어서, 표지가 금 나노입자이고, IAIP 리간드가 헤파린인 방법.
  18. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체가 플레이트, 입자, 나노입자, 수지, 막, 바이오칩, 컨테이너, 테스트 스트립 또는 비드인 방법.
  19. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체가 테스트 스트립인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 지지체가 테스트 스트립이고, 검출제가 샘플의 첨가 전, 후 또는 첨가와 동반하여 상기 스트립에 첨가되는 것인 방법.
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
  40. 삭제
  41. 삭제
  42. 삭제
  43. 삭제
  44. 삭제
  45. 삭제
  46. 삭제
  47. 삭제
  48. 삭제
  49. 삭제
  50. 삭제
  51. 삭제
  52. 삭제
  53. 삭제
  54. 삭제
  55. 삭제
  56. 삭제
  57. 삭제
  58. 삭제
  59. 삭제
  60. 삭제
  61. 삭제
  62. 삭제
  63. 삭제
  64. 삭제
  65. 삭제
  66. 삭제
  67. 삭제
  68. 삭제
  69. 삭제
  70. 삭제
  71. 삭제
  72. 삭제
  73. 삭제
  74. 삭제
  75. 삭제
  76. 삭제
  77. 삭제
  78. 삭제
  79. 삭제
  80. 삭제
  81. 삭제
  82. 삭제
  83. 삭제
  84. 삭제
  85. 삭제
  86. 삭제
  87. 삭제
  88. 삭제
  89. 삭제
  90. 삭제
  91. 삭제
  92. 삭제
  93. 삭제
  94. 삭제
  95. 삭제
  96. 삭제
  97. 삭제
  98. 삭제
  99. 삭제
  100. 삭제
  101. 삭제
  102. 삭제
  103. 삭제
  104. 삭제
  105. 삭제
  106. 삭제
  107. 삭제
  108. 삭제
  109. 삭제
  110. 삭제
  111. 삭제
  112. 삭제
  113. 삭제
  114. 삭제
  115. 삭제
  116. 삭제
  117. 삭제
  118. 삭제
  119. 삭제
  120. 삭제
  121. 삭제
  122. 삭제
  123. 삭제
  124. 삭제
  125. 삭제
  126. 삭제
  127. 삭제
  128. 삭제
  129. 삭제
  130. 삭제
  131. 삭제
  132. 삭제
  133. 삭제
  134. 삭제
  135. 삭제
  136. 삭제
  137. 삭제
  138. 삭제
  139. 삭제
  140. 삭제
  141. 삭제
  142. 삭제
  143. 삭제
  144. 삭제
  145. 삭제
  146. 삭제
  147. 삭제
  148. 삭제
  149. 삭제
  150. 삭제
  151. 삭제
  152. 삭제
  153. 삭제
  154. 삭제
  155. 삭제
  156. 삭제
  157. 삭제
  158. 삭제
  159. 삭제
  160. 삭제
  161. 삭제
  162. 삭제
  163. 삭제
  164. 삭제
  165. 삭제
  166. 삭제
  167. 삭제
  168. 삭제
  169. 삭제
  170. 삭제
  171. 삭제
  172. 삭제
  173. 삭제
  174. 삭제
  175. 삭제
  176. 삭제
  177. 삭제
  178. 삭제
  179. 삭제
  180. 삭제
  181. 삭제
  182. 삭제
  183. 삭제
  184. 삭제
  185. 삭제
  186. 삭제
  187. 삭제
  188. 삭제
  189. 삭제
KR1020197034223A 2017-04-25 2018-04-25 인터-알파 억제제 단백질을 정량화하는 방법 KR102587810B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762490003P 2017-04-25 2017-04-25
US62/490,003 2017-04-25
US201862614333P 2018-01-05 2018-01-05
US62/614,333 2018-01-05
PCT/US2018/029436 WO2018200722A1 (en) 2017-04-25 2018-04-25 Methods for quantifying inter-alpha inhibitor proteins

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200010262A KR20200010262A (ko) 2020-01-30
KR102587810B1 true KR102587810B1 (ko) 2023-10-11

Family

ID=63920445

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020197034223A KR102587810B1 (ko) 2017-04-25 2018-04-25 인터-알파 억제제 단백질을 정량화하는 방법

Country Status (9)

Country Link
US (2) US20200057077A1 (ko)
EP (1) EP3615937A4 (ko)
JP (2) JP7293128B2 (ko)
KR (1) KR102587810B1 (ko)
CN (1) CN110691973A (ko)
AU (1) AU2018258466A1 (ko)
BR (1) BR112019022358A2 (ko)
CA (1) CA3061164A1 (ko)
WO (1) WO2018200722A1 (ko)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA3036553A1 (en) * 2016-09-13 2018-03-22 Prothera Biologics, Inc. Methods for treating pulmonary disease using inter-alpha inhibitor proteins
WO2020086879A1 (en) * 2018-10-24 2020-04-30 Prothera Biologics, Inc. Inter-alpha inhibitor proteins and methods of use thereof
WO2022104282A1 (en) 2020-11-16 2022-05-19 Prothera Biologics, Inc. Methods for purifying inter-alpha inhibitor proteins
US20230055086A1 (en) * 2021-08-19 2023-02-23 Prothera Biologics, Inc. Inter-alpha inhibitor proteins
CN114088949A (zh) * 2021-11-11 2022-02-25 王南 乌司他丁前体用于检测炎症的应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4217717B2 (ja) * 1996-07-16 2009-02-04 生化学工業株式会社 血清由来ヒアルロナン結合性タンパク質−ヒアルロン酸結合体の測定法および測定キット
US6660482B1 (en) * 2000-02-28 2003-12-09 Rhode Island Hospital Inter-alpha-trypsin inhibitor as a marker for sepsis
JP4180911B2 (ja) * 2002-12-27 2008-11-12 生化学工業株式会社 新規酵素活性測定方法
EP1691820A4 (en) * 2003-11-08 2010-03-03 Prothera Biolog PREPARATION AND COMPOSITION OF INTER-ALPHA INHIBITOR PROTEINS FROM HUMAN PLASMA FOR THERAPEUTIC USE
US7939282B2 (en) * 2004-10-21 2011-05-10 Rhode Island Hospital Methods for detecting sepsis
US8026345B2 (en) * 2007-01-08 2011-09-27 Hoffmann-La Roche Inc. Characterization and identification of unique human adiponectin isoforms and antibodies
TR201808152T4 (tr) * 2008-05-28 2018-07-23 Prothera Biologics Inc Kandan inter-alfa inhibitör proteinlerinin hazırlanması ve bunların bileşimi.
JP2013101047A (ja) * 2011-11-08 2013-05-23 Nagasaki Univ １４−３−３蛋白γアイソフォーム特異的ＥＬＩＳＡ

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TEIWES, HANNO, 'A PAPER-BASED LATERAL FLOW DEVICE FOR THE DETECTION OF IαIP VIA ELISA', Open Access Master's Theses, 2014, pp 1-118. 1부.*
ZHANG, SUZHEN et al., Journal of biological chemistry, 2012, Vol. 287, pp 12433-12444. 1부.*

Also Published As

Publication number Publication date
JP7293128B2 (ja) 2023-06-19
JP2020517967A (ja) 2020-06-18
US20220099684A1 (en) 2022-03-31
EP3615937A4 (en) 2021-08-11
AU2018258466A1 (en) 2019-12-05
US20200057077A1 (en) 2020-02-20
BR112019022358A2 (pt) 2020-05-19
EP3615937A1 (en) 2020-03-04
CA3061164A1 (en) 2018-11-01
JP2023085249A (ja) 2023-06-20
KR20200010262A (ko) 2020-01-30
CN110691973A (zh) 2020-01-14
WO2018200722A1 (en) 2018-11-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102587810B1 (ko) 인터-알파 억제제 단백질을 정량화하는 방법
JP7441662B2 (ja) ｐＫａｌ関連疾病の評価、アッセイおよび治療
US9291622B2 (en) Complement assays and uses thereof
US9939446B2 (en) Lateral flow immunoassay for complement activation and methods of use for point-of-care assessment of complement-associated disorders
US20140187503A1 (en) Diagnostic method
US8865164B2 (en) Detecting complement activation
US7939282B2 (en) Methods for detecting sepsis
US20170261516A1 (en) Methods and compositions for diagnosis and treatment of meningitis
US20230055086A1 (en) Inter-alpha inhibitor proteins
ES2711921T3 (es) Detección de la activación del complemento
EA045401B1 (ru) Способы количественного определения интер-альфа ингибиторных белков
TW201625946A (zh) ５-甲氧基色胺酸作為發炎疾病診斷試劑之用途
BR112015017195B1 (pt) Método e kit para detectar inibidor de protease c1 de plasma

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant